XVI Curso de Especializacin FEDNA LOS CIDOS ORGNICOS COMO AGENTES ANTIMICROBIANOS

LOS CIDOS ORGNICOS COMO AGENTES ANTIMICROBIANOS P. Rodrguez-Palenzuela Departamento de Biotecnologa. Universidad Politcnica de Madrid

 
1.- INTRODUCCIN 2.- CONCEPTO DE CIDO: pH

El uso de cidos orgnicos como preservantes en alimentacin animal y humana es muy antiguo. De hecho, el tradicional ensilado de forrajes se basa en las propiedades antimicrobianas del cido lctico, generado irnicamente- por la fermentacin que llevan a cabo bacterias lcticas. Tambin en la Industria Alimentaria son bien conocidos los procesos que emplean este cido como conservador, tales como el yogur, el chucrut o el salami. Sin embargo, el empleo de acidificantes en alimentacin animal ha adquirido un considerable inters los ltimos aos, debido a la necesidad de encontrar alternativas al empleo de varios antibiticos, cuyo uso como preventivo se ha prohibido en la legislacin europea. Los acidificantes pueden tener una influencia positiva en la produccin ganadera, ya que pueden limitar la proliferacin de bacterias y otros microorganismos patgenos o nocivos. Al mismo tiempo, es muy difcil prever las complejas interacciones que pueden darse entre cidos orgnicos y otros componentes del alimento, as como la influencia de stos en el metabolismo del animal y la microflora saprfita. El propsito de este artculo es revisar, desde un punto de vista bsico, algunos conceptos relacionados con el empleo de acidificantes en alimentacin animal.

Intuitivamente, un cido es una sustancia cuya solucin tiene un sabor cido caracterstico. En qumica se han formulado distintas definiciones para este concepto. La teora clsica o teora de Arrhenius, formulada en 1884 establece que cido es toda sustancia que en disolucin da lugar a iones hidrgeno, H+. Son cidos, por ejemplo el clorhdrico, ClH, o el actico, CH3-COOH, ya que al disolverse en agua dan lugar a un in negativo, que es al anin del cido y otro positivo, que es el catin hidrgeno H+. Este ion hidrgeno se encuentra

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normalmente hidratado, por lo que suele escribirse tambin como in hidronio H3O+. ClH + H2O Cl- + H3O+ (1)

Segn la teora de Arrhenius, base es toda sustancia que en disolucin acuosa se ioniza dando lugar a iones hidrxido, OH-. As, son bases el amoniaco, NH3, y todos los hidrxidos porque en disolucin acuosa dan lugar a un in positivo y al anin negativo OH-. NH3 + H2O NH4+ + OH-

 
(Cl- + H+) + (Na+ +OH-) (Cl- +Na+) + H2O ClH + NH3 Cl- + NH4+ cido 1+ base 2 = base1 + cido 2

Una reaccin de neutralizacin es la reaccin en disolucin acuosa de un cido con una base. Esta reaccin siempre tiene como producto molculas de H2O, ya que los iones hidrgeno H+ liberados por el cido se combinan con los iones hidroxilo OH- de la base. As, en una reaccin donde mezclramos cantidades equimoleculares de cido clorhdrico, ClH y de hidrxido sdico, NaOH, tendramos: (3)

es decir, cloruro sdico (sal comn) y agua. Esta reaccin es reversible, aunque el equilibrio se encuentra por lo general muy desplazado hacia la formacin de la sal y el agua. La reaccin inversa a la de neutralizacin se llama hidrlisis, por la que la reaccin de una sal con agua produce el cido y la base correspondientes.

La definicin de Arrhenius slo es vlida cuando se utiliza el agua como disolvente. Una definicin ms general es la formulada por Lewis, por la que cido es toda especie qumica que puede aceptar un par de electrones no compartidos y base la sustancia capaz de cederlos. Segn esta definicin el H+ y el NH3 deberan considerarse, respectivamente, como cidos y bases, ya que el primero puede aceptar un par de electrones del segundo para formar NH4+ (2). Tambin puede definirse un cido como una sustancia capaz de donar protones y anlogamente- una base como un receptor de estas partculas. Cuando un cido ha cedido un protn a una base, puede volver a recuperarlo a continuacin, es decir se ha convertido en una base, llamada base conjugada del cido. Asimismo, cuando una base acepta un protn se convierte en un cido, puesto que puede volver a cederlo, se llama entonces cido conjugado de la base. (4)

El agua puede comportarse como cido o como base segn con quien reaccione. As, en la reaccion (1) se comportaba como una base, mientras que en la reaccin (2) se comporta como un cido. A las sustancias con esta propiedad se las conoce como anfteras o anfiprticas. Un cido fuerte es aquel que muestra gran tendencia a ceder un protn. De modo contrario una base fuerte es aquella que muestra gran tendencia a aceptar protones. Como sustancia de referencia se toma en general el agua. Los cidos inorgnicos ordinarios, como el


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sulfrico, clorhdrico, etc... se encuentran totalmente disociados en solucin y por ello son cidos fuertes. Por ejemplo, una disolucin de 1 mol de HCl en 1 l de H2O dar lugar a la aparicin de (prcticamente) 1 mol de protones en dicha solucin (1). La medida cuantitativa de la acidez de una solucin se basa en el fenmeno de autoprotlisis del agua. Si destilsemos H2O varias veces hasta conseguir un lquido completamente puro, encontraramos que no est compuesto solamente por molculas de H2O, sino tambin de una pequesima proporcin de iones hidronio e hidroxilo, segn el siguiente equilibrio: H2O + H2O H3O+ + OH-

 
pH = -log [H+] De esto se deduce que el pH del agua pura ser: pH = -log [H+] = -log [10-7] = -(-7) = 7

Medidas muy delicadas, basadas en la conductividad elctrica del agua indican que a 25 grados centgrados, la concentracin de H3O+ y OH- es de 1.00 x 107 M. Se ha comprobado que esta disociacin aumenta ligeramente con la temperatura. Se define pH como el logaritmo decimal cambiado de signo de la concentracin de iones hidrgeno H+ (o iones hidronio H3O+), esto es: (6)

Segn las definiciones anteriores las disoluciones cidas tendrn un pH< 7, las neutras un pH=7 y las bsicas un pH>7. El pH de la solucin de HCl mencionada en (1) ser de 0, ya que esta solucin contena 1 mol de iones hidrgeno por cada litro. Es importante mencionar que la escala de pH, universalmente empleada como medida de la acidez de una solucin, es de carcter logartmico, por lo tanto, la variacin en una unidad de pH equivale a una variacin de 10 veces en la concentracin de iones hidrgeno.

3.- CIDOS ORGNICOS: DISOCIACIN Y PROPIEDADES. SOLUCIONES En qumica orgnica, se denominan cidos orgnicos a aquellas sustancias que poseen al menos un grupo carboxilo (-COOH). R-COOH +H2O R-COO- + H3O+ (8) Los cidos orgnicos se denominan alifticos, si R es una cadena lineal de carbonos y aromticos si R es un anillo de carbonos. Tambin se denominarn di, tri, etc... policarboxlicos, si contienen ms de un grupo carboxilo. El nombre qumico de los cidos se basa en el del alcano o hidrocarburo aromtico correspondiente, anteponindose la palabra


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cido y empleando la terminacin oico. Se admiten numerosos nombres comunes para estas sustancias, por ejemplo, el cido metanoico, presente en muchos insectos, se suele llamar frmico (lat. formica = hormiga) y el cido etanoico se denomina actico (lat. acetum = vinagre). La mayora de los cidos orgnicos, como el actico, son cidos dbiles ya que no se encuentran totalmente disociados en solucin acuosa. Esto significa que al disolver en agua cierta cantidad de cido actico se alcanza un equilibrio estacionario representado por la ecuacin: [H+][A-] / [HA] = Ka

 
Ka = ( c)( c) / (1-)c = (2c)/(1-) pKa = -log Ka Despejando de la ecuacin (9) tenemos: [H+]= Ka [HA ] / [A-] Y tomando logaritmos y cambiando de signo: pH = pKa + log [HA ] / [A-]

donde Ka constituye la constante de ionizacin del cido, la cual debe medirse experimentalmente, mediante la determinacin del pH de soluciones sucesivas del cido. Si llamamos a la fraccin de cido ionizado y c a la concentracin total de cido (ionizado + no ionizado), entonces la concentracin de cido ionizado es c y la de no ionizado ser c c = (1- )c. Sustituyendo en la ecuacin (9) tenemos: (10)

expresin conocida como la ley de dilucin de Ostwald, que nos indica que la fraccin de cido ionizado aumenta al disminuir la concentracin o, en otras palabras, que los cidos dbiles se comportan como si fuesen ms fuertes a concentraciones bajas.

Para entender el comportamiento de los cidos dbiles resulta til el concepto de pKa, que se define como el logaritmo decimal del inverso de la constante de disociacin Ka del cido: (11)

Esta ltima expresin nos indica que a un pH igual al pKa las formas ionizada y noionizada estn a la misma concentracin en equilibrio. O sea, el pKa de un cido es el pH al cual este cido se encuentra semi-ionizado. El concepto de pKa nos proporciona una medida de la fuerza del cido. Los cidos fuertes tendrn valores prximos a 1, mientras que la mayora de los cidos orgnicos tienen valores entre 3 y 5.


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4.- EFECTO ANTIMICROBIANO

Es importante sealar que los cidos ejercen sobre los microorganismos dos tipos de efectos distintos, aunque estrechamente relacionados. En primer lugar, existe un efecto antimicrobiano debido a la acidez en s, esto es, a la bajada del pH extracelular. El segundo tipo, ms importante en la prctica, es el efecto antimicrobiano especfico debido a la forma no disociada. Todos los microorganismos tienen un pH ptimo de crecimiento y un intervalo de pH fuera del cual les resulta imposible proliferar. Esto se refiere al pH del medio o extracelular, ya que el pH intracelular tiene que estar necesariamente cerca de la neutralidad, incluso el de los organismos que crecen mejor a pHs cidos (acidfilos). El mantenimiento de estas condiciones adecuadas de pH se consigue mediante diversos mecanismos de homeostasis (Booth, 1985). Las bacterias entticas, como Escherichia y Salmonella slo crecen a pHs prximos a la neutralidad (neutrfilos). Dada la naturaleza logartmica de la escala de pH, una disminucin de 1 o 2 unidades (equivalente a un aumento de 10 o 100 veces en la concentracin de protones) tienen un efecto drstico sobre la proliferacin de microorganismos. La mayora de las bacterias crecen mal a pHs inferiores a 5, pero este nivel de acidez no garantiza, naturalmente, la esterilidad microbiolgica: muchas bacterias pueden sobrevivir en estas condiciones durante periodos prolongados de tiempo. La figura 1 muestra algunos pHs extracelulares tpicos de ambientes naturales (Madigan et al., Biology of microorganisms, 1997) . Un pH extracelular muy alejado de 7 perturba el gradiente de protones, que es el principal componente de la fuerza proto-motriz, necesaria para los procesos de transporte a travs de la membrana, motilidad y sntesis de ATP acoplada al proceso respiratorio. Adems, el metabolismo anaerbico de bacterias se encuentra regulado por el pH del medio (Booth, 1985). El efecto de la acidificacin del medio depende de la concentracin y fuerza del cido. Por tanto, este tipo de efecto antimicrobiano ocurrir igual con cidos orgnicos que inorgnicos, con la salvedad de que har falta utilizar una cantidad mayor de un cido orgnico (dbil) que de un cido inorgnico (fuerte) para alcanzar el mismo pH.

Si se aade una pequea cantidad de cido a un cierto volumen de agua, se produce una variacin drstica del pH. Esto puede evitarse en gran medida si el agua contiene una solucin amortiguadora o tampn. Una solucin de este tipo est compuesta, generalmente, por un cido fuerte y su base conjugada. Una solucin tampn es capaz de mantener el pH alrededor de un entorno caracterstico. La concentracin a la que se encuentran los componentes del tampn es importante, ya que determina la cantidad de cido (o de base) que se puede aadir externamente sin que se produzca una variacin excesiva del pH. Existen soluciones amortiguadoras con gran importancia biolgica; por ejemplo, la sangre se mantiene en un pH cercano a 7,4 gracias a la presencia de protenas del suero que contienen grupos cidos y bsicos, y tambin gracias al bicarbonato disuelto en sangre, molcula que puede aceptar protones para dar H2CO3 o reaccionar con el OH- dando CO3 2-.

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Figura 1.- pHs extracelulares tpicos de ambientes naturales (Madigan et al., 1997)

 

El efecto antimicrobiano de muchos cidos orgnicos se ejerce a travs de la forma no disociada y este factor tiene mayor importancia que la bajada del pH por s misma. La forma disociada de los cidos, al ser un anin, es altamente polar y por tanto no atraviesa fcilmente la membrana plasmtica de los microorganismos. La forma no disociada del cido, por el contrario, s atraviesa la membrana. Una vez en el interior de la bacteria, el cido puede disociarse y entonces afecta directamente al pH intracelular microbiano (stling y Lindgren, 1993). Esto puede afectar gravemente a su metabolismo, ya que afecta al gradiente de protones y de carga con el exterior, e interfiere con los sistemas de transporte de aminocidos y fosfatos. Adems, muchas enzimas esenciales para el metabolismo microbiano se inactivan a pHs cidos (Bearson et al., 1997) . Otra consecuencia negativa de este proceso se debe al aumento de turgor celular. Al producirse la disociacin del cido en el interior de la clula, la concentracin interna de aniones va aumentar. Esto a su vez, desencadena un mecanismo de compensacin de la carga

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elctrica que obliga a la bacteria a aumentar los niveles de Na+, K+ y/o glutamato, lo que lleva a un incremento mayor de la fuerza inica intracelular y del turgor. Este proceso provoca un gran aumento de la presin mecnica sobre la pared del microorganismo, lo que hace que eventualmente estalle (Foster, 1999). Naturalmente, el efecto inhibitorio debido a la forma no disociada no tiene lugar si la acidificacin se produce utilizando cidos inorgnicos fuertes, por la sencilla razn de que todo el cido se encuentra disociado en disolucin. La mayor o menor actividad inhibitoria de la forma no disociada depende, en primer lugar, de la capacidad de sta para atravesar las membranas plasmtica y exterior de la bacteria, por lo que, en general resultarn ms eficaces molculas de pequeo tamao y carcter hidrofbico. Con todo, este tipo de toxicidad se debe seguramente a otros efectos del anin en el interior de la clula y, por tanto, su toxicidad hay que determinarla empricamente para cada cido orgnico y cada tipo de microorganismo. El cuadro 1 muestra las Concentracin Mnima Inhibitoria (MIC) de algunos cidos orgnicos comnmente empleados. En general, estas concentraciones se encuentran alrededor de 1 mM, muy lejos de las MIC tpicas de los antibiticos, que generalmente son de nivel micromolar (stling y Lindgren, 1993).
Cuadro 1.- Concentracin mnima inhibitoria de cido no disociado (mmol-1) para el crecimiento de enterobacterias (concentracin media a un intervalo de pH entre 4,2-5,4) en condiciones aerobias y anaerobias.

 
Acido lctico Aerbico Anaerbico Enterobacter 7 6 agglomerans Escherichia 7 4 coli Rahnella 7 5 aquatilis Serratia 8 6 fonticola Hafnia alvei 8 7 Salmonella 7 4 typhimorium Yersinia 6 4 enterocolitica Cepa 8 8 7 9 9 6 6 7 3 9 5 4 [AH] = [AH] +[A- ] / (1+10pH-pKa) (14)

Aunque la acidificacin del medio extracelular y el efecto antimicrobiano especfico sean muy diferentes, se encuentran ntimamente relacionados, ya que la concentracin de la forma no disociada de un cido dbil depende, a su vez, del pH del medio; de acuerdo con la ecuacin:


0,9 1,1 0,9 0,9 0,8 0,7

Acido actico Acido frmico Aerbico Anaerbico Aerbico Anaerbico 4 2 0,7 0,7 1,0 1,0 0,8 1,2 0,8 0,5

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que nos indica que la concentracin de la forma no disociada del cido dbil ser mayor a un pH inferior al pKa correspondiente. Esta relacin entre pH y concentracin de la forma no disociada permite disear acidificantes compuestos por dos especies qumicas, por ejemplo, un cido inorgnico, con el objetivo de bajar el pH y un cido orgnico dbil con buen efecto antimicrobiano. Asmismo, es perfectamente posible emplear las sales correspondientes a los cidos orgnicos, ya que al ser compuestos slidos resultan ms fciles de manejar. Para poder evaluar las consecuencias de aadir acidificantes al alimento, hay que tener en cuenta que los cidos orgnicos van a tener un efecto no slo en el pienso en s, sino tambin en el estmago e intestino del animal. Adems, estos efectos no se van a limitar a la inhibicin de microorganismos potencialmente txicos, sino tambin a la flora microbiana del intestino y a la fisiologa del animal. Resulta muy difcil hacer generalizaciones, ya que los efectos pueden ser totalmente distintos al variar el tipo de cido, el pienso sobre el que se aplica y la especie y la edad del animal. En primer lugar, debe considerarse el efecto del acidificante sobre el pienso en s. La bajada del pH ser mayor o menor dependiendo de la capacidad de tamponacin del propio pienso. La mayora de los piensos que se utilizan en la prctica son muy complejos qumicamente y suelen contener sustancias con capacidad de actuar como tampn. En alimentos de origen animal, las molculas ms importantes en este sentido son protenas, fosfatos y el cido lctico, mientras que en alimentos de origen vegetal, stas son los cidos policarboxlicos y, en menor medida, protenas y fosfatos (Fennema, 1993). En definitiva, el efecto de un acidificante sobre el pH del alimento tiene que medirse experimentalmente, siendo necesario ajustar la cantidad de cido en funcin de la capacidad de tamponacin. En general, las leguminosas tienen mayor capacidad amortiguadora del pH que los cereales. Los efectos de un acidificante sobre el alimento del ganado no se limitan a la accin inhibidora de microorganismos, sino que pueden producir otras modificaciones. Por ejemplo, a pHs incluso moderadamente cidos se puede producir la desnaturalizacin de protenas, lo que en general- se traduce en un aumento de la digestibilidad de las mismas (Belitz y Grosch, 1986). Mayor importancia pueden tener los cambios en la palatabilidad y aceptabilidad del alimento, factor que puede fcilmente limitar la mxima concentracin posible de cidos rganicos. Una vez ingeridos, los acidificantes tambin pueden tener efectos en el estmago del animal. Esto es importante en el caso de los lechones recin destetados, ya que los mecanismos de secrecin de HCl para acidificar el estmago an no estn completamente desarrollados, y frecuentemente se produce una ralentizacin del crecimiento. Se ha comprobado experimentalmente que la adicin de acidificantes contribuye a disminuir el pH estomacal y disminuye la incidencia de infecciones por enterobacterias (Fontaine, 1999; Bolduan, 1999). La disminucin del pH estomacal tambin puede afectar a la digestin de protenas, ya que la principal enzima proteoltica del estmago, la pepsina, tiene un pH ptimo acdico. Sin embargo, en la mayora de los casos este efecto tiene una importancia secundaria, puesto que

 

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el grueso de la digestin proteica se produce en el intestino (Roth y Kichgener, 1998). En rumiantes, la adicin de cidos orgnicos afecta a las bacterias del rumen, por lo que los efectos son sumamente complejos y hasta la fecha, muy mal conocidos (Lpez et al.,1999) . Por ltimo, la ingestin de cidos orgnicos va a producir efectos en el intestino del animal, aunque no es fcil que se produzca una bajada del pH en este rgano. Puede pensarse en un cierto efecto de proteccin frente a enterobacterias patgenas, mientras que la flora beneficiosa, rica en bacterias lcticas, se ver poco afectada. De hecho, los monogstricos includo el humano- mantienen poblaciones bacterianas muy bajas en el intestino delgado, gracias a mecanismos naturales de defensa, en particular, a la secrecin de protenas antibacterianas (defensinas) por el epitelio intestinal. El posible sinergismo entre cidos orgnicos y protenas antibacterianas constituye una interesante rea de investigacin para el futuro. Por ltimo, la mayora de los cidos orgnicos son metabolizables y contribuyen a la energa bruta del alimento. En algunas ocasiones se ha encontrado que la combinacin de cidos orgnicos resulta ms efectiva que la suma de los efectos de ambos por separado (Plnen et al., 1997). Una explicacin posible se asocia a la combinacin acidificante-antibacteriano antes mencionada. En otros casos, la explicacin al sinergismo requerir un mejor conocimiento del mecanismo de accin de los cidos.

 

5.- MECANISMOS DE DEFENSA EN MICROORGANISMOS A LOS ACIDOS Las bacterias experimentan diferentes tipos de estrs en su vida diaria, a los cuales deben adaptarse. Por ejemplo, una bacteria entrica tendr que sobrevivir al pH extremadamente bajo del estmago y a la accin antibacteriana de los cidos grasos de cadena corta presentes en el intestino. Un patgeno intracelular, como Salmonella, tendr ademsque tolerar episodios de bajo pH cuando se encuentre en el interior del fago-lisosoma del macrfago. El fenmeno de tolerancia inducida a estrs acdico fue descubierto inicialmente en Escherichia y Salmonella, pero se ha generalizado despus a muchas otras bacterias Gram (-) y Gram (+). El hecho fundamental de este mecanismo de adaptacin estriba en que el crecimiento a un pH moderadamente acdico induce la sntesis de protenas especficas, las cuales protegen a las clulas a pHs extremadamente cidos. Existen diferentes sistemas implicados, dependiendo de la fase de crecimiento, medio de cultivo y tipo de estrs acdico (Slonczwski y Foster, 1996). Tal como poda esperarse, la respuesta a los cidos inorgnicos (efecto de pH) es distinta e independiente de la desencadenada por cidos orgnicos (efecto de la forma no disociada). Nuestro conocimiento de los mecanismos de adaptacin a estrs acdico es an muy incompleto, aunque ha habido un considerable progreso en los ltimos aos en las enterobactericeas. La bajada del pH extracelular acaba provocando una disminucin del pH intracelular. Esto es debido a la difusin pasiva de los protones, a pesar de que la membrana

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Figura 2.- Reacciones de decarboxilacin de aminocidos asociadas al estrs acdico

 
6.- REFERENCIAS BEARSON, S. et al. (1997) FEMS Microbiology Letters, 147: 173-180. BELITZ, H.D. y GROSCH W. (1986) Food Chemistry, Springer-Verlag. BOLDUAN, G. (1999) Feed Tech. 3: 4. BOOTH, I.R. (1985) Microbiological Reviews, 49: 359-378. FENNEMA, O.R. (1993) Qumica de los alimentos. Ed. Acribia.

Adems, la bajada del pH interno produce la acumulacin de dos importantes protenas reguladoras: RpoS y PhoP. Estos reguladores controlan distintos conjuntos de genes que estn implicados en la proteccin y reparacin de macromolculas. Asmismo, en Salmonella typhimurium se ha descrito un mecanismo fisiolgico de adaptacin a la accin antimicrobiana de cidos grasos de cadena corta y esta resistencia inducida se ve reforzada en condiciones de anaerobiosis, pH cido y exposicin prolongada a dichos cidos (Kwon y Ricke, 1998).

plasmtica de la clula es bastante impermeable a estas molculas. La bajada del pH intracelular activa la expresin de genes que codifican descarboxilasas de aminocidos y estas enzimas pueden elevar el pH interno, ya que catalizan reacciones en las que se consumen protones. Se han descrito 3 reacciones de descarboxilacin asociadas a este fenmeno: el paso de glutamato a GABA, el de arginina a agmatina y el de lisina a cadaverina (figura 2). En todos los casos se consume un protn por cada molcula de aminocido. Los nuevos productos as formados se intercambian por un nuevo sustrato mediante mecanismos de tipo anti-porte. Naturalmente, este mecanismo resulta caro para la clula desde el punto de vista energtico.

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FONTAINE, J. (1994) Feed Mix, 2: 3. FOSTER, J.W. (1999) Current Opinion in Microbiology, 2: 170-174. KWON, Y.M. y RICKE, S.C. (1998) Applied and Enviromental Microbiology, 64: 34583463. LPEZ, S. et al. (1999) Br. J. Nutr., 81: 59-64. MADIGAN, M.T. et al. (1997) Brock Biology of Microorganisms. Prentice Hall International Inc. STLING, C.E. y LINDGREN, S.E. (1993) J. Appl. Bacteriology, 75: 18-24. PLNEN, I. et al. (1997) Anim. Feed Sci. Techn. 71: 197-202. ROTH, F.X. y KICHGENER, M. (1998) J. Anim. Feed Sci., 7: 25-33. SLONCZEWSKI, J.L. y FOSTER, J.W. (1987) En: Escherichia Coli and Salmonella Typhimorium, Cellular and Molecular Biology, Ingraham J.L. et al., American Society for Microbiology, captulo 96, 1539-1549.