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Mtodo analtico por el que se mide la emisin de mltiples fluorescencias y la dispersin de luz (light scatter) de clulas o partculas microscpicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente lquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad (hasta miles de clulas/segundo) frente a un haz de luz lser de longitud de onda adecuada
QUE SE PUEDE ANALIZAR POR CITOMETRIA QUE SE PUEDE ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO? DE FLUJO?
Protenas extracelulares Secuencias de ADN o ARN libres Complejos inmunes circulantes Viriones individuales Liposomas Cromosomas aislados Orgnulos aislados Ncleos aislados Bacterias Hongos unicelulares Clulas humanas y animales Protoplastos vegetales Hibridomas y fusiones celulares Esferoides Organismos pluricelulares
QUE PARAMETROS SE PUEDEN ANALIZAR QUE PARAMETROS SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO? POR CITOMETRIA DE FLUJO?
Parmetros Nucleares
Enzimas Proteinas
Pared celular
Molculas de superficie
Proteinas Enzimas
Molculas de superficie
Enzimas
Parmetros de Superficie
Parmetros Citoplasmticos
Proteinas secretadas
Extracellular Parameters
PARAMETROS NUCLEARES QUE SE PUEDEN PARAMETROS NUCLEARES QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
Parmetros nucleares
PARAMETROS CITOPLASMATICOS QUE SE PARAMETROS CITOPLASMATICOS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
1. Componentes intracelulares: 1. Componentes intracelulares: - -Contenido en protenas totales Contenido en protenas totales - -Protenas estructurales Protenas estructurales - -Protenas funcionales Protenas funcionales - -Glicoconjugados intracelulares Glicoconjugados intracelulares - -Lpidos intracelulares Lpidos intracelulares - -GSH yytioles libres GSH tioles libres
1. Parmetros basados en ADN: 1. Parmetros basados en ADN: - -Contenido de ADN Contenido de ADN - -Contenido en pares GC/AT Contenido en pares GC/AT - -Superenrrollamiento de ADN Superenrrollamiento de ADN - -Estructura de la cromatina Estructura de la cromatina - -Roturas de hebras de ADN Roturas de hebras de ADN
Parmetros citoplasmticos
Nucleus
2. ADN+otros parmetros: 2. ADN+otros parmetros: - -ADN/ARN ADN/ARN - -ADN/Proteinas totales ADN/Proteinas totales - -ADN/Proteinas totales ADN/Proteinas totales - -ADN/Antgenos Nucleares ADN/Antgenos Nucleares - -ADN/Antigenos celulares ADN/Antigenos celulares
Ciclo celular
Expresin gnica
Apoptosis/Necrosis
Regulacin del ciclo celular Compartimentos del ciclo Ciclo celular de Cariocinesis poblaciones especficas Intercalado de frmacos
3. Parmetros no 3. Parmetros no basados en ADN: basados en ADN: - -Receptores nucleares Receptores nucleares - -Expresin de genes Expresin de genes indicadores (Reporters) indicadores (Reporters) - -Morfologa nuclear Morfologa nuclear - -Componentes nucleares Componentes nucleares Accin de hormonas
2. Funciones intracelulares: 2. Funciones intracelulares: - -Enzyme activities Enzyme activities - -Protein synthesis Protein synthesis - -Membrane potentials Membrane potentials
3. Entorno intracelular: 3. Entorno intracelular: - -Concentratin de iones Concentratin de iones - -Movimientos inicos Movimientos inicos - -Generacin de ROS Generacin de ROS - -Lpidos yyprotenas oxidados Lpidos protenas oxidados Lesin y Muerte celular
Adaptacin celular
PARAMETROS DE SUPERFICIE QUE SE PUEDEN PARAMETROS DE SUPERFICIE QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
1. Estructuras de la 1. Estructuras de la superficie celular: superficie celular: - -Antgenos Antgenos - -Glicoconjugados Glicoconjugados - -Carga de superficie Carga de superficie - -Pared celular Pared celular Adhesin celular
PARAMETROS EXTRACELULARES QUE SE PARAMETROS EXTRACELULARES QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
Parmetros Extracelulares
Receptors
Parmetros de Superficie
Diferenciacin celular
2. Dinmica de la superficie celular: 2. Dinmica de la superficie celular: - -Unin de ligandos Unin de ligandos - -Transporte/internalizacin de ligandos Transporte/internalizacin de ligandos - -Eflujo de solutos Eflujo de solutos - -Exposicin de receptores Exposicin de receptores - -Potencial de membrana Potencial de membrana
Dinmica de la secrecin celular: Dinmica de la secrecin celular: - -Captura de protenas secretadas Captura de protenas secretadas - -Ensayos multiplexados en suero Ensayos multiplexados en suero
Surface molecules
Activacin celular
Reciclaje de membrana
PARAMETER SELECTION PARAMETER SELECTION GATE DEFINITION GATE DEFINITION DATA DISPLAY AND STORING DATA DISPLAY AND STORING
SIGNAL COLLECTION SIGNAL COLLECTION SIGNAL AMPLIFICATION SIGNAL AMPLIFICATION PULSE PROCESSING PULSE PROCESSING
PHOTOMULTIPLIERS
FCS 2.0 FORMAT FILES LIST MODE FILES: NON-CORRELATED DATA MATRIX DOTPLOTS HISTOGRAMS KINETIC PLOTS AUTOMATED DATA STATISTICS AND REPORTS
FILTER ASSEMBLY
SAMPLE IN
LASER
FLOW CHAMBER
+
SORTING SORTING
EJEMPLOS DE CITOMETROS DE FLUJO EJEMPLOS DE CITOMETROS DE FLUJO A LO LARGO DE LA HISTORIA A LO LARGO DE LA HISTORIA
EPICS PROFILE EPICS XL FACSCan
FACSCalibur
LSR
Cytoron
PAS
CyFlow
Bryte
QU ES FLUORESCENCIA? QU ES FLUORESCENCIA?
Un fotn de energa hEX es absorbido Un fotn de energa hEX es absorbido por la molcula fluorescente, creando un por la molcula fluorescente, creando un estado excitado con un electrn en estado excitado con un electrn en singlete (S1'). singlete (S1').
2 2
El estado excitado tiene una duracin El estado excitado tiene una duracin de 110 10-9 segundos de 110 10-9 segundos
Un fotn de energa hEM es emitido, Un fotn de energa hEM es emitido, para devolver la molcula fluorescente para devolver la molcula fluorescente aasu estado basal S0. su estado basal S0.
3 3
COMPLEJIDAD
EJEMPLOS DE ESPECTROS DE ABSORCION EJEMPLOS DE ESPECTROS DE ABSORCION Y EMISION DE FLUOROCROMOS COMUNES Y EMISION DE FLUOROCROMOS COMUNES
Argn 488nm He-Ne 630nm
PROPIEDADES BIOLOGICAS DE LOS PROPIEDADES BIOLOGICAS DE LOS MARCADORES FLUORESCENTES MARCADORES FLUORESCENTES
CLASIFICACION FUNCIONAL DE LOS CLASIFICACION FUNCIONAL DE LOS MARCADORES FLUORESCENTES MARCADORES FLUORESCENTES
REACTIVIDAD CON GRUPOS QUIMICOS UNION NO COVALENTE A ESTRUCTURAS INTERACCION CON IONES O RADICALES SUSCEPTIBILIDAD A REACCIONES ENZIMATICAS PERMEABILIDAD Y RETENCION A TRAVES DE MEMBRANA
MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL INDICADORES Y QUELANTES DE IONES SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES
ANTICUERPOS CONJUGADOS CON FLUOROCROMOS REACTIVOS DE GRUPOS TIOL (SH-) REACTIVOS DE GRUPOS AMINO (NH2-) REACTIVOS DE BASES NITROGENADAS LECTINAS CONGUJADAS CON FLUOROCROMOS MARCADORES DE ACIDOS NUCLEICOS MARCADORES DE LIPIDOS LIGANDOS FLUORESCENTES DE RECEPTORES
SUSTRATOS DE ENZIMAS OXIDATIVOS SUSTRATOS DE ENZIMAS REDUCTIVOS SUSTRATOS DE ENZIMAS DE TRANSFERENCIA SUSTRATOS DE P-GLICOPROTEINA ANALOGOS FLUORESCENTES DE BIOMOLECULAS
PROTEINAS CONJUGADAS CON FLUORESCENCIA DEXTRANOS CONJUGADOS CON FLUORESCENCIA ESFERAS DE EMISION AMPLIA DE FLUORESCENCIA ESFERAS CON FLUORESCENCIA ESPECIFICA ESFERAS FLUORESCENTES CALIBRADAS ESFERAS RECUBIERTAS DE ANTICUERPO
DIAGNOSTICO BASADO EN EL ANALISIS CELULAR PRONOSTICO BASADO EN EL ANALISIS CELULAR EVALUACION Y MONITORIZACION DE TRATAMIENTO
APLICACION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN APLICACION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR EL ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR
DETECCION DE LESION CELULAR SUBLETAL: Cambios en parmetros estructurales Changes in functional parameters CUANTIFICACION DE LA VIABILIDAD CELULAR: Determinacin de efectos citotxicos globales Control de calidad de las preparaciones celulares CARACTERIZACION DE LOS MECANISMOS DE MUERTE CELULAR: Identificacin y anlisis de clulas apoptticas Identificacin de clulas necrticas
ANALISIS DE LA MUERTE CELULAR EN EL ANALISIS DE LA MUERTE CELULAR EN EL SISTEMA INMUNITARIO SISTEMA INMUNITARIO
Anlisis de clulas efectoras citolticas: Identificacin fenotpica de subpoblaciones CD8 y NK Anlisis de la citotoxicidad mediada por clulas: Anlisis de la interaccin entre clulas efectoras y dianas Anlisis de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos: Monitorizacin de la terapia con anticuerpos monoclonales Anlisis del proceso y mecanismo de muerte celular: Identificacin y cuantificacin de clulas apoptticas Identificacin y cuantificacin de clulas necrticas Anlisis de parmetros celulares durante la apoptosis
APLICACIONES GENERALES DE LA APLICACIONES GENERALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN INVESTIGACION CITOMETRIA DE FLUJO EN INVESTIGACION BASICA BASICA
Integracin de respuestas y mecanismos Anlisis multiparamtrico Resolucin de heterogeneidad celular Anlisis de gran nmero de clulas
Anlisis secuencial
SISTEMAS ESPECIALES DE CITOMETRIA PARA SISTEMAS ESPECIALES DE CITOMETRIA PARA EL ANALISIS MEDIOAMBIENTAL EL ANALISIS MEDIOAMBIENTAL
Placas cargadas
Clulas separadas
EJEMPLOS DE CELL SORTERS EJEMPLOS DE CELL SORTERS A LO LARGO DE LA HISTORIA A LO LARGO DE LA HISTORIA
EPICS V EPICS CS EPICS ELITE
MoFlo
FACS Vantage
EJEMPLOS DE OBTENCION Y ANALISIS DE EJEMPLOS DE OBTENCION Y ANALISIS DE DATOS EN CITOMETRIA DE FLUJO DATOS EN CITOMETRIA DE FLUJO
RECUENTO ABSOLUTO DE LINFOCITOS CD4 RECUENTO ABSOLUTO DE LINFOCITOS CD4 CON ESFERAS DE CONCENTRACION CALIBRADA CON ESFERAS DE CONCENTRACION CALIBRADA
DETECCION Y CUANTIFICACION ABSOLUTA DETECCION Y CUANTIFICACION ABSOLUTA DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS CD34++ DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS CD34
CD69
CD69
BASAL
+ CD3/CD28
Plaquetas
ADP ADP
A23187 A23187
A23187 A23187
Basal Basal
F
Basal Basal ADP ADP
Basal Basal
ANALISIS DE LA ACTIVIDAD DEL ANALISIS DE LA ACTIVIDAD DEL TRANSPORTADOR Na++/H+ EN LEUCOCITOS TRANSPORTADOR Na /H+ EN LEUCOCITOS
WBC
A
RBC
WBC
Granulocitos
WBC
C
Granulocitos Granulocitos Monocitos
Lymphocytes
D E
Monocitos Monocitos Linfocitos Morfologa leucocitaria y seleccin de linfocitos Seleccin de poblaciones: clulas T (CD3) Seleccin de clulas T: TC (CD8+)/TH (CD8-) Control de activacin: CD69 Linfocitos
IgG2bPE
Leucocitos Leucocitos
Linfocitos Linfocitos
Monocitos Monocitos
Granulocitos Granulocitos
AVANCES EN LAS APLICACIONES AVANCES EN LAS APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
AVANCES EN LAS APLICACIONES DE VALOR AVANCES EN LAS APLICACIONES DE VALOR PRONOSTICO O PREDICTIVO PRONOSTICO O PREDICTIVO
1. ESTABLECIMIENTO DE CONSENSOS METODOLOGICOS : Inmunofenotipo de leucemias y linfomas Ploida de DNA e ndice de proliferacin en tumores slidos Deteccin y cuantificacin de activacin de plaquetas Anlisis del fenotipo MDR 2. ESTABLECIMIENTO DE CONTROLES DE CALIDAD: Inmunofenotipo de superficie Ploida de DNA e indice de proliferacin en tumores slidos Cuantificacin de clulas CD34+ 3. VALOR PRONOSTICO/PREDICTIVO DE LA CITOMETRIA: Inmunofenotipo en leucemias y linfomas Ploida de DNA e ndice de proliferacin en algunos tumores Expresin de genes relacionados con apoptosis en neoplasias Expresin de protenas reguladoras del ciclo celular en neoplasias Indice de madurez reticulocitaria en hematopoyesis
AVANCES EN EL ANALISIS DE LA LESION Y AVANCES EN EL ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR MUERTE CELULAR
1. AVANCES EN EL ESTUDIO FUNCIONAL CELULAR: Desarrollo de tcnicas para la cuantificacin de sustratos Desarrollo de tcnicas de citoenzimologa de flujo Desarrollo de mtodos de activacin celular in vitro 2. AVANCES EN EL ESTUDIO DE LA MUERTE CELULAR: Desarrollo de tcnicas de deteccin y cuantificacin de apoptosis Desarrollo de mtodos para el estudio de los mecanismos moleculares de la apoptosis Establecimiento del valor predictivo/pronstico de la apoptosis en neoplasias e inmunodeficiencias Establecimiento del valor predictivo/pronstico de la apoptosis en la respuesta a la teraputica