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QUE ES LA CITOMETRIA DE FLUJO? QUE ES LA CITOMETRIA DE FLUJO?

Mtodo analtico por el que se mide la emisin de mltiples fluorescencias y la dispersin de luz (light scatter) de clulas o partculas microscpicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente lquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad (hasta miles de clulas/segundo) frente a un haz de luz lser de longitud de onda adecuada

INTRODUCCION A LA CITOMETRIA DE FLUJO INTRODUCCION A LA CITOMETRIA DE FLUJO

QUE SE PUEDE ANALIZAR POR CITOMETRIA QUE SE PUEDE ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO? DE FLUJO?
Protenas extracelulares Secuencias de ADN o ARN libres Complejos inmunes circulantes Viriones individuales Liposomas Cromosomas aislados Orgnulos aislados Ncleos aislados Bacterias Hongos unicelulares Clulas humanas y animales Protoplastos vegetales Hibridomas y fusiones celulares Esferoides Organismos pluricelulares

QUE PARAMETROS SE PUEDEN ANALIZAR QUE PARAMETROS SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO? POR CITOMETRIA DE FLUJO?
Parmetros Nucleares
Enzimas Proteinas

Pared celular

Molculas de superficie
Proteinas Enzimas

Molculas de superficie

Enzimas

Parmetros de Superficie

Parmetros Citoplasmticos
Proteinas secretadas

Extracellular Parameters

PARAMETROS NUCLEARES QUE SE PUEDEN PARAMETROS NUCLEARES QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
Parmetros nucleares

PARAMETROS CITOPLASMATICOS QUE SE PARAMETROS CITOPLASMATICOS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
1. Componentes intracelulares: 1. Componentes intracelulares: - -Contenido en protenas totales Contenido en protenas totales - -Protenas estructurales Protenas estructurales - -Protenas funcionales Protenas funcionales - -Glicoconjugados intracelulares Glicoconjugados intracelulares - -Lpidos intracelulares Lpidos intracelulares - -GSH yytioles libres GSH tioles libres

1. Parmetros basados en ADN: 1. Parmetros basados en ADN: - -Contenido de ADN Contenido de ADN - -Contenido en pares GC/AT Contenido en pares GC/AT - -Superenrrollamiento de ADN Superenrrollamiento de ADN - -Estructura de la cromatina Estructura de la cromatina - -Roturas de hebras de ADN Roturas de hebras de ADN

Parmetros citoplasmticos

Nucleus
2. ADN+otros parmetros: 2. ADN+otros parmetros: - -ADN/ARN ADN/ARN - -ADN/Proteinas totales ADN/Proteinas totales - -ADN/Proteinas totales ADN/Proteinas totales - -ADN/Antgenos Nucleares ADN/Antgenos Nucleares - -ADN/Antigenos celulares ADN/Antigenos celulares

Ploida de ADN Cariotipo en flujo

Ciclo celular

Expresin gnica

Apoptosis/Necrosis

Regulacin del ciclo celular Compartimentos del ciclo Ciclo celular de Cariocinesis poblaciones especficas Intercalado de frmacos

3. Parmetros no 3. Parmetros no basados en ADN: basados en ADN: - -Receptores nucleares Receptores nucleares - -Expresin de genes Expresin de genes indicadores (Reporters) indicadores (Reporters) - -Morfologa nuclear Morfologa nuclear - -Componentes nucleares Componentes nucleares Accin de hormonas

Metabolismo celular y Energtica Procesos de Biosntesis Procesos degradativos

2. Funciones intracelulares: 2. Funciones intracelulares: - -Enzyme activities Enzyme activities - -Protein synthesis Protein synthesis - -Membrane potentials Membrane potentials

3. Entorno intracelular: 3. Entorno intracelular: - -Concentratin de iones Concentratin de iones - -Movimientos inicos Movimientos inicos - -Generacin de ROS Generacin de ROS - -Lpidos yyprotenas oxidados Lpidos protenas oxidados Lesin y Muerte celular

Transduccin Estrs celular de seal

Adaptacin celular

PARAMETROS DE SUPERFICIE QUE SE PUEDEN PARAMETROS DE SUPERFICIE QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
1. Estructuras de la 1. Estructuras de la superficie celular: superficie celular: - -Antgenos Antgenos - -Glicoconjugados Glicoconjugados - -Carga de superficie Carga de superficie - -Pared celular Pared celular Adhesin celular

PARAMETROS EXTRACELULARES QUE SE PARAMETROS EXTRACELULARES QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
Parmetros Extracelulares
Receptors

Parmetros de Superficie

Diferenciacin celular

Interacciones clula-clula Accin de frmacos Resistencia a frmacos

2. Dinmica de la superficie celular: 2. Dinmica de la superficie celular: - -Unin de ligandos Unin de ligandos - -Transporte/internalizacin de ligandos Transporte/internalizacin de ligandos - -Eflujo de solutos Eflujo de solutos - -Exposicin de receptores Exposicin de receptores - -Potencial de membrana Potencial de membrana

Dinmica de la secrecin celular: Dinmica de la secrecin celular: - -Captura de protenas secretadas Captura de protenas secretadas - -Ensayos multiplexados en suero Ensayos multiplexados en suero

Surface molecules

Activacin celular Diferenciacin celular

Interaccin con otras clulas

Activacin celular

Reciclaje de membrana

Lesin celular y muerte celular

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

Inyeccin de la muestra y cmara de flujo

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

Emisin de fluorescencia y bancada ptica

Amplificacin de las seales de fluorescencia

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

Eliminacin de seales no deseadas: Discriminador

Cuantificacin de las seales: Convertidor analgico-digital

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

Clasificacin de las seales: Histograma de frecuencias

Presentacin de datos: Dot-plots y proyecciones

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO? CMO FUNCIONA UN CITMETRO DE FLUJO?

Acotamiento de subpoblaciones de inters: gating

Generacin de resultados: Dot-plots mltiples

INSTRUMENT INSTRUMENT CONTROL CONTROL

CYTOSETTINGS SORT SETTINGS

ESQUEMA DE UN SISTEMA DE CITOMETRIA ESQUEMA DE UN SISTEMA DE CITOMETRIA

PARAMETER SELECTION PARAMETER SELECTION GATE DEFINITION GATE DEFINITION DATA DISPLAY AND STORING DATA DISPLAY AND STORING

DIGITALIZED SIGNALS INTENSITY-CLASSIFIED DATA

REAL-TIME REAL-TIME DATA ACQUISITION DATA ACQUISITION

INTERFACED COMPUTER WITH CYTOMETER SOFTWARE

SIGNAL COLLECTION SIGNAL COLLECTION SIGNAL AMPLIFICATION SIGNAL AMPLIFICATION PULSE PROCESSING PULSE PROCESSING

PHOTOMULTIPLIERS

FCS 2.0 FORMAT FILES LIST MODE FILES: NON-CORRELATED DATA MATRIX DOTPLOTS HISTOGRAMS KINETIC PLOTS AUTOMATED DATA STATISTICS AND REPORTS

FILTER ASSEMBLY

SAMPLE IN
LASER

FLUORESCENCE COLLECTING LENS

FLOW CHAMBER

OFF-LINE ANALYSIS OFF-LINE ANALYSIS


FORWARD SCATTER DETECTOR NON-INTERFACED COMPUTER WITH STAND ALONE OR THIRD-PARTY SOFTWARE

+
SORTING SORTING

EJEMPLOS DE CITOMETROS DE FLUJO EJEMPLOS DE CITOMETROS DE FLUJO A LO LARGO DE LA HISTORIA A LO LARGO DE LA HISTORIA
EPICS PROFILE EPICS XL FACSCan

FACSCalibur

LSR

Cytoron

PAS

CyFlow

Bryte

FLUOROCROMOS Y MARCADORES FLUOROCROMOS Y MARCADORES FLUORESCENTES FLUORESCENTES 1 1

QU ES FLUORESCENCIA? QU ES FLUORESCENCIA?
Un fotn de energa hEX es absorbido Un fotn de energa hEX es absorbido por la molcula fluorescente, creando un por la molcula fluorescente, creando un estado excitado con un electrn en estado excitado con un electrn en singlete (S1'). singlete (S1').

2 2

El estado excitado tiene una duracin El estado excitado tiene una duracin de 110 10-9 segundos de 110 10-9 segundos

Un fotn de energa hEM es emitido, Un fotn de energa hEM es emitido, para devolver la molcula fluorescente para devolver la molcula fluorescente aasu estado basal S0. su estado basal S0.

3 3

CONCEPTOS ESENCIALES EN CONCEPTOS ESENCIALES EN FLUORESCENCIA FLUORESCENCIA


Fluorocromo: Molcula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energa (mayor longitud de onda). Fluorforo: Parte del fluorocromo responsable de la emisin de fluorescencia. Marcador fluorescente o sonda fluorescente: Fluorocromo diseado para unirse a una regin especfica de una muestra biolgica o responder a un determinado estmulo. Longitud de onda de excitacin: Longitud de onda a la que un fluorocromo puede absorber fotones. Longitud de onda de emisin: Longitud de onda a la que un fluorocromo emite fotones de fluorescencia. Desplazamiento de Stokes: Separacin entre las longitudes de onda de absorcin y de emisin en un fluorocromo. Rendimiento cuntico: cociente entre el nmero de fotones de fluorescencia emitidos y el nmero de fotones absorbidos

RELACION ESTRUCTURA/FLUORESCENCIA RELACION ESTRUCTURA/FLUORESCENCIA

COMPLEJIDAD

LONGITUD DE ONDA DE EXCITACIN

EJEMPLOS DE ESPECTROS DE ABSORCION EJEMPLOS DE ESPECTROS DE ABSORCION Y EMISION DE FLUOROCROMOS COMUNES Y EMISION DE FLUOROCROMOS COMUNES
Argn 488nm He-Ne 630nm

FLUORESCENCE ENERGY TRANSFER FLUORESCENCE ENERGY TRANSFER

PE-Cy5 Conjugado ECD Propidio Etidio PE = RD1 FITC Indo 1; DAPI

PROPIEDADES BIOLOGICAS DE LOS PROPIEDADES BIOLOGICAS DE LOS MARCADORES FLUORESCENTES MARCADORES FLUORESCENTES

CLASIFICACION FUNCIONAL DE LOS CLASIFICACION FUNCIONAL DE LOS MARCADORES FLUORESCENTES MARCADORES FLUORESCENTES

REACTIVIDAD CON GRUPOS QUIMICOS UNION NO COVALENTE A ESTRUCTURAS INTERACCION CON IONES O RADICALES SUSCEPTIBILIDAD A REACCIONES ENZIMATICAS PERMEABILIDAD Y RETENCION A TRAVES DE MEMBRANA

MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL INDICADORES Y QUELANTES DE IONES SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES

MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA

MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL ESTRUCTURAL

ANTICUERPOS CONJUGADOS CON FLUOROCROMOS REACTIVOS DE GRUPOS TIOL (SH-) REACTIVOS DE GRUPOS AMINO (NH2-) REACTIVOS DE BASES NITROGENADAS LECTINAS CONGUJADAS CON FLUOROCROMOS MARCADORES DE ACIDOS NUCLEICOS MARCADORES DE LIPIDOS LIGANDOS FLUORESCENTES DE RECEPTORES

INDICADORES Y QUELANTES INDICADORES Y QUELANTES

SUSTRATOS DE ENZIMAS Y SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES TRANSPORTADORES


SUSTRATOS DE ENZIMAS HIDROLITICOS

INDICADORES DE pH QUELANTES DE CATIONES SENSORES DE POTENCIAL DE MEMBRANA SENSORES DE ESTRS OXIDATIVO

SUSTRATOS DE ENZIMAS OXIDATIVOS SUSTRATOS DE ENZIMAS REDUCTIVOS SUSTRATOS DE ENZIMAS DE TRANSFERENCIA SUSTRATOS DE P-GLICOPROTEINA ANALOGOS FLUORESCENTES DE BIOMOLECULAS

MACROMOLECULAS Y POLIMEROS MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS SINTETICOS

FLUOROCROMOS INTRACELULARES FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES NATURALES


NUCLEOTIDOS DE NICOTINA REDUCIDOS (NADH, NADPH) NUCLEOTIDOS DE FLAVINA OXIDADOS (FMN; FAD) CLOROFILAS FICOBILIPROTEINAS PROTEINAS FLUORESCENTES (GFP)

PROTEINAS CONJUGADAS CON FLUORESCENCIA DEXTRANOS CONJUGADOS CON FLUORESCENCIA ESFERAS DE EMISION AMPLIA DE FLUORESCENCIA ESFERAS CON FLUORESCENCIA ESPECIFICA ESFERAS FLUORESCENTES CALIBRADAS ESFERAS RECUBIERTAS DE ANTICUERPO

APLICACIONES CLINICAS GENERALES APLICACIONES CLINICAS GENERALES

DIAGNOSTICO BASADO EN EL ANALISIS CELULAR PRONOSTICO BASADO EN EL ANALISIS CELULAR EVALUACION Y MONITORIZACION DE TRATAMIENTO

APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO DE FLUJO

ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR

APLICACIONES DIAGNOSTICAS DE LA APLICACIONES DIAGNOSTICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO CITOMETRIA DE FLUJO

IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE CELULAS NORMALES CELULAS NORMALES


PARAMETROS ESTRUCTURALES: Tamao Complejidad ANTIGENOS DE SUPERFICIE: Identidad Linaje Funcin Activacin ADN, ARN Y PARAMETROS RELACIONADOS: Ploida Estado proliferativo Estado de maduracin Expresin gnica BIOQUIMICA INTRACELULAR: Condiciones basales Respuesta bioqumica a estmulos controlados

CARACTERIZACION DE LAS CELULAS NORMALES IDENTIFICACION Y DETECCION DE CELULAS ANORMALES

IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE CELULAS ANORMALES CELULAS ANORMALES


ALTERACIONES EN LA MORFOLOGIA CELULAR: Cambios en tamao Cambios en granularidad ALTERACIONES EN EL INMUNOFENOTIPO: Inmunoproliferacin/ Inmunodeficiencia Inmunodisfuncin ALTERACIONES EN EL GENOTIPO: Cambios en el contenido de ADN (ploida) Cambios en la expresin de genes ALTERACIONES EN LA BIOQUIMICA INTRACELULAR: Cambios en la sntesis y concentracin de molculas Cambios en la actividad de enzimas y en el flujo a travs de rutas Alteraciones en el nmero y la funcin de orgnulos subcelulares Cambios en la respuesta bioqumica a estmulos controlados DETECCION DE CELULAS INFRECUENTES (CELULAS RARAS) Deteccin de clulas tumorales circulantes Deteccin de clulas fetales en sangre materna Deteccin de clulas activadas o antgeno-especficas circulantes

APLICACIONES PRONOSTICAS DE LA APLICACIONES PRONOSTICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO CITOMETRIA DE FLUJO


CORRELACION DE PARAMETROS CITOMETRICOS CON OTROS PARAMETROS CLINICOS BIEN ESTABLECIDO: Estudios retrospectivos con material de archivo Estudios prospectivos PARAMETROS IMPLICADOS DIRECTAMENTE EN EL PROCESO PATOLOGICO: Anlisis de muestras especficas de la patologa Anlisis de parmetros especficos de la patologa PARAMETROS IMPLICADOS INDIRECTAMENTE EN EL PROCESO PATOLOGICO : Anlisis de muestras indicadoras (reporter) Anlisis de parmetros indicadores de la patologa (pathology-reporter) Anlisis de parmetros predictivos de riesgo

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN LA TERAPEUTICA EN LA TERAPEUTICA


SELECCION DE CELULAS EN LA TERAPIA CELULAR: Anlisis de progenitores en el transplante autlogo Pruebas cruzadas (cross-match) en transplantes heterlogos Deteccin y cuantificacin de leucocitos residuales en hemopreparados ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL CELULAR: Cambios en parmetros estructurales Cambios en parmetros funcionales ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL DEL PACIENTE : Deteccin de recidivas y enfermedad mnima residual Establecimiento de patrones pronsticos de xito teraputico DETECCION Y ANALISIS DE RESISTENCIA A LA TERAPIA: Anlisis de la captacin y retencin de frmacos (fenotipo MDR) Anlisis del metabolismo de frmacos

APLICACION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN APLICACION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR EL ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR
DETECCION DE LESION CELULAR SUBLETAL: Cambios en parmetros estructurales Changes in functional parameters CUANTIFICACION DE LA VIABILIDAD CELULAR: Determinacin de efectos citotxicos globales Control de calidad de las preparaciones celulares CARACTERIZACION DE LOS MECANISMOS DE MUERTE CELULAR: Identificacin y anlisis de clulas apoptticas Identificacin de clulas necrticas

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN INMUNOAPLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN INMUNOHEMATOLOGIA HEMATOLOGIA

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN INMUNOAPLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN INMUNOHEMATOLOGIA HEMATOLOGIA


ANALISIS DE ANTIGENOS: Inmunofenotipo de superficie Deteccin de antgenos intracelulares Deteccin de antgenos circulantes ANALISIS DE ANTICUERPOS: Deteccin de anticuerpos circulantes Deteccin de anticuerpos unidos a clulas ANALISIS DE LA FUNCION CELULAR: Anlisis de la proliferacin celular Anlisis de la bioqumica intracelular Anlisis de la muerte celular

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE


Identificacin de subpoblaciones celulares mediante anticuerpos monoclonales de especificidad conocida Sistema CD: Clasificacin de grupos de anticuerpos (Clusters of Differentiation) que reconocen los mismos antgenos en los mismos tipos celulares Proporciona informacin sobre: Linaje celular Estado de maduracin hematopoytica Implicacin en la respuesta inmunitaria Grado de activacin celular

INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE INMUNOFENOTIPO DE SUPERFICIE


Identificacin de subpoblaciones celulares en la hematopoyesis Diagnstico y clasificacin de enfermedades hematolgicas: Leucemias agudas y crnicas Linfomas Inmunodeficiencias Hemoglobinuria paroxstica nocturna Deteccin de enfermedad mnima residual Enumeracin de precursores hematopoyticos CD34+ Diagnstico de enfermedades congnitas plaquetarias: Tromboastenia de Glanzmann Sndrome de Bernard-Soulier

ANTIGENOS INTRACELULARES ANTIGENOS INTRACELULARES


Deteccin de protenas intracelulares con anticuerpos fluorescentes Requiere el ajuste de procedimientos metodolgicos clave: Suspensin de clulas individuales e intactas Preservacin de los epitopos a determinar Fijacin Permeabilizacin Marcaje con los anticuerpos Anlisis multiparamtrico

ANTIGENOS INTRACELULARES ANTIGENOS INTRACELULARES


Deteccin de citokeratinas en muestras heterogneas: Identificacin especfica de las clulas tumorales Deteccin de clulas metastticas en ndulos linfticos Deteccin de clulas tumorales circulantes Fenotipo intracelular de leucemias y linphomas: Cadenas ligeras de Ig intracelulares: y Antgenos de superficie an no expresados: CD3, CD22 Enzimas intracelulares: TdT, MPO Expresin de reguladores del ciclo celular: Ciclina D1 Expresin de protenas antiapoptticas: Bcl-2, Rb Expresin de protenas supresoras de tumores: p53 Anlisis de citokinas intracelulares: Fenotipo Th0, Th1 y Th2

ANTICUERPOS CIRCULANTES ANTICUERPOS CIRCULANTES


Deteccin de autoanticuerpos circulantes: Anticuerpos antiplaquetarios Anticuerpos antineutrfilos Deteccin de aloanticuerpos circulantes : Pruebas cruzadas pre-transplante Uso de esferas recubiertas con HLA especficos Deteccin de anticuerpos unidos a clulas de la sangre

ANALISIS DE LA INMUNOPROLIFERACION ANALISIS DE LA INMUNOPROLIFERACION


Anlisis monoparamtrico del ciclo celular: Contenido de ADN Anlisis multiparamtrico del ciclo celular: Fenotipo de superficie y contenido de ADN Contenido de ADN y antgenos relacionados con el ciclo Anlisis de la historia de divisin celular: Trazadores celulares (Cell-tracking dyes:PKH-1, CFSE) Trazadores celulares y fenotipo de superficie

ANALISIS DE LA BIOQUIMICA INTRACELULAR ANALISIS DE LA BIOQUIMICA INTRACELULAR


Funciones bioqumicas de la inmunidad especfica: Sntesis y secrecin de citokinas Expresin de molculas de adhesin Movimientos inicos tras la activacin celular Funciones bioqumicas de la inmunidad innata: Fagocitosis y destruccin de microorganismos Generacin intracelular de especies reactivas de oxgeno Actividad proteoltica intracelular Respuestas quimiotcticas: Expresin de molculas de adhesin Explosin oxidativa (Oxidative burst) Funciones bioqumicas de las plaquetas: Activacin y agregacin plaquetarias

ANALISIS DE LA MUERTE CELULAR EN EL ANALISIS DE LA MUERTE CELULAR EN EL SISTEMA INMUNITARIO SISTEMA INMUNITARIO
Anlisis de clulas efectoras citolticas: Identificacin fenotpica de subpoblaciones CD8 y NK Anlisis de la citotoxicidad mediada por clulas: Anlisis de la interaccin entre clulas efectoras y dianas Anlisis de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos: Monitorizacin de la terapia con anticuerpos monoclonales Anlisis del proceso y mecanismo de muerte celular: Identificacin y cuantificacin de clulas apoptticas Identificacin y cuantificacin de clulas necrticas Anlisis de parmetros celulares durante la apoptosis

APLICACIONES GENERALES DE LA APLICACIONES GENERALES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO EN INVESTIGACION CITOMETRIA DE FLUJO EN INVESTIGACION BASICA BASICA

VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN APLICACIONES FUNCIONALES


Acceso no invasivo a parmetros celulares Mltiples procesos funcionales analizables

Integracin de respuestas y mecanismos Anlisis multiparamtrico Resolucin de heterogeneidad celular Anlisis de gran nmero de clulas

Seleccin fenotpica de subpoblaciones

ENSAYOS CINETICOS POR CITOMETRIA DE FLUJO

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN CIENCIAS MEDIOAMBIENTALES CIENCIAS MEDIOAMBIENTALES

Anlisis Cintico in situ

Deteccin de efectos tempranos o transitorios

Anlisis secuencial

Evaluacin de procesos dinmicos

APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN APLICACIONES DE LA CITOMETRIA EN CIENCIAS MEDIOAMBIENTALES CIENCIAS MEDIOAMBIENTALES


Anlisis de poblaciones unicelulares en su entorno: Identificacin y taxonoma Estimacin de biomasa Deteccin de contaminaciones Deteccin de toxicidad in situ: Marcadores de exposicin Marcadores de efecto bioqumico Uso de microorganismos naturales o de laboratorio como indicadores de toxicidad Anlisis genmico en clulas procedentes de organismos superiores

SISTEMAS ESPECIALES DE CITOMETRIA PARA SISTEMAS ESPECIALES DE CITOMETRIA PARA EL ANALISIS MEDIOAMBIENTAL EL ANALISIS MEDIOAMBIENTAL

CITOMETRO DE FLUJO IN SITU EPICS V A BORDO DE UN BARCO OCEANOGRAFICO

CMO FUNCIONA UN SEPARADOR CELULAR? CMO FUNCIONA UN SEPARADOR CELULAR?


488 nm laser

Detector de FS Detector de fluorescencia

Placas cargadas

Clulas separadas

EJEMPLOS DE CELL SORTERS EJEMPLOS DE CELL SORTERS A LO LARGO DE LA HISTORIA A LO LARGO DE LA HISTORIA
EPICS V EPICS CS EPICS ELITE

MoFlo

EPICS ALTRA FACStar

FACS Vantage

EJEMPLOS DE OBTENCION Y ANALISIS DE EJEMPLOS DE OBTENCION Y ANALISIS DE DATOS EN CITOMETRIA DE FLUJO DATOS EN CITOMETRIA DE FLUJO

INMUNOFENOTIPO DE POBLACIONES INMUNOFENOTIPO DE POBLACIONES LINFOCITARIAS LINFOCITARIAS

RECUENTO ABSOLUTO DE LINFOCITOS CD4 RECUENTO ABSOLUTO DE LINFOCITOS CD4 CON ESFERAS DE CONCENTRACION CALIBRADA CON ESFERAS DE CONCENTRACION CALIBRADA

DETECCION Y CUANTIFICACION ABSOLUTA DETECCION Y CUANTIFICACION ABSOLUTA DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS CD34++ DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS CD34

ANALISIS DE LA FUNCION PLAQUETARIA ANALISIS DE LA FUNCION PLAQUETARIA

ANALISIS DE MARCADORES DE ACTIVACION EN ANALISIS DE MARCADORES DE ACTIVACION EN LINFOCITOS LINFOCITOS

CD69

CD69

BASAL

+ CD3/CD28

RECUENTO DE RETICULOCITOS RECUENTO DE RETICULOCITOS


RBC

ANALISIS DE PARAMETROS DE ANALISIS DE PARAMETROS DE ACTIVACION EN PLAQUETAS ACTIVACION EN PLAQUETAS


ADP ADP ADP ADP

Plaquetas

ADP ADP

A23187 A23187

A23187 A23187

Basal Basal

F
Basal Basal ADP ADP

Basal Basal

ANALISIS DE CITOKINAS INTRACELULARES ANALISIS DE CITOKINAS INTRACELULARES EN LINFOCITOS EN LINFOCITOS

ANALISIS DE LA ACTIVIDAD DEL ANALISIS DE LA ACTIVIDAD DEL TRANSPORTADOR Na++/H+ EN LEUCOCITOS TRANSPORTADOR Na /H+ EN LEUCOCITOS
WBC

A
RBC

WBC
Granulocitos

WBC

C
Granulocitos Granulocitos Monocitos
Lymphocytes

D E

Monocitos Monocitos Linfocitos Morfologa leucocitaria y seleccin de linfocitos Seleccin de poblaciones: clulas T (CD3) Seleccin de clulas T: TC (CD8+)/TH (CD8-) Control de activacin: CD69 Linfocitos

Control isotpico: IgG2d-PE

IgG2bPE

Sntesis de IFN: Baja

Sntesis de IFN : Alta

Leucocitos Leucocitos

Linfocitos Linfocitos

Monocitos Monocitos

Granulocitos Granulocitos

Leucocitos Leucocitos + EIPA + EIPA

AVANCES EN LAS APLICACIONES AVANCES EN LAS APLICACIONES CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO CLINICAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

AVANCES EN LA IDENTIFICACION Y AVANCES EN LA IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE CELULAS CARACTERIZACION DE CELULAS


1. ANTIGENOS DE SUPERFICIE: Caracterizacin de nuevas molculas de superficie (CD) Marcaje con 4-5 colores de fluorescencia Implementacin de software de autoajuste y autocompensacin Preparacin automtica de muestras para inmunofluorescencia 2. ANTIGENOS INTRACELULARES: Desarrollo de tcnicas reproducibles de permeabilizacin Desarrollo de anticuerpos contra citokinas y enzimas Desarrollo de sistemas para detectar protenas secretadas 3. ACIDOS NUCLEICOS: Anlisis multiparamtrico del DNA y componentes celulares Desarrollo de anticuerpos contra productos gnicos especficos Desarrollo de anticuerpos contra protenas reguladoras del ciclo Implementacin de software para ajuste del ciclo celular

AVANCES EN EL ESTUDIO FUNCIONAL AVANCES EN EL ESTUDIO FUNCIONAL DE CELULAS DE CELULAS


1. ASPECTOS FUNCIONALES DE LA INMUNIDAD: Desarrollo de reactivos (tetrmeros) para detectar linfocitos antgenoespecficos Desarrollo de mtodos para el anlisis de la activacin leucocitaria Desarrollo de anticuerpos contra molculas de adhesin leucocitarias Desarrollo de fluorocromos sensibles al burst oxidativo Desarrollo de mtodos para el anlisis de fagocitosis Desarrollo de mtodos para el anlisis de citotoxicidad 2. FUNCIONALIDAD DE LA HEMOSTASIA: Desarrollo de anticuerpos contra antgenos estructurales y dependientes de activacin en superficie de plaquetas Desarrollo de tcnicas en sangre entera para el estudio de la activacin de plaquetas 3. ANALISIS DEL METABOLISMO CELULAR: Desarrollo de sustratos fluorognicos para enzimas intracelulares Desarrollo de mtodos para Citoenzimologa de Flujo Desarrollo de fluorocromos con especificidad subcelular

AVANCES EN LAS APLICACIONES AVANCES EN LAS APLICACIONES A LA TERAPEUTICA A LA TERAPEUTICA


1. MECANISMO DE RESISTENCIA A FARMACOS: Desarrollo de anticuerpos contra glicoprotena P Desarrollo de tcnicas cinticas para el estudio de la captacin/eflujo de frmacos o anlogos Desarrollo de tcnicas para la cuantificacin de glutatin intracelular y de glutatin-S-transferasa 2. DETECCION DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL: Desarrollo de mtodos de inmunofluorescencia mltiple Implementacin del anlisis de eventos infrecuentes 3. INMUNOLOGIA DEL TRANSPLANTE/TRANSFUSION: Desarrollo de tcnicas para el estudio de histocompatibilidad Implementacin de la deteccin de anticuerpos circulantes Implementacin de la cuantificacin de clulas CD34+ Desarrollo de mtodos para detectar clulas contaminantes infrecuentes

AVANCES EN LAS APLICACIONES DE VALOR AVANCES EN LAS APLICACIONES DE VALOR PRONOSTICO O PREDICTIVO PRONOSTICO O PREDICTIVO
1. ESTABLECIMIENTO DE CONSENSOS METODOLOGICOS : Inmunofenotipo de leucemias y linfomas Ploida de DNA e ndice de proliferacin en tumores slidos Deteccin y cuantificacin de activacin de plaquetas Anlisis del fenotipo MDR 2. ESTABLECIMIENTO DE CONTROLES DE CALIDAD: Inmunofenotipo de superficie Ploida de DNA e indice de proliferacin en tumores slidos Cuantificacin de clulas CD34+ 3. VALOR PRONOSTICO/PREDICTIVO DE LA CITOMETRIA: Inmunofenotipo en leucemias y linfomas Ploida de DNA e ndice de proliferacin en algunos tumores Expresin de genes relacionados con apoptosis en neoplasias Expresin de protenas reguladoras del ciclo celular en neoplasias Indice de madurez reticulocitaria en hematopoyesis

AVANCES EN EL ANALISIS DE LA LESION Y AVANCES EN EL ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR MUERTE CELULAR
1. AVANCES EN EL ESTUDIO FUNCIONAL CELULAR: Desarrollo de tcnicas para la cuantificacin de sustratos Desarrollo de tcnicas de citoenzimologa de flujo Desarrollo de mtodos de activacin celular in vitro 2. AVANCES EN EL ESTUDIO DE LA MUERTE CELULAR: Desarrollo de tcnicas de deteccin y cuantificacin de apoptosis Desarrollo de mtodos para el estudio de los mecanismos moleculares de la apoptosis Establecimiento del valor predictivo/pronstico de la apoptosis en neoplasias e inmunodeficiencias Establecimiento del valor predictivo/pronstico de la apoptosis en la respuesta a la teraputica