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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CINCIAS E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ITA02003 BIOENGENHARIA PARA ENGENHARIA QUMICA - POLGRAFO -

Profa Rosane Rech

ITA02003 Bioengenharia para Engenharia Qumica Semestre 2010/1

Profa. Rosane Rech 2

ndice

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Introduo Engenharia de Bioprocessos ................................................................................................................. 7 1.1 Definies ......................................................................................................................................................... 7 1.2 Histrico do desenvolvimento dos bioprocessos .............................................................................................. 7 1.3 Produtos provenientes de processos biotecnolgicos....................................................................................... 9 1.3.1 Enzimas .................................................................................................................................................... 9 1.3.2 cidos Orgnicos ..................................................................................................................................... 9 1.3.3 Aminocidos............................................................................................................................................. 9 1.3.4 Vitaminas................................................................................................................................................ 10 1.3.5 Biopolmeros .......................................................................................................................................... 10 1.3.6 Solventes ................................................................................................................................................ 10 1.3.7 Bebidas Alcolicas ................................................................................................................................. 10 1.3.8 Alimentos ............................................................................................................................................... 10 1.3.9 Microrganismos...................................................................................................................................... 10 1.3.10 Antibiticos ............................................................................................................................................ 11 1.3.11 Protenas reguladoras do metabolismo ................................................................................................... 11 1.3.12 Transformao de esterides .................................................................................................................. 11 1.3.13 Vacinas ................................................................................................................................................... 11 1.3.14 Controle Biolgico de Pragas................................................................................................................. 11 1.3.15 Lixiviao Bacteriana de Minrios......................................................................................................... 12 1.4 A Biotecnologia no Brasil............................................................................................................................... 12 1.5 Tendncias ...................................................................................................................................................... 12 1.6 Processos fermentativos industriais ................................................................................................................ 14 Microbiologia........................................................................................................................................................... 16 2.1 Distribuio dos organismos vivos ................................................................................................................. 16 2.2 Morfologia e estrutura..................................................................................................................................... 17 2.2.1 Bactrias (procariotos) ........................................................................................................................... 17 2.2.2 Fungos .................................................................................................................................................... 18 2.3 Nutrio microbiana........................................................................................................................................ 19 2.3.1 Consideraes gerais .............................................................................................................................. 19 2.3.2 Requisitos Nutricionais .......................................................................................................................... 19 2.4 Fatores fsico-qumicos ................................................................................................................................... 21 2.4.1 Temperatura............................................................................................................................................ 21 2.4.2 pH ........................................................................................................................................................... 22 2.4.3 Presso Osmtica ................................................................................................................................... 22 2.5 Meios de Cultura ............................................................................................................................................. 22 2.6 Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial ........................................................................ 23 Biorreatores e Processos Fermentativos .................................................................................................................. 24 3.1 Classificao dos biorreatores......................................................................................................................... 24 3.2 Formas de conduo de um processo fermentativo: ....................................................................................... 25 Cultivo Descontnuo ................................................................................................................................................ 26 4.1 Inculo ............................................................................................................................................................ 26 4.2 Meio de cultura ............................................................................................................................................... 26 4.3 Cintica de um cultivo em batelada ................................................................................................................ 27 4.3.1 Cintica de crescimento celular.............................................................................................................. 28 4.3.2 Equao de Monod: interpretao da fase exponencial de crescimento................................................. 28 4.3.3 Cintica de formao de produto............................................................................................................ 31 4.3.4 Cintica de consumo de substrato pela clula ........................................................................................ 31 Cultivo Contnuo...................................................................................................................................................... 33 5.1 Formas de operao do sistema contnuo........................................................................................................ 33 Cultivo Semi-contnuo ............................................................................................................................................. 35 6.1 Produtividade de um processo semi-contnuo................................................................................................. 35 Cultivo em Regime Batelada Alimentada................................................................................................................ 36 Reatores com clulas imobilizadas .......................................................................................................................... 39 8.1 Mtodos de imobilizao celular..................................................................................................................... 39 8.1.1 Imobilizao sobre a superfcie de um suporte slido............................................................................ 39

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8.1.2 Envolvimento em uma matriz porosa:.................................................................................................... 40 8.1.3 Floculao celular (agregao)............................................................................................................... 41 8.1.4 Conteno mecnica atrs de uma barreira ............................................................................................ 41 8.2 Caractersticas e vantagens da imobilizao celular ....................................................................................... 41 8.3 Exemplos de usos de clulas imobilizadas...................................................................................................... 42 9 Biorreatores com membranas................................................................................................................................... 45 10 Cultivo Semi-Slido ............................................................................................................................................ 48 10.1 Microrganismos normalmente utilizados: ....................................................................................................... 48 10.2 Substratos: caractersticas e composio:........................................................................................................ 48 10.3 Biorreatores para CSS ..................................................................................................................................... 49 10.4 Controle de processo em CSS ......................................................................................................................... 50 10.4.1 Teor de umidade..................................................................................................................................... 50 10.4.2 Atividade de gua:.................................................................................................................................. 50 10.4.3 Temperatura............................................................................................................................................ 50 10.4.4 pH ........................................................................................................................................................... 51 10.4.5 Aerao: ................................................................................................................................................. 51 10.4.6 Agitao ................................................................................................................................................. 52 10.4.7 Estimativa de crescimento ...................................................................................................................... 52 10.4.8 Extrao dos produtos ............................................................................................................................ 52 11 Agitao e aerao em biorreatores..................................................................................................................... 53 11.1 Transferncia de oxignio da bolha de gs para a clula ................................................................................ 53 11.2 Mtodo dinmico para o clculo do kLa......................................................................................................... 54 11.3 Respirao microbiana .................................................................................................................................... 55 11.4 Anlise conjunta da transferncia e do consumo do oxignio ........................................................................ 56 11.5 Sistemas para a transferncia de oxignio....................................................................................................... 58 11.6 Transferncia de oxignio em meios agitados e aerados................................................................................. 58 11.6.1 Agitao de lquidos newtonianos.......................................................................................................... 58 11.6.2 Agitao de lquidos newtonianos submetidos aerao....................................................................... 61 11.6.3 Transferncia de oxignio ...................................................................................................................... 61 12 Escalonamento de biorreatores............................................................................................................................ 63 12.1 Critrios para ampliao de escala .................................................................................................................. 63 12.1.1 Constncia da potncia por unidade de volume do meio (P/V).............................................................. 63 12.1.2 Constncia do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa)............................................ 64 12.1.3 Constncia da velocidade na extremidade do impelidor (vimp) ............................................................... 65 12.1.4 Constncia do tempo de mistura (tm) ...................................................................................................... 65 12.1.5 Constncia da capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V) .......................................................... 66 12.1.6 Constncia do Nmero de Reynolds ...................................................................................................... 66 12.1.7 Critrios ou regras de aerao ................................................................................................................ 67 12.2 Comparaes entre os critrios de ampliao de escala .................................................................................. 68 13 Esterilizao ........................................................................................................................................................ 69 13.1 Modos de atuao dos agentes esterilizantes .................................................................................................. 69 13.2 Esterilizao de equipamentos e meios de cultivo por calor mido................................................................ 71 13.2.1 Cintica de morte celular........................................................................................................................ 71 13.2.2 Esterilizao em batelada de meios de cultivo ....................................................................................... 71 13.2.3 Esterilizao contnua de meios de cultivo............................................................................................. 73 14 Referncias Bibliogrficas................................................................................................................................... 75 14.1 Livros .............................................................................................................................................................. 75 14.2 Artigos Cientficos .......................................................................................................................................... 75 14.3 Bibliografia complementar.............................................................................................................................. 76

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Lista de Figuras

Figura 1.1: Multidisciplinaridade da Biotecnologia.......................................................................................................... 8 Figura 1.2: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997). ............................................... 14 Figura 1.3: Fluxograma de um processo fermentativo (Fonte: Schmidell et al., 2001) .................................................. 15 Figura 2.1: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de R. H. Wittaker em 1969 (Fonte: Borzani et al., 2001). ....................................................................................................................................................................... 16 Figura 2.2: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de C. Woese em 1979 (Fonte: Borzani et al., 2001). ................................................................................................................................................................................. 16 Figura 2.3: Representao esquemtica de uma bactria (Fonte: Lehninger, 1997). ..................................................... 17 Figura 2.4: Diferentes tipos de bactrias. ........................................................................................................................ 18 Figura 2.5: Esquema de clula eucaritica animal (Fonte: http://people.eku.edu/ritchisong/cell1.gif em 01/08/08). .... 18 Figura 2.6: Classificao dos microrganismos quanto sua temperatura tima de crescimento. ................................... 21 Figura 2.7: Efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula........................................................... 21 Figura 3.1: Configuraes de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) air-lift; (d) recirculao de meio com leito fluidizado. ................................................................................................................................................................ 25 Figura 4.1: Representao esquemtica do preparo do inculo (Fonte: Schmidell et al., 2001)..................................... 27 Figura 4.2: Curva de crescimento em reator batelada (Fonte: Doran, 1995). ................................................................. 28 Figura 4.3: Curvas da equao de Monod para valores hipotticos de mx = 0,14h-1 e KS = 0,60mg.L-1 (Curva A) e KS = 0,030mg.L-1 (Curva B). ........................................................................................................................................ 29 Figura 4.4: Cintica de inibio pelo substrato (Curva A) e sem inibio (Curva B), conforme a equao de Monod para mx = 0,14 h-1. ................................................................................................................................................. 30 Figura 5.1: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L....................................................................................................................................................... 33 Figura 5.2: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L em um sistema com reciclo interno onde a frao de meio que sai diretamente do biorreator 0,2 e o fator de diluio do meio filtrado 0,1. ............................................................................................................. 34 Figura 6.1: influncia de sobre a produtividade de um processo semi-contnuo (Fonte: Schmidell et al., 2001). ...... 35 Figura 7.1: Grficos da variao da vazo de alimentao, F, e da velocidade especfica de crescimento, , em cultivos em regime batelada-alimentada com vazo de alimentao constante, linear crescente e exponencial................... 37 Figura 7.2: Biomassa e produo de ergosterol para diferentes mtodos de controle de alimentao em cultivos batelada alimentada (Fonte: Gao & Tan, 2003)....................................................................................................... 37 Figura 7.3: Cultivo batelada-alimentada com alimentao exponencial combinada com pH-stat de Escherichia coli K12 com velocidade especfica de crescimento controladas em 0,1h-1 (esquerda) e 0,3h-1 (direita) (Fonte: Kim et al., 2004).................................................................................................................................................................. 38 Figura 8.1: Desenho esquemtico dos mtodos bsicos de imobilizao celular (Fonte: Kourkoutas et al., 2004). ..... 40 Figura 8.2: Imobilizao de clulas por envolvimento em gel hidroflico induzida por Ca++ e K+................................. 41 Figura 8.3: Produo de lipase com clulas imobilizadas e clulas livres (Fonte: Ellaiah et al., 2004). ........................ 42 Figura 8.4: Cintica de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001). ................................................................................................... 42 Figura 8.5: Produtividade de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio (b) Produtividade de um cultivo contnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus coimobilizadas em alginato de sdio em biorreator PBR com 60mL de volume de trabalho (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001). ................................................................................................................................................ 43 Figura 8.6: Biomassa e atividade de bacteriocina em um biorreator contnuo com clulas livres (Fonte: Bhugaloo-Vial et al., 1997). ............................................................................................................................................................. 43 Figura 8.7: Produtividade de bacteriocina com a taxa de diluio (a) em um biorreator contnuo com clulas livres e (b) em biorreator contnuo PBR com clulas imobilizadas em alginato de sdio (Fonte: Bhugaloo-Vial et al., 1997). ....................................................................................................................................................................... 43 Figura 8.8: Produo de etanol, evoluo de CO2 e consumo de glicose por clulas de S. cerevisiae imobilizadas (smbolo cheio) e livres (smbolo aberto) (Fonte: Wendhausen et al., 2001).......................................................... 44 Figura 8.9: Produtividade (smbolo cheio) e concentrao de etanol (smbolo aberto) em clulas de S. cerevisiae imobilizadas em funo da taxa de diluio e em funo do tempo em um bioreator de leito empacotado alimentado com 33% de caldo de cana (180 g/L de sacarose) a 30oC (Fonte: Wendhausen et al., 2001)............... 44

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Figura 9.1: Configuraes de MBRs: (a) membrana submersa, (b) circulao externa (Fonte: Melin et al., 2006)....... 45 Figura 10.1: Influncia do tamanho das partculas na velocidade de fermentao de acar de beterraba por Zymomonas mobilis para produo de etanol. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ....................................................... 49 Figura 10.2: Reatores para cultivo semi-slido industrial (a) tanques circulares; (b) esteira rolante; (c) reator tubular com agitao interna. (Fonte: Schmidell et al., 2001).............................................................................................. 49 Figura 10.3: Influncia do teor de umidade sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001)........... 50 Figura 10.4: Relao entre a atividade de gua e as reaes de deteriorao dos alimentos. ......................................... 51 Figura 10.5: Influncia da temperatura sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001).................. 51 Figura 11.1: Variao da concentrao de oxignio dissolvido em gua com a temperatura. ........................................ 53 Figura 11.2: Etapas da transferncia de oxignio da bolha de ar para a clula (Doran, 1995. p. 200). .......................... 54 Figura 11.3: Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de massa da fase lquida, kLa. ........................ 55 Figura 11.4: Representao esquemtica da variao de QO2 com a concentrao de O2 dissolvido. (Fonte: Schmidell et al., 2001) .............................................................................................................................................................. 56 Figura 11.5: Curva de variao de concentrao de oxignio dissolvido para clculo de kLa e q O2 conforme o mtodo dinmico. Fonte: Ayub, 1991, p. 60. ....................................................................................................................... 57 Figura 11.6: Sistemas diversos de transferncia de oxignio em biorreatores. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............. 58 Figura 11.7: Esquema de um biorreator agitado com turbinas de ps planas. (Fonte: Schmidell et al., 2001)............... 59 Figura 11.8: nmero de potncia em funo do nmero de Reynolds para impelidor tipo hlice e Rushton. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............................................................................................................................................. 60 Figura 11.9: Pg/P em funo do nmero de aerao para um sistema de agitao com duas turbinas Rushton. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............................................................................................................................................. 61 Figura 12.1: Variao do fator tempo de mistura com o nmero de Reynolds. (Fonte: Schmidell et al., 2001) ............ 66 Figura 13.1:Perfil tpico de temperatura do meio de cultivo e evoluo da morte celular em uma esterilizao em batelada (Fonte: Doran, 1997). ................................................................................................................................ 72 Figura 13.2: Curvas de aquecimento e resfriamento em uma esterilizao em batelada................................................. 73 Figura 13.3: Equipamentos para esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor............................................................................................... 73 Figura 13.4: Curvas de aquecimento, manuteno da temperatura e resfriamento durante uma esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor........ 74 Figura 13.5: Trocador de calor de placas (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995). ................................................. 74 Figura 13.6: Trocador de calor tubular (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995)...................................................... 74

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Lista de Tabelas

Tabela 1.1: Marcos Histricos no Desenvolvimento da Biotecnologia............................................................................. 8 Tabela 1.2: Principais Tipos de Enzimas e Suas Aplicaes............................................................................................. 9 Tabela 1.3: Principais tipos de vacinas produzidas por via fermentativa........................................................................ 11 Tabela 1.4: Aplicaes Comerciais Futuras da Nova Biotecnologia............................................................................... 13 Tabela 3.1: Classificao geral dos biorreatores. ............................................................................................................ 24 Tabela 4.1: valores de KS para diferentes microrganismos.............................................................................................. 30 Tabela 4.2: Exemplos de produtos conforme sua associao com o metabolismo energtico. ....................................... 31 Tabela 4.3: Coeficiente de manuteno de diversos microrganismos em glicose como fonte de carbono. .................... 32 Tabela 9.1: Comparao das caractersticas dos diferentes mdulos de membranas utilizados em MBRs..................... 46 Tabela 11.1: Valores de concentrao crtica de oxignio para alguns microrganismos ................................................ 56 Tabela 11.2: Coeficientes e da equao 11.23 conforme a escala de trabalho. ........................................................ 62 Tabela 12.1: Variao da freqncia de rotao (N) numa ampliao de escala............................................................. 68 Tabela 12.2: Relao entre variveis em uma ampliao de escala (V1 = 60L; V2 = 7,5m3) ........................................... 68

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1 1.1

Introduo Engenharia de Bioprocessos Definies

Biochemical engineering is concerned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the links between biology and chemical engineering. (...) The heart of biochemical engineering lies on the scale up and management of cellular processes. Aiba, Humphrey, Millis Biochemical Engineering (1973). Processing of biological materials and processing using biological agents such cells, enzymes or antibodies are the central domain of biological engineering. Success in biochemical engineering requires integrated knowledge of governing biological properties and principles and of chemical engineering methodology and strategy. (...) Reaching this objective clearly requires years of careful study and practice. Bailey, Ollis Biochemical Engineering Fundamentals (1986). 1.2 Histrico do desenvolvimento dos bioprocessos

O uso da Biotecnologia teve o seu incio com os processos fermentativos, cuja utilizao transcende, de muito, o incio da era Crist, confundindo-se com a prpria histria da humanidade. A produo de bebidas alcolicas pela fermentao de gros de cereais j era conhecida pelos sumrios e babilnios antes do ano 6.000 a.C. Mais tarde, por volta do ano 2.000 a. C., os egpcios, que j utilizavam o fermento para fabricar cerveja, passaram empreg-lo tambm na fabricao de po. Outras aplicaes como a produo de vinagre, iogurte e queijos so, de h muito, utilizadas pelo ser humano. Entretanto, no eram conhecidos os agentes causadores das fermentaes que ficaram ocultos por 6 milnios. Somente no sculo dezessete, o pesquisador Antom Van Leeuwenhock, atravs da visualizao em microscpio, descreveu a existncia de seres to minsculos que eram invisveis a olho nu. Foi somente 200 anos depois que Louis Pasteur, em 1876, provou que a causa das fermentaes era a ao desses seres minsculos, os microrganismos, caindo por terra a teoria, at ento vigente, que a fermentao era um processo puramente qumico. Foi ainda Pasteur que provou que cada tipo de fermentao era realizado por um microrganismo especfico e que estes podiam viver e se reproduzir na ausncia de ar. Posteriormente, em 1897, Eduard Buchner, demonstrou ser possvel a converso de acar em lcool, utilizando clulas de levedura maceradas, ou seja, na ausncia de organismos vivos. Foram as grandes guerras mundiais que motivaram a produo em escala industrial de produtos advindos de processos fermentativos. A partir da primeira guerra, a Alemanha, que necessitava de grandes quantidades de glicerol para a fabricao de explosivos, desenvolveu atravs de Neuberg, um processo microbiolgico de obteno desse lcool, tendo chegado a produzir 1.000 toneladas do produto por ms. Por outro lado, a Inglaterra produziu em grande quantidade a acetona para o fabrico de munies, tendo essa fermentao contribudo para o desenvolvimento dos fermentadores industriais e tcnicas de controle de infeces. Foi, todavia, a produo de antibiticos o grande marco de referncia na fermentao industrial. A partir de 1928, com a descoberta da penicilina por Alexander Fleming, muitos tipos de antibiticos foram desenvolvidos no mundo. Na dcada de 40, durante a segunda guerra mundial, os antibiticos passaram a integrar os processos industriais fermentativos, principalmente nos Estados Unidos, basendo-se inicialmente na sntese da penicilina e, posteriormente, da estreptomicina. Foi, todavia, a partir da dcada de 50 que a Biotecnologia, com a descoberta da sntese qumica do DNA, e com as tcnicas de manipulao gentica (DNA recombinante e fuso celular ou hibridoma), passou de fato a existir. A tcnica do DNA recombinante envolve a criao sinttica de novos organismos vivos, com caractersticas no encontradas na natureza, formadas pela hibridizao em nvel molecular do DNA. Essa tcnica permite, por exemplo, o enxerto de genes humanos que determinam a produo de insulina em um

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microrganismo, possibilitando a produo industrial de insulina humana, substituindo, com grande vantagens, a insulina bovina ou suna empregadas no tratamentos de diabticos. A tcnica de hibridoma possibilitou a manipulao gentica a nvel das clulas vivas onde duas ou mais clulas so fundidas para formar novos microrganismos. Na prtica, clulas animais que produzem anticorpos so incorporadas a outras malignas ou perniciosas resultando em uma nova que se torna eficiente produtora de anticorpos. A Tabela 1.1 mostra os principais marcos histricos no avano cientfico e tecnolgico da Biotecnologia. Tabela 1.1: Marcos Histricos no Desenvolvimento da Biotecnologia Perodo 6.000 a. C. 2.000 a.C. 1875 d. C. 1880-1910 1910-1940 1940-1950 1953 1973 1982 Acontecimento bebidas alcolicas (cerveja e vinho) so produzidas por sumrios e babilnios panificao e bebidas fermentadas so utilizadas por egpcios e gregos Pasteur mostra que a fermentao causada por microrganismos surgimento da fermentao industrial (cido lctico, etanol, vinagre) sntese de glicerol, acetona e cido ctrico antibiticos so produzidos em larga escala por processos fermentativos estabelecida a estrutura do DNA incio da engenharia gentica insulina humana produzida

Atualmente crescente o ritmo de desenvolvimento do setor, mantendo, inclusive, uma acentuada relao de interao com diversos outros setores da cincia e tecnologia tais como: biologia molecular, fisiologia, microbiologia, engenharia qumica, engenharia ambiental, etc. como mostrado na Figura 1.1.

Figura 1.1: Multidisciplinaridade da Biotecnologia

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1.3

Produtos provenientes de processos biotecnolgicos

A Biotecnologia encontra muitas e diferentes aplicaes importantes em vrios segmentos de atividade, como a agricultura, a minerao, a pecuria, a sade e a indstria. Suas aplicaes na indstria constituem o objetivo principal da chamada Biotecnologia Industrial. A fermentao como processo industrial apresenta hoje uma importncia crescente em setores chaves da economia. Empresas por todo o mundo produzem e comercializam produtos obtidos atravs de processos fermentativos, tendo sido a produo em escala industrial de bens, atravs de processos microbiolgicos, iniciada a partir da primeira guerra mundial. Atualmente, existem mais de uma centena de produtos viveis de serem obtidos atravs da via fermentativa. 1.3.1 Enzimas

As enzimas so molculas de protenas que tm a funo de catalisar reaes. A principal fonte de obteno de enzimas so os microrganismos, embora muitas enzimas de aplicao industrial tenham sua origem nos tecidos animal ou vegetal: renina, obtida do estmago de bezerros e papana, obtida do mamo, por exemplo. Os principais tipos de enzimas comercializados atualmente so as proteases, as gluco- e -amilase e a glicose-isomerase. A Tabela 1.2 mostra os principais tipos de enzimas bem como o seus principais usos (para saber mais: http://en.wikipedia.org/wiki/Enzymes) Tabela 1.2: Principais Tipos de Enzimas e Suas Aplicaes enzima protease amilase e amiloglucosidase catalase glicose-isomerase invertase lactase lipase celulase glicose-oxidase aplicao quebra de molculas de protena sacarificao do amido eliminao da gua oxigenada no processamento de alimentos produo de frutose hidrlise da sacarose desdobramento da lactose desdobramento de leos e gorduras desdobramento da celulose remoo da glicose

1.3.2

cidos Orgnicos

Dentre os cidos orgnicos que podem ser produzidos por processos fermentativos destacam-se: o cido actico, o cido ctrico e o cido lctico, os trs de grande uso industrial, principalmente na rea de alimentos, com a funo de acidulantes. 1.3.3 Aminocidos

Os aminocidos constituem a unidade bsica das protenas. O ser humano necessita basicamente de 20 aminocidos para as suas necessidades de metabolismo e desenvolvimento orgnico. Destes, oito no so sintetizados pelo organismo necessitando, pois, serem ingeridos atravs de alimentos.

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Entretanto, dois aminocidos revestem-se de especial importncia: a metionina e a lisina, dado ao fato de no se encontrarem presentes nos cereais. A metionina no obtida por processos fermentativos, porm 80% da lisina produzida obtida por via microbiolgica. Outros importantes aminocidos sintetizados por via fermentativa so o cido glutmico, o cido asprtico e o triptofano. 1.3.4 Vitaminas

Tradicionalmente utilizadas como suplemento alimentar para o ser humano e animais, as vitaminas so, em sua maioria, sintetizadas quimicamente. Entretanto, algumas delas como as do complexo B, notadamente a B2, so produzidas por biossntese microbiana. 1.3.5 Biopolmeros

Comercialmente entende-se por biopolmeros determinados polissacardeos excretados por microrganismos. Os principais biopolmeros encontrados no mercado so as gomas xantana e as dextranas. As primeiras representam a maior parte do mercado, sendo aplicadas como aditivos em alimentos: estabilizantes de suspenso lquidas e geleificantes. 1.3.6 Solventes

Trs so os principais solventes orgnicos produzidos por microrganismos: etanol, butanol e acetona. Destes, o etanol se reveste de especial importncia no contexto brasileiro pelo seu destaque no segmento da economia. 1.3.7 Bebidas Alcolicas

As bebidas alcolicas so to antigas quanto a humanidade e numerosas como suas etnias. Fencios, assrios, babilnios, hebreus, egpcios, chineses, germanos, gregos e romanos mencionaram-nas e cada povo tem praticamente as suas, a partir das fontes naturais prprias de acares e produtos amilceos como: frutas, cana-de-acar, milho, trigo, arroz, batata, centeio, aveia, cevada, e mesmo razes e folhas. Deve-se lembrar, alis, de que esses produtos de fermentao alcolica originavam-se na antigidade de processos espontneos de fermentao e que s em poca mais recente comearam a ser usados nas indstrias, para a sua fabricao, os modernos mtodos da Biotecnologia. As bebidas alcolicas podem ser classificadas em : - fermentadas: cerveja, vinho saqu, sidra, etc. - fermento - destiladas: aguardente, rum, usque, conhaque, vodca, gim, etc. 1.3.8 Alimentos

Inmeros so os produtos alimentcios modificados ou produzidos atravs de processos fermentativos. Alguns como queijos, iogurte e po so utilizados pela humanidade h mais de 2.000 anos. Picles, azeitonas e chucrute so outros alimentos que tem a participao de processos biolgicos em sua obteno. 1.3.9 Microrganismos

O primeiro processo industrial para a produo de microrganismos teis ao homem constituiu-se na produo de levedura para panificao. Hoje, alm da panificao, so produzidos microrganismos para serem utilizados como inculos para produo de bebidas alcolicas e iogurtes, e esporos para utilizao como bioinseticidas. Alm de inculos, o uso de protena unicelular - SCP (sigle cell protein) para a nutrio animal tem-se mostrado atraente. Para ingesto humana, a SCP provoca problemas de digestibilidade devido a grande quantidade de cidos nuclicos componentes da SCP. Todavia, muitas indstrias tm construdo fbricas para a produo de protenas unicelular nos ltimos anos, principalmente na Europa, Estados Unidos e Japo.

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1.3.10 Antibiticos Os antibiticos so empregados no combate a infeces causadas por microrganismos, notadamente bactrias, tanto no organismo humano como no animal e vegetal. So usados tambm no controle de contaminaes em determinados processos fermentativos. Atualmente existem mais de 5.000 tipos diferentes de antibiticos conhecidos, tendo sido a sua produo grandemente impactada pelo melhoramento gentico dos microrganismos utilizados. Dentre os produtos industrializados a maior contribuio comercial provm das penicilinas e cefalosporinas. 1.3.11 Protenas reguladoras do metabolismo A produo dessas macromolculas por microrganismos, teve grande impulso com as pesquisas do DNA recombinante. Os principais produtos so: insulina humana, interferon, hormnio de crescimento humano, peptdios neuroativos, etc. Desses frmacos, o que se encontra em estgio tecnolgico mais avanado a insulina, fundamental na regulao do teor de glicose no sangue, sendo usada na terapia de pacientes com diabetes. 1.3.12 Transformao de esterides A cortisona, descoberta no incio da dcada de 30, e suas propriedades no combate artrite reumtica, levou pesquisa do desenvolvimento de muitos compostos similares, hoje industrializados e comercializados. Inicialmente, a sntese da cortisona era feita por via qumica. Posteriormente, algumas das etapas principais da sntese passaram a ser realizadas por microrganismos o que proporcionou substancial barateamento no custo final. Outros produtos como hidrocortisona, testosterona, albumina humana, gama globulina, e fator antihemoflico esto sendo produzidos e comercializados. 1.3.13 Vacinas As vacinas representam um importante instrumento no controle de doenas infecciosas. Muitas doenas podem ser evitadas pela imunidade induzida como a poliomielite, a varola e o sarampo. As vacinas podem ser de origem viral, bacteriana, protozoria e mesozoria. A Biotecnologia, atravs da tcnica do DNA recombinante, tem envidado esforos no desenvolvimento de novos agentes imunizantes para influenza tipos A e B, herpes, pliomelite e hepatite A e B. Vacinas de origem bacteriana, para diversos tipos de meningite, tem sido produzidas por meio de fermentao, bem como o componente pertussis da vacina trplice.

Tabela 1.3: Principais tipos de vacinas produzidas por via fermentativa Vacinas Difteria Ttano Coqueluche Poliomielite Rubola Hepatite B Fonte Corynebacterium diphtheriae Clostridium tetani Bordetella pertussis Vrus atenuados em clulas renais diplides humanas ou de macacos Vrus atenuados em clulas renais de hamsters recm-nascidos Anticorpo de superfcie expressado em leveduras recombinantes

1.3.14 Controle Biolgico de Pragas So inegveis os danos que os insetos/pragas causam agricultura. A monocultura e o uso indiscriminado de produtos qumicos - defensivos agrcolas - eliminam os inimigos naturais que existem em

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culturas diversificadas, provocando o desequilbrio ecolgico nas reas de plantio, gerando condies propcias para o aparecimento de pragas alm de aumentar a sua resistncia. Os microrganismos patognicos aos insetos/pragas so adequados reduo especficas, enquanto que os predadores naturais e insetos benficos so preservados ou podem se desenvolver, estabelecendo o equilbrio natural. Portanto, os inseticidas microbiolgicos so considerados como uma forma alternativa de controle de pragas. 1.3.15 Lixiviao Bacteriana de Minrios O estudo e aperfeioamento dos processos de concentrao de metais em geral tem contribudo significativamente para o aproveitamento de minrios. No campo da metalurgia extrativa, mais especificamente da hidrometalurgia, a lixiviao bacteriana de minrios vem merecendo crescente ateno como alternativa para os processos convencionais. Analogamente a lixiviao convencional, baseia-se na solubilidade dos metais em solues adequadas por meio de reaes qumicas e tambm de reaes bioqumicas. Cobre, urnio e zinco so exemplos de minerais que podem ser recuperados atravs de lixiviao bacteriana. 1.4 A Biotecnologia no Brasil

A aplicao de cincias biolgicas no Brasil remonta a meados do sculo passado. Notadamente tcnicas laboratoriais e de campo em microbiologia - uma disciplina precursora da moderna Biotecnologia foram aplicadas por pesquisadores como Piraj da Silva e Pedro Severiano de Magalhes. No decurso da segunda metade do sculo XIX, trabalhos pioneiros foram desenvolvidos em vrias modalidades da microbiologia dentre os quais merecem destaque a bacteriologia, micologia, protozoologia, fitopatologia e virologia. Na primeira metade do sculo XX registrou-se atuao marcante de pesquisadores tais como: Carlos Chagas, Vital Brasil, Oswaldo Cruz, Adolfo Lutz, Emlio Ribas, Rangel Pestana, dentre outros no campo do combate e profilaxia de graves molstias que atingiam a populao brasileira. Atualmente, a continuidade desse esprito cientfico est presente nas equipes de pesquisas dos Institutos Oswaldo Cruz, Biofsica e Microbiologia no Rio de Janeiro, Biolgico, Agronmico de Campinas, Adolfo Lutz, Butant e Pasteur em So Paulo. Na dcada de 40, a Biotecnologia clssica atraiu o esprito empreendedor de cientistas da Universidade de Viosa, Minas Gerais, que fundaram uma empresa pioneira, a Sementes Agroceres, objetivando produzir sementes de milho hbrido a partir de material gentico selecionado no Pas. A Brasil Sul Agropecuria, na dcada de 60, voltou-se produo e seleo de sementes forrageiras e pesquisa gentica para a obteno de hbridos de sorgos granferos forrageiros e de milho doce para o consumo humano. A Agroflora Reflorestamento e Agropecuria, dedicou-se pesquisa e produo de sementes melhoradas e seleo de variedades de plantas adaptadas a diferentes condies sazonais. Atualmente existem no Pas cerca de meia centena de instituies de pesquisa e empresas comerciais atuando em Biotecnologia. 1.5 Tendncias

As novas tcnicas de engenharia gentica esto promovendo uma reavaliao de quase todos os processos industriais que empregam tcnicas ou produtos biolgicos. A engenharia gentica aplicada Biotecnologia, alm de substituir processos e produtos tradicionais, apresenta grandes perspectivas de melhorar o bem estar da populao por meio de melhores solues para problemas de sade, alimentao, energia, materiais e meio ambiente.

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A Tabela 1.3, a seguir, fornece uma indicao parcial da aplicao comercial da nova Biotecnologia s necessidades da sociedade. Tabela 1.4: Aplicaes Comerciais Futuras da Nova Biotecnologia rea aplicao potencial - remdios e vacinas mais eficazes com maior grau de pureza e a um custo menor - diagnstico, preveno e tratamento de doenas genticas - novos produtos e processos alimentcios mais eficientes - melhor rendimento e qualidade na produo agropecuria - maior eficincia na converso de biomassa em combustveis Energia - menor consumo energtico em processos industriais - aumento na recuperao de petrleo - menor custo na produo de produtos qumicos com matrias-primas de biomassa - extrao econmica de minerais de baixo teor - alternativas biolgicas herbicidas e pesticidas - tratamento de detritos txicos

Sade

Alimentos

Materiais

Meio Ambiente

A Tabela 1.3 demonstra a amplitude e a profundidade de mudanas que devero advir com o uso da nova Biotecnologia. Na rea da sade, o desenvolvimento de produtos teraputicos para o tratamento de herpes, cncer, hepatite, artrite e outras doenas vislumbra solues novas. Em outras aplicaes da Biotecnologia sade, essas tcnicas novas permitem meios baratos e mais sensveis para diagnosticar gravidez, doenas venrias e outras condies que atualmente requerem testes de laboratrio complexos e caros. Adicionalmente, essas tcnicas possibilitam a dosagem especfica de produtos farmacuticos para determinados rgos do corpo. Na rea de materiais, produtos de qumica fina para medicina e alimentao podem ser produzidos por microrganismos novos, que tornam possveis transformaes complexas em uma nica etapa. A nova Biotecnologia um instrumento poderoso, podendo substituir vasto nmero de processos industriais atualmente empregados e criando com isso novas e melhores solues para uma grande gama de problemas. O papel do engenheiro qumico na engenharia de bioprocessos reside no: desenho e operao de biorreatores, esterilizadores e equipamentos para recuperao de produtos; desenvolvimento de sistemas para automao e controle de processos; projeto de indstrias de fermentao seguras e eficientes.

A Figura 1.2 mostra os passos no desenvolvimento de um novo bioprocesso.

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Figura 1.2: Passos no desenvolvimento de um processo biotecnolgico (Doran, 1997).

1.6

Processos fermentativos industriais

O objetivo primordial da biotecnologia a obteno de produtos metablicos teis atravs do processamento biolgico. Entende-se por processo biolgico, todo sistema reacional envolvendo seres vivos. Dentre estes seres, destacam-se microrganismos tais como fungos, bactrias, algas, etc. Denominam-se processos fermentativos os processos biolgicos que tm aplicao industrial. Em geral, um processo fermentativo compreende seis etapas, conforme ilustra a Figura 1.3. Estas etapas so: Formulao do meio de cultura: define-se a composio qualitativa e quantitativa do meio de cultura, o pH e a temperatura ideal de cultivo; Esterilizao do meio de cultura e dos equipamentos: promove-se a assepsia de todo material que entrar em contato direto com os microrganismos. Desenvolvimento do inculo: Produo de cultura pura em quantidade suficiente para inocular o biorreator. Para operacionalizar o cultivo de microrganismos em escala industrial necessrio promover o cultivo destes microrganismos em uma srie de vasos ou reatores em escala reduzida (pr-reatores), de modo a garantir o crescimento acelerado e a eliminao da fase de adaptao (lag). Alm disto, necessrio garantir a qualidade do inculo em todas as etapas de forma a garantir resultados consistentes. Promoo do crescimento da populao de clulas no biorreator sob condies propcias para a formao do produto: Nesta etapa aplicam-se todos os conhecimentos adquiridos no estudo da fisiologia do microrganismo de maneira a propiciar as condies mais favorveis para o crescimento celular e a produo do metablito desejado.

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Extrao e purificao do(s) produto(s): Aps a converso biolgica, o produto ou produtos precisam ser separados do meio de cultura e purificados em seguida. Muitos dos produtos do processamento biolgico so quimicamente frgeis, devendo-se controlar cuidadosamente a temperatura e o pH da mistura e aplicar tcnicas de separao que preservem a atividade biolgica dos produtos. Tratamento dos efluentes: recomendvel o tratamento dos efluentes do processo biolgico antes deles serem descartados. Muitas vezes, os efluentes constituem-se em produtos teis, podendo-se aumentar a margem de lucro do processo atravs da utilizao eficiente desses efluentes.

Figura 1.3: Fluxograma de um processo fermentativo (Fonte: Schmidell et al., 2001) Em muitos processos uma ou mais destas etapas so desnecessrias ou diferentes. Por exemplo, a produo de etanol por Saccharomyces cerevisae no Brasil feita sem a esterilizao do meio e dos equipamentos. J a produo de SCP (single cell protein) d-se pela ao de uma mistura de microrganismos, sendo o preparo do inculo diferente do mencionado acima e as prprias clulas so produto desejado. A eficincia do processo fermentativo pode ser aumentada atravs de programas de pesquisa e desenvolvimento atuando principalmente em trs das etapas citadas acima: modificando o microrganismo atravs de tcnicas de mutao e de engenharia gentica, e selecionando variaes de clulas mais produtivas, otimizando as condies do meio durante a reao e desenvolvendo estratgias de separao e purificao do produto.

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2 2.1

Microbiologia Distribuio dos organismos vivos

Figura 2.1: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de R. H. Wittaker em 1969 (Fonte: Borzani et al., 2001).

Figura 2.2: Distribuio dos microrganismos conforme a proposta de C. Woese em 1979 (Fonte: Borzani et al., 2001).

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A nomenclatura dos organismos vivos binomial, sendo que o nome cientfico dado pela combinao do nome genrico (gnero) seguido da espcie. O nome do gnero iniciado com letra maiscula mas o da espcie no. Ambos devem ser escritos em itlico ou grifado. Exemplo:

Saccharomyces cerevisiae gnero espcie


2.2 2.2.1 Morfologia e estrutura Bactrias (procariotos)

As clulas bacterianas podem ter forma esfrica (cocos), cilndrica (bacilos) ou espiralada. Os cocos podem estar isolados (micrococos), em duplas (diplococos), formar correntes (estreptococos) ou formaes aleatrias tipo cachos (estafilococos). Os bacilos podem apresenta-se isolados ou formar correntes (estreptobacilos). As bactrias espiraladas podem ter a forma de espiral (espirilos) ou de uma vrgula (vibries). Seu tamanho varia entre 0,5 e 4,0 m para os cocos e em torno de 19,0 m para os bacilos. As principais estruturas bacterianas, mostradas na Figura 2.3, so: Membrana citoplasmtica: de composio lipoprotica, regula as trocas com o meio externo e executa processos respiratrios, fotossntese, sustentao de ribossomos, orientao da diviso celular e biossntese de estruturas de superfcie. Parede celular: garante a forma celular e protege contra a diferena de presso osmtica entre o interior da clula e o ambiente externo.

Figura 2.3: Representao esquemtica de uma bactria (Fonte: Lehninger, 1997). Citoplasma: solubiliza sais minerais, aminocidos, pequenas molculas, protenas e acares, e possui partculas em suspenso: ribossomos e grnulos de material de reserva (amido, glicognio, lipdeos, fosfatos). Nucleide: filamento duplo de DNA (cromossomo) no associado a protenas e preso a uma invaginao da membrana plasmtica (mesossomo). Flagelos: mobilidade celular. Fmbrias ou pili: fixao celular (formao de biofilmes). A Figura 2.4 mostra fotos de microscopia de diferentes tipos de bactrias. Algumas bactrias possuem a capacidade de formar esporos. Os esporos se constituem em uma clula em tamanho menor, com material nuclear e citoplasma condensado, baixo teor de gua, maior quantidade de clcio e presena do

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cido dipicolnico. Alm da membrana citoplasmtica, o esporo possui vrias camadas de invlucro, possuindo um revestimento bastante espesso e com considervel resistncia agentes externos, sobretudo temperatura. A reproduo das bactrias se d por diviso binria simples, gerando duas clulas filhas iguais.

Escherichia coli

Streptococcus pneumoniae

Lactobacillus acidophilus

Propionibacterium acne

Figura 2.4: Diferentes tipos de bactrias.

2.2.2

Fungos

So organismos eucariticos, heterotrficos. Podem ser divididos em leveduras (unicelulares) e bolores ou mofos. As leveduras possuem forma esfrica, elptica ou filamentosa, com 1 a 5 m de dimetro a 5-30 m de comprimento. Bolores so constitudos por clulas multinucleadas que formas tubos denominados hifas. Um conjunto de hifas denominado de miclio. A clula fngica possui parede celular, membrana citoplasmtica, e membrana nuclear, dentro da qual existem diversos cromossomos, nuclolo e histonas. O citoplasma possui vacolos, mitocndrias, retculo endoplasmtico, ribossomos e material de reserva. A Figura 2.5 apresenta o desenho esquemtico de uma clula eucaritica animal. A reproduo das leveduras pode ser assexuada, por brotamento ou diviso celular, ou sexuada, via formao de esporos.

Figura 2.5: Esquema de clula eucaritica animal (Fonte: http://people.eku.edu/ritchisong/cell1.gif em 01/08/08).

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2.3 2.3.1

Nutrio microbiana Consideraes gerais Quanto nutrio: Plantas: Fotossintticas: obtm energia da luz solar Auxotrficas: nutrem-se basicamente de substncias inorgnicas Animais, fungos: Quimiotrficos: obtm energia atravs de reaes qumicas. Heterotrficos: exigem fontes orgnicas de carbono.

2.3.2

Requisitos Nutricionais

Os microrganismos retiram do meio ambiente todas as substncias necessrias para a sntese de material celular e de obteno de energia. As necessidades nutricionais dos microrganismos variam muito. Organismos autotrficos podem sintetizar todos os metablitos necessrios pela clula a partir de compostos inorgnicos; os heterotrficos requerem um ou mais nutrientes orgnicos. Essas diferenas nutricionais refletem diferenas na habilidade de sntese dos microrganismos. A habilidade em usar diferentes compostos como fonte de energia e de sintetizar protenas e compostos do citoplasma a partir de compostos inorgnicos depende da presena de uma srie de enzimas, sem as quais as clulas tornam-se mais exigentes nutricionalmente. A formao dessas enzimas diretamente controlada pela gentica da clula. A falta ou a represso de um ou mais genes que codificam a formao de uma destas enzimas reflete-se diretamente nas necessidades nutricionais da clula. Geralmente o cultivo de microrganismos para aplicao em biotecnologia feito em ambiente controlado. A formulao do meio de cultura essencial para a produo do metablito desejado. O meio de cultura deve conter todas as substncias que constituem o material celular. As principais substncias so descritas seguir. 2.3.2.1 Fontes de material plstico

O Carbono representa de 45 a 50% do peso seco celular. o componente bsico para a biossntese, fazendo parte de todos os compostos sintetizados pela clula. Geralmente a mesma fonte de carbono serve como fonte de energia. As fontes de carbono mais comuns so os acares e os glicdios (pentoses, hexoses, polissacardeos). Outras fontes de carbono menos comuns abrangem uma ampla faixa de compostos, indo desde os mais simples como metano e metanol s mais complexas como celulose e hemicelulose. No entanto, a eficincia de assimilao destes compostos, do ponto de vista biotecnolgico, muito menor do que as fontes tradicionais e poucos microrganismos selvagens so capazes de assimilar tais compostos. O Nitrognio consiste de 10 a 15% do peso seco das clulas. o componente bsico na formao de aminocidos. assimilado sob forma amoniacal. Fontes de nitrognio em outras forma que no a amoniacal so primeiro transformadas em ons amnio sendo ento utilizadas normalmente no metabolismo celular. Muitas substncias servem como fonte de nitrognio: i) Fontes inorgnicas de nitrognio: NH4Cl, (NH4)2SO4 , NH4NO3, N2, etc. ii) Fontes orgnicas de nitrognio: aminocidos e hidrolisados de protenas naturais, peptdeos, uria, purinas e pirimidinas. Os ons inorgnicos dividem-se em macronutrientes e micronutrientes. Entre os primeiros esto o fsforo e o enxofre. O fsforo assimilado somente na forma de di-hidrognio fosfato (ortofosfato) H2PO4-. importante na regulao do metabolismo celular e no fornecimento de fosfatos para a gerao de energia. A concentrao intracelular de PO43- regula a sntese de lipdeos e carboidratos. O enxofre representa 1 a 2% do peso seco celular e entra na constituio dos aminocidos sulfurados metionina e cistena. As fontes inorgnicas de enxofre so tipicamente K2SO4 ou mais comumente (NH4)2SO4. A formao de pontes de

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dissulfeto e importante para a atividade de protenas. O enxofre encontrado em certas vitaminas tais como biotina e tiamina. Os micronutrientes so necessrios em concentraes da ordem de miligramas por litro de cultura. Esses compostos, s vezes, esto presentes como impurezas de outros ingredientes do meio de cultura. O Potssio regulador da presso osmtica (para cada on metlico bivalente absorvido, o dobro da quantidade de K+ excretada), estimula fermentao e respirao em pH reduzido, e co-fator de vrias enzimas. O Magnsio co-fator de vrias enzimas. Participa na ativao das enzimas glicolticas, estimula a sntese de cidos graxos essenciais, regula os nveis inicos celulares, a ativao de ATPase na membrana e a absoro de fosfato juntamente com K+. A concentrao de Mg++ afeta a associao de ribossomos. O Clcio estimula o crescimento celular pela incorporao na parede celular e membrana plasmtica. O Ferro necessrio para a sntese dos citocromos e de certos pigmentos. Outros ons como Cl-, Na+, Ba2+, Zn2+, Mn2+, Co+2 so encontrados na composio elementar de muitos microrganismos e esto envolvidos em importantes etapas do metabolismo. O Fator de Crescimento um metablito essencial que o microrganismo incapaz de sintetizar, devendo encontrar pr-formado no meio. A bactria Zymomonas mobilis, por exemplo auxotrfica em relao a pantotenato, um precursor da coenzima A. Em geral, os fatores de crescimento podem ser: i) aminocidos - indispensveis para a sntese de protenas; ii) bases pricas e pirimdicas - necessrias para a sntese dos cidos nuclicos; iii) vitaminas - so co-enzimas ou precursores de co-enzimas.

2.3.2.2

gua

Representa 75% de peso celular. essencial para a absoro dos nutrientes e a remoo de produtos indesejveis.

2.3.2.3

Oxignio

O oxignio o receptor final de eltrons na respirao celular. Tambm altera o potencial de oxidao-reduo das clulas. Muitos sistemas enzimticos de clulas requerem condies extremamente reduzidas, isto , um baixo potencial de oxidao-reduo, para funcionar. Outros requerem condies oxidadas, um potencial de oxidao-reduo elevado. Os microrganismos podem ser classificados quanto ao requerimento de oxignio em: i) aerbios - necessitam do oxignio para a sua sobrevivncia. O oxignio participa do metabolismo desses microrganismos como receptor final de eltrons. Bacillus, Pseudomonas e Streptomyces pertencem a esta classe. ii) anaerbios - no sobrevivem na presena de oxignio, que txico para esta classe de microrganismos. As espcie do gnero Clostridium incluem-se nesta classe. iii) anaerbios facultativos - sobrevivem na ausncia ou na presena de oxignio. Tais organismos podem ser subdivididos em dois grupos, dependendo se o oxignio ativamente metabolizado ou meramente tolerado. As bactrias acticas (Streptococcus, Leuconostoc e Lactobacillus) pertencem ao grupo que obtm energia exclusivamente de fermentao, embora no sejam prejudicadas pelo oxignio. Por outro lado, bactrias coliformes, tal como Escherichia coli, podem obter energia de fermentao ou respirao. O desenvolvimento timo destes microrganismos geralmente acontece em uma das duas condies. Zymomonas mobilis por exemplo, se desenvolve na presena de oxignio, porm no o utiliza no seu metabolismo e a taxa de crescimento inferior que na sua ausncia. iv) microaerfilos - precisam de oxignio para sobreviver, mas a concentraes muito baixas. v) aerotolerantes - so bactrias anaerbias que crescem em presses de oxignio inferiores a da atmosfera terrestre.

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2.4 2.4.1

Fatores fsico-qumicos Temperatura

A temperatura ideal para o crescimento do organismo varia de espcie para espcie. Os microrganismos podem ser classificados de acordo com a temperatura em que o seu crescimento pleno em (Figura 2.6): i) psicrfilos- se desenvolvem em temperaturas baixas entre -4C e 15C. Estes microrganismos, por sua vez, apresentam taxas metablicas bastante reduzidas. ii) mesfilos - se desenvolvem em temperaturas mdias entre 20C e 40C iii) termfilos - se desenvolvem em temperaturas entre 45C e 100C. A principal vantagem destes microrganismos sobre os outros que crescem em temperaturas inferiores o metabolismo mais rpido.

Figura 2.6: Classificao dos microrganismos quanto sua temperatura tima de crescimento.

Figura 2.7: Efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula. A influncia da temperatura no crescimento , em ltima anlise, o reflexo do efeito da temperatura nas reaes enzimticas conduzidas na clula. Na Figura 2.7 mostra-se que com a reduo da temperatura, a atividade enzimtica, e portanto a taxa de crescimento celular, diminui. No ponto de congelamento a atividade metablica pra, no somente devido diminuio da atividade enzimtica como tambm porque a clula desprovida de gua. Um aumento da temperatura acima da temperatura tima de crescimento, aumenta a atividade metablica, porm ao mesmo tempo a taxa de degradao das enzimas e das protenas tambm aumenta, resultando eventualmente em dano aos componentes celulares e conseqentemente na morte da clula.

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Note-se, que a faixa de temperatura em que um microrganismo se desenvolve otimamente muito mais estreita que a representada pela classificao acima. A temperatura tima para o crescimento de uma espcie de microrganismo est diretamente relacionada com a temperatura do seu habitat natural.

2.4.2

pH

Existe uma faixa tima de concentrao de ons hidrognio para o desenvolvimento de microrganismos, embora a faixa de pH em que eles se desenvolvam seja relativamente ampla. As bactrias preferem os meios neutros (pH 7-7,5), sendo a maioria tolerantes a pH entre 6 e 9. As leveduras e os mofos preferem meios relativamente cidos de pH 3 a 6. Os microrganismos geralmente crescem melhor no pH do seu habitat natural. Em muitos casos, o prprio microrganismo, como resultado do seu metabolismo, exerce papel preponderante na definio do pH ideal para o seu crescimento. Bactrias produtoras de cido, mofos e leveduras aumentam a concentrao de ons hidrognio no ambiente e tendem a crescer melhor em valores de pH moderadamente baixos. Outras bactrias, especialmente as putrefativas que decompem protenas em aminocidos e amnia, aumentam o pH do ambiente e vivem bem em condies alcalinas.

2.4.3

Presso Osmtica

A presso osmtica de microrganismos independente da presso osmtica do meio de cultura em que eles esto suspensos. Quando uma clula colocada em um meio, uma presso osmtica exercida atravs de sua membrana semi-permevel. Um microrganismo normalmente cresce melhor em meios que tenham concentraes osmticas levemente inferiores sua prpria. Isto causa o fluxo de gua para o interior clula, condio essencial para a difuso de nutrientes e manuteno de uma presso exercida de dentro para fora da clula (turgor). Quando a concentrao do meio consideravelmente menor que a da clula (meio hipotnico), a gua difunde em excesso para interior da clula, aumentando a presso de turgor e causando muitas vezes, o rompimento da membrana celular (plasmlise) em clulas que no so protegidas por uma parede celular rgida. Se a concentrao osmtica do meio maior que a da clula (meio hipertnico), a gua deixa a clula, e a membrana citoplasmtica encolhe se afastando da parede celular. Organismos que crescem em altas presses osmticas ou em altas concentraes salinas so ditas osmoflicos e haloflicos, respectivamente.

2.5

Meios de Cultura

So meios lquidos ou slidos (semi-slido) contendo substncias capazes de proporcionar o crescimento de microrganismos. Os meios de cultura so classificados de acordo com as fontes de nutrientes em complexo e sinttico. Meio Complexo - um meio emprico consistindo de extratos de tecidos animal ou vegetal. Estes meios geralmente contm todos os ingredientes necessrios para o crescimento dos microrganismos, mas eles esto em formas cruas, isto , nem todos os componentes do meio nem as quantidades exatas deles so conhecidas. Muitos componentes de meio complexo so produtos da digesto cida ou enzimtica de tecidos de plantas, carnes, casena e clulas de levedura que so fontes ricas em polipeptdeos, aminocidos, vitaminas e sais minerais. Exemplos de meios complexos so os extratos de levedura e as peptonas (hidrolisados de protena). Estes extratos, geralmente contm carboidratos, no entanto os meios complexos so suplementados com acar. Meio Sinttico (Quimicamente Definido) - so os meios de cultura em que todos os nutrientes necessrios para o crescimento do microrganismo so fornecidos na forma de produtos qumicos relativamente puros e suas quantidades so conhecidos. Diz-se que o meio mnimo quando todos os compostos, exceto fatores de crescimento, so provenientes de fontes inorgnicas.

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Alguns autores chamam de meio semi-definido ou completo, o meio complexo complementado por quantidades conhecidas de sais minerais. Os meios de cultura so usualmente esterilizados com calor em autoclave a 121oC e 15 libras de presso de vapor durante 15 a 30 minutos.

2.6

Microrganismos e meios de cultura para utilizao industrial

Os microrganismos que possam ter interesse industrial podem ser obtidos basicamente das seguintes formas: isolamento a partir de recursos naturais compra de colees de cultura obteno de mutantes naturais obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de biologia molecular.

Caractersticas desejveis em microrganismos industriais: Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto; permitir o acmulo de produto no meio de cultura, de forma a se obter elevada concentrao deste no caldo fermentado; no produzir substncias incompatveis com o produto; apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico; no ser patognico; no exigir condies de processo muito complexas; no exigir meios de cultura dispendiosos.

Caractersticas desejveis nos meios de cultivos: Ser o mais barato possvel; atender as necessidades nutricionais dos microrganismos; auxiliar no controle do processo, como o caso de meios ligeiramente tamponados, que evitam variaes drsticas de pH, ou evitar formao excessiva de espuma; no provocar problemas na recuperao do produto; os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponveis o tempo todo; ter composio razoavelmente fixa; no causar dificuldades no tratamento final dos efluentes.

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Biorreatores e Processos Fermentativos

Denominam-se biorreatores, reatores bioqumicos ou reatores biolgicos os reatores qumicos onde ocorrem uma sries de reaes qumicas catalisadas por biocatalisadores. Estes biocatalisadores podem ser enzimas ou clulas vivas (microbianas, animais ou vegetais). Assim, os biorreatores podem ser classificados em dois grandes grupos: 1. biorreatores nos quais as reaes ocorrem na ausncia de clulas vivas, ou seja, so reatores enzimticos; 2. biorreatores onde as reaes se processam na presena de clulas vivas 3.1 Classificao dos biorreatores Os biorreatores podem receber diversos tipos de classificao, como por exemplo: quanto ao tipo de biocatalisador (clulas ou enzimas); quanto configurao de biocatalisador (cel/enz livres ou imobilizadas); quanto a forma de se agitar o lquido no biorreator.

Considerando as vrias propostas uma classificao mista e abrangente apresentada na Tabela 3.1, seguir. A Figura 3.1 mostra alguns tipos de configuraes de biorreatores. Tabela 3.1: Classificao geral dos biorreatores. CLASSIFICAO DOS BIORREATORES 1. Reatores em fase aquosa (fermentao submersa): 1.1. Clulas ou enzimas livres: - reatores agitados mecanicamente (STR: stirred tank reactors) Figura 3.1 (a) - reatores agitados pneumaticamente: o coluna de bolhas (bubble column) Figura 3.1 (b) o reatores air-lift Figura 3.1 (c) - reatores de fluxo empistonado (plug-flow) 1.2. clulas ou enzimas imobilizadas em suportes: - reatores agitados pneumaticamente com leito fixo ou fluidizado: o coluna de bolhas (bubble column) o reatores air-lift - reatores agitados devido recirculao do meio com leito fluidizado Figura 3.1 (d) - reatores de fluxo empistonado (plug-flow) 1.3. clulas confinadas em membranas: - reatores com membranas planas - reatores de fibra oca 2. Reatores de fase no aquosa (fermentao em estado slido) - reatores estticos (bandejas) - reatores com agitao (tambor rotativo) - reatores com leito fixo - reatores com leito fluidizado gs-slido. Fonte: Adaptado de Schmidell et al., 2001

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Figura 3.1: Configuraes de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) air-lift; (d) recirculao de meio com leito fluidizado. 3.2 Formas de conduo de um processo fermentativo: a) descontnuo: - com um inculo por tanque; - com recirculao de clulas; b) semicontnuo: - sem recirculao de clulas; - com recirculao de clulas; c) descontnuo alimentado: - sem recirculao de clulas; - com recirculao de clulas; d) contnuo: - executado em um biorreator (com ou sem recirculao de clulas); - executado em vrios biorreatores (com ou sem recirculao de clulas).

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Cultivo Descontnuo

Os cultivos descontnuos clssicos vm sendo utilizados pelo homem desde a Antigidade e, ainda hoje so os mais utilizados para a obteno de diversos produtos. So tambm conhecidos como fermentaes descontnuas, fermentaes por batelada ou processo descontnuo de fermentao. Forma de operao: No primeiro instante, o meio de cultura esterilizado adicionado ao biorreator. Aps adicionada o inculo e inicia-se o cultivo. Ao longo do cultivo podem ser adicionados ar, no caso de cultivos aerbios, soluo cida e/ou alcalina, quando se deseja manter o pH constante, e antiespumante. Terminado o tempo de cultivo, esvazia-se o biorreator e o meio fermentado segue para a etapa de extrao e purificao dos produtos. O biorreator ento lavado, esterilizado e recarregado novamente com meio de cultivo. Caractersticas dos cultivos descontnuos: - volume de meio de cultura praticamente constante ao longo do cultivo; - pode ter baixos rendimentos e/ou produtividades devido a efeitos de inibio pelo substrato ou pelo produto e dos tempos mortos de carga, descarga, lavagem e esterilizao do biorreator; - baixo risco de contaminao; - grande flexibilidade de operao. 4.1 Inculo

Denomina-se de inculo, p-de-cuba ou p-de-fermentao um volume de suspenso de microrganismo de concentrao adequada capaz de garantir, em condies econmicas, o cultivo de um dado volume de meio de cultura. O armazenamento dos microrganismos possui o objetivo de conservar a cepa vivel e com capacidade produtiva, portanto, como o mnimo possvel de divises celulares, evitando desta forma o aparecimento de mutaes. O principais mtodos de armazenamento das cepas so em gar inclinado ou secas. A manuteno da cepa to importante que algumas empresas possuem centros especializados para manuteno e distribuio das cepas. O volume de inculo introduzido em um fermentador normalmente em torno de 10% de sua capacidade til, podendo variar, no entanto entre 0,5% e 50% de sua capacidade conforme o processo. A Figura 4.1 apresentas as diversas fases de preparao do inculo. Nos processos industriais, as bateladas podem ser classificadas conforme seu inculo em trs tipos: - cada biorreator recebe um inculo; - processo com recirculao de microrganismos; - processo por meio de cortes. 4.2 Meio de cultura

Tambm denominado de mosto, o meio de cultura deve possuir os nutrientes necessrios para o crescimento celular: a) b) c) d) elementos principais: C, H, O e N; elementos secundrios: P, K, S, Mg; vitaminas e hormnios; elementos traos: Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, etc.

Na hora de escolher um meio de cultivo para utilizao industrial, a quantidade de cada um dos elementos no meio de cultivo deve levar em conta a necessidade de nutrientes do microrganismo e favorecer a formao do produto final. Outro fatores importantes so: - o custo; - a quantidade de carbono disponvel;

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a disponibilidade e o armazenamento; dificuldade de esterilizao; a fermentescibilidade; o comportamento do meio durante e aps o cultivo (ex: formao de espuma);

Exemplos de substratos disponveis para utilizao como meio de cultura industrial: acares, melaos, soro de queijo, celulose, amido, e resduos como gua de macerao de milho, metanol, etanol, alcanos, leos e gorduras, etc.

Figura 4.1: Representao esquemtica do preparo do inculo (Fonte: Schmidell et al., 2001)

4.3

Cintica de um cultivo em batelada

O estudo cintico de um processo fermentativo consiste, inicialmente, na anlise da evoluo dos valores de concentrao de um ou mais componentes do sistema. Por componentes do sistema entende-se: - Microrganismo (biomassa) X - Substratos do meio de cultura S - Produto ou metablito P Parmetros de um processo biolgico: Velocidades instantneas de transformao, r: tambm denominadas velocidades volumtricas de transformao, com unidades (massa) (comprimento)-3 (tempo)-1. Velocidades especficas de transformao, : tambm denominada velocidade especfica de crescimento em (tempo)-1. Tempo de duplicao, td : O crescimento celular muitas vezes expresso em termos de tempo de duplicao. Fatores de converso e coeficientes especficos de manuteno, Y e m.

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4.3.1

Cintica de crescimento celular

Em um cultivo descontnuo so observadas diferentes fases na curva de crescimento celular. Estas fases so bem visveis quando se desenha o grfico semilogartmico da concentrao de clulas viveis contra o tempo, como mostrado na Figura 4.2.

Figura 4.2: Curva de crescimento em reator batelada (Fonte: Doran, 1995). Fase lag ou de latncia: durante a fase lag, a taxa de crescimento nula (X = X0 = cte), pois as clulas esto se adaptando ao novo meio de cultura, sintetizando novas enzimas ou componentes estruturais. A durao da fase lag varia com a concentrao do inculo, com a idade do microrganismo e com seu estado fisiolgico. Conforme a composio e a durao do pr-inculo possvel que a fase lag nem exista. Fase de acelerao: a fase de transio em que se observa o incio da reproduo microbiana. Ocorre um aumento gradual na velocidade de reproduo e, conseqentemente, na velocidade especfica de crescimento. Fase exponencial de crescimento: a velocidade especfica de crescimento constante e mxima ( = mx). Desta forma, pode-se concluir, atravs da equao (4.1), que a velocidade de crescimento diretamente proporcional concentrao celular X:

dX = mx X dt

(4.1)

Fase de declnio ou desacelerao: medida que os nutrientes do meio de cultura vo se esgotando, ou que so formados produtos inibitrios, a taxa de crescimento cai e a curva de crescimento celular entra na fase de declnio. Fase estacionria: nesta fase foi atingida a concentrao mxima de clulas no meio de cultivo e esta concentrao constante (X = Xmx) durante a fase estacionria. H um balano entre a velocidade de reproduo e a velocidade de morte dos microrganismos, ocorrendo tambm modificaes na estrutura bioqumica da clula. Fase de morte: o valor da concentrao celular diminui porque as clulas perdem viabilidade ou so destrudas por lise.

4.3.2

Equao de Monod: interpretao da fase exponencial de crescimento

A equao emprica abaixo, proposta por Monod, tem sido normalmente utilizada para explicar a relao entre a concentrao de substrato limitante no meio de cultivo, S, e a velocidade especfica de reproduo do microrganismo, :

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mx S
KS + S

(4.2)

onde mx representa a velocidade especfica mxima de crescimento do microrganismo e KS a constante de saturao. Na equao (4.2), fazendo-se S = KS, tem-se que = mx , ou seja, KS a concentrao de substrato quando a metade de mx. A equao (4.2) est representada na Figura 4.3 para dois valores diferentes de KS. Quanto menor for o valor de KS, maior ser a durao da fase exponencial de crescimento. A Tabela 4.1 apresenta valores de KS para diversos microrganismos.

0,16 0,14 0,12 0,10


-1 (h )

B A

0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 S (mg/L)

Figura 4.3: Curvas da equao de Monod para valores hipotticos de mx = 0,14h-1 e KS = 0,60mg.L-1 (Curva A) e KS = 0,030mg.L-1 (Curva B). A equao de Monod no leva em conta o efeito inibidor tanto do substrato como do produto formado, contudo no o nico modelo que tenta explicar a relao entre o substrato limitante e a velocidade de crescimento microbiano nesta condio de cultivo. Outras equaes foram propostas e merecem ser citadas: Equao de Teissier:

= mx 1 e

Equao de Moser:

KS

(4.3)

= mx

Sn KS + S n S KS X + S S KS + KD + S

(4.4)

Equao de Contois e Fujimoto:

= mx
Equao de Powell

(4.5)

= mx

(4.6)

A ausncia de inibio , na verdade, uma situao pouco comum na prtica, principalmente em cultivos descontnuos, onde h um crescente acmulo de metablitos que acabam interferindo desfavoravelmente sobre o metabolismo e crescimento microbianos.

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Tabela 4.1: valores de KS para diferentes microrganismos. Microrganismo (gnero) Saccharomyces Escherichia Substrato limitante Glicose Glicose Lactose Fosfato Glicose Glicerol Oxignio Metanol Metano Dixido de carbono Magnsio Potssio Sulfato Metanol Ribose Tiamina KS (mg.L-1) 25 4,0 20 1,6 5,0 4,5 0,042-0,45 0,7 0,4 0,4 0,56 0,39 2,7 120,0 3,0 1,4 10-7

Aspergillus Candida Pseudomonas Klebsiella

Hansenula Cryptococcus Fonte: Doran, 1997

de mx, provoca o efeito contrrio, conforme mostrado na Figura 4.4:


0,14 B

O efeito da inibio pelo substrato ocorre quando um alto valor inicial de S, ao invs de aproximar

-1 (h )

A 0,07

0,00 0,0S K 5,0 10,0 15,0 K 20,0 I,S 25,0 S (mg/L)

Figura 4.4: Cintica de inibio pelo substrato (Curva A) e sem inibio (Curva B), conforme a equao de Monod para mx = 0,14 h-1. Com o objetivo de explicar esta reduo na velocidade especfica de crescimento, foi proposta uma modificao na equao de Monod:

= mx

K I ,S S K S + S K I ,S + S

(4.7)

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Nesta nova expresso, KS continua sendo a constante de saturao da equao de Monod, e KI,S a constante de inibio pelo substrato, que se refere a um valor de S para qual X = mx , porm para um valor de S de cause inibio, sendo assim superior ao valor de S da equao de Monod. Se KI,S muito maior que S, a ltima parte da equao 4.7 fica igual unidade e no h inibio pelo substrato. Quando ocorre inibio pelo produto, uma equao semelhante foi proposta:

= mx

K I ,P S K S + S K I ,P + P

(4.8)

onde KI,P a constante de inibio pelo produto, com significado semelhante KI,S da equao 3.20. 4.3.3 Cintica de formao de produto

Os produtos de fermentao podem ser classificados conforme a relao entre a cintica de formao do produto e a gerao de energia pela clula. Conforme a Tabela 4.2 podemos classificar a cintica de formao de produtos durante a fermentao em trs tipos: - produtos diretamente associados formao de energia na clula (crescimento celular); - produtos indiretamente associados ao crescimento celular; - produtos no associados ao metabolismo energtico. Tabela 4.2: Exemplos de produtos conforme sua associao com o metabolismo energtico. Classe de produto Exemplos

Etanol, cido actico, cido glucnico, produtos diretamente associados formao de energia na clula acetona, butanol, cido ltico e outros produtos de fermentao anaerbica. produtos indiretamente associados formao de energia na clula produtos no associados ao metabolismo energtico Fonte: Doran, 1997. Aminocidos e derivados, cido ctrico, nucleotdeos. Penicilina, estreptomicina, vitaminas

4.3.4

Cintica de consumo de substrato pela clula

As clulas consomem substrato do meio externo e os canalizam para diferentes vias metablicas. Parte direcionada a crescimento e sntese de produtos, outra frao utilizada para gerar energia para a manuteno da atividade celular. A necessidade de substrato para manuteno depende do microrganismo e das condies de cultura. A velocidade especifica de consumo de substrato para manuteno da atividade celular conhecida como coeficiente de manuteno, mS, com dimenso (tempo)-1, geralmente expresso em (kg de substrato) (kg de biomassa)-1 (s)-1. Alguns exemplos de coeficiente de manuteno so mostrados na Tabela 4.3. A fora inica do meio de cultivo possui grande influncia no coeficiente de manuteno celular, pois so necessrias grandes quantidades de energia para manter os gradientes de concentrao atravs da membrana celular.

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Tabela 4.3: Coeficiente de manuteno de diversos microrganismos em glicose como fonte de carbono. Microrganismo Saccharomyces cerevisiae Azotobacter vinelandii Klebsiella aerogenes Lactobacillus casei Aerobacter clocae Penicilium crysogenum Fonte: Doran, 1997 Condio de cultivo mS (kg glicose) (kg clulas)-1 (s)-1 anaerbia 0.036 anaerbia, 1,0M NaCl 0,360 1,5 fixao de nitrognio, tenso de O2 dissolvido: 0,2 atm 0,15 fixao de nitrognio, tenso de O2 dissolvido: 0,02 atm 2,88 anaerbica, limitao de triptofano, 2g.L-1 NH4Cl 3,69 anaerbica, limitao de triptofano, 4g.L-1 NH4Cl 0,135 anaerbia, limitao de glicose 0,094 aerbia 0,022

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Cultivo Contnuo

O cultivo contnuo caracteriza-se por possuir uma vazo de alimentao contnua e constante de meio de cultura dentro do biorreator, sendo que o volume de meio de cultura mantido constante dentro do biorreator atravs da retirada contnua de meio cultivado. Nesta operao o biorreator atinge a condio de estado-estacionrio ou regime permanente, no qual as variveis de processo permanecem constantes ao longo do tempo. Vantagens do processo contnuo em relao ao descontnuo: - aumento da produtividade do processo devido da reduo dos tempos mortos e no produtivos; - o meio de sada do biorreator uniforme, facilitando os processos de extrao e recuperao de produto; - manuteno das clulas num mesmo estado fisiolgico; - possibilidade de associao com outras operaes contnuas da linha de produo; - menor necessidade de mo-de-obra. Desvantagens do processo contnuo: - maior investimento inicial na planta; - possibilidade de ocorrncia de mutaes genticas espontneas; - maior possibilidade de ocorrncia de contaminaes; - dificuldade de operao do estado estacionrio. 5.1 Formas de operao do sistema contnuo

O cultivo contnuo normalmente tm incio num cultivo em batelada. Aps o final de um processo batelada tpico, inicia-se a entrada e retirada de meio de cultivo, dando-se incio operao contnua propriamente dita. Uma vez iniciado o processo, ele ir convergir para o estado estacionrio com maior ou menor rapidez, dependendo das condies do processo.. O sistema contnuo extremamente verstil quanto as vrias possibilidades de operao: - contnuo em um nico estgio (um nico reator) com ou sem reciclo de clulas. - contnuo em mltiplos estgios (n reatores em srie): i. com uma nica alimentao (com ou sem reciclo de clulas); ii. com mltiplas alimentaes (com ou sem reciclo de clulas).

20 18 16 14 X, S (g/L) 12 10 8 6 4 2 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 diluio (1/h)

12 10 X Qx 6 4 2 0 Qx (g/(L.h) S 8

Figura 5.1: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L.

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70 60 50 X, S (g/L) 40 X 30 20 10 0 0,0 0,5 1,0 1,5 diluio (1/h) 2,0 2,5 3,0 X Qx S S Qx

40 35 30 Qx (g/(Lh)) 25 20 15 10 5 0

Figura 5.2: Variao da concentrao celular (X) e da concentrao de substrato (S) na corrente de sada, e da produtividade celular (QX) com a taxa de diluio em um cultivo contnuo, com mx = 0,8h-1, S0 = 40g/L, YX/S = 0,45 e KS = 1g/L em um sistema com reciclo interno onde a frao de meio que sai diretamente do biorreator 0,2 e o fator de diluio do meio filtrado 0,1.

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Cultivo Semi-contnuo

O cultivo recebe a denominao de semi-contnuo quando, uma vez colocados no biorreator o meio de cultura e o inculo, as operaes que se seguem obedecem seguinte ordem: 1. aguarda-se o trmino do cultivo 2. retira-se parte do meio cultivado, mantendo-se no reator o restante do meio cultivado 3. adiciona-se no reator um volume de meio de cultivo igual ao volume retirado na operao anterior (2). Este processo chamado semi-contnuo porque so intermitentes tanto o fluxo de entrada de meio no reator quanto o de sada de material cultivado. O antigo processo de fabricao de vinagres partir do vinho um exemplo tpico de processo semi-contnuo. Vantagens do processo semi-contnuo a) possibilidade de operar o biorreator por longos perodos sem que seja necessrio preparar um novo inculo; b) possibilidade de aumentar a produtividade do biorreator apenas modificando-se o cronograma de trabalho; c) possibilidade de, uma vez conhecidas as condies timas de operao, conseguir produtividade significativamente maior que a obtida em processos descontnuos. 6.1 Produtividade de um processo semi-contnuo A produtividade do processo semi-contnuo depende de fatores como: - a quantidade inicial de clulas no biorreator - a concentrao inicial de substrato - a concentrao inicial de produto. Contudo, os fatores acima relacionados dependem de uma nica varivel: a frao de meio cultivado de que retirada do biorreator aps cada cultivo, . A Figura 6.1 mostra algumas relaes de com a produtividade. Duas situaes devem ser comentadas: a) se = 1, todo o meio do reator retirado e no haver mais cultivo b) se se aproximar muito de zero, o volume de meio retirado do biorreator ser muito pequeno e o processo se aproximar de um cultivo contnuo.

Figura 6.1: influncia de sobre a produtividade de um processo semi-contnuo (Fonte: Schmidell et al., 2001).

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Cultivo em Regime Batelada Alimentada

O cultivo em regime batelada alimentada definido como a tcnica em que um ou mais nutrientes so adicionados ao biorreator durante o cultivo com vazo de alimentao controlada, e os produtos permanecem no biorreator at o final do cultivo. A vazo de alimentao pode ser constante ou pode variar com o tempo. Pode ser ainda contnua ou intermitente. No cultivo em batelada-alimentada, a concentrao de um dado substrato pode ser controlada dentro do biorreator de modo que, por exemplo, o metabolismo microbiano seja deslocado para uma determinada via metablica, levando ao acmulo de um produto especfico. Vantagens do cultivo em baleada-alimentada: a) minimizao da represso catablica de enzimas do metabolismo de fontes de carbono complexas pela glicose e outras fontes de carbono rapidamente metabolizveis; b) minimizao da represso catablica pela glicose sobre a produo de metablitos secundrios como alcalides de ergot, cefalosporina C, indolmicina, bacitracina, estreptomicina, neomicina, novobiocina, penicilina, etc.; c) inibio da produo de proteases quando o produto um protena recombinante extracelular; d) preveno da inibio por substratos como etanol, metanol, cido actico e compostos aromticos; e) minimizao da formao de produtos txicos do metabolismos celular, como etanol para leveduras, cido actico para Escherichia coli e lactato e amnia no cultivo de clulas animais; f) minimizao de problemas como contaminao, mutao e instabilidade de plasmdeo; i. formao de espuma ii. nutriente instvel iii. processos aerbios de longo perodo (1 a 2 semanas). h) estudo da cintica de processos fermentativos. Os cultivos em batelada alimentada permitem que se trabalhe com cultivos em duas fases, uma de crescimento e outra de produo de produto e ainda que se obtenham cultivos com grandes concentraes de clulas, at 100g/L. O cultivo em batelada-alimentada repetitiva aquele em que uma frao constante do volume da cultura removida em intervalos de tempos fixos, podendo ser mantido indefinidamente. O cultivo em batelada-alimentada estendida aquele em que a concentrao do substrato limitante mantida constante no meio de fermentao atravs do suprimento contnuo deste nutriente. O cultivo em batelada-alimentada ainda pode ser dividido em dois tipos baseado no fato de a vazo de alimentao ser ou no baseada em um sistema de retro-alimentao. No modo de operao com sistema retro-alimentado, a vazo de alimentao pode ser controlada atravs da concentrao de substrato no meio de alimentao (sistema direto) ou em funo de outros parmetros (controle indireto) como densidade tica, pH, coeficiente de respirao, concentrao de etanol e outros. No modo de operao no reto-alimentado a vazo de alimentao pode ser intermitente ou contnua, seguindo um padro pr-estabelecido. g) adequao do bioprocesso s condies operacionais:

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0,20 F (m /h) 0,15 0,10 0,05 0,00 0

exponecial linear constante

veloc espec crescimento (1/h)

0,25

0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0 5 10 15 tempo (h) 20 25 30 exponecial linear constante

10

15 tempo (h)

20

25

30

Figura 7.1: Grficos da variao da vazo de alimentao, F, e da velocidade especfica de crescimento, , em cultivos em regime batelada-alimentada com vazo de alimentao constante, linear crescente e exponencial.

Figura 7.2: Biomassa e produo de ergosterol para diferentes mtodos de controle de alimentao em cultivos batelada alimentada (Fonte: Gao & Tan, 2003).

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Figura 7.3: Cultivo batelada-alimentada com alimentao exponencial combinada com pH-stat de Escherichia coli K12 com velocidade especfica de crescimento controladas em 0,1h-1 (esquerda) e 0,3h-1 (direita) (Fonte: Kim et al., 2004)

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Reatores com clulas imobilizadas

Clulas imobilizadas so definidas como clulas fisicamente confinadas ou localizadas em um espao definido com a reteno das suas atividades catalticas, e que podem ser utilizadas repetida e continuamente. Pode-se dividir os processos com clulas imobilizadas em dois tipos: Os primeiros so os que utilizam as enzimas contidas nas clulas, no havendo necessidade de coenzimas (ATP, NADH) e vias anablicas presentes na replicao celular. Exemplos: produo industrial de cido mlico, cido asprtico e xarope de frutose de milho (High Frutose Corn Syrup). O segundo tipo o que necessita manter a viabilidade celular, uma vez que os produtos formados requerem mltiplos passos de transformaes, regenerao de coenzimas, presena de cadeia respiratria, vias metablicas geradoras de produtos intermedirios e outros mecanismos inerentes s clulas vivas. Histrico: 1916: Nelson e Griffin descobriram que uma invertase de levedura mantinha sua atividade cataltica de hidrlise de sucrose quando adsorvida em carvo ativado (activated charcoal). 1953: Grubhofer e Schleith imobilizaram diversas enzimas (carboxipeptidase, diastase, pepsina e ribonuclease) numa resina de poly-amino-estireno diazotizado por ligao covalente. 1969: Chibata e colaboradores desenvolveram a primeira aplicao industrial de biocatalizadores imobilizados. Uma aminoacilase fngica foi imobilizada em DEAE-Sephadex por ligao inica e foi utilizada para a hidrlise estreo-seletiva de N-acil-D,L-aminocidos para produzir L-aminocidos e N-acil-Daminocidos. 1973: Chibata e colaboradores desenvolveram a primeira aplicao industrial de clulas imobilizadas, produzindo L-aspartato de fumarato de amnia atravs de clulas de Escherichia coli imobilizadas em gel de poliacrilamida.

8.1

Mtodos de imobilizao celular

A imobilizao celular freqentemente imita fenmenos que ocorrem na natureza: muitos microrganismos possuem a capacidade de aderir naturalmente sobre diferentes tipos de materiais e estruturas, formando biofilmes. As vrias tcnicas de imobilizao celular podem ser classificadas em quatro grupos, conforme o mecanismo de imobilizao empregado (Figura 8.1): 1. ligao ou adsoro sobre a superfcie de um suporte slido; 2. envolvimento em uma matriz porosa; 3. formao de agregados celulares por floculao (natural) ou ligao com o uso de agentes qumicos (induzida artifcialmente); 4. conteno das clulas atrs de uma barreira.

8.1.1

Imobilizao sobre a superfcie de um suporte slido

A imobilizao celular sobre a superfcie de um suporte slido ocorre atravs de adsoro devido foras eletrostticas entre a membrana celular e a superfcie do suporte, ou devido ligaes covalentes. A espessura do biofilme varia de uma monocamada celular at em torno de 1 mm. Suportes slidos utilizados: a) materiais celulsicos: DEAE-celulose (Dietilaminoetil-celulose), madeira, serragem;

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b) materiais inorgnicos: poligorsquita, montmorilonita, hidromica, porcelana poroso, vidro poroso, etc. Os materiais slidos como vidro e celulose podem tambm ser tratados com polictions, quitosana ou outros compostos qumicos para aumentar sua capacidade de adsoro.

Figura 8.1: Desenho esquemtico dos mtodos bsicos de imobilizao celular (Fonte: Kourkoutas et al., 2004).

8.1.2

Envolvimento em uma matriz porosa:

um mtodo de imobilizao muito utilizado devido sua facilidade, baixssima toxidez e alta capacidade de reteno celular. As clulas ficam imobilizadas dentro de uma matriz polimrica formadora de um gel hidroflico. Os poros da matriz no menores que as clulas contidas no seu interior e permitem a transferncia de nutrientes e metablitos. Os materiais mais utilizados para a produo de partculas so os gis polissacardecos de alginato, agar, quitosana e cido poligalacturnico, ou outras matrizes polimricas como gelatina, colgeno e lcool polivinlico. A imobilizao em gar realizada pelo abaixamento da temperatura, e dos outros polmeros polissacardeos conforme o esquema da Figura 8.2.
K-carragena,

A principal desvantagem desta tcnica a limitao imposta pela difuso intraparticular de substratos e produtos metablicos. O tamanho da partcula, a difusividade atravs da matriz polimrica e a concentrao celular na partcula devem ser otimizados no sentido de minimizar estes efeitos.

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Polissacardeo (1 a 4%) + clulas

Partculas contendo clulas imobilizadas dimetro de 0,5 a 5 mm 250 mg de clulas / g matriz

Soluo de KCl ou CaCl2 0,05 a 0,5M

Agitador magntico

Figura 8.2: Imobilizao de clulas por envolvimento em gel hidroflico induzida por Ca++ e K+.

8.1.3

Floculao celular (agregao)

A floculao celular definida como uma agregao de clulas formando uma unidade maior ou como a propriedade de clulas em suspenso de formarem agregados e sedimentarem. Sobretudo fungos e clulas de plantas formam agregados, contudo pode-se adicionar agentes floculantes em culturas celulares que no floculam naturalmente. A floculao da levedura Saccharomyces cerevisiae durante a fabricao de cerveja de grande importncia, pois afeta a produtividade da fermentao e a qualidade da cerveja, alm de interferir na separao e recuperao da levedura.

8.1.4

Conteno mecnica atrs de uma barreira

A conteno das clulas atrs de uma barreira pode ser obtida utilizando-se membranas microporosas, pelo envolvimento das clulas em microcpsulas ou pela imobilizao das clulas na superfcie de interao entre dois lquidos imiscveis. Os biorreatores de membranas so um exemplo deste tipo de imobilizao e so tratados no Captulo 9.

8.2

Caractersticas e vantagens da imobilizao celular Os suportes so adequados para a imobilizao celular quando possuem as seguintes caractersticas:

1. o suporte deve possuir uma grande superfcie, com grupos funcionais para a adeso celular; 2. o suporte deve ser de fcil manipulao e regenerao; 3. o biocatalisador imobilizado deve possuir grande viabilidade celular e alta estabilidade, alm de ficar retido (imobilizado) por longos perodos de tempo; 4. a atividade biolgica das clulas imobilizadas no pode ser afetada pelo processo de imobilizao; 5. o suporte deve ter porosidade uniforme e controlvel, permitindo a transferncia de massa de substratos, produtos, co-fatores e gases; 6. o suporte e a tcnica de imobilizao devem ser simples, de custo acessvel, e passvel de escalonamento.

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Os cultivos com clulas imobilizadas possuem diversas vantagens sobre os cultivos com clulas livres: atividade e estabilidade prolongada do biocatalisador, pois o suporte de imobilizao pode atuar como uma barreira protetora aos efeitos fsico-qumicos do pH, temperatura, solvente ou metais pesados; maior densidade de clulas por unidade de volume do biorreator, levando a uma maior produtividade volumtrica, menor tempo de cultivo, eliminao de fases de crescimento celular no produtivas; maior consumo de substrato e aumento do rendimento; possibilidade de processamento contnuo; aumento da tolerncia a altas concentraes de substrato e menor inibio pelo produto final; maior facilidade na recuperao do produto, diminuindo a necessidade de filtrao e separao, diminuindo assim os custo de equipamento e mo-de-obra e o consumo de energia; regenerao e reutilizao do biocatalizador em cultivos batelada, sem remov-los do biorreator, levando a cultivos semi-contnuos; reduo do risco de contaminao microbiana devido alta concentrao celular; possibilidade do uso de biorreatores menores, com processos mais simplificados, reduzindo o custo.

8.3

Exemplos de usos de clulas imobilizadas

5000 atividade lipoltica (U/L) 4000 3000 2000 1000 0 72 96 tempo (h) cl livres alginato de sdio k-carragena poliacrilamida 120

Figura 8.3: Produo de lipase com clulas imobilizadas e clulas livres (Fonte: Ellaiah et al., 2004).

Figura 8.4: Cintica de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001).

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produtividade (g EtOH / (L.h))

produtividade (g EtOH / (L.h))

5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 1 2 3 4 batelada 5 6 7

10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30 vazo de alimentao (mL/h)

(a)

(b)

Figura 8.5: Produtividade de um cultivo semicontnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus coimobilizadas em alginato de sdio (b) Produtividade de um cultivo contnuo de clulas de Z. mobilis e S. diastaticus co-imobilizadas em alginato de sdio em biorreator PBR com 60mL de volume de trabalho (Fonte: Amutha & Gunasekaran, 2001).

Figura 8.6: Biomassa e atividade de bacteriocina em um biorreator contnuo com clulas livres (Fonte: Bhugaloo-Vial et al., 1997).

Figura 8.7: Produtividade de bacteriocina com a taxa de diluio (a) em um biorreator contnuo com clulas livres e (b) em biorreator contnuo PBR com clulas imobilizadas em alginato de sdio (Fonte: BhugalooVial et al., 1997).

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Figura 8.8: Produo de etanol, evoluo de CO2 e consumo de glicose por clulas de S. cerevisiae imobilizadas (smbolo cheio) e livres (smbolo aberto) (Fonte: Wendhausen et al., 2001).

Figura 8.9: Produtividade (smbolo cheio) e concentrao de etanol (smbolo aberto) em clulas de S. cerevisiae imobilizadas em funo da taxa de diluio e em funo do tempo em um bioreator de leito empacotado alimentado com 33% de caldo de cana (180 g/L de sacarose) a 30oC (Fonte: Wendhausen et al., 2001).

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Biorreatores com membranas

Os biorreatores com membranas (MBR Membrane Bioreactor) so um importante avano no desenvolvimento de processos por membranas. Desde que se iniciaram as pesquisas em MBR na dcada de 70, foram desenvolvidas diversas geraes de MBRs. Desde ento os sistemas com MBRs so utilizados sobretudo para tratar efluentes industriais, domsticos e municipais, quando os padres de descarga so bastante rgidos ou se faz a reutilizao da gua. Um MBR combina o processo de lodo ativado com o processo de separao por membranas. O reator operado de forma similar a um reator convencional de lodo ativado, porm no necessita de passos secundrios de clarificao, e tercirios como filtrao em areia. Pode-se se utilizar membranas de micro ou de ultrafiltrao para separar o lodo ativado do efluente. As duas principais configuraes de MBRs so os MBRs de membrana submersa ou com membrana de circulao externa, conforme mostrado ma Figura 10.1.

Figura 9.1: Configuraes de MBRs: (a) membrana submersa, (b) circulao externa (Fonte: Melin et al., 2006). A primeira gerao de MBRs foram os sistemas de circulao externa, onde o mdulo de filtrao (membranas) localizado fora do biorreator. A soluo efluente bombeada em alta velocidade paralelamente s membranas, e a soluo concentrada retorna ao tanque de lodo ativado. Os MBRs desenvolvidos recentemente possuem a configurao de membrana submersa, onde o mdulo de filtrao colocado dentro do tanque de aerao contendo o efluente e o lodo ativado. A caracterstica desta configurao o baixo fluxo atravs da membrana reduzindo as obstrues (fouling) tanto quanto possvel e operando a baixa presso transmembrana. Os MBRs com circulao externa normalmente utilizam mdulos tubulares de membranas, enquanto que os de membrana submersa utilizam os mdulos de membrana plana (flat plate) ou de fibra-oca (hollow-fibre). A Tabela 10.1 mostra a comparao entre estes mdulos de membranas. O papel principal da membrana em um MBR uma barreira contra slidos suspensos. Contudo, devido complexidade do efluente lquido, possvel a remoo de espcies solveis, conforme o tipo de membrana: microfiltrao (MF), ultrafiltrao (UF) ou nanofiltrao (NF). Microfiltrao: - poros: 0,1-0,2 m - remoo de slidos suspensos como bactrias - remoo parcial de vrus e macrosolutos

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Ultrafiltrao: - poros de 0,1 m a 5 nm - boa remoo de vrus e substncias polimricas extracelulares (SPE) Nanofiltrao: - poros de 2 nm - retm quase todas as espcies solveis, com exceo de alguns ons e substncias orgnicas de baixo peso molecular.

Tabela 9.1: Comparao das caractersticas dos diferentes mdulos de membranas utilizados em MBRs. Mdulo de membrana Vazo (L/(h.m2)) MLSS recomendado (gMLSS/L) Consumo de energia (kWh/m3) Custo por m2 Faixa de pH Temperatura de trabalho Densidade do empacotamento limpeza Membrana plana 15-25 10-15 0,3-0,6 alto 1-12 < 60oC moderada moderada Fibra-oca 20-30 10-15 0,3-0,6 mdio 2-11 < 40oC alta retrolavagem Tubular 70-100 15-30 2-10 Muito alto 1-13 < 100oC baixa possvel uma boa limpeza fsica

Fonte: Lesjean et al. (2004); Fane (2002) Vantagens da tecnologia de MBRs comparadas ao processo de lodo ativado convencional: - Desinfeco do efluente, pois as membranas constituem uma barreira fsica para as bactrias e, no caso das membranas de UF, para os vrus; - Menor tamanho de biorreator como conseqncia da alta concentrao de slidos suspensos no efluente (MLSS - Mixed Liquor Suspended Solids) quando se opta por uma idade de lodo baixa ou moderada; - Menor produo de lodo quando se opta por uma alta idade do lodo; - Efluente com qualidade maior e mais consistente, como resultado da filtrao por membrana; - Menor sensibilidade a picos de concentrao e contaminao. Principais desvantagens dos MBRs: - Custo relativamente alto de instalao e operao - Necessidade de monitoramento e manuteno freqente da membrana; - Limitaes de pH, temperatura e presso; - As membranas tambm podem ser sensveis algumas substncias qumicas; - Menor eficincia de transferncia de oxignio devido alta concentrao de MLSS; - A tratabilidade do lodo excedente questionvel. A tecnologia de MBR mais cara que a tecnologia convencional de tratamento de efluentes, contudo encontra suas aplicaes em alguns casos especiais: - quando se necessita de uma tecnologia compacta, devido falta de espao ou ao alto custo da terra em reas urbanas; - quando se necessita de uma lata qualidade final do efluente, por exemplo, para reutilizao da gua (irrigao, atividades recreacionais, indstria, reutilizao

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domstica, ou recarga de aqferos), ou como pr-tratamento antes de nanofiltrao, osmose reversa ou deionizao (na dessalinizao e produo de gua ultrapura). Segundo Yang et al. (2006) existem mais de 2200 instalaes de MBRs em operao ou em construo espalhadas pelo mundo, a grande maioria para tratamento de esgoto municipal. A sia, especialmente o Japo e a Coria do Sul, abraaram a tecnologia de MBRs sobretudo para o tratamento em pequena escala de esgotos domsticos.

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10 Cultivo Semi-Slido O cultivo semi-slido (CSS) definido como processos que se referem a cultura de microrganismos sobre ou dentro de partculas em uma matriz slida (substrato ou material inerte, onde o contedo de lquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela est a um nvel de atividade de gua que, por um lado assegure o crescimento e o metabolismo das clulas e, por outro, no exceda a mxima capacidade de ligao da gua com a matriz slida. Histrico do CSS: produo de molho de soja em 1000a.C. e de chiang entre 2500a.C. e 500a.C. na China; produo de queijo Roquefort em 100 d.C. hoje: produo de enzimas

10.1 Microrganismos normalmente utilizados: Utilizam-se sobretudo fungos filamentosos como: Rhizopus, Trichoderma, Penicillium ou Aspergillus produo de enzimas Mucor ou Rhizopus produo de renina microbiana; Penicillium produo de penicilina; Fusarium o Giberella produo de cido giberlico. Bacillus thuringiensis bioinseticidas e -amilase; Zymomonas mobilis ou leveduras produo de etanol. enriquecimento protico e

A utilizao de bactrias e leveduras tem aumentado recentemente:

10.2 Substratos: caractersticas e composio: O substrato ou matriz slida deve possuir algumas caractersticas que possibilitem o maior rendimento do processo. O principal fator do CSS o grau de acessibilidade do microrganismo ao meio de cultivo, assim, as caractersticas que mais se destacam so a porosidade, o tamanho e o formato das partculas. Quanto menor o tamanho da partcula, maior a sua rea superficial e, conseqentemente, maior o grau de transformao. Por outro lado o processo necessita ter uma granulometria que permita a circulao doa ar por entre a massa de meio, e a dissipao dos gases produzidos, os quais poderiam via a prejudicar a produtividade do processo. A Figura 10.1 apresenta a velocidade de fermentao, avaliada em termos de produo de CO2 durante o processo, em funo do tamanho das partculas em meio slido. Quanto porosidade, sua principal conseqncia a absoro de gua, que facilita o transporte de enzimas e metablitos por entre o meio e os microrganismos. Processos empregados para facilitar a atuao dos microrganismos sobre o meio: esmagamento, quebra moagem e peneiramento; suplementao de nutrientes e correo de pH; hidrlise cida ou alcalina de material celulsico; embebio; aquecimento do substrato (gelatinizao ou inchamento) adio de agente quelante; esterilizao.

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Figura 10.1: Influncia do tamanho das partculas na velocidade de fermentao de acar de beterraba por Zymomonas mobilis para produo de etanol. (Fonte: Schmidell et al., 2001) Diversas matrias-primas e, dentre estas, principalmente os diversos tipos de resduos agroindustriais, podem ser empregadas como substrato em CSS. A escolha de cada meio depender da disponibilidade, do microrganismo e do produto final que se deseja obter. 10.3 Biorreatores para CSS O CSS ocorre sobretudo em processos batelada: o meio adicionado ao biorreator, que ento inoculado e ocorra a incubao por um determinado perodo de tempo. A seguir o produto pode ser extrado atravs da suspenso do meio com gua, solues-tampo ou solventes, ou ento simplesmente seco e armazenado. Biorreatores para laboratrio: frascos cnicos, garrafas de cultivo, copos de Becker. Biorreatores industriais: bandejas, tanques circulares, esteira rolante e reatores tubulares horizontais com agitao interna (Figura 10.2)

Figura 10.2: Reatores para cultivo semi-slido industrial (a) tanques circulares; (b) esteira rolante; (c) reator tubular com agitao interna. (Fonte: Schmidell et al., 2001)

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Para mais detalhes consultar Durand, A. Bioreactor desings for solid-state fermentation. Biochemical Engineering Journal 13 (2003) 113-125. 10.4 Controle de processo em CSS Os controles de umidade, temperatura e pH do meio de cultivo, a velocidade e freqncia de agitao, as condies de transferncia de oxignio e de nutrientes, as caractersticas do substrato, alm das caractersticas e estimativas de crescimento e automao do processo so os parmetros mais freqentemente analisados nos diversos estudos revistos. 10.4.1 Teor de umidade A natureza do substrato, as necessidades do microrganismo utilizado e o tipo de produto final desejado so os principais parmetros que determinam o grau de umidade que o substrato dever ter no incio e ao longo do cultivo. Um substrato apropriadamente umedecido dever possuir um filme superficial de gua visando facilitar a dissoluo e a transferncia de massa de nutrientes e de oxignio. Porm, entre as partculas devem existir canais que permitam a difuso de gases e a dissipao de calor. A Figura 10.3 apresenta a velocidade de produo de protena de Aspergillus niger de acordo com a umidade inicial do meio de cultura.

Figura 10.3: Influncia do teor de umidade sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001) 10.4.2 Atividade de gua: Este parmetro definido como a razo entre a presso de equilbrio de vapor de um substrato em relao gua pura, mesma temperatura. A atividade de gua (aw) influencia o desenvolvimento microbiano e os processos bioqumicos. Assim, cada microrganismo possui um nvel de aw mnimo para que possa efetuar suas atividades metablicas, conforme a Figura 10.4. 10.4.3 Temperatura Devido s atividades metablicas do microrganismo e dependendo da altura da cama de substrato, uma grande quantidade de calor pode ser produzida durante o cultivo. Como a temperatura afeta diretamente a germinao dos esporos, o crescimento e a esporulao dos microrganismos, e a formao de produto, o calor produzido dever ser imediatamente dissipado para que o aumento da temperatura no prejudique a fermentao desejada. A Figura 10.5 apresenta a velocidade de produo de protenas por Aspergillus niger em relao temperatura empregada no processo.

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Figura 10.4: Relao entre a atividade de gua e as reaes de deteriorao dos alimentos.

Figura 10.5: Influncia da temperatura sobre o crescimento de Aspergillus niger. (Schmidell et al., 2001) 10.4.4 pH O controle do pH durante o CSS, embora crtico, difcil de ser conseguido devido heterogeneidade e a consistncia do meio de cultivo. Como tentativa de evitar variaes bruscas no pH utilizam-se substratos com boa capacidade tamponante ou a adio de soluo tampo durante a etapa de umidificao do substrato. 10.4.5 Aerao: A aerao necessria para o bom rendimento de praticamente todos os processos produtivos biotecnolgicos, incluindo os via CSS. A oxigenao pode ser realizada via entrada de ar estril sob presso dentro do biorreator. A quantidade de ar que deve ser fornecido ao cultivo depende do microrganismo, da quantidade de calor metablico a ser dissipado no processo, da espessura da camada de substrato. Da quantidade de CO2 e outros volteis a serem eliminados e da necessidade de oxignio para sntese dos produtos.

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10.4.6 Agitao Visa obter uma melhor homogeneizao do meio de cultivo, gerando uma melhor distribuio do inculo e do meio umidificante, impedindo a formao de agregados e favorecendo tanto a transferncia gasosa como a troca de calor do meio. 10.4.7 Estimativa de crescimento realizado a travs de metodologias indiretas, pois na maioria das vezes no possvel separar-se o microrganismo do substrato slido onde este se desenvolveu. Mtodos mais utilizados: quantificao da protena total estimativa da quantidade de ATP ou glicosamina; medida contnua da quantidade de O2 e CO2 no gs de sada do biorreator.

10.4.8 Extrao dos produtos Normalmente utilizado um diluente como gua destilada, soluo salina ou soluo-tampo. A extrao realizada por agitao do meio como o solvente ou por percolao do solvente atravs do leito de slidos.

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11 Agitao e aerao em biorreatores O oxignio necessrio para todas as culturas aerbias, e manter uma concentrao apropriada de oxignio dissolvido no meio de cultura importante para a operao eficiente do reator. A equao estequiomtrica da oxidao completa da glicose dada por: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O Ou, seja, para que ocorra a oxidao de 1 mol de glicose, so necessrios 6 moles de oxignio. Contudo, enquanto fontes de carbono e de nitrognio e outros nutrientes so bastante solveis em gua, o oxignio pouco solvel. Pode-se dissolver centenas de gramas de glicose em gua, mas a solubilidade do oxignio a 35oC da ordem de 7 mgO2/L . Desta forma de nada adianta colocar centenas de gramas por litro de glicose do meio de cultivo se no se consegue transferir oxignio ao microrganismo numa velocidade suficientemente grande para suportar um crescimento exclusivamente aerbio.
0,016 0,014 Conc O2 (kg.m-3) 0,012 0,01 0,008 0,006 0 10 20 30
o

40

50

temperatura ( C)

Figura 11.1: Variao da concentrao de oxignio dissolvido em gua com a temperatura.

11.1 Transferncia de oxignio da bolha de gs para a clula Nas culturas aerbias, as molculas de oxignio devem transpor uma srie de resistncias transferncia antes de serem utilizadas pela clula. O diagrama da Figura 11.2 apresenta oito etapas envolvidas no transporte de oxignio do interior da bolha de gs at o interior da clula: i) ii) iii) iv) v) vi) vii) viii) transferncia do interior da bolha para a interface gs-lquido; movimento atravs da interface gs-lquido; difuso atravs do filme de lquido estagnado em torno da bolha; transporte atravs da massa de lquido; difuso atravs do filme de lquido estagnado em torno da clula; movimento atravs da interface lquido-clula; se as clulas estiverem em flocos ou em partculas slidas, difuso atravs do slido at a clula individual; transporte atravs do citoplasma ao stio de reao. Se as clulas esto suspensas individualmente no meio de cultura, o passo (vii) desaparece. Quando as clulas esto dispersas no meio de cultura e este possui mistura perfeita, a maior resistncia transferncia de oxignio o filme lquido em torno da bolha. Conseqentemente, o transporte

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de oxignio da bolha at a clula controlado pelo passo (iii) e a taxa de transferncia de massa pode ser calculada a partir da Equao 11.1.

OTR = k L a C * C

(11.1)

onde OTR (oxygen transfer rate) a velocidade de transferncia de oxignio por unidade de volume de fluido (kg.m-3.s-1), kL o coeficiente de transferncia de massa da fase lquida (m.s-1), a a rea da interface lquido-gs por unidade de volume do fluido (m2.m-3), C a concentrao de oxignio no meio de cultura (kg.m-3), e C* a concentrao de oxignio no meio de cultura em equilbrio com a fase gasosa (kg.m-3), tambm denominada solubilidade do oxignio no meio de cultura.

Figura 11.2: Etapas da transferncia de oxignio da bolha de ar para a clula (Doran, 1995. p. 200).

11.2 Mtodo dinmico para o clculo do kLa Em um meio lquido mergulha-se um eletrodo de O2 dissolvido. Aps o eletrodo calibrado, retira-se todo o O2 dissolvido borbulhando-se gs N2, por exemplo. A seguir inicia-se a aerao e a agitao nas condies que se pretende calcular o kLa. O sinal do eletrodo aumentar at atingir 100%. Nesta condio, a variao da concentrao de O2 dissolvido no meio de cultivo se d unicamente devido a aerao do meio:

dC = kL a C * C dt
C

)
t

(11.2)

A equao 11.2 pode ser integrada conhecendo-se a condio inicial (t0 = 0 e C0 = 0):

dC =0 C * C = k L at =0dt C0 0
C ln 1 * = k L a t C

(11.3a)

ou

C = 1 e kLat * C

(11.3b)

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Da equao 11.3a percebe-se que plotando-se os valores de ln1

C contra o tempo obtm-se C*

uma reta cujo coeficiente angular -kLa, conforme Figura 11.3. Ainda, no necessrio conhecer o valor de C*, apenas a frao C/C* que obtida de um eletrodo calibrado entre 0 e 100%.

Figura 11.3: Determinao do coeficiente volumtrico de transferncia de massa da fase lquida, kLa.

11.3

Respirao microbiana A velocidade especfica de respirao dos microrganismos pode ser definida como:
QO2 = 1 dC X dt

(11.4)

onde QO2 velocidade especfica de respirao (g O2 / (g cl . h)). A grandeza QO2 introduz a caracterstica biolgica do sistema em questo, pois depende do microrganismo empregado, das condies de fermentao (pH, temperatura) e do meio de cultivo. O valor de QO2 para um dado microrganismo funo da concentrao de O2 dissolvido no meio de cultivo, e segue uma equao do tipo Monod, ou seja:

QO2 = QO2 mx

C K O2 + C

(11.5)

onde QO2 mx o valor mximo de QO2 e K O2 a constante de saturao da equao de Monod para o O2. A Figura 11.4 mostra a variao de QO2 com a concentrao de O2 dissolvido, onde observa-se a existncia de uma dada concentrao de O2, denominada crtica, acima da qual o valor de QO2 constante e mximo. Um sistema adequadamente dimensionado de aerao/agitao deve permitir a mxima capacidade respiratria dos organismos, mantendo a concentrao de O2 acima da crtica a fim de que este no seja limitante. Alguns valores de Ccrit so mostrados na Tabela 11.1. Como se pode observar, os valores de Ccrit encontram-se entre 0,3 e 0,7 ppm, abaixo de 10% da concentrao de saturao do O2 no ar atmosfrico a 1 atm e 35oC. Clulas crescendo a altas velocidades especficas de crescimento possuem uma alta velocidade consumo de substrato e tambm uma alta velocidade de respirao. Desta forma natural que exista uma relao entre a velocidade especfica de crescimento da cultura () e a velocidade especfica de respirao, conforme a equao abaixo:

QO2 = mO2 +

1 YO2

(11.6)

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onde mO2 o coeficiente de manuteno das clulas para o O2 (g O2 / (g cl . h)) e YO2 o fator de converso de O2 para clulas (g cl / g O2). Foram determinados valores de 2mmolO2/(g cl . h) para mO2 e 1,55 g cl / g O2 para YO2 de Aspergillus awamori NRRL3112.

Figura 11.4: Representao esquemtica da variao de QO2 com a concentrao de O2 dissolvido. (Fonte: Schmidell et al., 2001) Tabela 11.1: Valores de concentrao crtica de oxignio para alguns microrganismos Microrganismo Escherichia coli Serratia marcenscens Levedura P chrysogenum Temperatura (oC) 37,8 31,0 34,8 24,0 30,0 Arpergillus oryzae 30,0 Ccrit (mg/L) 0,26 0,48 0,15 0,70 0,29 0,64

11.4 Anlise conjunta da transferncia e do consumo do oxignio Em um cultivo em biorreator, a concentrao de oxignio em um dado instante depende a entrada de ar e do consumo de oxignio pelos microrganismos:

dC = k L a (C * C ) QO2 X dt

(11.7)

Durante um cultivo contnuo, ou durante um pequeno intervalo de tempo de um cultivo em batelada ou batelada-alimentada, pode-se considerar que o sistema se encontra em estado estacionrio: X constante,

dC = 0 , e C a concentrao de oxignio no biorreator, medida pelo sensor de oxignio dt


k L a C * Ci QO2 X = 0
QO X Ci = C * 2 k a L
(11.8)

dissolvido, que ser denominada Ci. Assim, a equao 11.7 fica:

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Em dado instante ti corta-se a entrada de ar do sistema e monitora-se a queda da concentrao de oxignio no meio de cultura. Aps um tempo de 20 a 60 segundos, abre-se novamente a entrada de ar do sistema. Cessando o suprimento de oxignio, temos que o primeiro termo do lado direito da equao 11.7 torna-se zero, resultando em:

dC = QO2 X dt
A equao 11.9 pode ser integrada partir da condio inicial C = Ci quando t = ti:
C

(11.9)

Ci

dC = QO2 X dt
ti

C = Ci QO2 X (t ti )

(11.10)

Deste modo, QO2 X pode ser facilmente obtido atravs da inclinao da curva do grfico C contra t, mostrado na Figura 11.5. Dividindo-se o valor de QO2 X pela biomassa correspondente, a velocidade especfica de consumo de oxignio, QO2 , pode ser calculada.

Figura 11.5: Curva de variao de concentrao de oxignio dissolvido para clculo de kLa e q O2 conforme o mtodo dinmico. Fonte: Ayub, 1991, p. 60. A aerao reassumida antes que a concentrao de oxignio dissolvido atinja um valor crtico (em torno de 5 a 10% da saturao), e a equao 11.7 pode novamente ser utilizada para descrever o processo. Rearranjando os termos da equao 11.7 obtemos:

dC * QO2 X = C k a dt L dC = k L a(Ci C ) dt

C kLa

(11.11)

Combinando a equaes 11.11 e 11.8 temos: (11.12)

A equao 11.12 pode ser integrada partir das condies iniciais C = C0 quando t = t0:

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C C0 ln i C C = k L a (t t0 ) i
0 valor do kLa pode ser obtido atravs da inclinao da reta ln i C C contra o tempo. i

(11.13)

onde Ci, C0 e C so diferentes valores de concentrao de oxignio dissolvido mostrados na Figura 11.5. O

C C

11.5 Sistemas para a transferncia de oxignio Os principais sistemas de aerao de reatores lquidos so mostrados na Figura 11.5. Os sistemas (1) e (2) utilizam uma aerao superficial, e so encontrados em lagoas de tratamento biolgico de efluentes e em reatores com clulas imobilizadas, respectivamente. Os sistemas (3) e (4) realizam a transferncia de oxignio para o meio por borbulhamento de ar, sendo que o biorreator (4), conhecido como air-lift, possui bons coeficientes de transferncia de O2 sem a necessidade de agitao, logo com uma baixa tenso de cisalhamento sobre as clulas. Os reatores (5) e (6) so os aerados de tanque agitado. O biorreator (5) conhecido como padro e corresponde a 93% das aplicaes industriais. O biorreator (6), conhecido como draugth-tube o sistema que causa o maior cisalhamento celular. O biorreator tipo tanque agitado e aerado (padro), apresenta altura do lquido igual ao dimetro do tanque e agitado por um impelidor dom 6 ps planas que apresentam dimetro igual a 1/3 do dimetro do tanque. A fim de evitar a formao de vrtice, utiliza-se um sistema de 4 chicanas, diametralmente opostas, com largura de 1/10 ou 1/12 do dimetro do tanque.

Figura 11.6: Sistemas diversos de transferncia de oxignio em biorreatores. (Fonte: Schmidell et al., 2001)

11.6 Transferncia de oxignio em meios agitados e aerados 11.6.1 Agitao de lquidos newtonianos O objetivo de uma operao de agitao ou mistura pode ser a homogeneizao da soluo, manter slidos em suspenso ou tornar mais eficientes os transportes de calor e massa. Estes objetivos podem ser atingidos atravs da agitao, ou seja, da transmisso de potncia (energia/tempo) ao lquido.

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Quando uma turbina gira dentro de um reator com lquido, como o exemplificado na Figura 11.6, a capacidade desta turbina de transmitir potncia ao lquido depende de diversos fatores, como mostra a anlise dimensional a seguir:

NP =
onde:

P NDi2 N 2 Di H L DT WB , N Fr = , , , = f N Re = N 3 Di5 g Di Di Di

(11.14)

NP = nmero de potncia (adimensional) NRe = nmero de Reynolds (adimensional) NFr = nmero de Froude (adimensional) P = potncia transmitida na agitao (W) N = freqncia de agitao (s-1)

= densidade do lquido (kg.m-3) = viscosidade do lquido (kg.m-1.s-1)


g = acelerao da gravidade (m.s-2) Di = dimetro do impelidor (m) HL/Di , DT/Di, WB/Di = adimensionais ligados geometria do biorreator HL = altura do coluna de lquido (m) DT = dimetro do biorreator (m) WB = largura da chicana (m) C = distncia do impelidor ao fundo do biorreator (m) Wi = altura da p da turbina (m).

Figura 11.7: Esquema de um biorreator agitado com turbinas de ps planas. (Fonte: Schmidell et al., 2001) O grfico da Figura 11.7 apresenta a relao entre o NP e o NRe para o impelidor tipo hlice e para a turbina de disco com 6 ps planas (turbina Rushton) para tanques com as relaes padro conforme o item anterior. Para esta situao tem-se que a equao 11.13 fica:

N P = f ( N Re )

(11.15)

Na Figura 11.7 pode-se observar trs regies distintas: a regio de escoamento laminar (NRe < 10), uma regio de transio e a regio de escoamento turbulento (NRe > 104). Na regio laminar tem-se que N P = k1 ( N Re ) ou seja:
1

P = k1 N 2 Di3
na regio de escoamento turbulento tem-se que N P = k 2 , ou seja:

(11.16)

P = k2 N 3 Di5

(11.17)

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Na regio de transio h uma tendncia queda do Np, o que interessante quando, durante o cultivo, ocorre um aumento da viscosidade do meio. Assim, se o motor foi planejado para a regio turbulenta no h risco de sobrecarga at o incio do escoamento laminar.

Figura 11.8: nmero de potncia N P =

NDi2 P em funo do nmero de Reynolds N Re = para N 3 Di5

impelidor tipo hlice e Rushton. (Fonte: Schmidell et al., 2001) Para se calcular a potncia transmitida em sistemas geometricamente distintos do que foi utilizado para as relaes acima, foi proposto um fator de correo, fc, para ser aplicado sobre a potncia calculada a partir das equaes 11.15 e 11.16.

DT H L D Di i fc = DT H L D Di i
D onde T

(11.18)

e H L so as relaes geomtricas de um reator padro e DT e H L so as D Di Di Di i

novas relaes geomtricas. Quando se utilizam mais de um impelidor no eixo de agitao, se estes estiverem muito prximos um do outro no ser obtida a mxima potncia de transferncia. Desta forma as seguintes relaes normalmente so utilizadas para o nmero e a distncia entre os impelidores: Di < Hi < 2Di (11.19) (11.20)

H L Di H 2 Di > nmero de impelidores > L Di Di


onde Hi a distncia entre os impelidores.

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11.6.2 Agitao de lquidos newtonianos submetidos aerao Quando se tem bolhas de ar suspensas no lquido ocorre uma diminuio da densidade aparente o que deve provocar uma diminuio da potncia transmitida ao lquido. A fim de estudar este tipo de situao definiu-se um nmero adimensional chamado nmero de aerao (NA), definido como:

NA =

Q NDi3
3 -1

(11.21)

onde NA o nmero de aerao e Q a vazo de ar (m .s ) A Figura 11.8 mostra a relao entre a potncia transmitida ao lquido aerado em relao ao no aerado (Pg/P) em funo do nmero de aerao. A partir dos dados experimentais a seguinte equao foi proposta:
0 , 45

P 2 ND 3 Pg = 0,706 0,56 i Q

(11.22)

com as unidades no sistema internacional de unidades.

Figura 11.9: Pg/P em funo do nmero de aerao N A =

Q para um sistema de agitao com duas NDi3

turbinas Rushton. (Fonte: Schmidell et al., 2001)

11.6.3 Transferncia de oxignio Este subitem trata da relao entre a potncia transferida ao meio de cultura em um biorreator aerado e o coeficiente de transferncia de oxignio. A equao emprica abaixo correlaciona a transferncia de oxignio com a potncia cedida e a velocidade de aerao do sistema:

P KV = K 3 g V

(Vs )

(11.23)

onde: KV = coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio para uma soluo de sulfito de sdio; K3 = constante que depende da geometria do sistema; V = volume do lquido submetido aerao (m3);

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Vs = velocidade superficial do ar = Q = vazo de ar (m3/s); S =

Q (m/s); S

DT ; 4

, = constantes empricas.
Os coeficientes e variam de um sistema coalescente para um no-coalescente e com a escala de trabalho, conforme a Tabela 11.2. Tabela 11.2: Coeficientes e da equao 11.23 conforme a escala de trabalho. Volume do reator (m3) 0,005 0,5 50 0,002 - 2,6 Fonte: Schmidell et al., 2001 a 0,95 0,6 - 0,7 0,4 - 0,5 0,4

0,67 0,67 0,50 0,50

sistema no coalescente no coalescente no coalescente coalescente

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12 Escalonamento de biorreatores O estudo da variao de escala de processos examina os problemas associados com a transposio dos dados obtidos em equipamentos de escalas de laboratrio e piloto para a escala e produo industrial. O desenvolvimento tradicional de um bioprocesso normalmente executado em trs escalas: escala de bancada escala piloto escala industrial

12.1 Critrios para ampliao de escala Os critrios para ampliao de escala basicamente so os listados a seguir: o o o o o o o constncia da potncia do sistema no aerado por unidade de volume de meio (P/V) constncia do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) constncia da velocidade na extremidade do impelidor (vtip) constncia do tempo de mistura (tm) constncia da capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V) constncia do nmero de Reynolds (NRe) constncia da presso parcial ou concentrao de O2 dissolvido (C).

Princpios bsicos a ser considerados no aumento de escala de biorreatores: 1. Indentificar qual ou quais propriedades so importantes para otimizar a operao de um sistema agitado (kLa, capacidade de bombeamento, cisalhamento). 2. Lembrar que os biorreatores grandes apresentam tempo de mistura maior (tm) e cisalhamento maior. 3. Para reaes qumicas homogneas, o consumo de potncia do sistema no aerado por unidade de volume de meio (P/V) deve ser utilizado como critrio de aumento de escala. 4. No escalonamento de sistemas bifsicos (ar-lquido) como o dos cultivos aerbios, o kLa deve ser utilizado preferencialmente como critrio de aumento de escala.

12.1.1 Constncia da potncia por unidade de volume do meio (P/V) Atravs dos resultados discutidos no item 11.6.1, para regime laminar e de transio (NRe < 104):

1 NP = f N Re
Desta forma:

(12.1)

P 5 N Di NDi2
3

(12.2)

Sendo e constantes no aumento de escala:

P N 2 Di3
Para regime turbulento (NRe > 104):

(12.3)

NP =

P = constante N Di5
3

(12.4)

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Ou seja:

P N 3 Di5
O volume do tanque dado por :

(12.5)

V=

DT2
4

HL

(12.6)

Como a geometria do biorreator permanece constante na ampliao de escala:

DT Di H L Di
ento

(12.7) (12.8)

V Di3
Desta forma, no regime laminar:

(12.9)

P N2 V
E no regime turbulento:

(12.10)

P N 3 Di2 V
Para a ampliao da escala 1 para a escala 2:

(12.11)

P P = V 1 V 2
Para o regime laminar:

(12.12)

N 2 = N1
E para o regime turbulento:
2

(12.13)

N D

3 1

2 i 1

=N D
3 2

2 i 2

ou

D N 2 = N1 i 1 D i 2

(12.14)

12.1.2 Constncia do coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (kLa) A equao 11.22, do item 11.6.3 nos d que:

Pg kLa V

(Vs )

(11.22)

Sendo a velocidade superficial doa ar , Vs:

Vs =
temos que:

Q Q = 2 S DT

(12.15)

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Vs

Q Di2
0 , 45

(12.16)

A potncia transmitida ao lquido aerado dada pela equao 11.21:

P 2 ND 3 Pg 0,56 i Q

(11.21)

Sendo o volume V Di3 , no escalonamento, fazendo (k L a )1 = (k L a )2 , temos que:

D N 2 = N1 i2 D i1

2 2 ,85 3,15

Q2 Q 1

0 , 25 3,15

(12.17)

12.1.3 Constncia da velocidade na extremidade do impelidor (vimp) A velocidade na extremidade da p do impelidor (vimp) dada por:

vimp = Di N
Assim:

(12.18)

vimp Di N
No escalonamento, fazendo vimp

(12.19)

( ) = (v )
1

imp 2

temos que: (12.20)

N 2 = N1

Di 1 Di 2

12.1.4 Constncia do tempo de mistura (tm) O fator tempo de mistura, , dado por:

tm NDi2

)
1

g 6 Di
3

(12.21)

H L 2 DT 2
A curva experimental do Nmero de Reynolds contra o fator tempo de mistura, mostrada na Figura 12.1 mostra que para NRe > 105, constante e igual a 4,2. Assim, para NRe > 105 tem-se que:

tm

Di N

1 2

3 1

D t m i4 N

(12.22)

No escalonamento, fazendo (t m )1 = (t m )2 temos que:

D N 2 = N1 i2 D i1

(12.23)

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Figura 12.1: Variao do fator tempo de mistura com o nmero de Reynolds. (Fonte: Schmidell et al., 2001)

12.1.5 Constncia da capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V) A capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V) dada pela razo entre a vazo de circulao do fludo dentro do tanque (FL) e o volume de lquido (V). Seria como se as ps do(s) impelidor(es) funcionassem como as ps de uma bomba centrfuga. Experimentalmente tem-se que:

FL NDi
Sendo V Di temos que:
3

(12.24)

FL NDi 3 V Di

FL N V
No escalonamento, fazendo

(12.25)

FL FL = temos que: V 1 V 2
(12.26)

N1 = N 2

12.1.6 Constncia do Nmero de Reynolds O Nmero de Reynolds dado por

NDi 2 N Re =
ou seja

(11.13)

N Re NDi

(12.27)

No escalonamento, fazendo (N Re )1 = ( N Re )2 tem-se que:

D N 2 = N1 i 1 D i 2

(12.28)

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12.1.7 Critrios ou regras de aerao Os critrios ou regras de aerao normalmente recomendados so: o o o constncia do nmero de aerao (NA) constncia da velocidade superficial do ar (Vs) constncia da vazo especfica de ar (ar)

Pelo critrio do NA constante tem-se que:

NA =

Q 3 NDi

(12.29)

Fazendo ( N A )1 = ( N A )2 no escalonamento, a nova vazo de ar dada por:

N D Q2 = Q1 2 i 2 N D 1 i 1
Q Q = 2 S DT

(12.30)

A velocidade superficial do ar :

Vs =
ou

(12.15)

Vs

Q Di2

(12.16)

No escalonamento (Vs )1 = (Vs )2 tem-se que :

D Q2 = Q1 i 2 D i 1

(12.31)

O terceiro critrio de aerao a vazo especfica de ar (ar), definida como:

ar ( vvm) =

Q volume de ar = volume de meio tempo V


3

(12.32)

onde vvm volume de ar / (volume de meio minuto). Sendo V Di temos que :

ar

Q 3 Di

(12.33)

No escalonamento (ar )1 = (ar )2 , ou seja:

D Q2 = Q1 i 2 D i 1

(12.34)

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12.2 Comparaes entre os critrios de ampliao de escala Tabela 12.1: Variao da freqncia de rotao (N) numa ampliao de escala (V1 = 10L; V2 = 5.000L; ar = 0,3vvm) Critrio para ampliao de escala P/V kLa (A = 0,5 e B = 0,5) Cisalhamento (vtip) tm* FL / V NRe * NRe > 105 N (rpm) (V = 5.000 L) 175,9 91,3 88,2 1174,9 700 11,1

Tabela 12.2: Relao entre variveis em uma ampliao de escala (V1 = 60L; V2 = 7,5m3) Relao entre variveis N2 / N1 P/ V 0,34 42,7 125 1 0,34 1,7 8,6 2,7 FL / V 1 125 3125 25 1 5 25 1,3 NDi 0,2 25 25 0,2 0,2 1 5 3,8 NRe 0,04 5 0,2 0,0016 0,04 0,2 1 0,089 tm* 1,5 187 10449 83,6 1,5 7,5 37,4 1

(FL )2 (FL )1

P 2 / P1 (P V )2 (P V )1

(FL V )2 (FL V )1 (NDi )2 (NDi )1

(N Re )2 (N Re )1 (tm )2 (tm )1
NRe > 10
5

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13 Esterilizao Em muitos bioprocessos, a presena de microrganismos estranhos, genericamente denominados contaminantes, pode levar a prejuzos considerveis. O grau de eliminao de contaminantes com o objetivo de obter bons resultados depende de cada caso. Em um processo podem ou devem ser esterilizados os equipamentos (biorreatores, tubulaes, bombas, centrfugas, homogeneizadores, etc.), os meios de cultivo, o ar que entra nos biorreatores e as embalagens finais. A esterilizao engloba todos os procedimentos fsicos, mecnicos e qumicos utilizados para destruir microrganismos contaminantes. Os mtodos qumicos englobam o uso de xido de etileno, aldedos, gs-plasma de perxido de hidrognio. Os mtodos fsicos compreendem a utilizao de calor e radiaes. Ainda podem ser utilizados agentes esterilizantes e desinfetantes. Terminologia: Esterilizao: um processo fsico ou qumico que destri ou inativa todas as formas de vida presentes em um determinado material atravs de agentes fsicos. Desinfeco: um processo menos rigoroso de eliminao de microrganismos, objetivando sobretudo a destruio dos microrganismos patognicos presentes, envolvendo normalmente o uso de um agente qumico, temperatura ambiente ou moderada. Antissptico: substncia que impede a proliferao de bactrias atravs da inativao ou destruio das mesmas . Assepsia: conjunto de mtodos utilizados com o intuito de impedir a entrada de microrganismos em local que no os contenha . 13.1 Modos de atuao dos agentes esterilizantes Calor mido: A temperatura elevada associada com alto grau de umidade provoca a desnaturao das protenas. Os carboidratos do meio de cultivo tambm sofrem alteraes, muitas vezes gerando produtos txicos. O calor mido possui alta penetrao, destruindo esporos e bactrias em tempos bastante curtos. tambm econmico e no deixa resduos txicos. Contudo no pode ser utilizado em solues que formam emulses com a gua e nem em solues que possuam ao corrosiva sobre alguns metais. A esterilizao de biorreatores via calor mido normalmente ocorre via injeo de vapor no equipamento. A esterilizao normalmente realizada a 121oC e 1 atm em tempos que variam entre 20 minutos a mais de 1 hora conforme a necessidade. Calor seco: Destri microrganismos atravs da oxidao de seus constituintes qumicos. utilizado para vidrarias, metais e slidos resistentes ao calor. Ocorre em fornos ou estufas que atingem temperaturas maiores do que 150oC. Contudo, a ausncia de umidade torna a transferncia de calor mais lenta e os microrganismos mais resistentes. Desta forma o calor seco necessita de tempos mais longos para atingir o grau de esterilizao desejado, cerca de 3 a 4 horas. Radiao ultravioleta (UV): Os efeitos letais esto associados mutagnese atravs de transformaes fotoqumicas nas bases de pirimidinas no DNA. A reao principal a formao de ligaes cruzadas entre purinas adjacentes. Tambm ocorrem dmeros citosina-timina, citosina-citosina e uracila-uracila (RNA). produzida por lmpadas emissoras de radiao UV. Devido sua baixa penetrao somente utilizada para a esterilizao de superfcies e do ar. O tempo de exposio necessrio da ordem de horas.

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Radiao ionizante: So as radiaes alfa (), beta (), gama (), raios X, raios catdicos, alm de prtons, nutrons e eltrons de alta energia. Estas radiaes podem produzir radicais qumicos altamente reativos, como perxidos e radicais livres, os quais podem alterar grupos qumicos e at quebrar fitas de DNA. Dentre estas a radiao gama a mais importante. A radiao gama em geral produzida por cobalto 60 ou csio 137, e possui um poder de penetrao extremamente alto. Os materiais expostos radiao gama no guardam nenhum resqucio radioativo, tornando a irradiao um mtodo seguro. O bombardeio com radiao gama realizados em cmaras especiais que uma vez postas em operao, no mais possvel impedir a emisso de radiao, de forma que estas cmaras operam de forma contnua. Materiais como vidrarias, metais, alimentos, sementes, solo, ps, embalagens podem ser submetidos este tipo de esterilizao. Plasma de perxido de hidrognio: O plasma, considerado um quarto estado da matria, definido como uma nuvem de ons, eltrons e partculas neutras, altamente reativas. A gerao de um campo eletromagntico pela energia de radiofreqncia produz a formao do plasma. Os radicais livres gerados no plasma de perxido de hidrognio apresentam-se com cargas negativas e positivas, que excitados tendem a se reorganizar, interagindo com molculas essenciais ao metabolismo e reproduo microbianos, ligando-se de maneira especfica s enzimas, fosfolipdeos, DNA e RNA. Essa reao qumica extremamente rpida, viabilizando o processo de esterilizao em curto espao de tempo. indicado para esterilizao de artigos termossensveis. O ciclo de esterilizao ocorre em torno de 1 hora. compatvel com a maioria dos metais, plsticos, vidros, borrachas, acrlicos e incompatvel com celulose e ferro. O produto final gua e oxignio, no oferecendo portanto toxicidade para os profissionais e clientes. xido de etileno (EtO): um ter cclico que reage substituindo um tomo de H de grupos funcionais de protenas, cidos nuclicos e outras molculas (radicais carboxil, amino ou sulfidril) pela molcula de EtO aberta (CH2CH2O-). Esta reao causa a inativao destas molculas. O xido de etileno um gs inodoro, sem cor, inflamvel e explosivo. A adio de estabilizantes como dixido de cloro ou clorofluorocarbonado reduz o risco de exploso e de fogo. Vantagens: podem ser esterilizados materiais sem danific-los. Desvantagens: alto custo, toxicidade, e tempo longo do ciclo. Glutaraldedo: O glutaraldedo reage como os grupamentos amina livres da camada de peptidioglicano na superfcie das clulas, onde ocorrem reaes glutaraldedo-protenas, o que interfere no transporte de aminocidos de baixo peso molecular. Em alguns microrganismos ocorre a aglutinao celular, devido formao de ligaes intercelulares. indicado para desinfeco em alto nvel em artigos termossensveis com tempo de exposio de 30 minutos em soluo a 2%. Tambm indicado como esterilizante, com o tempo de exposio entre 8 e 10h. O produto sofre alteraes em temperaturas superiores a 25C. txico, no biodegradvel, portanto deve ser manipulado em local ventilado e com uso de EPI. Formaldedo: Formaldedo um monoaldedo que existe como um gs solvel em gua. Embora tenha sido usado durante muitos anos, seu uso foi reduzido com o aparecimento do glutaraldedo. Suas desvantagens principais estavam relacionadas a menor rapidez de ao e carcinogenicidade. Embora tido como carcinognico, isto foi demonstrado a altas doses de exposio. Ao: ativo apenas na presena de umidade para formao do grupo metanol. Interage com protenas, DNA e RNA. No entanto difcil especificar precisamente seu modo de ao na inativao bacteriana. Possui amplo espectro de ao, inclusive contra esporos.

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Tem o mesmo mecanismo de ao semelhante ao do glutaraldedo. pouco ativo a temperaturas inferiores a 20C, aumentando a atividade em temperaturas superiores a 40C. Em processo de desinfeco ou esterilizao possui desvantagens, pois tem baixo poder de penetrao, distribuio no uniforme e alta toxicidade que restringem o seu uso. O tempo de exposio deve seguir orientaes do fabricante: para desinfeco utiliza-se soluo 4% volume-volume (v/v) por trinta minutos. Para esterilizao, tanto na soluo alcolica a 8%, quanto para a soluo aquosa a 10%, o tempo mnimo de 18 horas. lcoois: Agem por desnaturao das protenas dos microrganismos e sua ao bactericida aumenta quando hidratado. Possuem ao bactericida, fungicida e viruscida, porm no destroem esporos bacterianos. lcool isoproplico: tem ao seletiva para vrus, mais txico e com menor poder germicida que o lcool etlico. lcool etlico (70%): a concentrao 77% (v/v) que corresponde a 70% em peso, tem baixa toxicidade, indicado para desinfeco de nvel intermedirio ou mdio. Deve ser utilizado por frico, em trs aplicaes, com secagem espontnea e tempo total de exposio de 10 minutos. Compostos liberadores de cloro ativo: Hipoclorito de sdio/clcio/ltio: Produto instvel, termossensvel, fotossensvel e inativado rapidamente em presena de matria orgnica, o que diminui sua atividade rapidamente em recipientes claros ou em altas temperaturas. Por ser corrosivo seu uso contra-indicado em artigos metlicos. Efeitos adversos: os compostos inorgnicos liberadores de cloro ativo so txicos, irritantes de pele, mucosa e rvore respiratria. cido Peractico: bactericida, fungicida, viruscida e esporicida. Promove a desnaturao de protenas e alterao na permeabilidade da parede celular. Possui como vantagens manter-se efetivo em presena de matria orgnica e no promover a formao de resduos txicos. Como desvantagens: corrosivo e instvel aps diludo. O cido peractico ou peroxiactico, em baixas concentraes (0,001% a 0,02%) apresenta rpida ao contra os microorganismos, incluindo os esporos. 13.2 Esterilizao de equipamentos e meios de cultivo por calor mido 13.2.1 Cintica de morte celular 13.2.2 Esterilizao em batelada de meios de cultivo O meio de cultivo colocado dentro do biorreator e aquecido seguir. Deste modo o meio de cultivo e o biorreator so esterilizados simultaneamente. Formas de aquecimento: - vapor passando por uma camisa ou serpentina de aquecimento - injeo direta de vapor - aquecimento eltrico do meio dentro do biorreator. Perfil tpico de temperatura (Figura 13.1): - aquecimento: durao de horas - manuteno da temperatura: durao de minutos - resfriamento: durao de horas O clculo de um processo de esterilizao consiste em calcular o tempo de manuteno necessrio para atingir um determinado nvel de destruio celular. Esterilizao absoluta tempo infinito Desta forma trabalha-se com probabilidade de contaminao. Por exemplo: Nf = 10-3 significa o risco de sobrevivncia de 1 microrganismo em cada 1000 bateladas esterilizadas.

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Figura 13.1:Perfil tpico de temperatura do meio de cultivo e evoluo da morte celular em uma esterilizao em batelada (Fonte: Doran, 1997).

Curvas de aquecimento conforme o mtodo de aquecimento: a) injeo direta de vapor (curva hiperblica, Figura 13.2):

& hM s t M mC pT0 T = T0 1 + & M 1+ s t Mm

(13.1)

b) aquecimento eltrico (curva linear, Figura 13.2):

Qt T = T0 1 + M CT m p 0
c) trocador de calor com vapor isotrmico (curva exponencial, Figura 13.2):
T T MUAt 1 + 0 s e m C p T = Ts Ts

(13.2)

(13.3)

d) resfriamento com passagem de gua no isotrmica (Figura 13.2):


UA & & M wC pwt 1 e M wC pw M mC p T T T = Tci 1 + 0 ci e Tci

(13.4)

onde: A = rea de transferncia de calor; Cp = calor especfico do meio de cultivo; Cpw = calor especfico da gua; h = diferena especfica de entalpia entre o vapor e o meio; Mm = massa inicial de meio de cultivo ; & M s = vazo mssica de vapor; & M = vazo mssica de gua;
w

= velocidade de transferncia de calor;

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T T0 Tci Ts t U

= temperatura; = temperatura inicial do meio de cultivo; = temperatura inicial da gua de resfriamento; = temperatura do vapor; = tempo; = coeficiente global de transferncia de calor.
120
manuteno da temperatura

100

temperatura (oC)

80

60

40

injeo direta de vapor aquecimento eltrico

20

transferncia de calor de vapor isotrmico resfriamento

0 0 1 2 3 4 tempo (horas) 5 6 7 8

Figura 13.2: Curvas de aquecimento e resfriamento em uma esterilizao em batelada.

13.2.3 Esterilizao contnua de meios de cultivo Na esterilizao contnua de meios de cultivo consegue-se trabalhar com processos de alta temperatura e tempo de exposio curtos, o que reduz significativamente a destruio de componentes do meio de cultivo, e levando a um alto grau de destruio de microrganismos. Entre as vantagens da esterilizao contnua em relao esterilizao em batelada esto a economia de vapor (a esterilizao contnua consome entre 20% e 25% do vapor consumido pelo processo em batelada) e o tempo reduzido de processo, pois o aquecimento e o resfriamento so quase instantneos. As Figuras 13.3 e 13.4 mostram configuraes tpicas de equipamentos de esterilizao contnua e os seus respectivos perfis de temperatura, e as Figuras 13.5 e 13.6 mostram trocadores de calor de placa e tubulares, respectivamente, utilizados para o aquecimento e o resfriamento dos meios de cultivo nos processos de esterilizao contnua.
(a) (b)

Figura 13.3: Equipamentos para esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor.

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(a)

(b)

Figura 13.4: Curvas de aquecimento, manuteno da temperatura e resfriamento durante uma esterilizao contnua: (a) injeo direta de vapor com resfriamento flash; (b) transferncia de calor utilizando trocadores de calor.

Figura 13.5: Trocador de calor de placas (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995).

Figura 13.6: Trocador de calor tubular (Fonte: Dairy Processing Handbook, 1995).

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14 Referncias Bibliogrficas 14.1 Livros Bailey J E, D F Ollis. Biochemical Engineering Fundamentals. McGraw-Hill Book Company, 1986. Borzani W, W Schimidell, U A Lima, E Aquarone. Biotecnologia Industrial Vol. 1 Fundamentos. Editora Edgar Blcher Ltda, 2001. Doran P M. Bioprocess Engineering Principles. Academic Press, 1997. Lehninger A L, D L Nelson, M M Cox. Principles of Biochemistry. Worth Publishers, 1997. Lima U A, E Aquarone , W Borzani, W Schimidell. Biotecnologia Industrial Vol. 3 Processos fermentativos e Enzimticos. Editora Edgar Blcher Ltda, 2001. Schimidell W, U A Lima, E Aquarone, W Borzani. Biotecnologia Industrial Vol. 2 Engenharia Bioqumica. Editora Edgar Blcher Ltda, 2001. Stephen D, Flickinger M. Encyclopedia of Bioprocess Technology. John Wiley, 1999.

14.2 Artigos Cientficos Bhugaloo-Vial P, W Grajek, X Dousset, P Boyaval. Continuous bacteriocin production with high cell density bioreactors. Enzyme and Microbial Technology 21 (1997) 450-457. Ellaiah P, T Prabhakar, B Ramakrishna, AT Taleb, K Adinarayana. Production of lipase by immobilized cells of Aspergillus niger. Process Biochemistry 39 (2004) 525-528. Fane AG. Membrane bioreactors: design & operational options. Filtration & Separation 39 (2002) 26-29. Gao H, T Tan. Fed-batch fermentation for ergosterol production. Process Biochemistry 39 (2003) 345-350. Judd S. Submerged membrane bioreactors: flat plate or hollow fibre? Filtration & Separation 39 (2002) 30-31. Kim B S, S C Lee, S Y Lee, Y K Chang, H N Chang. High cell density fed-batch cultivation of Escherichia coli using exponential feeding combined with pH-stat. Bioprocess and Biosystems Engineering 26 (2004) 147-150. Kourkoutas Y, A Bekatorou, IM Banat, R Marchant, AA Koutinas. Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages production: a review. Food Microbiology 21 (2004) 377-397. Lesjean B, S Rosenberger, JC Schrotter, A Recherche. Membrane-aided biological wastewater treatment: an overview of applied systems. Membrane Technology 2004 (2004) 5-10. Melin T, B Jefferson, D Bixio, C Thoeye, W De Wilde, J De Koning, J van der Graaf, T Wintgens. Membrane bioreactor technology for wastewater treatment and reuse. Desalination 187 (2006) 271-282. R Amutha, P Gunasekaran. Production of ethanol from liquefied cassava starch using co-immobilized cells of Zymomonas mobilis and Saccharomyces diastaticus. Journal of Bioscience and Bioengineering 92 (2001) 560-564 Wendhausen R, A Fregonesi, PJS Moran, I Joekes, JR Rodrigues, E Tonella, K Althoff. Continuous fermentation of sugar cane syrup using immobilized yeast cells. Journal of Bioscience and Bioengineering 91 (2001) 48-52. Villen, Rafael A. Biotecnologia - Histrico e Tendncias. Revista de Graduao em Engenharia Qumica 10 (2002) em http://www.hottopos.com/regeq10/rafael.htm (acesso em 03/04/2008).

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