Princpios de Anlise Quantitativa em Cromatografia

RT
16.64 17.62 21.78 22.24 23.35 25.43 25.59 26.07

Library/ID
HEXENOL<3Z-> 1-Hexanol THUJENE<ALPHA> PINENE<ALPHA-> CAMPHENE SABINENE PINENE<BETA-> 1-Octen-3-ol OCTANONE<3-> MYRCENE PHELLANDRENE<ALPHA> TERPINENE<GAMMA-> HEXYL ACETATE CYMENE <PARA> LIMONENE 1,8-CINEOLE OCIMENE<(Z)-BETA->

FID%
0.07% 0.13% 0.08% 0.41% 0.28% 0.11% 0.35% 0.28% 0.04% 0.76% 0.04% 0.07% 0.21% 0.08% 0.75% 5.00% 0.89%

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 y = 2x + 1

26.62 26.95 27.88 28.32 28.84 29.53 29.87 30.05 30.72

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Etapas do mtodo analtico

1. Extraco dos analitos a partir da matriz na qual se encontram 2. Purificao e concentrao dos compostos a quantificar 3. Introduo da amostra no sistema cromatogrfico 4. Separao cromatogrfica 5. Deteco: Os detectores cromatogrficos produzem sinais elctricos que so enviados para registadores ou integradores Apesar de existir uma grande variedade de detectores em cromatografia lquida e gasosa o mtodo de quantificao idntico para todos eles: Cada detector produz uma resposta (sinal elctrico) cuja intensidade proporcional concentrao do analito. Esta resposta do detector depende tambm da natureza do analito o que torna obrigatria a utilizao de padres dos compostos a quantificar.
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Representao esquemtica de um cromatgrafo gasoso

Picos cromatogrficos
Linha de base: resposta do detector quando nenhum analito est a ser detectado Dever ser estvel ao longo da corrida cromatogrfica e corresponder a um sinal elctrico baixo e sem flutuaes (razo sinal/rudo grande)

Para que se possam quantificar os picos cromatogrficos devero estar razovelmente resolvidos: deve ser possvel localizar o incio e o fim de cada pico bem como o seu mximo.

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Altura do pico cromatogrfico Em alguns casos pode-se assumir que a altura do pico cromatogrfico proporcional concentrao do analito.

Vantagens: Mtodo simples Clculos rpidos

Desvantagens: A altura mais varivel do que a rea (menor exactido e menor preciso)
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rea do pico cromatogrfico

A rea do pico cromatogrfico o parmetro mais frequentemente correlacionado com a concentrao do analito detectado.

rea Concentrao
O valor de rea utilizado tpicamente a mdia de 3 a 5 determinaes A relao entre rea e concentrao linear em determinadas gamas de concentrao (gamas de linearidade)
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Como quantificar a rea do pico Mtodos manuais

Cortar e pesar Planmetro Triangulao

Mtodos automticos
Integradores Aquisio do sinal por computador

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 Cortar e Pesar

O pico registado em papel (registador), cortado e pesado. Considera-se que o peso de cada pico proporcional sua rea

Planmetro
Utiliza-se um dispositivo que desenha o pico e produz um nmero proporcional rea do pico

Triangulao
Assume-se que cada pico triangular e a sua rea determinada por:
rea = Altura (h) x Largura (w) ou rea = Altura (h) x 2 W1/2 Onde W1/2 a largura a meia altura
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 Integradores
Podem memorizar cromatogramas Se no se esquecer de gravar !!!

Aquisio por computador

Registo automtico em suporte digital Permite o tratamento de dados j gravados em simultneo com a aquisio de novos dados Maior flexibilidade no reprocessamento de cromatogramas (integrao personalizada) Grande versatilidade na apresentao de resultados

Atravs de uma frmula matemtica (algoritmo) calculam a rea de cada pico Permitem algumas operaes de reprocessamento do cromatograma (alterao de alguns parmetros de registo e/ou integrao (atenuao, rea mnima, etc)

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Determinar a concentrao
Normalizao interna Utilizao de factores de resposta Calibrao externa Calibrao com padro interno

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Normalizao interna
Calcular a rea total de todos os picos da amostra (excepto o de solvente) e assumir que: Cada componente produz um pico A resposta do detector no depende da natureza da substncia Nestas condies admite-se que a concentrao de um componente 1, C1 dada por:

C1 (%) = (Area 1 / Area total ) x 100

apenas um valor indicativo pois no tem em considerao a influncia da natureza dos vrios compostos detectados na resposta do detector
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Calibrao Externa
A calibrao deve ser efectuada com uma mistura de padres que inclui todos os analitos a ser quantificados numa gama de concentraes idntica das amostras reais As condies de anlise devem ser reproductveis: estado do equipamento, condies de introduo da amostra, volume de amostra, etc. Nestas condies:
Avalia-se a gama na qual a relao entre a resposta do detector e a concentrao do componente linear. Determina-se a resposta da mistura de padres a quantificar em pelo menos 5 nveis de concentrao uniformemente distribudos pela gama de linearidade Calcula-se a equao de correlaco entre rea e concentrao
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Mtodo do padro interno

Um composto que no faz parte da amostra (padro interno) adicionado, numa concentrao conhecida, antes de se efectuar anlise. Procede-se como no caso da calibrao externa mas:
Utiliza-se a razo A1 / Api em vez de A1 onde A1 a area do pico correspondente ao componente 1 e Api a area do pico correspondente ao padro interno Utiliza-se a razo C1 / Cpi em vez de C1 onde C1 a concentrao do componente 1 e Api a concentrao do padro interno Desta forma eliminam-se fontes de erro associadas ao processo de injeco: variao do volume de injeco, actividade no injector ou no topo da coluna, etc.

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Caractersticas de um bom padro interno

No pode existir na matriz a partir da qual se extraem as amostras reais
Padres deuterados

Deve ser estvel nas condies da anlise No pode co-eluir com outros componentes da amostra (analitos ou impurezas). No pode afectar o padro de eluio dos outros componentes da amostra Tem que ser adicionado numa concentrao constante a todas as amostras e todos os padres de calibrao

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