1 Unidade 3-Cintica enzimtica e uso e produo de enzimas-verso 2-ago 2006 Universidade Federal de Uberlndia Faculdade de Engenharia Qumica Prof.

Ubirajara Coutinho Filho

3.1-Introduo
As enzimas so catalisadores biolgicos, geralmente de estrutura protica (tambm existe enzima que tem como estrutura RNA cataltico dito ribozima), que participam de reaes qumicas diversas. Tais reaes ocorrem nas clulas vivas, em processos industriais diversificados, na produo de alimentos e em produtos de limpeza e no prprio organismo pela ingesto e uso tpico de enzimas presentes em medicamentos, complementos alimentares e cosmticos. O grande interesse no uso das enzimas pode ser explicado por inmeros fatores como: a grande variedade de reagentes nos quais as mesmas atuam; as reaes complexas que as enzimas so capazes de catalisar em rotas onde a gerao de resduos e subprodutos reduzida; capacidade que as mesmas tm atuar como catalisadores a altas velocidades em condies de reduzida necessidade energtica e reduzidos efeitos de corroso de equipamento (condies amenas de presso e temperatura). Na Tabela 1 feita uma comparao detalhada entre as enzimas e outros catalisadores sintticos.

Tabela 1 Comparao entre enzimas e catalisadores qumicos. Caracterstica Especificidade ao substrato Natureza da estrutura Sensibilidade T e pH Condies de reao (T, P e pH) Consumo de energia Formao de subprodutos Separao catalisador/ produtos Enzimas alta complexa alta suaves baixo baixa difcil/cara (enzima livre) simples(enz. imobilizada) Catalisadores Qumicos baixa simples (geralmente) baixa drstica (geralmente) alto alta (geralmente) simples (geralmente)

3.2-Mecanismo de ao enzimtica
A ao cataltica das enzimas envolve o fornecimento de um ambiente na estrutura tridimensional da enzima onde a reao enzimtica mais favorvel, sendo que a regio especfica da enzima onde ocorre a reao dito stio ativo. A reao se torna mais favorvel pelo fato da interao entre os resduos de aminocidos e as molculas reagentes diminuir a energia de ativao pelo rearranjo de ligaes covalentes e pela realizao de interaes no covalente entre enzima e substrato. Para reao esquematizada na equao que segue a Figura 1 representa este fato.

E + S ES EP E + P

G1

G
ES

# G2 EP

# : estado de transio ES: intermedirio de reao EP: intermedirio de reao G : energia livre

Coordenada de reao
Figura 1: Energia de ativao (G) sem enzima (G1) e com enzima (G2)

Em muitas enzimas o processo cataltico acima descrito s possvel quando uma pequena molcula orgnica (dita coenzima) ou um pequeno on (dito cofator) encontra-se ligado no stio cataltico da enzima. Esta necessidade de grupo prosttico (denominao feita para se referir ao grupo necessrio pela enzima) faz com que processos industriais de uso de enzimas que necessitam destes grupos s sejam satisfatrios quando o meio reacional contenha o cofator ou coenzima.

3.4-Modelos cinticos
A)Michaelis- Menten O modelo de Michaelis-Menten um modelo simples e bastante til na descrio de reaes enzimticas. Segundo este modelo a velocidade da reao (V) aumenta com a concentrao de substrato at um limite mximo (VM) quando a enzima se tornar saturada pelo substrato:
k1 k2 E + S ES E + P k 1

Em termos de velocidade de decomposio do substrato (VS), temos: VS=k1 [E][S]-k-1[ES] Em termos de complexo (VES) a velocidade se torna: VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] (2) (1)

A velocidade de formao do complexo nula pela hiptese do estado pseudo-estacionrio (HEPE). Considerando a HEPE e as equaes (1) e (2) tem-se: (3) k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] = 0 VS= k2[ES] A concentrao total de enzima que participa do processo (Et) dada pela soma das concentraes de enzima livre (E) e enzima complexada (ES): [Et]= [E]+[ES] Das equaes (3) e (5), tem-se: k1 ([Et]-[ES] ) [S]-k-1[ES]- k2[ES] = 0 Das equaes (4) e (6), tem-se: (4)

(5) (6) (7)

VS =
Assim :

k1.k2 .[ S ].[ Et ] k1.[ S ] + k2 + k1 VM .[ S ] [S ] + K M

VS =
Onde KM=(k2+k-1)/k1 e VM=k2[Et].

(8)

A equao (8) representa o modelo de Michaelis Menten Para dados cinticos, os parmetros VM e KM podem calculados por regresso no-linear e regresso de equaes linerizadas obtidas da equao (8). O mtodo Lineweaver-Burk e o de Eadie-Hoffstee so duas formas usuais de linearizar a equao de Michaelis-Menten. Y=a+bX com Y=1/V e X=1/S forma de linearizao de Lineweaver-Burk para qual VM=1/a e KM=b/a, conforme ilustra a Figura 2. Y=1/V

Ponto de intercepo Y=1/VM e X=0 X=1/S Ponto de intercepo X= -1/KM e Y=0 Figura 2: linearizao de Lineweaver-Burk

Y=a+bX com Y=V e X=V/S forma de linearizao de Eadie-Hoffstee para qual a=VM e b=-KM, conforme ilustra a Figura 3.

Y=V

Ponto de intercepo Y=VM e X=0

Ponto de intercepo Y=0 e X=VM/KM

X=V/S Figura 3: linearizao de Eadie-Hoffstee Quando a reao ocorre em um reator agitado sem a adio de enzima e substrato at o final do processo o perfil de concentrao de substrato ao longo do tempo corresponde a equao de Michaelis-Menten integrada: (8*) (S0-S)+ KM ln(S0/S)=VM(t-t0) onde S0 representa a concentrao inicial de substrato e t o intervalo de tempo contado a partir do momento onde a enzima e a soluo do substrato foram misturadas. A discusso da cintica em processos com enzima imobilizada e a discusso de diversos tipos de reatores enzimticos so descritos na Unidade 6. B) Inibio competitiva: O modelo de inibio competitiva um modelo onde a inibio reversvel conforme mostra as equaes de equilbrio:
k2 E + S ES E + P k1

E + I EI
k i

k 1 ki

Em termos de velocidade de decomposio do substrato (VS), temos: VS=k1 [E][S]-k-1[ES] Em termos de complexos (VES e VEI ) a velocidade se torna: VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] VEI=ki [E][I]-k-i[EI] Pela HEPE e pela equao (11), tem-se: (10) (11) (9)

[EI]= [E][I]/Ki onde Ki=k-i/ki

(12)

A concentrao total da enzima [Et] dada pela soma das concentraes de enzima na forma livre e complexada: [Et]= [E]+[ES] +[EI] (13) Das equaes (12) e (13): [E]=( [Et]-[ES])/fator onde fator = 1+[I]/Ki. Das equaes (10), (14) e da HEPE, tem-se: (14)

[ES]=[S] [Et]/([S]+fator.KM ) onde KM=(k2+k-1)/k1 Das equaes (9) e (10) em conjunto com HEPE (VES=0), tem-se: VS= k2[ES] De (15) e (16):

(15)

(16)

VS =

VM .[ S ] V .[ S ] = M ap [ S ] + K M (1 + [ I ]/ Ki ) [ S ] + K M

(17)

onde KMap=KM(1+I/Ki) A equao (17) representa o modelo de inibio competitiva que est representado na forma linerizada na Figura 4.

Y=1/V

Sem inibio com inibio

X=1/S Figura 4: representao do modelo de Michaelis Menten e o modelo de inibio competitiva no mesmo sistema cartesiano

B) Inibio no-competitiva: O modelo de inibio no-competitiva um modelo onde a inibio reversvel e a ligao do substrato a enzima e a ligao do inibidor a enzima no interferem na formao do complexo enzima-inibidor-substrato. As equaes de equilbrio que seguem demonstram esta situao:
k1 k2 E + S ES E + P

E + I EI ES + I ESI EI + S ESI k 1
Em termos de velocidade de decomposio do substrato (VS), temos: VS=k1 [E][S]-k-1[ES]+ k1 [EI][S]-k-1[ESI] Em termos de complexos (VES , VEI e VESI ) a velocidade se torna: VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] - ki [ES][I]+k-i[ESI] =0 (HEPE) VEI=ki [E][I]-k-i[EI]- k1 [EI][S]+k-1[ESI] = 0 (HEPE) VESI=ki [ES][I]-k-i[ESI]+ k1 [EI][S]-k-1[ESI] = 0 (HEPE) De (19) e (21), tem-se: k1 [E][S]-k-1[ES]+ k1 [EI][S]-k-1[ESI]= k2[ES] De (22) e (18), tem-se: VS= k2[ES] Para as equaes qumicas tem-se os equilbrios: Ki=[E][I]/[EI]= [ES][I]/[ESI] K1=[E][S]/[ES]= [EI][S]/[ESI] De (24): [ESI] = [ES][I]/Ki De (25): [E] = K1[ES]/[S] De (24) e (27): (27) (26) (23) (19) (20) (21) (18)
k i k1 k i ki

k 1 ki

(22)

(24) (25)

7 [EI] = [E] [I]/Ki = (K1/Ki)([I]/[S])[ES] (28)

A concentrao total da enzima [Et] dada pela soma das concentraes de enzima na forma livre e complexada: [Et]= [E]+[ES] +[EI]+ [ESI] (29)

De (26), (27), (28) e (29):

[ ES ] =

[ Et ] [ Et ] = K1 /[S ] + 1 + ([ I ]/ Ki)( K1 /[ S ]) + [ I ]/ Ki ( K1 /[S ] + 1)(1 + [ I ]/ Ki)

(30)

De (30) e (23):

k2 [ Et ][ S ] VM [S ] VMap [ S ] (1 + [ I ]/ Ki ) (1 + [ I ]/ Ki ) Vs = = = [S ] + K M K1 + [ s ] K1 + [ s]
onde VMap=VM/(1+I/Ki)

(31)

A equao (31) descreve o modelo de inibio no competitiva que est representado na forma linerizada na Figura 5.

Y=1/V

Sem inibio Com inibio X=1/S

Figura 5: representao do modelo de Michaelis Menten e o modelo de inibio nocompetitiva no mesmo sistema cartesiano

8 D) Inibio pelo substrato: O modelo de inibio pelo substrato um modelo onde o excesso de substrato gera uma inibio reversvel conforme mostra as equaes:
k1 k2 E + S ES E + P

ES + S ES2
k i

k 1 ki

Em termos de velocidade de decomposio do substrato (VS), temos: VS=k1 [E][S]-k-1[ES]+ ki [ES][S]-k-I[ES2] Em termos de complexos (VES eVESS) a velocidade se torna: VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] - ki [ES][S]+k-i[ES2] =0 (HEPE) VESS=ki [ES][S]-k-i[ES2] =0 (HEPE) De (34), (35) e (36): (35) VS= k2[ES] A concentrao total de enzima de enzima dada pela soma das concentraes de enzima livre e enzimas em formas complexas: (36) [Et]= [E]+[ES] +[ES2] Para as reaes podem ser associadas as constantes de equilbrio: KM=[E][S]/[ES] (37) Ki= [ES][S]/[ES2] De (37) e (38): [E ]= KM [ES]/[ S] [ES2]= [ES] [S]/ Ki De (36), (39) e (40): (39) (40) (38) (33) (34) (32)

[ ES ] =
De (41) e (35):

[ Et ] K M /[S ] + 1 + [S ]/ Ki

(41)

VS =

k2[ Et ] VM [S ] = K M /[S ] + 1 + [S ]/ Ki K M + [S ] + [S ]2 / Ki

(*)

A equao (*) representa o modelo de inibio pelo substrato. Neste modelo h um ponto de mximo onde a mxima velocidade possvel (dV/dS=0) corresponde a S =

K i .K M

3.5-Desativao trmica da enzima

Ao longo do tempo de armazenamento e uso a enzima perde sua atividade pelo efeito de mudanas conformacionais. O modelo mais simples que descreve este processo o modelo de primeira ordem onde a taxa de desativao (dA/dt, onde A representa atividade da enzima ativa) diretamente proporcional a concentrao da enzima ativa
k1 A Ai

(42)

Nestas condies: dA/dt=-k.A (44)

A resoluo da Equao (44) nos fornece o modelo de primeira ordem na forma integrada: A(t)=Ao.exp (-k.t) A equao (45) pode ser descrita na forma linerizada: ln[A(t)]=ln[Ao] -k.t Para o modelo de primeira ordem, o tempo de meia-vida (t1/2) associado da desativao trmica torna-se: t1/2=ln[2] /k O modelo cintico de desativao trmica acima descrito pode ser expresso em termos relativos a atividade inicial : Ar(t)=A(t)/Ao ou Ar(t)%=100.A(t)/Ao Neste caso: Ar(t)%=100.exp (-k.t) (48) (47) (46) (45)

(45)

Existem modelos de desativao mais complexos como os modelos de desativao em srie que consideram que a enzima passa por vrios estados de desativao com progressiva perda da atividade em cada estado:
k1 k2 A A1 A2

(49)

10 onde k1 e k2 so as constantes da taxa de desativao de primeira ordem. A, A1, A2 so as atividades especficas. 1 e 2 so as razes das atividades especficas A1/A e A2/A, respectivamente. Para um modelo desta natureza tem-se:

AR (t ) = 2 + [1 +

1k1
k2 k1

2 k2
k2 k1

]exp( k1t ) [

1k1
k2 k1

2 k1
k2 k1

]exp( k2t )

(50)

Onde AR(t) foi considerada uma funo do peso das atividades especficas dos estados das enzimas:
AR (t ) = A + 1 A1 + 2 A2 A0

3.6- Imobilizao das enzimas

A imobilizao das enzimas consiste na reteno da enzima em uma regio definida do espao com a manuteno da atividade. Este processo representa a metodologia mais utilizada para superar as dificuldades associadas ao uso das enzimas como: custos elevados de obteno e purificao; instabilidade da estrutura isolada do ambiente natural; efeitos desnaturantes associados ao uso em condies operacionais e condies do ponto timo de uso; ao de substncias traos que atuam como inibidores das enzimas. Entre as vantagens associadas ao uso de enzimas imobilizadas, constam: utilizao contnua da enzima; favorecimento da reutilizao da enzima; possibilidade do uso econmico da enzima em maior concentrao; estabilidade e resistncia a desnaturao. Embora a imobilizao represente as vantagens citadas h dificuldades que tornam a imobilizao ainda invivel para diversas enzimas de interesse. Entre as principais causas que dificultam a imobilizao, podem ser citadas: perda de atividade pelo processo de imobilizao; limitao da atividade cataltica por efeitos difusivos; aumento da complexidade do processo (devido a etapas adicionais); custos associados a enzima imobilizada. Os principais mtodos de imobilizao podem ser divididos em processos onde h imobilizao por ligao e processos onde h a imobilizao por reteno fsica da enzima. Os processos de ligao a suportes (ligao inica e ligao covalente) e ligao cruzada ( dividida em ligao cruzada e ligao co-cruzada) so as formas de imobilizao por ligao, j ocluso em matriz (gel e fibras) e ocluso em membranas (encapsulao e reatores de membranas) so as formas de imobilizao por reteno fsica. O gluteraldedo (OHC-[CH2]3-CHO, pentanodial) representa um dos compostos de uso comum para formao de ligaes cruzadas e ligaes covalentes entre enzima e

11 suporte. O grupo funcional aldedo (-CHO) se liga a um o mais grupos funcionais amino (NH2) da enzima conforme mostra as Equaes 51 e 52 . E-NH2 + OHC-[CH2]3-CHO E-N=CH-[CH2]3-CHO E-N=CH-[CH2]3-CHO + E-NH2 E-N=CH-[CH2]3-CH=N-E onde E-NH2 representa a estrutura da enzima com um dos grupos amino evidente. (51) (52)

A sucessiva ligaes de gluteraldedo (G) a enzima (E) gera estruturas como a representada na Figura (6): ...-E-G-E-G-E-G-P-G-E-G-E-.... G-E-G-E-G-E-G-P-G ...-E-G-E-G-E-G Figura 6: uma possvel estrutura de enzima(E), gluteraldedo (G) e protena (P) A ligao covalente de enzimas a suportes feita por suportes com presena de grupos diversos como o grupo amino (-NH2), hidroxila (-OH), carboxila e epxido ( -CH CH2 ) e aldedo (-CHO, ex: no gluteraldedo). O A Figura 7 apresenta exemplos de reaes de imobilizao envolvendo o suporte ligado a diferentes grupos. O terceiro exemplo um processo que utiliza suportes hoje j disponveis na forma ativada e o quarto exemplo um dos vrios tipos de silanizaes possveis. As reaes de silanizao so usadas em vidros, slica e xidos metlicos como a alumina.

Figura 7: ligao covalente de enzimas a suportes por quatro formas distintas de formao das ligaes covalentes enzima-suporte ativo. Nas resinas onde no h ligaes covalente resina-enzima, a imobilizao no suporte ocasionada por foras de natureza eletrostticas ou intermoleculares entre o suporte e as molculas da enzima. Entre as resinas disponveis no mercado constam: resina

12 catinica Amberlite (grupo funcional que retm os ctions: cido carboxlico), resina hidrofbica Amberlite (grupo funcional de natureza aliftica apolar Entre as enzimas hoje utilizadas industrialmente na forma imobilizadas em resinas de troca inica constam: lipase,-amylase, aminocilase, glicose-isomerase, Rnase, lactase e lisozima. Uma das formas de imobilizao por ocluso em gel o alginato de sdio (derivado do cido algnico proveniente de algas) com solues de ons de clcio ou outro ons(ex: alumnio) capazes de gerar um gel insolvel. Ao gotejar uma soluo composta de alginato de sdio e enzima na soluo do on clcio (ou outro on como o alumnio), ocorre a formao de uma rede polimrica de clcio e cido alginato (veja a Figura 8) que capaz de reter a enzima. A eficincia do processo pode ser melhorada pela formao, em uma etapa posterior, de ligaes cruzadas utilizando, por exemplo, gluteraldedo.

Figura 8: modelo da estrutura do gel de alginato de clcio

3.6- Extrao e purificao de enzimas

A baixa concentrao das enzimas no interior das clulas e no meio de cultura fermentado, bem como outros fatores (ex: existncia de diversas enzimas e substncias no meio onde se encontra a enzima; desnaturao da enzima ao por efeito do tempo, temperatura, acidez do meio e ao microbiana) fazem com que o processo de purificao e padronizao de preparados enzimticos seja essencial antes que os mesmos possam ser utilizados em processos e produtos variados. So as principais etapas associadas a obteno das enzima para uso industrial e em produtos: obteno da matria-prima ou, no caso de enzimas microbianas, fermentao para obteno da enzima; extrao da enzima envolvendo o processo de ruptura celular para enzimas intracelulares (via ultra-som, ao de detergentes e solventes, moagem entre outros processos como processos enzimticos); extrao da enzima; purificao da enzima e padronizao do preparado enzimtico. A primeira etapa da purificao consiste na obteno da enzima em meio lquido pela triturao da fonte animal, vegetal ou ruptura de clulas ricas em enzimas, aps esta etapa feita a filtrao ou sedimentao do material insolvel, e, ento, a enzima purificada pelo uso de tcnicas variadas como: fracionamento por solventes (ex: etanol e

13 acetona), fracionamento por sais (ex: sulfato de amnio); fracionamento por variao da acidez; e outras tcnicas de custo mais elevado (ex: dilise; filtrao em gel; eletroforese; ultrafiltrao; cromatografia e troca inica). A escolha de uma ou mais das tcnicas combinadas entre as disponveis depende do grau de pureza e escala de produo desejada. O fracionamento com sal, tambm conhecido como salting-out, est relacionado com a fora inica do sal (I). A Equao (53) relaciona a solubilidade a enzima (S) com a fora inica do sal: log (S)=a-b.I (53) onde: a a solubilidade hipottica na ausncia de sal, b a constante de precipitao e I a fora inica representada pela Equao (54). 1 n I = Ci Z i (54) 2 i =1 onde Ci a concentrao da espcie inica i, Zi a carga do on i e n o nmero total de ons presentes no meio onde est a enzima. log(S) Intercepto: I=0, log(S)=a Solubilidade real Eq. (51)

I Figura 8: Fracionamento de enzimas por salting-out Quando se tem uma mistura de enzimas e protenas, a adio progressiva de sal gera, a baixas temperaturas, a obteno de fraes ricas nas diferentes enzimas e protenas, assim o processo gera a separao das enzimas e protenas do meio lquido. O fracionamento por alterao da acidez conseguido quando a acidez do meio gera a ausncia de cargas na estrutura da enzima. Esta situao conhecida como o ponto isoeltrico (pI) e torna mnima as foras eletrostticas repulsivas entre as molculas das enzimas, assim valores de pH prximos ao pI ocasionam a menor solubilidade de enzima o que possibilita sua separao por insolubilizao. A extrao enzimtica com polietilenoglicol (PEG) um mtodo de interesse prtico pelo fato do PEG ser um composto que favorece a estabilizao de enzimas e ser fcil o processo de extrao com PEG a custos atrativos. A adio de PEG em concentraes de 25-30% gera precipitao por excluso da gua superficial da estrutura protica e a enzima recuperada por centrifugao.

3.7- Uso de enzimas

14

O mercado mundial de enzimas movimenta uma cifra superior a um bilho de dlares anuais com uma taxa de crescimento de 8 a 10% ao ano. Este mercado disponibiliza uma grande variedade de enzimas sendo que os setor de alimentos, detergente e couro utilizam grande quantidade de enzimas. A Tabela 2 apresenta exemplos de uso de diferentes enzimas. Tabela 2 Uso de enzimas

Vivemos em uma poca perigosa. O homem domina a natureza antes que tenha aprendido a dominar-se a si mesmo ( Albert Schweitzer)