99 submeLese o maLerlal ampllflcado de uma reao de C8 a

enzlmas dlgesLlvas (endonucleases de resLrlo) que corLam o unA em

posles consLanLes denLro de um slLlo desLa forma o perfll de resLrlo de
um unlco gene conhecldo possa ser comparado com o perfll de ouLra cepas
ou sorogrupos bacLerlanos

8lL vn18 e S18 assoclados C8

A Llpagem de 8lL fol a prlmelra Lecnologla usada em LesLes de unA forense sendo adoLada
para uso em dlversos palses uevldo necessldade de uma grande quanLldade de unA no
degradado a Lecnologla 8lL no e mals o proLocolo de escolha dos laboraLrlos que reallzam
LesLes de unA forense C meLodo de C8 Lem uma slgnlflcanLe vanLagem sobre a Lecnlca
anLerlor de 8lL baseada em SouLhern pols necesslLa de uma quanLldade bem menor de unA
para anllse e alem dlsLo e um LesLe mulLo mals rpldo podendo uLlllzar amosLras mulLo
degradadas Lendo a cerLeza de resulLados saLlsfaLrlos (SPuLLL8 eL al 2001)Asslm Lodos os
pollmorflsmos descrlLos anLerlormenLe so aLualmenLe lnvesLlgados aLraves de C8

Princpio da identificao de mutaes pontuais atravs da

eliminao/criao de stios de restrio e gerao de fragmentos de
digesto com polimorfismo de comprimento a partir de produtos de
PCR (PCR/RFLP). A figura representa o caso de um indivduo
heterozigoto para a marca estudada. A mutao elimina um stio
EcoR existente no alelo selvagem (wt). A amplificao dos dois alelos
produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digesto
destes fragmentos com a enzima EcoR gera um polimorfismo de
comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado,
enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho
distinto.
Na avaliao do resultado da PCR/RFLP discutida acima, o gel deve
mostrar uma banda nica apenas para o indivduo afetado
(homozigoto mutante, com clnica da doena), j que os produtos de
PCR dos dois alelos no podem ser clivados pois perderam o stio de
restrio para EcoR. J o homozigoto normal ter seus os produtos
de PCR de dois alelos clivados e no gel apenas duas bandas estaro
visveis. Apenas no caso j discutido (portador so, heterozigoto wt/3)
sero visveis trs bandas. A figura abaixo representa de forma
esquemtica o resultado de uma anlise PCR/RFLP.

Fig. 7.12 Resultado da investigao da presena de mutao no stio

EcoR por PCR (PCR/RFLP). A figura representa o caso de um
indivduo heterozigoto para a marca estudada (coluna b), um indivduo
afetado e um normal homozigoto. A mutao elimina um stio EcoR
existente no alelo selvagem (wt). A amplificao dos dois alelos
produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a digesto
destes fragmentos com a enzima gera um polimorfismo de
comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado,
enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho
distinto.

Em muitos casos de mutaes pontuais a tcnica de PCR/RFLP no

pode ser aplicada, seja porque no h stio de restrio conhecido
para o entorno da mutao, seja porque mltiplas mutaes so
possveis no gene de interesse, tornando a abordagem acima
impraticvel. Uma alternativa o mis-match PCR, ou PCR com
pareamento errneo. O princpio desta tcnica, descrito pela primeira
vez por Cotton et al., em 1988, e tambm conhecido com CMC -
chemical mismatch cleavage - baseia-se na clivagem de DNA em
locais com pareamento errneo pela piperidina, e est representada
na figura abaixo. Um indivduo heterozigoto tem uma mutao pontual
numa regio qualquer do gene. Podemos amplificar esta regio com
primers dirigidos a suas extremidades, como fizemos na PCR/RFLP.
Em seguida aquecemos o produto do PCR e deixamos esfriar
rapidamente para induzir a formao de heteroduplexes (uma fita
simples de um alelo e a complementar do outro) alm dos
homoduplexes (as dus fitas pareadas de volta, de um mesmo alelo).
Nas regio no pareadas ou com pareamento errneo com bases C e
T liga-se o produto hidroxilamina ou o tetrxido de smio,
respectivamente. Uma vez ligados, estes produtos permitem a
clivagem do DNA neste local pela piperidina. Assim, 50% dos produtos
de PCR sero cortados por este sistema em todo lugar onde houver
uma mutao. Em geral os fragmentos gerados pro este sistema so
pequenos e devem ser visualizados em gel de poliacrilamida. A figura
abaixo mostra como funciona este sistema.

Fig. 7.13 Resultado da investigao da presena de mutao em uma

base desconhecida pela tcnica de PCR-mismatch. A figura
representa o caso de um indivduo heterozigoto para a marca
estudada: o alelo selvagem tem o par TA e o mutante o par GC. A
amplificao por PCR do trecho onde a mutao est usa primers que
esto a alguma distncia direita e esquerda da provvel mutao.
Quando o produto do PCR aquecido os dois tipos de fita (TA e GC)
se separam, dando origem a 4 fitas simples. Quando a mistura
rapidamente aquecida, as fitas simples se reassociam ao acaso de 4
formas distintas, pois a diferena de uma nica base no impede o
pareamento das fitas quase complementares. Aps o uso de um
sistema qumico adequado, os pares de base errneos so clivados e
as fitas com mis-match geram dois fragmentos no gel, ao contrrio das
fitas com pareamento perfeito. O heretozigoto aparece, no gel, com
trs bandas (veja figura abaixo).
O resultado do experimento descrito acima est esquematicamente
representado na figura seguinte. O portador so, heterozigoto, tem
uma mutao na posio descrita na figura anterior. O primeiro
afetado tem esta mutao nos dois alelos. J o segundo afetado tem
um alelo com a mutao da figura anterior e outro alelo com uma
mutao mais a direita, como representado na barra vertical ao lado
do gel.

Fig. 7.14 Resultado da investigao da presena de mutao pela

tcnica de mismatch PCR. A figura representa o caso de um indivduo
heterozigoto para a marca estudada (coluna b), dois indivduo
afetados e um normal homozigoto. A amplificao dos dois alelos
produz fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a clivagem
destes fragmentos pela piperidina gera um polimorfismo de
comprimentos, com o alelo mutante permanecendo no cortado,
enquanto o alelo selvagem clivado em dois pedaos de tamanho
distinto. No caso do primeiro afetado (homozigoto) no h mismatch
interno porque os dois alelos so idnticos. Nocaso do afetado
heterozigoto cada alelo diferente do outro em dois pontos distintos, o
que gera trs fragmentos pela piperidina, mais o produto no clivado
do homoduplex.

RFLP
O que o RFLP?
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) uma tcnica em que os organismos podem
ser diferenciados pela anlise de padres derivados da clivagem do seu DNA. Se dois
organismos diferirem na distncia entre os stios de clivagem de uma endonuclease de
restrio, o comprimento dos fragmentos produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com
uma enzima de restrio.
MetodoIogia
Para a deteco de RFLP's, pode ser usada a metodologia de "Shouthern Blotting, descrita
em 1975 por Edmund Southern. Aps restrio enzimtica os fragmentos de DNA genmico
so sujeitos a electroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte slido de
nitrocelulose atravs do arrastamento por capilaridade. Aps hibridizao com sondas
radioactivas este processo possibilita a identificao, entre milhares de fragmentos de restrio
obtidos, de sequncias bem determinadas.
ApIicaes
Com o aumento da informao da sequncia gentica um grande nmero de doenas
genticas podem ser determinadas atravs da anlise do RFLP:
1
Fig. 3 - Linhagem de uma famlia em que o filho o nico a possuir anemia falciforme.
) A anemia faIciforme uma doena
gentica em que ambos os genes no
paciente substituem um T por um A na
posio do meio do codo 6. sto converte o
codo GAG (para o glutamato) ao codo
GTG (para a valina) e elimina e sequncia
reconhecida (CTGAGG que comum aos
codes 5, 6 e 7) e cortada por uma das
enzimas de restrio. Quando o gene
normal (beta a) digerido com uma enzima
de restrio e os fragmentos so separados por electroforese a sonda liga-se a um pequeno
fragmento (entre as setas vermelhas). Quando o gene doente (beta s) a enzima no pode
cort-lo neste stio, ento a sonda liga-se a um fragmento muito maior (Fig. 3). Neste exemplo,
uma mudana de um nico nucleotdio produz o RFLP. sto uma causa comum de RFLP's e
estes polimorfismos so actualmente referidos como SNP's (Single Nucleotide Polymorphisms).
2
Fig.4 Anlise do RFLP para a FC.
A fibrose cstica (FC) uma doena hereditria que faz certas glndulas produzirem
secrees anormais, resultando disso vrios sintomas, os
mais importantes afectando o trato digestivo e os pulmes.
A FC uma doena recessiva, pelo que qualquer pessoa
com FC deve ser homozigtica para os alelos da doena.
Se os progenitores requererem aconselhamento gentico
recorre-se anlise de RFLP que realizada ao seu DNA.
Os RFLP's para a FC so conhecidos, portanto fcil
determinar se uma pessoa homozigtica normal, heterozigtica portadora ou homozigtica
com FC (Fig. 4).
Limitaes
As mutaes que causam a maior parte das doenas genticas humanas so mais
variadas do que a nica mutao associada anemia falciforme. 2 Existem muitas
doenas que resultam de vrios genes mutantes trabalhando juntos para produzir o
fentipo da doena. Ainda existem doenas genticas para as quais o gene ainda
no foi descoberto. At o gene poder ser localizado, clonado e sequenciado nenhuma
sonda pode ser feita para o detectar directamente.



PoIimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrio (RFLP O R F L P (R e s t r i c t i
o n F r a g m e n t L e n g h t PoIymorphysm um mtodo que utiliza enzimas de
restrio para deteco de mutaes e polimorfismos genticos. As enzimas de restrio
reconhecem stios especficos na seqncia do DNA que clivada somente quando o stio est
presente, gerando fragmentos de vrios tamanhos que so separados e analisados por
eletrofores.
Os tamanhos de fragmentos gerados so muito variveis. Originalmente este mtodo foi
utilizado no Southern Blot para deteco de grandes fragmentos de DNA. Nesta aplicao, o
DNA genmico fragmentado utilizando-se enzimas de restrio e os fragmentos so
separados por eletroforese em gel de agarose de alta resoluo. Posteriormente os fragmentos
de DNA so transferidos a uma membrana de nylon e hibridizados com sondas marcadas que
contem seqncias complementares ao loco gnico a ser estudado.Os fragmentos hibridizados
so identificados por autorradiografia ou outro sistema de deteco.
Com o advento da PCR e do conhecimento e disponibilidade das seqncias de DNA em
bancos genmicos, o mtodo passou a ser utilizado no formato de PCR-RFLP (Figura 8) que
permite analisar fragmentos de tamanhos menores. Quando as mutaes ou polimorfismos no
esto presentes em stios de restrio,podem ser criados stios artificiais utilizando-se
oligonucleotdeos modificados na PCR. Esta estratgia denominada mutagenese sitio-dirigida
mediada pela PCR.
Os fragmentos gerados no RFLP podem ser detectados por eletroforese e transferncia de
DNA como o Southern blot. No caso da PCR-RFLP, os fragmentos so separados por
eletroforese em gel de agarose ou acrilamida e detectados diretamente pela colorao com
brometo de etdeo ou outro corante fluorescente como o SYBR Gold ou ainda por colorao
com nitrato de prata. O limite de deteco da PCR-RFLP de uma clula mutante pode ser
detectada entre cinqenta a cem clulas normais.
A especificidade do mtodo de 100% quando a enzima de restrio apropriada utilizada.
Para o controle de qualidade, amostras de DNA contendo alelos mutantes e comuns devem ser
includos na anlise. O mtodo tambm deve ser ajustado para condies que no permitam
que resultados falsos positivos sejam obtidos quando quantidade varivel e diferentes
propores de DNA mutante e selvagem estejam sendo analisadas. Resultados questionveis
devero ser confirmados por repetio dos testes e seqenciamento de DNA.