MARCADORES MOLECULARES

Discentes:Jos Ccero e Liza Ellen Docentes: Ana Cristina e Vilma Loreto Disciplina: Introduo a Gentica

INTRODUO

Com o advento das tecnologias modernas de Gentica e da Biologia Molecular, surgiram, por exemplo, diversos tipos de marcadores moleculares que detectam o polimorfismo gentico diretamente do DNA. Diferenas genticas no DNA significam na maioria das vezes diferenas fenotpicas. Obteno de um nmero ilimitado de polimorfismos genticos, identificao direta do gentipo, deteco de polimorfismos em qualquer estgio do desenvolvimento da planta. H a possibilidade de gerar maior quantidade de informao gentica por loco no caso de marcadores co-dominantes.

As diferentes metodologias da gentica tm permitido estudos de evoluo, de diversidade gentica inter e intra-especfica, de identidade, origem gentica e identificao de novas variantes, gerando informaes importantes para subsidiar diferentes aes de pesquisa desde a coleta at o uso dos recursos genticos em programas de melhoramento.

PRINCIPAIS MARCADORES MOLECULARES

Nos ltimos anos, com os avanos da gentica e da biologia molecular, principalmente com o advento da tecnologia do DNA recombinante, da reao em cadeia da polimerase (PCR) e do seqenciamento automtico do DNA foram desenvolvidas poderosas tcnicas para o desenvolvimento de marcadores genticos teis na identificao, caracterizao e avaliao dos recursos genticos.

Para obteno de marcadores moleculares, exigida uma infra-estrutura apropriada para realizar as diferentes fases da metodologia que varia de acordo com o tipo de marcador. De modo geral so necessrios equipamentos para extrao de DNA, amplificao via reao em cadeia da polimerase (PCR), separao por eletroforese, fotodocumentao e anlise estatstica dos marcadores gerados. A infra estrutura tambm depende do nmero de acessos a derem analisados, sendo que equipamentos mais robustos so fundamentais para anlise de grande nmero de acessos.

Acesso-> Amostra de germoplasma representativa de um indivduo ou de vrios indivduos da populao. Qualquer registro individual constante de uma coleo de germoplasma.

ISOENZIMAS

Grupo de mltiplas formas moleculares de uma enzima, resultante e variaes allicas dos genes codificadores. A obteno de marcadores isoenzimticos envolve a preparao da amostra do tecido, a separao por eletroforese dos polimorfismos e gis de policrilamida ou de amido e a visualizao dos polimorfismos por meios de corantes enzimticos especficos. Vantagens: baixo custo, facilidade e rapidez da metodologia, obteno de marcadores genticos codominantes (marcadores que permitem a diferenciao dos locos em homozigose dos locos em heterozigose) Desvantagem: baixo nmero de sistemas enzimticos polimrficos e a influncia das condies ambientais e dos tecidos vegetais nas atividades enzimticas.

RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORFIC DNA) OU PCR (ARBITRARILY PRIMED POLYMERASE CHAIN REACTION)
So fragmentos de DNA amplificados pela reao em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers curtos de sequencia aleatria. A obteno desses marcadores envolve a extrao e a amplificao do DNA, eletroforese normalmente em gel de agarose corado com brometo de atdio e fotodocumentao sob luz ultravioleta. Vantagens: facilidade e a rapidez para obteno dos marcadores, a necessidade de quantidade mnimas de DNA e a universalizao das anlises.Pode-se trabalhar com qualquer espcie pois no h necessidade de conhecimento prvio de dados de sequencia de DNA para a construo dos primers utilizados.

Desvantagens: dominncia dos marcadores, no diferenciando os locos de heterozigose dos locos de homozigose e baixa reprodutibilidade das marcas por causa da sensibilidade da tcnica s condies experimentais, principalmente quando elas no esto bem padronizadas. Para diminuir os problemas de reprodutibilidade do marcador RAPD, primers especficos (15 a 30 pb) podem ser desenhados a partir do sequanciamento de determinado marcador RAPD ligado a uma caracterstica de interesse do geneticista, de modo a produzir marcadores SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)

Fonte: http://mycor.nancy.inra.fr/molecular/aubure/index.html

RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM)

So fragmentos de DNA obtidos de enzimas de restrio, separados por eletroforese, e visualizados por meio de hibridizaes com sondas de seqncia homlogas marcadas com radioatividade ou fluorescncia. Marcadores RFLP podem ser obtidos de diferentes genes ou regies genmicas, inclusive, de DNA ribossomal (rDNA) de mitocndria (mtDNA), cloroplastos (cpDNA). As etapas para aquisio de RFLPs envolvem a extrao de DNA, digesto com endonucleases de restrio, eletroforese, transferncia dos fragmentos para uma membrana de nylon, hibridizao dos fragmentos com sondas marcadas e visualizao dos polimorfismos, normalmente, por auto-radiografia.

Vantagens: co-dominncia dos marcadores e a alta reprodutibilidade deles. Desvantagens: exigncia de sondas especficas para hibridizao e o fato da a tcnica ser mais trabalhosa, demorada e cara quando comparada a outras tcnicas.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml

MICROSSATLITES OU SSR (SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

So unidade muito curtas (2 a 5pb) repetidas em tandem, ou seja, uma aps outra. A obteno dos maracadores envolve a amplificao dos microssatlites via PCR, utilizando primers especficos (de 20 a 25 pb) para as regies do DNA que flanqueiam os microssatlites. Nesse sentido para se conseguir marcadores microssatlites, necessrio, primeiramente o desenvolvimento dos primers especficos para a espcie em estudo, e este desenvolvimento requer a construo de bibliotecas genmicas, seleo e seqenciamento dos clones positivos e desenhos dos primers.

Uma vez desenvolvidos os primers especficos, as etapas de obteno so parecidas com as utilizadas para marcadores RAPD: extrao e amplificao via PCR do DNA, eletroforese em gis de poliacrilamida ou agarose e visualizao do polimorfismo por auto-radiografia, colorao com prata ou fluorescncia ou por colorao com brometo de etdios sob luz ultravioleta.

Vantagens: co-dominncia dos marcadores, alto nvel de polimorfismo que pode ser detectado, alta reprodutibilidade das marcas e a possibilidade de deteco de vrios microssatlites no mesmo gel, facilitando a operacionalizao das anlises, principalmente quando requer grande nmero de acessos. Desvantagens: alto custo requerido para o desenvolvimento dos primers, a indisponibilidade dos primers para espcie estudada, e o fato de bandas inespecficas ou gis de baixa resoluo poderem dificultar a acurada avaliao dos polimorfismos.

Fonte: http://www.jbrj.gov.br/pesquisa/conserv/dna.htm Fonte: http://scienceblogs.com.br/bessa/2009/06 /manchetes_comentadas_18_-_voo.php

AFLP (AMPLIFIED FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM)

So fragmento de DNA com enzimas de restrio, seguidos da ligao de oligonucleotdeos adaptadores e amplificao seletiva dos fragmentos via PCR. Esse tipo de marcador combina os princpios dos marcadores RAPD e RFLP. As etapas de obteno envolvem a extrao do DNA, digesto com endonucleases de restrio ligao de adaptadores, amplificao seletiva via PCR, eletroforese em gis de alta resoluo e visualizao dos fragmentos por auto-radiografia, colorao com prata ou fluorescncia.

Vantagens: Gerao de grande nmero de polimorfismos por reao e o fato de no haver necessidade de conhecimento prvio de dados de seqncia de DNA para construo dos primers utilizados.
Desvantagens: dominncia dos marcadores, alto custo e as vrias etapas e reagentes necessrios obteno dos marcadores.

Fonte: http://www.environment.ucla.edu/CTR/research/InfDiseases/migratory_connectivity.html

MINISSATLITES OU VNTRS (VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEATS)

So unidade de 10 a 100 pb repetidas em tandem, flanqueadas por stios conservados de endonucleases e de restrio. As etapas de obteno envolvem a extrao e digesto do DNA com endonucleases de restrio, transferncia dos fragmentos para uma membrana de nylon, hibridizao dos fragmentos com sondas de minissatlites marcadas e visualizao dos polimorfismos, normalmente, por auto-radiografia.

Vantagens: a alta reprodutibilidade das marcas e a gerao de muitas bandas informativas por reao. Desvantagens: esto relacionadas a dominncia dos marcadores e o fato da tcnica ser mais trabalhosa, demorada e cara em relao a semelhana dos marcadores RFLP.

Fonte: http://science.kennesaw.edu/~rrascati/forensicpolymorphs.html

CAPS (CLEAVED AMPLIFIED POLYMORPHIC SEQUENCE)

So fragmentos de DNA amplificados via PCR, utilizando-se de primers especficos (20 a 30pb), seguido da digesto com endonucleases de restrio. esse tipo de marcador tambm conhecido como PCR-RFLP. As etapas para obteno desses marcadores so a extrao e amplificao de DNA via PCR, a digesto com enzimas de restrio, eletroforese em gis de agarose ou poliacrilamida e a visualizao dos polimorfismos pela colorao com brometo de etdio sob luz ultravioleta ou com prata.

Vantagens: co-dominancia e reprodutibilidade dos marcadores.

alta

Desvantagem: necessidade de conhecimento prvio de seqncia de DNA para a construo dos primers.
Vantagem sobre o RFLP que ele no requer o tempo e os reagentes necessrios s etapas de hibridizao e visualizao por auto-radiografia.

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechCAPS.shtml

SSCP (SINGLE-STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM)

So fragmentos de DNA de 200 a 800pb amplificados via PCR usando primers especficos, desnaturados para a fita simples e separados por eletroforese. O princpio desse tipo de marcador que a eletroforese da fita simples do DNA permite a deteco da variao da sequncia de nucleotdeos de cada fragmento responsvel por sua estrutura secundria.

Uma variao dessa tcnica chamada de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electroforesis) que utiliza gis desnaturantes usando concentraes de formamida e uria. O procedimento metodolgico para obteno de SSCPs envolve a extrao e a amplificao do DNA, desnaturao dos fragmentos amplificados para fita simples, separao dos fragmentos por eletroforese em gis de poliacrilamida e a visualizao dos polimorfismos pela colorao com prata ou autoradigrafia.

Vantagens: Baixa quantidade de DNA requerida para as anlises e a co-dominncia dos marcadores. Desvantagens : necessidade de conhecimento prvio de seqencia para a construo dos primers e falta de reprodutibilidade quanto as condies da eletroforese no esto bem padronizadas

Fonte: http://www.biocompare.com/Articles/ApplicationNote/1365/RapidHigh-Throughput-Mutation-Discovery-Using-Fluorescent-SSCP-On-TheABI-PRISM-3100-And-3100%E2%80%93Avant-Genetic-Analyzers.html

ISSR (INTER SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

So fragmentos de DNA de 100 a 3000 pb amplificados via PCR usando um nico primer (16-20 pb) construdo a partir da sequncia de microssatlites. As etapas de obteno desses marcadores so a extrao e amplificao via PCR do DNA, eletroforese em gis de policrilamida ou agarose e visualizao do polimorfismo por auto-radiografia, colorao com prata ou fluorescncia ou por colorao com brometo de etdio sobre luz ultravioleta. Vantagens: gerao de grande nmero de bandas informativas por reao e o fato de no haver a necessidade de conhecimento prvio da sequncia de DNA. Desvantagens: dominncia dos marcadores.

Fonte: http://ifgtb.icfre.gov.in/ifgtb-pic/Biotechnology/pages/ISSRPCR%20pattern%20in%20Eucalyptus%20tereticornis%20provenances_jpg_jpg.htm

PCR-SEQUENCING
Envolve a determinao da sequncia de nucleotdeos do fragmento de DNA amplificado via PCR utilizando primers especficos (15 a 30 pb) para dada regio do genoma em estudo. Normalmente, dentro da mesma espcie no h muitas variaes na sequncia de nucleotdeos, sendo assim, mais til em estudos taxonmicos interespecficos, como estudos de reconstruo filogentica. Vantagens: alta reprodutibilidade e nivel de detalhamento a ser estudado.

Desvantagens: baixo nvel de variao em estudos intra-especficos e custo da tcnica

Fonte: http://www.biomedcentral.com/1471-2164/8/291/figure/F2?highres=y

MARCADORES BASEADOS EM
RETROTRANSPONSONS
Compreendem a classe mais comum de transponsons e ocorrem em grande nmero de cpias em genomas de plantas. Vrios desses elementos tm sido sequnciados e tem sido vertificados alto grau de polimorfismos intra e interespecficos. Como as inseres so irreversveis e ocorrem ao longo do genoma, os marcadores baseados nessas sequncias so considerados particulamente teis em estudos filogenticos e mapeamento gentico.

Os retrotransponsons so frequentemente observados em regies adjacentes a genes de planta j conhecidos e consistem em longas sequencias repetidaas com regio terminal altamente conservada. Tal regio tem sido utilizada para o anelamento de primers especficos e desenvolvimento dos marcadores baseados em retrotransponsons.

MARCADORES BASEADOS EM GENMICA

FUNCIONAL

As sequncias gnicas tm estimulado o desenvolvimento de marcadores moleculares direcionados aos genes de interesse. Esses marcadores so particularmente teis na avaliao de germoplasma no estudo da diversidade funcional e na seleo assistida por marcadores moleculares em programas de melhoramento gentico.

Entre os marcadores baseados em genmica funcional, pode-se citar os marcadores baseados em sequncias conectadas de genes de resistncia e aqueles originados da tecnologia do chip de DNA, baseados na hibridizao entre sondas e sequncias complementares de microarranjos de DNA que podem corresponder a mais de 250000 sequnccia ou caractersticas por cm. Sua aplicaes so diagnose de mutaes, deteco de polimorfismos, descoberta de genes, estudo de expresso gnica e mapeamento gentico.

SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM)

So marcadores moleculares de DNA utilizados para identificar mutaes e polimorfismos baseados na posio de um nico nucleotdeo. Os polimorfismos de sequncia nucleotdica so fontes abundantes de variao gentica, sendo gerados por substituio de uma nica base ou pequenos eventos de insero e deleo. interessante para estudos filogenticos de evoluo dentro da espcies, mapeamento gentico e diferenciao de alelos do mesmo gene. feita a amplificao, clonagem e sequenciamento de fragmentos dos genes de interesse.

Vantagem: possibilidade de deteco de grande quantidade de polimorfismos entre alelos de determinado gene.
Desvantagem: necessidade prvio da sequencia de conhecimento

Fonte: http://www.science.marshall.edu/murraye/341/snps/Human%20Geneti cs%20MTHFR%20SNP%20Page.html

ANLISE DOS MARCADORES

REFERNCIA

FALEIRO, F. G. Marcadores GenticoMoleculares Aplicados a programas de conservao e uso de recursos energticos.

FIM