Las enzimas de restriccin cortan el DNA en sitios de secuencia especfica , haciendo posible la unin de molculas de DNA no homlogas de origen

distinto. En este caso se corta el vector con E.corI y la secuencia que queremos aadir se corta tambin con Ecor I despus se une al vector gracias a la accin de la ligasa , se produce una hibridacin y as obtenemos nuestra molcula de DNA recombinante. De este modo podemos aislar fragmentos concretos de DNA de cualquier organismo e introducirlos en un genomio ms pequeo , que es mucho ms fcil de analizar . Estas molculas de ADN recombinantes pueden construirse mediante la unin de molculas de DNA no homlogas de prcticamente cualquier orgen ,incluyendo molculas de DNA de especies muy diferenes entre s. Normalmente el vector en el que se introduce el DNA es capaz de replicarse selectivamente en algn momento del proceso , permitiendo de esta forma la amplificacin de dicho fragmento especifico de DNA . Disponer de un gran nmero de copias del segmento del DNA en estudio facilita sobremanera su anlisis molecular detallado. Con frecuencia las bacterias son los organismos hospedadores para el mantenimiento y amplificacin de molculas de DNA recombinante derivadas de bacterias u organismos superiores .

Los plsmidos y el DNA se corta con las mismas enzimas de restriccin , mediante ligasa se unen generando las molculas recombinantes . Estos plsmidos se introducen en una clula hospedadora en este caso una bacteria a este procedimiento le llamamos transformacin . Los plsmidos son pequeas molculas circulares de DNA que se introducen en las clulas mediante transformacin .Los plsmidos se pueden considerar minicromosomas que se replican autnomamente dentro de la clula. Dentro de la bacteria los plmidos permiten la amplificacin del DNA clonado ,durante el crecimiento celular ,algunos plsmidos estan presentes de 20 a 50 copias por clula. En la placa de petri obtenemos una genoteca es decir varias copias de nuestro DNA recombinante. La clonacin de genes implica la unin del fragmento de DNA deseado a una molcula vector y la propagacin luego de la molcula recombinante en un hospedador adecuado.

Vector de clonacin
Molcula de DNA que permite el transporte a una clula hospedadora, la replicacin y la purificacin de fragmentos individuales de DNA

Requisitos de un vector de clonacin

Molculas relativamente pequeas, fciles de manipular. Replicacin autnoma y fcil introduccin en la clula hospedadora. Puntos de cortes nicos para una o varias enzimas de restriccin. Fcilmente seleccionables. Fcil distincin entre vector no modificado y vector quimrico. Molcula de DNA que permite el transporte a una clula hospedadora,la replicaciny la purificacin de fragmentos individuales de DNA.

Las cpsidas del fago lambda empaquetan de una forma rutinaria una molcula de DNA de unas 45 kb de longitud . Esta propiedad se aprovecha para insertos de DNA que remplazan la porcin central del genomio del fago ,innecesaria para la replicacin de lambda en E.coli. Se han creado vectores hbridos entre plsmidos y fagos que permiten incrementar la longitud del fragmento de DNA que puede clonarse hasta 44 Kb . Estos csmidos se aprovechan del desarrollo de un sistema in Vitro para empaquetar DNA en cpsidas del fago.

Una gran ventaja es su capacidad de conferir resistencia a antibiticos a la clula hospedadora.

Ello permite la seleccin directa de las clulas que incorporan y mantienen los plsmidos de DNA recombinante. Para facilitar esta selccin , pueden introducirse en los plsmidos genes de resistencia a diferentes antibiticos .

pUC8
Es un plsmido muy utilizado, ya que presenta unas caractersticas que son muy beneficiosas:

Es pequeo, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de unos 10.000 pares de bases). Tiene un origen de replicacin y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por clula. Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restriccin que se han agrupado en una regin denominada polylinker o multiple cloning site. Permite la identificacin sencilla de los plsmidos recombinantes, ya que contiene un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a colonias de color blanco.