Universidad veracruzana Programa acadmico: qumica clnica

EE: Virologa

Catedrtico: Mario Eduardo Acosta Hernndez

Alumnos: Hernndez Zapt Denia

Xalapa Equez., Veracruz

METODOS PARA RECONOCER INFECCIONES VIRALES

Para demostrar la presenciadel virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped; se clasifican en: Mtodos Directos: Estos mtodos detectan: El virus como agente infeccioso (aislamiento viral). La presencia de antgenos virales. Tcnicas inmunolgicas: -Inmunofluorescencia(IF), - Enzimoinmunoanlisis (EIA), - Test de Aglutinacin. La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.). El virus como partcula viral (microscopa electrnica).

AISLAMIENTO CELULAR. CULTIVOS CELULARES: Son la base del diagnostico viral; tiene como ventajas alta sensibilidad y alta especificidad y como desventajas es lento, laborioso, costoso y requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados. Son los ms empleados para la propagacin de los virus. Se disocian con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular Se coloca en la superficie plana de un recipiente en donde las clulas se adhieren y multiplican formando una fina capa de clulas que se llama MONOCAPA CELULAR.

Los cultivos celulares se dividen en: Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.

 Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos. Lneas Celulares Continuas: Permite subcultivos y son heteroploides un nmero finito de

1.Inoculacin

Observar al microscopio alas 24, 48 y 72 hs y luego 2 veces por semana

Incubacion 35-37 C

Aparicin de efecto citoptico, toxicidad o degeneracion celular DETECCION DE ANTIGENOS: Pueden utilizarse:

Periodo de hasta 14 dias

Mtodos directos: Deteccin de antgenos, se utiliza un anticuerpo especfico antiviral (por lo general IgG) a cuya fraccin Fc se ha conjugado una molcula marcada, que puede ser: Isotiocianato de fluorescena (Inmunofluorecencia), Istopo radioactivo 125I o 131I (RIA), Enzima: peroxidasa, fosfatasa alcalina, Biotina-avidina (EIA).

 Inmunofluorescencia directa (ID): Se puede utilizar para una identificacin rpida del virus directamente sobre la muestra o se la puede emplear para la confirmacin del efecto citoptico observado en cultivos celulares. Tincin de inmunoperoxidasa: El anticuerpo monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adicin de un sustrato para evidenciar la reaccin por un cambio de color que es visible micro y macroscpicamente. Test de aglutinacin: Se usa para la deteccin de antgenos virales en muestras clnicas. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecficas. Radioinmunoensayo (RIA): La aparicin de un mtodo como el ensayo inmunoenzimtico (EIA) lo ha reemplazado. Enzimoinmunoanalisis (EIA): captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase slida. El antgeno viral presente en la muestra se combina con el anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima. (Peroxidasa o fosfatasa alcalina). En la reaccin con la peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto qumico incoloro que en su forma oxidada tiene un color caracterstico.

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR SONDA SINTETICA Es un ensayo de hibridacin molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.

solubilizacin y desnaturalizacin de los cidos nucleicos.

Se aade un DNA marcado, complementario del DNA del virus. Se incuba

La muestra se pasa por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.

AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Tiene una sensibilidad alta que puede amplificar una nica molcula de DNA y una sola copia de genes puede ser extrada

Mtodos indirectos: Deteccin de anticuerpos, se emplea un antianticuerpo marcado y la reaccin se realiza sobre un cultivo celular infectado por el virus en estudio.

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) Es un mtodo para la determinacin de anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se incuba el suero del paciente con las clulas infectadas y no infectadas. Luego se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA) Los antgenos virales se inmovilizan sobre una fase slida y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los

resultados se pueden leer con un espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual. PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO Revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B extrados de sangre total, lo que indicara que el sistema inmune del paciente ha sido estimulado por el virus.

 Hepatovirus
Orden: Picornavirales Expresin: El ARN es infeccioso y sirve como el genoma y el ARN viral mensajero. Familia: Picornaviridae Gnero: Hepatovirus

P1 cortado proteoliticamente

P2 Y P3 procesados en la replicacin

VGp Conduce a lisis celular

Replicacin: 1. El virus se adhiere a receptores husped. 2. La cpside abre un poro en la membrana de la clula husped. 3. VPg se retira del ARN viral. 4. Se replica el ARN viral en vesculas de la membrana 5. El nuevo ARN es sintetizado 6. La clula se lisa y libera al virus.

Hepevirus
Orden:Unassigned Familia: Hepeviridae Expresin: 1. ORF 1 codifica las protenas no estructurales, que no es buen tiempo esta poliprotena se rompe o no. 2. ORF 2 codifica la protena de la cpside. Gnero: Hepevirus Especie: Virus de la Hepatitis E (VHE)

3. ORF 3 codifica una protena inmunognica pequeos. 4. ORF2 y ORF3 son codificadas por un ARN subgenmico bicistrnico. Replicacin: 1. Virus se adhiere para recibir receptores y es interiorizado. 2. Uncoating, y la liberacin del ARN viral genomico en el citoplasma. 3. El ARN viral se traduce en una poliprotena procesada ORF1 para obtener la madurez protenas no estructurales implicados en la transcripcin del ARN. 4. El Sentido Negativo ssRNAs complementario es sintetizado usando el ARN genmico como plantilla. 5. Nuevos RNA genmicos se sintetizan usando el ARN de sentido negativo, como las plantillas. 6. Expresin de dos molculas de ARN mensajero, uno subjenomico 3,7 kb y un 2,0 kb coterminal. 7. Liberacin de Virus.

Cardiovirus
Orden: Picornavirus Familia: picornaviridae Gnero: Cardiovirus Especie: Encephalomyocarditis

Es un virus sin envoltura, esfrico, con una cubierta proteica que rodea el genoma de ARN desnudo. La cpside consiste en una disposicin icosadrica densas de 60 protmeros, cada uno compuesto por cuatro polipptidos, VP1, VP2, VP3 y VP4. VP4 se encuentra en la parte interna de la cpside. Expresin de genes El ARN del virin es infeccioso y sirve como el genoma y el ARN viral mensajero. . Las poliprotenas son procesadas por la proteasa viral en el precursor de diversas protenas maduras para producir las protenas estructurales ( replicasa, VPg) y una serie de protenas que modifican la clula husped.

Replicacin 1. El virus se adhiere a los receptores de acogida, induciendo un cambio en la cpside. 2. La cpside se abre en un poro de la membrana de la clula husped, y el ARN genmico viral penetra en el citoplasma de la clula husped. 3. El VPg se retira del ARN viral, que se traduce en una poliprotena procesada. 4. La replicacin viral de RNA tiene lugar en vesculas de membrana que deriva de la ER. Un ARN complementario de sentido negativo se sintetiza utilizando la genmica RNA como una plantilla. 5. El genoma nuevo de RNA es sintetizado utilizando el sentido negativo de RNA que se cree una plantilla y se empaquetan en procapsides preformados. 6. -Lisis celular y virus liberar.

Flavivirus
Virus ARN. Familia Flaviviridae Virion: Envuelto, esfrico icosadrica similar. protenas de superficie simetra

Viriones maduros 2 virus codifican protenas de membrana (M y E) Genoma Lineal, ssRNA (+) de10-11 kb. El extremo 3 del genoma forma estructura de bucle. El extremo 5 'tiene una tapa metiladonucletidos

Expresin El ARN del virin es infeccioso y sirve como el genoma y el ARN mensajero viral.

Replicacin 1. El Virus se adhiere a los receptores a travs de la glicoprotena E y proceso de endocitosis en vesculas en la clula husped. 2. El genoma de ARN se libera en el citoplasma. 3. El RNA genmico de sentido positivo se traduce en una poliprotena 4. La replicacin tiene lugar en la superficie del retculo endoplasmtico. 5. Los RNA complementarios en sentido negativo se sintetiza con el ARN genmico como plantilla. 6. Los brotes de viriones en el retculo endoplsmico, se transporta al aparato de Golgi, y luego brotan de la membrana celular.

QUIMIOTERAPIA ANTI-VIRAL
Los frmacos anti-bacteriales como los antibiticos tipo penicilina han probado ser muy eficaces puesto que actan contra una estructura bacteriana, la pared celular, que no se encuentra en las clulas eucariticas. Al contrario, la mayora de los agentes anti-virales han probado tener poca eficacia teraputica dado que el virus usa reacciones metablicas del husped y por tanto, muchos de los agentes anti-virales tambin son anti-celulares. Muchos anti-virales que aparentemente son eficaces in vitro no lo son in vivo. Un frmaco anti-viral eficaz debe de: interferir con una funcin especfica del virus interferir con una funcin celular de forma tal que el virus no pueda replicarse un buen frmaco debe mostrar mucha ms toxicidad hacia el virus que hacia la clula husped PROBABLES ETAPAS DEL CICLO VITAL EN LAS QUE UN ATAQUE ANTI-VIRAL PUEDE INICIARSE Entre las etapas del ciclo vital que han sido objetivos de agentes teraputicos potenciales tenemos: Fijacin del virus a la superficie celular Endosomas Prdida de la envoltura viral Integracin del ADN viral al ADN cromosmico de la clula husped Transcripcin del genoma a un nuevo ARN o ADN Transcripcin de ARNm Procesamiento de ARNm Traduccin a protena Modificacin postraduccin de las protenas. Ensamblaje de los componentes en un virus entero Inhibidores de la sntesis de DNA Modificaciones de sacridos

Aciclovir/Acicloguanosina:

Este frmaco es un inhibidor competitivo compite con el GTPd pero tambin acta de otra manera ms importante: al ser incorporado al ADN, acta como

un finalizador (figura 8). Se administra por va oral, tpica o intravenosa. Las VHS-1, VHS-2 y VVZ son susceptibles al aciclovir. Penciclovir Famciclovir Ganciclovir Otras modificaciones del grupo sacarsido: Didesoxinosina Zalcitabina Stavudine Lamivudina

Modificaciones de Bases Estos son anlogos de la pirimidina que son incorporados al ADN mediante la polimerasa de ADN vrica. Forman pares de bases inestables y mal-traducciones resultando en protenas mutantes. Son inhibidores competitivos de la polimerasa viral de ADN luego de la fosforilacin intracelular. Bromovinil desoxiuridina (Brivudin Yodo-desoxiuridina (Idoxuridina) Trifluorotimidina (Trifluridina) Inhibidores no-nuclesidos de la transcriptasa inversa Frmacos alternativos podran ser de utilidad en terapias combinadas puesto que hay un nmero limitado de mutaciones que la transcriptasa inversa puede sufrir sin perder su funcin. Claramente, las mutaciones que dan resistencia a los inhibidores no-nuclesidos no competitivos de la transcriptasa inversa estaran en una localizacin diferente de la mutacin que provoca que la enzima sea resistente a los anlogos nuclesidos competitivos. Nevirapina Delavirdina Efavirenz Otros inhibidores no nuclesidos de la polimerasa Foscarnet: Este es un inhibidor competitivo de la polimerasa de ADN se une al sitio del pirofosfato. La polimerasa viral de ADN es inhibida a

concentraciones de 10 100 veces menores que la polimerasa de ADN celular proveyendo as de cierta selectividad. Se utiliza de forma endovenosa para retinitis por CMV en pacientes con SIDA y en otros pacientes inmunocomprometidos. Es til cuando el virus infectante ha ganado resistencia a otras drogas como el Aciclovir. INTEGRACIN DEL ADN Los retrovirus copian su genoma de ARN a ADN usando la transcriptasa inversa. El ADN puede permanecer como un provirus circular o puede ser integrado al ADN celular. Este ltimo es necesario para la transcripcin a ARN genmico y mensajero. Por tanto, la integracin es necesaria para la replicacin viral La integracin del ADN viral es efectuada por la enzima integrasa que es codificada por el gen pol. La necesidad de integracin para la replicacin significa que la integrasa sera una diana selectiva de los frmacos. Recientemente, se aprob un inhibidor selectivo de la integrasa. Raltegravir INHIBIDORES DE LA SNTESIS DE ARN Ribavirina Neplanocin A ENZIMAS DE CLIVAJE DE ARN Las ribozimas son molculas de ARN que tienen propiedades catalticas dentro de las cuales est el clivaje especfico de cidos nucleicos. La heptazima es una ribozima que rompe el ARN de la hepatitis C en regiones altamente preservadas (as reduciendo la posibilidad de desarrollo de resistencia). Reconoce y rompe todos los tipos conocidos del virus de la hepatitis C, finalizando as la replicacin viral. La heptazima no ha tenido xito en ensayos clnicos INHIBIDORES DE LA SNTESIS PROTICA Se ha hecho poco progreso en el desarrollo de frmacos que inhiban la sntesis viral de protenas puesto que los virus usan los mecanismos de traduccin de la clula husped. No obstante, un frmaco de esta clase est disponible. Fomivirsen

INHIBIDORES DEL PROCESAMIENTO DE PROTENAS Inhibidores de la proteasa Muchos virus han de clivar (romper) las protenas que ellos producen. En el caso de las glicoprotenas de superficie, esto usualmente se lleva a cabo por una proteasa del husped en la va secretoria (i.e. cuerpo de Golgi). En el caso de protenas internas, como la polimerasa o los antgenos grupo-especfico (AGGs) de los retrovirus y de algunos otros virus, hay una proteasa viral que es codificada por el gen POL. Saquinavir Ritonavir Indinavir Terapia antiretroviral altamente activa (HAART) Las terapias de combinacin (ccteles triples de frmacos, HAART) son muy efectivos y pueden reducir la carga viral de los pacientes a niveles por debajo de los detectables sugiriendo que la replicacin del VIH ha cesado. Uno de estos ccteles HAART consiste en zidovudina (AZT) , lamivudina (3TC), ambos anlogos nuclesidos de la transcriptasa inversa, e Indinavir, un inhibidor de proteasa. Los niveles de ARN viral antes del tratamiento, que pueden ser tan altos como 11 millones de copias por ml, son reducidos a niveles no detectables en unas cuantas semanas por esta combinacin farmacolgica (se pueden medir hasta 20 copias /ml) (figura 23). La evidencia sugiere que NO hay replicacin viral en estos pacientes y esto es mantenido por varios aos. Cuando se detiene el tratamiento, el virus vuelve porque ha estado latente en clulas T de memoria y posiblemente en otras clulas tambin. INHIBIDORES DE LA MODIFICACIN DE PROTENAS

Glicosilacin: La 2-deaoxiglucosa y D-glucosamina interfieren con la glicosilacin in vitro pero tienen muy poco efecto in vivo. Fosforilacin: No se han encontrado frmacos buenos que ataquen virus mediante alteracin de la fosforilacin de sus protenas. Sialidacin: Dos glicoprotenas han sido encontradas en la superficie de los virus de influenza; la hemaglutinina y la neuraminidasa (sialidasa). Esta ltima tiene diversas funciones. Permite al virus moverse a travs de secreciones mucosas en el tracto respiratorio de modo que pueda infectar nuevas clulas. Puesto que el cido silico es el receptor de la influenza, es necesario remover el cido silico de la superficie de las clulas

infectadas y del virus para que las partculas virales puedan escapar. La neuraminidasa es por tanto muy importante para la diseminacin de clula a clula del virus.