TEMA 3: Mtodos para el anlisis de protenas 3.1. Cuantificacin de protenas totales. 3.2. Tcnicas de separacin de protenas.

Anlisis de protenas especficas. INTRODUCCIN A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas tcnicas que nos permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido proteico de las muestras biolgicas haciendo especial hincapi en el estudio de las protenas plasmticas. Las protenas estn presentes en todas las clulas y en los distintos lquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), lquido cefalorraqudeo (15-45 mg/dL). Si nos centramos en las protenas plasmticas, podemos diferenciar: Protenas plasma-especficas: componentes habituales del plasma. Protenas no plasma-especficas: aquellas que aparecen en el plasma por rotura de otras clulas. Las protenas plasma-especficas (albmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hgado, pero tambin en: clulas plasmticas, ganglios linfticos, bazo y mdula sea. En caso de enfermedad, tanto la concentracin total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. As, la determinacin de las protenas totales sirve para el diagnstico de: Afecciones hepticas Afecciones de la mdula sea Otras afecciones del metabolismo o nutricionales 3.1. Cuantificacin de protenas totales Los principales mtodos empleados para la determinacin de protenas totales son los siguientes: Mtodo del Biuret En solucin alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptdico de las protenas dando un color purpreo que se cuantifica espectrofotomtricamente (540nm). Como estndar se utiliza una solucin de albmina. Protena + Cu+2 Complejo Cu-Protena (prpura)

Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del cogulo o el plasma de las clulas antes de 3h. Si el paciente est acostado durante la extraccin el resultado ser menor. Mtodo de Lowry Dependen de la concentracin de tirosina y triptfano de la muestra. Consiste en dos reacciones: 1. Reaccin de Biuret

2. Reaccin de Folin: caracterstica de los grupos OH reductores de los aminocidos tirosina y triptfano que, junto con los complejos Cu+2 , reducen el reactivo de Folin generando un color azul. Est sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina. Turbidimetra Medicin de la turbidez resultante de la precipitacin de protenas Absorcin en el ultravioleta Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromticos de triptfano y tirosina. Mtodos de unin a colorantes NOTA: para semicuantificar la concentracin de protenas en orina se utilizan tiras reactivas. 3.2. Tcnicas de separacin y anlisis de las protenas La proporcin de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran nmero de enfermedades lo que conlleva que, la cuantificacin de las mismas sea de valor considerable en el diagnstico clnico. Los procedimientos ms utilizados actualmente en el laboratorio clnico para el estudio de las protenas son los siguientes: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Turbidimetra y nefelometra Inmunodifusin Electroforesis Inmunoelectroforesis Inmunoelectroforesis en cohete Inmunofijacin Cromatografa

1.- TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA Cuando un haz de luz choca con una partcula en suspensin parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersin de la luz depende de: la longitud de onda de la luz (?), del tamao de la partcula y del ndice de refraccin de la partcula en relacin con el medio que la rodea. La dispersin de la luz se puede medir por turbidimetra o por nefelometra. En ambas tcnicas, para dar como resultado una concentracin de protena concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersin con los valores de dichos parmetros en estndares proteicos conocidos.

1.1.

La turbidimetra mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (detector en la misma direccin del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminucin de la luz transmitida) ej. determinacin de protenas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las protenas precipiten con TCA o cido sulfosaliclico).

1.2.

La nefelometra: mide la luz dispersada en direccin distinta a la luz emitida (generalmente con ngulos que oscilan entre 15 y 90). Utiliza como instrumento el nefelmetro (en el que el detector se ubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ej. a 90). Se suele utilizar para concentraciones ms diluidas.

Aspectos prcticos: Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partculas que produzcan una dispersin de luz no deseada ej. lipoprotenas, quilomicrones Tambin puede interferir la suciedad. La intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la ?. Las protenas suelen tener un pico de absorcin en el ultravioleta ( < ? 300nm) y los cromgenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se suele trabajar a ? que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm. Muy frecuentemente, para cuantificar protenas concretas, se utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas protenas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetra e inmunonefelometra. Para enteder estas tcnicas necesitamos tener claro unos conceptos previos: Antgenos (Ag): sustancias, generalmente de gran tamao, capaces de estimular el sistema inmunolgico de un animal y originar una respuesta dirigida especficamente contra l.

Eptopo o determinante antignico: lugar del antgeno que reconoce y se une al anticuerpo. Anticuerpo (Ac): grupo de protenas llamadas inmunoglobulinas, producidas por linfocitos B y su progenie (clulas plasmticas) que se combinan especficamente con los antgenos.

Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac especfico contra ese antgeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rpidamente pero, existe una segunda fase de crecimiento de complejos ms lenta y, es precisamente en sta fase en la que aparece la dispersin de la luz. As, en la inmunoturbidimetra e inmunonefelometra se mide la dispersin de la luz provocada por los compeljos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de ltex para aumentar el tamao de los complejos (inmunoanlisis potenciados). 2.- INMUNODIFUSIN La inmunodifusin se basa en la formacin de bandas de precipitacin Ag-Ac en medios semislidos (generalmente de agarosa). La formacin de inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH, temperatura, fuerza inica del medio, caractersticas propias del Ac como afinidad y avidez y, la ms importante, la concentracin relativa de Ag y Ac. La zona ptima de concentracin para la formacin del precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. La inmunodifusin puede ser simple (slo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac). Para visualizar el resultado de la inmunodifusin, una vez terminada la difusin se lava el gel y se tie con colorantes para protenas (ej. negro amido o azul brillante de Coomassie). La inmunodifusin se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. Entre otras modalidades podemos hablar de: a) Inmunodifusin radial: en este caso se aade un antisuero especfico a la agarosa que, a su vez , se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estndares d e protenas y problemas (antgenos). El antgeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. Em la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitacin

a) Inmunodifusin doble o tcnica de Ouchterlony: se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrn de roseta. Se depositan antisueros especficos en los pozos centrales y los estndares de protenas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antgeno alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posicin y forma de la banda se determinan segn la concentracin del antgeno y del anticuerpo, y sus tamaos. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antgeno presente.

Inconvenientes de la inmunodifusin: 1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag. 2. Las molculas ms pequeas migran con ms rapidez que las de gran tamao y conforme la migracin contina el precipitado puede redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de concentracin de Ag o Ac en el gel. 3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antgeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es ms grueso o espeso. 3. ELECTROFORESIS Una de las tcnicas ms sencillas para la separacin (y posterior cuantificacin) de protenas es la electroforesis (tcnica en la cual una partcula cargada se hace desplazar a travs de un medio aplicando un campo elctrico). Cuando se aplica un campo elctrico a un medio que contiene partculas cargadas, las partculas cargadas negativamente migran hacia el nodo o polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (ctodo). Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de protenas puesto que los aminocidos (aa) constituyentes de la protenas, y por tanto las protenas, son compuestos anfteros que se comportan como cidos

(ceden protones y quedan con carga negativa) o bases (captan protones y quedan con carga positiva) dependiendo del medio en el que estn.

NOTA: El pH al que un aa no se comporta ni como cido ni como base se

denomina punto isoelctrico pI (en l la estructura del aa no posee carga neta). Los pI varan desde 3 a 10, sin que exista un pH al que todos los aa sean neutros.
a pH superior 2 o + unidades a pI, el aa aparece cargado negativamente a pH inferior 2 o + unidades a pI el aminocido aparece cargado positivamente pH = pI los aa aparecen como iones dipolares neutros

En soluciones muy cidas todos los aa aparecen como cationes, mientras que en soluciones muy bsicas los aa se encuentran en forma aninica..

Si una disolucin de protenas se somete a la accin de un campo elctrico la tasa de migracin durante la electroforesis depende de: La carga neta de la molcula, su forma y tamao La fuerza del campo elctrico Caractersticas del soporte

La cantidad de carga neta en la molcula es variable y depende del pH del amortiguador. Si el pH del medio es menor que el punto isoelctrico, las protenas se compo rtan como cationes y, si el pH del medio es superior al pI, se comportan como aniones. La carga de la protena se hace ms negativa a medida que el pH del amortiguador se hace ms bsico. A pH 8,6 (bsico) todas las protenas migran hacia el nodo (tienen carga global negativa). La albmina, con pI de 4,7 tendr una mayor carga negativa que la gamma-globulina, que tiene un pI de 7,2. En definitiva, lo anterior explica que la albmina recorra una mayor distancia que la gamma-globulina cuando se siten en un campo elctrico. Hay numerosos sistemas de electroforesis de protenas comercialmente disponibles. En clnica el suero es la muestra de eleccin. Se puede usar plasma pero, en ese caso se observar una banda adicional de fibringeno. Tambin se puede analizar orina y lquido cefalorraqudeo si se aumenta su contenido proteico (hasta 20-30 g/l) por ultracentrifugacin, dilisis u otras tcnicas de concentracin. Los pasos a seguir en una electroforesis se pueden resumir en:

1. Separacin electrofortica mediante un campo elctrico 2. Fijacin de las protenas sobre el soporte 3. Revelado de las protenas para identificar su presencia y separacin. Se realiza mediante colorantes cidos, negro amido, rojo Ponceau... que se fijan sobre las funciones bsicas de las protenas. El exceso de colorante se arrastra con mezclas actico -agua, o metanol-actico, segn el colorante utilizado con tal de que se decolore el soporte sin elucin del colorante fijado a las protenas. 4. Cuantificacin de las fracciones electroforticas mediante fotmetros especiales (densitmetros) que permiten cuantificar el colorante fijado a diferentes distancias del punto de aplicacin, y con ello la representacin grfica de la separacin (proteinograma: grfica que representa las fracciones protecas del suero sanguneo).

Cuando el soporte utilizado para llevar a cabo el desarrollo electrofortico es de acetato de celulosa las principales fracciones protecas son

La fraccin de albmina (aprox. 64.5%): la que ms migra respecto al punto de aplicacin de la muestra (ctodo) Las globulinas que se subdividen en las siguientes fracciones: alfa 1 (a-1 globulinas, aprox. 3.6%), alfa 2 (a-2 globulinas, aprox. 6.5%), beta (-globulinas, aprox. 12.6%), y gamma (? globulinas, inmunoglobulinas o anticuerpos, aprox. 7.9%, es la banda que menos se desplaza y en sueros no patolgicos es la banda ms ancha).

El fibringeno aparece entre las y ? globulinas cuando la muestra utilizada es plasma no as en el suero (se ha co nsumido en la coagulacin). Cuando el soporte es gel de agarosa las -globulinas, se dividen en: -1 y -2. Es muy importante tener en cuenta que cada fraccin est formada por un conjunto de protenas con una movilidad electrofortica semejante aunque muy distintas en cuanto a su estructura y funcin. Adems, excepto la albmina, el resto de las fracciones corresponden a grupos de protenas, por ello , aunque el resultado de la fraccin sea normal, puede existir variacin porcentual en sus componentes. Conviene corroborar los resultados del proteinograma con ensayos inmunolgicos ms especficos como la inmunodifusin radial o la inmunoelectroforesis.

4. INMUNOELECTROFORESIS La inmunoelectroforesis es una inmunodifusin en la que se aplica una corriente elctrica para separar las protenas de la muestra. Esta tcnica se realiza en dos fases: Electroforesis para separar las protenas de la muestra en funcin de su carga. Aplicacin de un antisuero, mono o poliespecfico, en un surco paralelo a la direccin del campo elctrico. El o los anticuerpos

difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitacin.

Se utiliza fundamentalm ente para analizar, cualitativamente, alteraciones de distintas protenas, especialmente inmunoglobulinas en suero, orina o lquido cefalorraqudeo. 5. INMUNOELECTROFORESIS EN COHETE La inmunoelectroforesis en cohete es una tcnica cuantitativa equivalente a la inmunodifusin radial pero, a en la que la placa se expone a un campo elctrico. Al igual que en la inmunodifusin radial, el antisuero (Ac) se incorpora al gel de manera que el Ac no pueda migrar. En el gel se realizan unos pocillos (generalmente en el ctodo) que se rellenarn con la muestra o con diluciones patrn. Una vez depositadas stas se activa el campo elctrico. El Ag se desplaza en la agarosa y precipita al encontrarse con el Ac. La precipitacin va producindose a medida que el Ag avanza hacia el nodo de manera que al ir disminuyendo la concentracin de Ag los bordes laterales se van acercando hasta unirse. As, se produce una precipitacin triangular (en estela de cohete). La concentracin de Ag de la muestra es directamente proporcional al rea y altura del tringulo. Comparando los resultados de la muestra con los obtenidos en las diluciones patrn obtendremos un resultado cuantitativo.

6. INMUNOFIJACIN La inmunofijacin consiste en la separacin electrofortica de las protenas de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero. La unin Ag-Ac da lugar a la formacin de bandas de precipitacin visulalizadas tras lavar y teir. Es una tcnica muy rpida que se utiliza especialmente en le deteccin de bandas oligoclonales en lquido cefalorraqudeo. Preguntas de revisin
1. Si pretendiera cuantificar la concentracin de protenas en una muestra de suero Qu mtodo empleara? 2. 3. 4. Describa el fundamento del mtodo anterior Sabra idear un protocolo experimental para llevar a cabo dicho mtodo? Sera necesario preparar algn blanco? Razone su respuesta

5. Un paciente con un mieloma: a) Tendra hiper o hipoproteinemia? b) Si quisiera identificar la inmunoglobulina que aparece alterada qu tcnica podra utilizar? c) Y si quisiera cuantificarla? 6. Podra utilizar la espectrofotometra con luz U.V. para cuantificar protenas? Conteste razonadamente. 7. a) b) c) d) e) 8. a) b) c) d) e) 9. a) b) c) d) e) 10. a) b) c) La nefelometra difiere de la turbidimetra en: Mide el ndice de refraccin ngulo de medida de la luz dispersa Tiene menor sensibilidad Se pueden medir partculas de bajo peso molecular La solucin no necesita ser homognea La La La La La La La La La La La La nefelometra mide: luz dispersada luz transmitida disminucin de la luz transmitida disminucin de la luz dispersada luz reflejada turbidimetra mide luz dispersada luz transmitida disminucin de la luz transmitida disminucin de la luz dispersada luz reflejada

Conteste razonadamente verdadero o falso a las siguientes afirmaciones de las medidas nefelomtricas Su principal aplicacin es en la medida de reacciones Ag-Ac Trabajan con medidas en distintas zonas del espectro. Se hacen en ngulos de 15 a 90 respecto a la luz incidente.

10

11. a) b) c) d) e) 12. a) b) c) d) e) 13. a) b) c) d) e) 14. a) b) c)

La turbidimetra se puede medir: En turbidmetros especiales. En aparatos con un monocromador de turbidez. En aparatos con un detector especial para la luz dispersa. En cualquier espectrofotmetro o analizador de qumica clnica. En aparatos con cubetas especiales El ngulo de medida de la luz dispersa en turbidimetra es: 0o 10o 15 a 90o 90o Cualquiera El ngulo de medida de la luz dispersa en nefelometra es: 0 10 15 a 90 90 Cualquiera La longitud de onda que se emplea en las medidas de luz dispersa: Debe ser tal que no se absorba luz por los componentes del suero. Debe ser lo menor posible Deber ser lo mayor posible

15. La inmunodifusin radial es una tcnica cuantitativa Por qu? 16 Cul cree que es el principal inconveniente de las tcnicas inmunolgicas? a) Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac se encuentren dentro de la zona de equivalencia b) Son tc nicas poco sensibles c) Son tcnicas poco especficas 17. La inmunodifusin doble es una tcnica cualitativa o semicuantitativa por qu? 18. En un campo elctrico, una molcula cargada negativamente migra hacia el: a) nodo b) Ctodo c) Polo negativo d) Polo positivo e) a y d 19. Qu factores afectan a la movilidad de una partcula en el seno de un campo elctrico) a) pH del tampn b) Fuerza inica del tampn. a) Tamao y forma de la partcula. b) Potencial del campo. c) Todos 20. El punto isoelctrico es: a) El pH al cual una partcula no se mueve b) El pH al cual una partcula migra al nodo c) El pH al que la carga neta de la partcula es cero. d) ayc

11

e)

ay b

21. Cul es el medio de soporte ms empleado en electroforesis? 22. Cul es el mtodo de eleccin para la lectura de un espectro electrofortico? a) Nefelometra b) Turbidimetra c) Elusin d) Fotodensitometra 23. Hemos sometido una muestra de suero a una separacin electrofortica, a pH 8,6, sobre acetato de celulosa a) Qu componentes se nos han separado en el proceso? b) A qu cambios en el proceso recurriremos segn queramos cuantificar protenas o lipoprotenas? 24. Sera conveniente llevar a cabo la electroforesis de protenas a pH 6? Por qu?

12