Knockdown Hormon GSH Pada Udang (Crustacea) Dengan Teknologi RNA Interference (RNAi) Oleh : Robi Binur (NIM:

21110003) PS. Bioteknologi SITH-ITB 1. Pendahuluan RNA interferance (RNAi) adalah suatu mekanisme membloking ekspresi gen (gen silencing) pada fase post-transkripsi dengan cara meginduksi double-stranded RNA (dsRNA) ke dalam sel target sehingga menempel pada sekuen mRNA dan memicu degradasinya (Estrada MP et al. 2007). RNAi ditemukan pertama kali oleh Andrew Z. Fire and Craig C. Mello (1998) pada nematode Caenorhabditis elegans. Percobaannya menggunakan antisense RNA untuk menghambat (knockdown) ekspresi gen, mereka menemukan efek sinergis pada gen silencing ketika sekuen antisense and sense RNA dikirim bersamaan ke dalam sel. Fenomena ini dianggap sebuah kenaehan yang terjadi pada waktu itu, tetapi perkembangan selanjutnya RNAi menjadi penemuan besar dalam membloking ekspresi gen terutama pada sel eukariot (Paddison PJ, 2008). Perkembangan aplikasi teknologi RNAi sangat pesat terutama dibidang medis, pertanian, dan akuakultur. Di bidang medis teknologi RNAi paling berkembang pesat, terutama untuk terapi gen misalnya silencing gen pada penderita hepatitis A dan B maupun penderita kanker atau tumor, validasi model penyakit secara in-vitro maupun in-vivo, validasi aktivitas obat, dan identifikasi kandidat obat baru (Sidahmed AME & Wilkie B, 2010). Di bidang pertanian teknologi RNAi digunakan untuk memproduksi tanaman yang rendah kadar toksinnya. Sedangkan di bidang akuakultur teknologi RNAi digunakan untuk meningkatkan masa otot pada ikan misalnya silencing gen myostatin yang menghambat pertumbuhan otot pada zebrafish dan meningkatkan kualitas indukan pada udang misalnya silencing gen crustacean hyperglycemic hormone (CHH) yang berperan dalam memacu reproduksi dan molting pada litopenaeus schmitti (Estrada, MP et al. 2007). Udang merupakan salah satu sumberdaya perikanan yang bernilai ekonomis tinggi yang banyak dibudidayakan contohnya: udang windu (Penaeus monodon), udang putih (Litopenaeus vanameii), udang galah (Macrobrachium rosenbergii) dan lain-lain. Masalah utama dalam budidaya udang adalah rendahnya kualitas indukan. Rendahnya kualitas indukan ini salah satunya sangat dipengaruhi oleh terlalu seringnya udang bereproduksi atau bertelur. Misalnya saja pada udang galah yang dapat bereproduksi sepanjang tahun dengan menghasilkan sekitar 80.000-100.000 butir telur sekali memijah (Brown et al. 2010). Tentunya hal ini sangat mempengaruhi kualitas indukan dan telur yang dihasilkan, karena sekali bereproduksi udang betina memerlukan banyak energi. Pada sebagaian besar reproduksi udang (crustacea) dikendalikan oleh hormon GSH (gonad-stimulating hormone) dan GIH (gonad-inhibiting hormone). Pada budidaya udang untuk meningkatkan kemampuan reproduksi sering dilakukan teknik ablasi atau ESA (eyestalk ablation), yaitu pemotongan mata. Dengan tujuan menghambat dikeluarkannya hormon GIH yang disekresi oleh komplek X-organ-sinus gland (XOSG) yang berada didekat mata (eyestalks). Dengan teknik ini cukup signifikan meningkatkan pertumbuhan gonad dan perkembangan ovarium pada udang. Tetapi disisi lain indukan hanya dapat digunakan hanya satu kali pemijahan, setalah itu mati. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa dengan teknik ablasi ini dapat memicu pematangan telur sebelum waktunya (Nagaraju GPC, 2011). Hasil penelitian Treerattrakool S et al. (2008) dan Treerattrakool S et al. (2011) pada udang windu Penaeus 1

monodon menunjukkan knockdown ekspresi GIH (induksi GIH-dsRNA) tanpa melakukan ablasi dapat menurunkan level produksi GIH dan meningkatnya level ekspresi vitellogenin pada udang betina. Tetapi sampai saat ini, knockdown ekspresi GSH pada udang belum pernah dilakukan sehingga penting untuk dicoba. Dengan me-knockdown ekspresi GSH diharapkan juga dapat meningkatkan kualitas reproduksi dan pertumbuhan udang. 2. RNA interference (RNAi) 4.1 Mekanisme kerja RNAi Ketika double-stranded RNA (dsRNA) diinduksi ke dalam sel target maka tidak begitu saja memicu shutdown transkripsi dan translasi protein, tetapi melalui beberapa proses (Gambar 1), yaitu: [1] Untaian panjang dsRNA (long dsRNA) dipotong oleh enzim RNAse-III melalui mekanisme Dicer menjadi fragmen-fragmen kecil yang panjangnya sekitar 19-23 nukleotida dengan 2-4 nukleotida overhang pada ujung 3. Hasil potongan ini disebut small interfering RNA (siRNA) yang selanjutnya akan memicu terjadinya RNAi pada sel target. Proses pemotongan dsRNA oleh RNAse-III tidak memerlukan ATP tetapi oleh aktivitas enzim nuklease (Schepers U, 2005). [2] Beberapa fragmen siRNA akan berikatan dengan komplek protein RISC (RNA-induced silencing complex) yang akan memandu mengenal mRNA yang berisi sekuen homolog, selanjutnya kedua sekuen ini akan berkomplemen. Setelah berkomplemen maka enzim nuklease yang ada pada komplek RISC akan mendegradasi mRNA. [3] Setelah mRNA terdegradasi maka ekspresi gen secara spesifik menjadi inaktif pada tahap post-transkripsi. Inaktifnya ekspresi gen ini dapat bersifat permanen ataupun transien (tidak diturunkan ke generasi berikutnya) (Mocellin S & Provenzano M, 2004).

Gambar 1. Mekanisme kerja RNA interference (RNAi) (Mocellin S & Provenzano M, 2004). 2

4.2 Merancang RNAi RNAi akan efektif jika memicu terjadinya siRNA yang mengandung 19-23 nukleotida sense dan antisense dengan 2-4 nukleotida overhang pada ujung 3. Strand sense homolog dengan mRNA, sebaliknya antisense akan berkomplemen dengan mRNA target. siRNA harus memiliki dua kriteria untuk bekerja dengan efektif, yaitu: [1] siRNA harus efektif memicu RNAi dan [2] siRNA harus spesifik menghambat ekspresi gen target (Scherr M et al., 2004). Merancang siRNA yang spesifik memerlukan informasi sekuen gen target (sekitar 19 nukleotida) yang dapat dicari didatabase (misalnya di GenBank). Selain sekuen utama, kadang-kadang struktur sekunder dan tersier berperan penting untuk potensi hibridisasi antara RNA target dan strand siRNA antisense. Sekuen yang berlokasi di dalam intron tidak bisa digunakan sebagai target siRNA untuk menjalankan gen silencing machinery di dalam sitoplasma. Sekuen juga harus mencakup sisi pemanjangan translasi dan potensi potein binding site yang berada pada ujung 5 and 3 daerah UTR (untranslated region) harus dihindari. Oleh karena itu, seleksi sekuen target mRNA dapat dilakukan secara trial and error, sekuen lain dapat dipilih jika tidak ada informasi pada struktur RNA yang tersedia secara in-vivo. Spesifisitas sekuen harus tinggi sehingga sekuen tidak men-silencing gen lain diluar target, yaitu dengan megetahui tingkat homologinya. Hal ini harus didukung dengan profile ekspresi genom yang baik sebelum diinduksi dengan RNAi. Strategi seleksi siRNA untuk menghindari tingginya homologi dengan gen lain, yaitu dengan BLAST. Dengan metode ini efek terhadap gen non-taget dapat diminimalkan dan dihindari. Pada kontek ini, perlu dicatat bahwa satu atau dua mismatches antara strand antisense siRNA dan mRNA target kemungkinan hanya sebagian menghilangkan siRNA yang memediasi degradasi RNA, khususnya jika mismatches berada pada ujung 3 atau 5 pada untaian siRNA (Scherr M et al., 2004). 4.3 Teknik pengiriman RNAi Pengiriman RNAi (RNAi delivery) ke dalam sel target sampai saat ini merupakan tantangan yang paling besar dan cukup sulit dilakukan karena kompleknya sistim dalam sel. Ada dua metode yang sudah cukup sukses digunakan untuk pengiriman siRNA ke dalam sel target pada sel hewan, yaitu viral delivery dan non-viral delivery (Li CX et al., 2006; Scherr M et al., 2004). Viral delivery adalah pengiriman siRNA menggunakan virus sebagai vektor. Keuntungan menggunakan virus adalah berbiaya lebih murah dan lebih efisien. Ada lima vektor virus yang umum digunakan, yaitu: Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Adeno-Associated-Virus (AAV), dan Baculovirus. [1] Retrovirus merupakan vektor pertama yang digunakan untuk transfer dsRNA yang diekspresikan dalam plasmid. Retrovirus berkerja dengan cara mengintegrasikan genomnya ke dalam sel inang kemudian mengendalikan replikasinya. Kelemahan retrovirus adalah genom yang terintegrasi membawa resiko terjadinya insersi mutagenesis dan karsinogenesis. [2] Lentivirus merupakan subklas retrovirus dengan cara kerja, sama dengan retrovirus tetapi tidak memberikan resiko terjadinya insersi mutagenesis, dapat mentranduksi genom lebih efisien, dan tidak membelah dalam sel. Selain itu lentivirus dapat mengakomodasi sejumlah besar data dalam genomnya dan rendah immunogenic daripada adenovirus. [3] Adenovirus merupakan vektor yang populer untuk terapi gen. Informasi genetik dari adenovirus menyebar diluar inti sel target sehingga memiliki resiko yang kecil terintegrasinya DNA virus ke dalam genom sel inang. Hal ini menyebabkan informasi genetik yang diberikan tidak stabil dan bersifat transien. [4] AdenoAssociated-Virus (AAV) sangat menjanjikan sebagai vektor karena memiiki banyak keuntungan antara lain tidak bersifat pathogenik, memiliki target sel yang luas, dan tidak membelah dalam sel inang. [5] Baculovirus merupakan vektor relatif baru digunakan dengan beberapa keuntungan yaitu

kapasitas membawa informasi genetik yang besar sehingga dapat dikombinasikan penggunaannya dengan vektor gen terapi dan gen silencing serta lebih aman. Sedangkan non-viral delivery adalah pengiriman siRNA tanpa menggunakan vektor virus, tetapi menggunakan teknik atau agen tertentu misalnya hydrodynamic injection, chemically modified siRNA, liposomes, nanoparticles, selective particles, dan bacteria. [1] Hydrodynamic injection adalah metode injeksi dsRNA ke dalam pembuluh darah secara langsung dengan tekanan tinggi (high pressures) dalam waktu yang sangat singkat (dalam hitungan detik) dengan volume relatif tinggi sekitar 5002000 L. [2] Chemically modified siRNA yaitu memodifikasi molekul siRNA dengan penambahan struktur kimia tertentu (residu) pada posisi 2 gugus ribosa misalnya 2'-O-Me, 2'-O-allyl, dan 2deoxyfluorouridine. [3] Liposomes yaitu metode pengirman siRNA dengan membungkuskannya dengan Liposomes seperti cationic liposomes, neutral liposomes (DOPC), dan cationic DOTAP liposomes. Kemudian siRNA ini diberi probe atau penanda fluorescent untuk kuantifikasi bahwa siRNA masuk ke dalam sel target. [4] Nanoparticles juga merupakan metode pengiriman siRNA dengan membungkuskannya dengan nanopartikel misalnya cationic polymer dan polyethyleneimine (PEI). [5] Selective particles adalah siRNA untuk pengobatan (therapeutics) yang mengkombinasikan pendekatan stabilisasi kimia siRNA dengan pengiriman melalui liposom atau nanopartikel pada target yang lebih spesifik yang disebut SNALP (stable nucleid acid-lipid particle). [6] Bacteria adalah pengiriman siRNA menggunakan bakteri nonpatogenik untuk menginduksi gen silencing pada sel target. Keuntungan menggunakan bakteria yaitu lebih aman, mudah mengontolnya dengan antibiotik, dan lebih mudah untuk dimanipulasi genetiknya.

3. Hormon Reproduksi Pada Udang (Crustacea) Jumlah hormon dari organ neuroendokrin berperan penting dalam mengontol pematangan gonad dan ovarium (gonad and ovarium maturation) pada semua jenis crustacea seperti crayfish, shrimp, 4

crab, lobsters, dan lain-lain. Pematangan gonad pada crustacea ini diregulasi oleh dua antagonistic neuropeptides, yaitu: GSH (gonad-stimulating hormone atau VSOH: vitellogenesis-stimulating ovarian hormone pada betina) yang diproduksi oleh otak dan thorax ganglion dan GIH (Gonad-inhibiting hormone atau VIH: vitellogenesis-inhibiting hormone pada betina) disintesis dan disekresi dari komplek X-organ sinus gland (XOSG) pada mata (eyestalk). Selain dua hormon tersebut, juga terdapat hormon CHH (crustacean hyperglycemic hormone) yang juga berperan dalam mengontrol reproduksi terutama merangsang vitellogenesis pada perkembangan ovarium dan molting. Hormon ini juga disekresi dari komplek XOSG pada mata (Nagaraju GPC, 2011; Estrada, MP et al. 2007). 3.1 Gonad-stimulating hormone (GSH)/Vitellogenesis-stimulating ovarian hormone (VSOH) Hormon GSH/VSOH sangat berperan dalam menstimulus perkembangan gonad dan ovarium pada crustacea. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pemberian ekstrak cerebral (brain) atau TG (thoracic ganglia) secara in-vivo dan in-vitro pada crustacea betina (Paratya compressa, Uca pugilator, L.. vannamei) menstimulus pertumbuhan ovariumnya, mempercepat pematangan ovarium, dan perkembangan oosit, tetapi ekstrak cerebral lebih efektif dibandingkan ekstrak TG. Ketika ekstrak tersebut juga diberikan pada crustacea jantan (Potamon koolooense) juga meningkatkan gonad indeksnya dan memperlebar testicular tubules dan vas deferens. Produksi hormon GSH setiap spesies crustacea tergantung pada siklus reproduksinya (Nagaraju GPC, 2011). Namun demikian, beberapa hormon juga memegang peranan penting dalam regulasi reproduksi misalnya androgenic gland hormone, MF, steroids, opioid peptides, dan neurotransmitters (Gambar 2). Beberapa komponen diketahui memiliki fungsi metabolik pada berbagai spesies crustacea, termasuk metabolisme karbohidrat, molting, reproduksi, dan osmoregulasi (Estrada MP et al. 2007; Nagaraju GPC, 2011).

Gambar 2. Efek faktor eyestalk pada reproduksi crustaceans. CHH (crustacean hyperglycemic hormone), MIH (molting inhibiting hormone), VIH (vitellogenesis inhibiting hormone), GIH (gonad inhibiting hormone), MOIH (mandibular organ inhibiting hormone), 5-HT (5hydroxytryptamine), OA (octopamine), SP (spiperone), DA (dopamine), Leu-enk (leucineenkephalin), Met-enk (methionine-enkephalin). Tanda panah hijau menunjukkan pengaruh positif, tanda panah merah menunjukkan regulasi negatif, dan tanda panah ungu menunjukkan pengaruh positif atau negatif (Nagaraju GPC, 2011). 5

Tabel 2. Efek hormon neuroendocrine dan non-neuroendocrine pada jaringan target dan aksi fisiologisnya pada crustacea

3.2 Gonad-inhibiting hormone (GIH)/Vitellogenesis-inhibiting hormone (VIH) Pematangan gonad dan ovarium pada crustacea dibawah kendali hormon GIH/VIH dengan menghambat sintesis gonad dan vitellogenin (Vg). Pada crustacea betina vitellogenin adalah prekusor vitellin (ovarian lipovitellin) yang merupakan protein yolk utama (crustacean yolk proteins) yang terakumulasi di ooplasm. Vitellin mengandung lipoprotein yang tinggi (high-density lipoprotein: HDL). Vitellogenin berperan penting untuk transport lipid ke ovarium dari hemolymph selama vitellogenesis. Sintesis Vg secara normal menjadi kunci pematangan ovarium (ovarian maturation) (Subramoniam T, 2011; Treerattrakool S et al. 2011). Jalur fisiologis (physiologis pathway) VIH dalam menghambat vitellogenesis kemungkinan dengan cara: [1] VIH berpengaruh langsung pada oosit dengan menghambat naiknya Vg atau sintesis yolk protein, [2] VIH menghambat keluarnya hormon GSH dari TG atau otak pada sistim saraf utama atau mandibular organ (MO), dan [3] VIH berikatan dengan Vg, dengan dua cara mencegah berikatannya reseptor atau berikatan pada reseptor kemudian memblok Vg binding site (Nagaraju GPC, 2011). Berbagai penelitian menunjukkan bahwa pemotongan mata (eyestalk) atau ablasi pada crustacea dapat meningkatkan matangnya ovarium dengan cepat, karena hilangnya hormon VIH. Tetapi penelitian lain pada udang Palaemon serratus selama inaktif seksual menunjukkan juga ketika dilakukan ablasi maka memicu matangnya telur sebelum waktunya. Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa setiap mata secara aktif berperan dalam perkembangan ovarium tergantung kondisi fisiologisnya. Contohnya crustacea aktif bereproduksi ketika VIH and ecdysteroid rendah dan beberapa GSF (gonad stimulating factor) dan MF (methyl farnesoate) tinggi (Nagaraju GPC, 2011). Hasil penelitian Treerattrakool et al. (2011) dengan men-slencing ekspresi GIH dengan GIH-specific double-stranded RNA (GIH-dsRNA) pada udang windu Penaeus monodon hasilnya menunjukkan meningkatnya level ekspresi vitellogenin. 4. Metode Knockdown Hormon GSH pada Udang (Crustacea) Metode knockdown hormon GSH pada udang mengkuti metode Treerattrakool S et al. (2008) dan Treerattrakool S et al. (2011) pada udang windu Penaeus monodon yang dimodifikasi. Serta dengan metode kompilasi lainnya dari Robalino J, (2005) dan Tiu dan Chan, (2007). 4.1 Sampel dan isolasi GSH-dsRNA Sampel udang yang diambil yaitu udang dewasa dengan ukuran tergantung jenisnya misalnya pada udang windu (Penaeus monodon) udang dewasa berukuran sekitar 100-320 gram. Sampel udang ini dapat diambil dari tambak (budidaya) atau dari alam (wildtype). Isolasi GSH-RNA total udang diekstrak dari otak dan thorax ganglion dengan metode TRI-REAGENT (Molecular Research Center, USA). Kemudian dibuat cDNAnya menggunakan primer rivese transkriptase (PRT) (5CCGGAATTC AAGCTTCTAGAGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTT-3) dengan RT-PCR. Sintesis cDNA dilakukan pada suhu 42 oC selama 60 menit sehingga diperoleh GSH-dsRNA. GSH-dsRNA dirancang sesuai dengan gen target yang akan di knockdown, dalam hal ini gen pengkode GSH. Ukuran sekuen GSH-dsRNA dapat dirancang dengan panjang sekitar 240 bp. 4.2 Kloning GSH-dsRNA GSH-dsRNA yang diperoleh kemudian disisipkan kedalam vektor misalnya pGEM-TE (Promega), pCR4.0 (Invitrogen), atau pBluescript (Stratagene) untuk membuktikan ekspresinya. Perbanyakan (koloning) GSH-dsRNA menggunakan Escherichia coli yang ditumbuhkan dalam medium tertentu (YT medium) selama 2 jam. Sel-sel yang tumbuh tersebut kemudian diresuspensi dalam buffer 500 l garam phosphate yang mengandung 0.1% SDS. Selanjutnya sampel dipanaskan selama 2 menit dan dicelupkan dalam es. Sel dilisis dengan perlakukan RNaseA pada suhu 37 C selama 30 7

menit. Kemudian GSH-dsRNA diekstrak menggunakan protokol TRI-REAGENT. Hasil ekstraksi ini selanjutnya diresuspensi dengan 10 mM Tris/HCl, pH7, 10 mM NaCl (Tris/NaCl). 4.3 Induksi GSH-dsRNA Udang dewasa yang sudah matang gonad dipelihara dalam tank (lingkungan buatan). Selanjutnya dibuat dua grup yang terpisah, dimana grup pertama sebagai kontrol dan grup kedua sebagai eksperimen yang akan diijeksi dengan GSH-dsRNA. Metode induksi GS-dsRNA menggunakan metode hydrodynamic injection atau injeksi secara langsung ke dalam pembuluh darah dengan tekanan tinggi. Grup kontrol diinjeksi dengan buffer 50 l Tris/NaCl tanpa GSH-dsRNA dibagian arthrodial membrane pada kaki jalan kedua (second walking leg). Kemudian grup kedua (eksperimen grup) diijeksi dengan GSH-dsRNA sebanyak 3 g/g berat badan. Selanjutnya udang dikultur selama 30 hari dalam kondisi gelap dan diiberi pakan pelet. Setelah 30 hari sebanyak empat sampai tujuh individu dari setiap grup diambil secara random. Kemudian optic-lobe dari setiap individu dipotong untuk analisis kandungan GSHnya. 4.4 Deteksi knockdown GSH Knockdown GSH dideteksi menggunakan metode RT-PCR dengan primer yang berada diluar daerah GSH-dsRNA untuk menghindari teramplifikasinya dsRNA. Total RNA dari optic lobe udang diekstrak dengan metode TRI-REAGENT. Rivese transkriptase cDNA menggunakan PRT primer dengan suhu annealing 42oC selama 60 menit. Transkripsi GSH diamplifikasi menggunakan dua primer yang spesifik (primer forward dan riverse) dengan teknik PCR. Reaksi PCR terdiri dari tahap denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik, annealing pada suhu 55 oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada suhu 72 oC selama 1 menit untuk empat siklus. Dimana setiap siklus suhu annealingnya diturunkan 1 oC dan dijaga konstan pada suhu 52 oC untuk 26 siklus berikutnya kemudian diikuti dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 7 menit. Aktin digunakan sebagai housekeeping protein, transkripsi aktin diamplifikasi menggunakan dua primer yaitu PmActin-Forwad dan PmActin-Riverse. Reaksi dilakukan selama 21 siklus, dimana denaturasi pada suhu 94 oC selama 30 detik, annealing pada suhu 55 oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada suhu 72 oC selama 1 menit diikuti inkubasi pada suhu 72 oC selama 7 menit. Hasil yang diperoleh divisualisai pada 2D-elektroforesis dan immunoblotting. 5. Kesimpulan Perkembangan aplikasi teknologi RNA interference (RNAi) sangat pesat terutama dibidang medis untuk tujuan terapi gen dalam penyembuhan penyakit misalnya HIV, kanker, dan diabetes. Dibidang akuakultur, misalnya pada budidaya udang teknologi RNAi sudah mulai berkembang terutama untuk meningkat kualitas reproduksi indukan udang. Salah satu penelitian terbaru yang berhasil menghambat ekspresi GIH dengan menginduksi GIH-dsRNA adalah penelitian yang dilakukan oleh Treerattrakool S et al., (2011) pada udang windu Penaeus monodon. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa dengan menginduksi GIH-dsRNA dapat meningkatkan level ekspresi vitellogenin (perkembangan ovarium) pada udang windu betina tanpa dilakukan ablasi. Tetapi penelitian yang menggunakan teknologi RNAi untuk menghambat ekspresi GSH pada udang (crustacea) belum pernah dilakukan. Padahal dengan men-knockdown ekspresi GSH juga akan meningkatkan kualitas indukan dengan cara menekan reproduksi udang yang berlebihan (terus menerus). Teknologi induksi GSH-dsRNA dan GIH-dsRNA dapat saling melengkapi, dimana ketika indukan diperlukan untuk bereproduksi (memijah) maka dapat diinduksi dengan GIH-dsRNA. Tetapi ketika indukan diperlukan untuk pertumbuhan tubuhnya, maka aktivitas reproduksinya dapat dihambat dengan menginduksi GS-dsRNA. Dengan menerapkan kedua 8

teknologi RNAi tersebut maka kualitas reproduksi indukan udang bisa tetap terjaga dalam menghasilkan anakan yang juga berkualitas. Daftar Pustaka Brown JH., New MB., and Ismael D. 2010. Biology. Edited by New et al. in Freshwater Prawns Biology and Farming. Wiley-Blackwell Publishing Ltd. United Kingdom. Estrada, MP et al. 2007. Effects RNA Interferences On Gene Functions of Aquatic Organism. Biotecnologia Aplicada vol. 24 (2): 179-182. Li CX et al. 2006. Delivery of RNA Interference (Review). Cell Cycle 5:18, 2103-2109. Mocellin S., and Provenzano M. 2004. RNA Interference: Learning Gene Knock-down from Cell Physiology (Review). Journal of Translational Medicine 2:39. Nagaraju GPC, 2011. Reproductive Regulators In Decapod Crustaceans: An Overview (Review). The Journal of Experimental Biology 214: 3-16. Paddison PJ. 2008. RNA Interference in Mammalian Cell Systems. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Robalino J. 2005. Double-Stranded RNA Induces Sequence-Specific Antiviral Silencing in Addition to Nonspecific Immunity in a Marine Shrimp: Convergence of RNA Interference and Innate Immunity in the Invertebrate Antiviral Response?. Journal Of Virology 1356113571. Schepers U. 2005. RNA Interference in Practice. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Sidahmed AME and Wilkie B. 2010. Endogenous Antiviral Mechanisms of RNA Interference: A Comparative Biology Perspective. Edited by Wei-Ping Min and Thomas Ichim In RNA Interference From Biology to Clinical Applications. Human press. New York. Scherr M., Steinmann D., and Eder M. 2004. RNA Interference (RNAi) in Hematology. Ann Hematol 83:18. Subramoniam T. 2011. Mechanisms and Control of Vitellogenesis In Crustaceans (Review Article). Fish Sci 77:121. Tiu, Shirley Hiu-Kwan and Chan, Siu-Ming. 2007. The Use of Recombinant Protein and RNA Interference Approaches to Study The Reproductive Functions of A Gonad-Stimulating Hormone from The Shrimp Metapenaeus ensis. FEBS Journal 274: 43854395. Treerattrakool S et al. 2008. Molecular Characterization of Gonad-Inhibiting Hormone of Penaeus Monodon and Elucidation of Its Inhibitory Role In Vitellogenin Expression by RNA Interference. FEBS Journal 275: 970980. Treerattrakool S., Panyim S., and Udomkit A. 2011. Induction of Ovarian aturation and Spawningin Penaeus monodon Broodstock by Double-Stranded RNA. Mar Biotechnol 13:163169.