APLICACIONES DE LA PCR

1. Secuenciacin Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formacin de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciacin. Es mucho mas sencillo y rapido que la clonacin en clulas. 2. Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir rboles filogenticos. El PCR tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3. Huellas dactilares del ADN. La determinacin de las huellas dactilares genticas constituye una de las aplicaciones mas interesantes de la PCR. Mediante esta tcnica es posible comparar muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta tcnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar indiividuos a partir de muestras biolgicas, como sangre, semen, piel o cabellos. Tambin se utiliza en las pruebas de paternidad.

METODO SOUTHERN BLOTTING El mtodo de Southern, descrito en 1975, ha representado un importante avance en los estudios moleculares, al permitir visualizar cualquier fragmento de DNA mediante el empleo de una sonda o marcador conocido. Se basa en la transferencia de los fragmentos de DNA obtenidos al digerir con enzimas de restriccin y fraccionados mediante un gel de agarosa, a un soporte slido, el cual puede hibridarse posteriormente con una sonda marcada. El gel se trata con el fin de desnaturalizar las hebras, para que stas puedan unirse posteriormente a una sonda de inters. La transferencia del DNA al filtro de niln o nitrocelulosa se realiza por capilaridad durante aproximadamente 24 h. Transcurrido este tiempo, los fragmentos se unen covalentemente al filtro mediante exposicin a rayos ultravioleta (UV) o bien a 80 C. El filtro se hibrida con una sonda marcada radiactivamente. Este proceso se realiza a una temperatura elevada para aumentar la especificidad de los hbridos que se producen entre el DNA presente en el filtro y la sonda marcada que empleamos. Posteriormente el filtro se lava con soluciones de mayor a menor salinidad para eliminar la sonda que no ha hibridado con los fragmentos de inters. La exposicin del filtro a una pelcula de radiografa permite visualizar en la autorradiografa unas seales o bandas, que se corresponden con los tamaos de los fragmentos de DNA estudiados. METODO NOTHERN BLOT El Northern Blot es una tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un pptido dado en una extraccin de ARN total).Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamao. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la cual se efecta la hibridacin de una sonda molecular marcada radiactiva o qumicamente. El nombre de la tcnica deriva de la propia de la deteccin de cido desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor a su descubridor; de este modo, al desarrollarse la tcnica equivalente para ARN se empleo el punto cardinal opuesto (northern, septentrional en ingls, frente al meridional southern). METODO WESTERN BLOT El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad... Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta la unin antgenoanticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia... De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas. Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa.

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP)

Son las variaciones en las bases nitrogenadas en el sitio donde una enzima de restriccin corta un segmento de ADN. Estas variaciones afectan el tamao de los fragmentos que resultan del corte. Los RFLP se pueden utilizar como marcadores en la construccin de mapas fsicos y de ligamiento. RFLP, es la sigla en ingls para Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restriccin. Bsicamente sta es una variacin en la secuencia del ADN que afecta el que una enzima en particular corte o no el ADN en esa posicin. Tiene que tratarse de un sitio polimrfico, as que algunas personas lo tienen y otras no. En la dcada del 80, cuando la forma principal de estudiar la variacin humana era por medio de enzimas de restriccin, los RFLP reinaban soberanos. Pero todo eso ha cambiado con el advenimiento de la PCR. La mayora de los cientficos ya no usan RFLP para estudiar la variacin humana, sino que miran las secuencias en una forma ms precisa, usando polimorfismos de un solo nucletido (snips) o microsatlites.

PROCESO DE SECUENCIACION DE ADN El proceso de secuenciacin se hace en seis pasos. Primero se prepara la secuencia de inters o templado de la reaccin de secuencia. Esto consiste en la amplificacin de la misma va PCR. Una vez culminado el PCR la secuencia debe ser limpiada para eliminar los restos de primer y posibles inhibidores de la reaccin de secuencia. Es recomendable mirar el producto de PCR antes de la limpieza y hacerlo migrar unos tres dedos en un gel de agarosa, para estar seguros de que la secuencia no presenta dobles bandas ni barridos. Si este es el caso, es necesario aislar la banda de inters del gel y limpiarla. El segundo paso es la cuantificacin del producto de PCR limpio. La reaccin de secuencia es muy sensible a la concentracin del ADN templado, grandes cantidades inhiben la reaccin (los reactivos se consumen rpidamente, como resultado se obtienen secuencias truncadas) y las pequeas cantidades generan intensidades de luz pequeas que pueden ser confundidas con el ruido de fondo. Adicionalmente se tiene establecida la cantidad de ADN templado para varios tipos y tamaos de secuencias El tercer paso es la reaccin de secuencia. Esta consiste en el copiado de la secuencia patrn, no es una amplificacin de la secuencia como en el caso de la PCR, de all que la concentracin del ADN inicial sea tan restrictiva. La reaccin de secuencia necesita de la hebra molde, uno solo de los primers (la inclusin de los dos primers genera dos secuencias superpuestas ilegibles), una enzima polimerasa de ADN, el cofactor de la enzima MgCl2, una solucin tampn (buffer), los cuatro desoxinucleotidos (dNTPs) y los cuatro didesoxinucleotidos marcados (ddNTPs). Generalmente los kit de secuenciacin traen una solucin con la mezcla adecuada de dNTPs, ddNTPs, la enzima y el MgCl2. En nuestro caso, utilizamos el kit Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) y la mezcla de reactivos de denomina Terminator Ready Reaction mix o Big Dye. La reaccin de secuencia se lleva a cabo en un termociclador donde se repite un programa de extensin que consta de, un paso de desnatulalizacin de la secuencia de ADN a 96C, uno para el anhealing de la secuencia a una temperatura de 50C y el de la extensin de la secuencia a 60C. El cuarto paso es la precipitacin de la reaccin de secuencia. En este se eliminan los reactivos sobrantes de la reaccin y otras molculas que puedan interferir en la lectura del secuenciador. Existen varios mtodos de precipitacin de la secuencia, aqu se muestran dos de ello uno basado en etanol e isopropanol y otro donde se utilizan perlitas magnticas para capturar el ADN.

El quinto paso es la resuspensin de la secuencia marcada en formamida de alta pureza (Formamida Hi-Di). El Sexto paso consiste en el montaje de la muestra en el equipo de secuenciacin