Practica No.

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Recuento de coliformes fecales y E. coli en alimentos
Objetivo. Desarrollar los mtodos utilizados para el recuento de coliformes fecales y E. coli en alimentos. Introduccin.
El termino de coliformes fecales ha surgido como un intento de encontrar mtodos rpidos y fiables para establecer la presencia de E. coli y variantes estrechamente relacionados, sin necesidad de purificar los cultivos obtenidos en las pruebas para coliformes o de aplicar las relativamente costosas pruebas confirmatorias. Los coliformes fecales, comprende un grupo de microorganismos seleccionados por incubacin de los inculos procedentes del caldo de la prueba presuntiva para coliformes totales, a temperaturas superiores a las normales(44.5C.). Tales cultivos contienen por lo general un alto porcentaje de E. coli tipos I y II y son, por ello, muy indicativos de una probable contaminacin de origen fecal del alimento. La investigacin cuantitativa de la E. coli constituye una variante de mayor significado. Este refinamiento no acaba de resolver el problema, pues el microorganismo, exhibe capacidad para multiplicarse en diversos alimentos. Con todo, el hallazgo de E. coli en alimentos especialmente en cifras elevadas se suele asociar con exposiciones a contaminacin de origen fecal recientes, mas aun, cuando un producto en cuestin florece en un ambiente impropio para el libre crecimiento de este germen, y una vez retirado de l se toman precauciones para evitar tanto su desarrollo como nuevas contaminaciones, y con lo cual su papel de indicador de exposiciones a materia fecal adquiere suficiente apoyo. En general la ausencia o cifras bajas de coliformes fecales y mejor aun de E. coli, en una gran variedad de alimentos como producto terminado o durante su proceso, suele generar una situacin de confianza desde el punto de vista de su calidad.

Procedimiento. Coliformes fecales

1.1. Proceder de acuerdo a la tcnica de NMP para coliformes totales y, transferir una asada de los tubos de caldo lauril triptosa que muestren cualquier cantidad de gas a tubos con caldo EC. 1.2. Incubar en bao de agua a 44.5C durante 24-48 horas. La produccin de gas en estos tubos hace positiva la prueba para coliformes fecales. 1.3. Reportar el nmero de coliformes fecales por gramo de muestra, de acuerdo al nmero de tubos positivos a gas en cada dilucin. Consultar la tabla del nmero ms probable.

Escherichia coli.
1.4. Sembrar una asada de los tubos que muestren gas en el caldo EC despus de 48 horas, en placas de agar eosina azul de metileno. 1.5. Incubar las placas invertidas a 35C durante 24 horas. Las colonias tpicas de E. coli muestran un color violeta oscuro con ncleo central, con o sin brillos metlicos; las

colonias atpicas son opacas, carecen de ncleo y son de color rosa, pudiendo o no presentar un aspecto mucoide. 1.6. Sembrar 2 colonias de cada placa en los medios para determinar IMVIC: 1.7. De acuerdo con los resultados determinar la positividad de los tubos de caldo lauril triptosa originalmente inoculados. E. coli produce indol, acidez en caldo MR-VP, no produce acetil metil carbinol y no utiliza el citrato sdico(IMVIC: ++-- ). 1.8. Determinar el NMP de E coli en la muestra. Consultar la tabla del NMP.

Determinacin del IMVIC Prueba de indol

Inocular mediante picadura un tubo con medio SIM a partir de cada colonia(de preferencia tpica). Incubar los tubos sembrados a 35C. Durante 24 horas, aadir a cada tubo 0.2 ml de reactivo de Kovac y agitar. Si aparece un color rojo en la superficie de la capa de alcohol amlico, la prueba es positiva. Un color naranja indica la posible presencia de escatol y puede ser anotado como prueba +-.

Prueba del rojo de metilo

Inocular en tubo con caldo MR-VP a partir de cada colonia. Incubar los tubos sembrados a 35C. Durante 48 horas. Colocar aspticamente 1 ml del cultivo a un tubo y adicionar unas gotas del indicador rojo de metilo. La aparicin de un color rojo hace la prueba positiva.

Prueba de Voges-Proskauer
Adicionar al tubo que contiene el caldo restante de la prueba anterior, 6 gotas de solucin de alfa naftol, 2 gotas de KOH al 40% y unos cristales de creatinina. Despus de 2 horas de a temperatura ambiente, sin tapn, la aparicin de un anillo color rojo en la superficie del medio, revela la presencia de acetil metil carbinol.

Prueba del citrato sdico

Inocular con un alambre recto a partir de las colonias un inoculo pequeo por picadura y estra sobre la superficie inclinada de agar citrato de Simmons. Incubar a 35C. Hasta 96 horas. La reaccin es positiva si el crecimiento es visible, lo cual se manifiesta generalmente, por el cambio del color verde al azul. Material:
Cajas de Petri Cajetero Pipetas de 1 mL Pipetas de 10 mL Pipetero Tubos de 16150 con tapn y campana Tubos de 13100 con tapon y campana Gradilla Matraz Erlenmeyer de 1 litro ESatula Probeta de 100 mL Frascos Ambar Placa de Calentamiento Mosca Agua Destilada

Medios de cultivo:
Caldo MRVP Peptona Caldo Lauryl Caldo Bilis Verde Brillante Agar Triple Azcar y Hierro

Agar Bilis Rojo Violeta

Agregar 90 ml de dil. De peptona i agregar 10 ml de muestra (jugo de zanahoria)

1 ml 1 ml
Agregar 9 ml de dil peptona a cada tubo ms 1 ml de muestra.

1 ml

1: 100

1:1000

1:10000

Tcnica en vaciado en placa: ABRV

Tcnica NMP Caldo lauril 3-3-3

Gas CBVB Gas Coli. Tot. Gas EC Gas Col. Fec.

Col. Rojo - Tinto

EMB

Pruebas bioq.

EMB
Indol Rojo Metilo Voges Proskaver Citrato I M V C

Pruebas bioq . IMVIC

Dil. 1

Dil. 2

Dil. 3

Caldo lauril

Caldo lauril

Caldo lauril

Caldo EC

Caldo EC

Caldo EC

CBVB

CBVB

CBVB

Incubacin Coliformes totales 37 C Dil. 1 Coliformes fecales 44.5 C bao mara. 0.5 C

Caldo lauril 9c/gas Dil. 2 Dil.3

1 asada

1 asada

1 asada

CBVB

Caldo EC

CBVB

Caldo EC

CBVB

Caldo EC

EMB

EMB

EMB

EMB

Dil. 3
EMB

Dil. 2
EMB Citrato AHTA MIO MRVP

Dil. 1

Colocar un poco de MRVP en otros tubos.

MRVP

1 gota de rojo de metilo

6 gotas de alfa naftol, 2 gotas de NaOH

Tabla de resultados por equipo: Equipo 1 2 3 4 5

Muestra D4 513 661 106 265 167

UFC/g 550,0000 661,0000 106,0000 265,0000 167,0000

Coliformes Totales Coliformes Fecales

NMP 3-3-3 = > 1.100/g 3-3-3 = > 1.100/g

E. Coli.

Color

1 2 3

Rosita Blanca Blanca

Brilla verde metal. No esta en EMB No esta en EMB No esta en EMB

Dimetro (mm) 2 mm 2 mm 10 mm

Elevacin

Nucleo

Periferia

Consistencia

Borde

Halo

Convexa Convexa Plana

Rosa Negro Blanco

Rosa Blanca Transparente

Pegajosa Pegajosa Cremosa

Lisa Lisa Irregular

Rosa Blanco Rosa

Tabla de resultados E. Coli

TSI Triple azcar de hierro Colonia Simmons de citrato + azul + azul + azul glucosa Lactosa H S Gas Movilidad

MIO Indol Ornitina

MRVP Rojo de metilo + Vogers Proskaver + -

1 2 3

+ + +

+ + +

Preguntas de investigar. 1.- Cul es la prueba de EIJKMAN? 2.- El brillo metlico verde en agar EMB es exclusivo de E. coli? Si 3.- Que otra tcnica puede desarrollarse para el recuento de E. coli en los alimentos? 4.- Cmo puede enumerarse coliformes daados subletalmente (estresados)? 1 por 1

Conclusiones:
En esta prctica determinamos E. Coli por medio de distintos mtodos microbiolgicos con muestras de alimentos, realizando recuentos de colonias en distintos medios de cultivo.