Inmunohistoqumica

La historia de la inmunohistoqumica comienza en 1941 cuando Coons identifica neumococos usando un mtodo de fluorescencia directa. Ms tarde se desarrollan la inmunofluorescencia indirecta y las tcnicas inmunoenzimticas. En las ltimas dcadas, el uso de las tcnicas inmunohistoqumicas ha ido creciendo progresivamente hasta consolidarse como tecnologa esencial en el diagnstico anatomopatolgico de rutina. La inmunohistoqumica (IHQ) y la inmunocitoqumica (ICQ) son tcnicas cualitativas de deteccin y de localizacin de antgenos presentes en clulas y tejidos. Todas las tcnicas de IHQ e ICQ utilizan anticuerpos o sistemas amplificadores (sistema avidina: biotina) conjugados con enzimas y un cromgeno que precipita sobre los tejidos generando una reaccin coloreada. Existen diversos mtodos: Directo: el anticuerpo primario (dirigido contra el antgeno de inters) se encuentra conjugado con la enzima. Es fcil y rpido de realizar, pero tiene bajo lmite de deteccin. Indirecto: el anticuerpo primario, dirigido contra el antgeno, no est marcado luego se agrega un anticuerpo secundario conjugado con la enzima, que reconoce especficamente al anticuerpo primario (anti-Ig de la especie). El lmite de deteccin de este mtodo es 4 a 5 veces mayor que el mtodo directo La ventaja del uso de dos anticuerpos es la amplificacin de la reaccin en cada paso, es decir, por cada anticuerpo primario que reaccione lo reconocern dos o ms molculas de anticuerpos secundarios. Los anticuerpos utilizados en estas tcnicas pueden ser monoclonales o policlonales. En ambos casos tienen que tener alta afinidad y especificidad por el antgeno. En el caso de los sueros inmunes, es deseable que tengan ttulos elevados. De esta forma pueden ser usados en diluciones altas (muy baja concentracin) y se evita la aparicin de falsos positivos Si los anticuerpos no tienen elevada especificidad pueden producir reacciones inespecficas que lleven a falsos positivos. Tambin, algunas veces, puede aparecer reactividad cruzada cuando los anticuerpos reconocen sitios similares en molculas relacionadas. Para evitar estas falsas interpretaciones, la tcnica necesita realizarse con controles estrictos de todos lo pasos y de todos los reactivos. Las ventajas de las tcnicas inmunohistoqumicas son que permiten una localizacin ms precisa de la reaccin antgeno-anticuerpo; la tincin es permanente, estable, puede contrastarse y puede evaluarse con microscopio ptico. El material as estudiado puede archivarse por aos sin prdida de la intensidad de la reaccin. Tiene algunas desventajas como la presencia de reacciones inespecficas o cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Los anticuerpos monoclonales han permitido aumentar la especificidad y sensibilidad de esta tcnica. Algunos reactivos son carcingenos potenciales y su manipulacin debe ser cuidadosa, requieren de estandarizacin precisa y estricto control de calidad. Existen diversos tipos de tcnicas, cuya indicacin depender del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), del material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y de los antgenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmticos o nucleares. Estas tcnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. En los tejidos, las uniones inespecficas se pueden bloquear con albmina bovina, con leche descremada, o con suero normal de alguna especie distinta y alejada filogenticamente de la que se esta estudiando.

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Mtodos que utilizan la interaccin avidina-biotina: La avidina es una glucoprotena tetramrica de 67 kda, presente en la clara de huevo, que posee en su superficie regiones hidrofbicas que unen con gran afinidad la biotina. Por otra parte, las cadenas glucdicas de la avidina tienen una carga tal que las hace adhesivas con regiones cargadas del tejido, lo que aumenta el ruido de fondo (uniones inespecficas). La estreptavidina es una protena tetramrica de 60 kDa procedente de Streptomyces avidinii, con alta afinidad por la biotina. La biotina es una protena soluble en agua (vitamina H) de peso molecular bajo (244 Da) con un grupo carboxlico que permite su unin a los restos amino de las protenas. La biotinilizacin es una reaccin bioqumica que permite unir biotina por unin covalente a una gran variedad de molculas como enzimas, lectinas, anticuerpos, cidos nucleicos, etc. El pequeo tamao de la biotina hace que la biotinilizacin no afecte drsticamente las propiedades biolgicas de las molculas a las que se conjuga la biotina. Se han desarrollado varios mtodos que combinan los tres reactivos mencionados, puesto que a medida que se amplifican las seales, se aumenta ostensiblemente el lmite de deteccin de la tcnica. El esquema general del mtodo IHQ sera: 1 paso: Preparacin histolgica de los tejidos o clulas a estudiar 2 paso: Bloqueo de las peroxidasas endgenas 3 paso: Incubacin de los tejidos con el anticuerpo primario 4 paso: Incubacin con el anticuerpo secundario unido a biotina (anticuerpo biotinilado) 5 paso: Incubacin con una solucin de estreptavidina marcada con enzima peroxidasa 6 paso: Agregado del sustrato de la enzima y el cromgeno. Enzimas utilizadas: Las enzimas ms utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina, que reaccionan dando distintos colores con los diferentes sustratos segn la reaccin, lo cual servir para detectar distintas uniones antgeno-anticuerpo. Preparacin de tejidos para inmunohistoqumica: El xito de la inmunohistoqumica depende de la preservacin de los antgenos y del manejo de los anticuerpos. La conservacin de los tejidos por congelacin puede afectar los tejidos y la estructura celular, debido a la formacin de cristales de agua intracelulares. La necesidad de mantener la estructura tisular hace de la fijacin un paso fundamental en las tcnicas histolgicas. Esta necesidad de fijacin se contrapone al riesgo de provocar cambios estructurales y moleculares asociados a cualquier tratamiento de las clulas o tejidos destinados a la observacin microscpica. En IHQ, la fijacin y el tratamiento previo de los tejidos debe satisfacer diferentes criterios como: Retener los antgenos Preservar la antigenicidad Preservar la estructura Permitir la interaccin antgeno- anticuerpo Fijacin:

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El mayor problema que suelen presentar los fijadores qumicos es que pueden impedir la unin antgeno-anticuerpo, por el enmascaramiento del antgeno debido a cambios conformacionales que ocurren en el antgeno (epitope). No existe un fijador universal, en todos los casos hay que realizar distintas pruebas con diferentes fijadores (y diferentes condiciones de fijacin) para cada antgeno y para cada tejido. El fijador mas utilizado es el formol tamponado, (formaldehdo al 10 % en fosfato disdico y monobsico) debido a que es ms accesible por costos y es menos agresivo a los tejidos que el formol puro. Bloqueo de peroxidasas endgenas Los tejidos tienen sus propias peroxidasas que interfieren con la reaccin cuando se utilizan anticuerpos marcados con peroxidasa. Para bloquear las peroxidasas endgenas se pueden incubar los cortes con una solucin de perxido de hidrgeno y metanol absoluto (entre 10 y 30 minutos) a temperatura ambiente. El mtodo es muy eficiente y lleva a la neutralizacin de las peroxidasas de los tejidos, sin afectar la inmunoreactividad. Otro mtodo consiste en hacer reaccionar las peroxidasas endgenas (inespecficas) con un cromgeno y luego efectuar la reaccin inmunohistoqumica (especfica) con otro cromgeno que desarrolle un color contrastante con el anterior. Preincubaciones Una vez obtenidos los cortes y antes de iniciar las incubaciones con los anticuerpos, se han de hacer diversas preincubaciones y lavados a fin de facilitar la penetracin de los anticuerpos y disminuir el marcaje inespecfico. Generalmente todas las preincubaciones se realizan en soluciones fosfato o tris-HCl o bien en solucin salina tamponada. En el caso de que el proceso se realice sobre portaobjetos gelatinizados, hay que calentarlos previamente entre 37 y 50C (dependiendo de la sensibilidad de los antgenos a la temperatura) durante 10 min. Aplicaciones de la IHQ en medicina veterinaria I. Diagnstico de infecciones: deteccin de microorganismos en los tejidos afectados. II. Diagnstico de enfermedades autoinmunes: deteccin de depsitos de anticuerpos o complejos inmunes en los tejidos afectados. III. Diagnstico de neoplasias: deteccin de marcadores tumorales especficos en las clulas neoplsicas. IV. Investigacin: por ejemplo, utilizando marcadores leucocitarios (CD Cluster of diferentiation) a fin de determinar poblaciones leucocitarias predominantes en ciertas afecciones o tejidos.

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