Disponvel em: <www.camposecarrer.com.br/reproducao/Tricomonosebovina.

doc> Acesso em: 19 de Dezembro de 2011

CURSO PFIZER MDULO - TRICOMONOSE BOVINA PROFESSOR: Antnio Marcos Guimares

1. INTRODUO A tricomonose uma doena venrea e infecciosa causada pelo protozorio Tritrichomonas foetus que acomete os bovinos, acarretando elevados prejuzos econmicos explorao pecuria, decorrentes dos baixos ndices de fertilidade no rebanho. A doena em vacas se caracteriza por aumento do intervalo de partos, reduo na produo de bezerros, morte embrionria ou aborto, feto macerado, repetio de cio em intervalos irregulares e piometra. No touro, a infeco assintomtica, no afetando inclusive a qualidade do semn ou o desempenho sexual. O impacto econmico da infeco pelo Tritrichomonas foetus pode ser profundo, representado pelo descarte e reposio de animais infrteis (fmeas repetidoras de cio, que abortam constantemente e touros infectados), custo do smen e pela reduo no nmero de bezerros nascidos devido reabsoro embrionria e abortos. Em rebanhos leiteiros, esses fatores provocam uma grande reduo na produo de leite pelo alongamento do intervalo de partos. A combinao dessas perdas pode

resultar na diminuio de 5 a 35% no retorno econmico, por vaca, em rebanhos infectados com T. foetus. Estudos realizados nos EUA estimaram uma perda econmica de U$ 650 milhes de dlares anualmente e o custo da doena no rebanho leiteiro foi estimado em U$665 dlares por vaca infectada, por ano, computando-se as perdas referentes ao intervalo de partos, custos de descarte, do smen e assistncia veterinria. Na pecuria de corte, o principal efeito da tricomonose bovina (TB) sobre o aumento do intervalo de partos, reflexo de um grande nmero de vacas vazias ou que concebem tardiamente dentro da estao de monta, produzindo os chamados bezerros refugos, com baixos valores de comercializao. Este mdulo tem como objetivo ressaltar a crescente importncia da tricomonose bovina no mbito da reproduo de bovinos, proporcionando aos veterinrios que atuam na rea uma viso dos principais aspectos que envolvem a doena, com enfse a epidemiologia, patogenia, diagnstico e controle; bem como, orientar os profissionais sobre os principais mtodos de colheita e envio de material para o diagnstico laboratorial dessa parasitose. 2. HISTRICO O agente da tricomonose bovina foi observado pela primeira vez por Kunstler (1888) em vagina de vaca na Frana, e posteriormente, por Mazzanti (1900) no trato genital de fmeas na Itlia, que o denominou Trichomonas uterovaginalis vitulae. Em 1944, o protozorio foi isolado do abomaso de um feto de sete meses de idade, na Alemanha. At essa data, os casos de aborto eram creditados `a brucelose bovina.

Reidmuller (1928), isolou o parasito em cultura pura do abomaso de dois fetos abortados e props o nome de Trichomonas foetus. Abelein (1929) comprovou que o T. foetus, nas vacas, est intimamente associado com abortos precoces, esterilidade e piometrite, e verificou que o parasito, no macho, localiza-se na cavidade prepucial. Nos Estados Unidos o parasito foi identificado pela primeira vez por Emmerson (1932), em duas vacas estreis. A reclassificao do Trichomonas foetus como Tritrichomonas foetus foi proposta por Emmerson (1933), tendo em vista a presena de trs flagelos anteriores. No Brasil, a primeira referncia sobre a tricomonose bovina (TB) se deve a Roehe (1948) no estado do Rio Grande do Sul, que encontrou o protozorio no smen de touros utilizados na inseminao artificial (IA). 3. AGENTE ETIOLGICO 3.1 Classificao taxnomica Tritrichomonas foetus (Reidmuller, 1928), est classificado

taxonomicamente no filo Sarcomastigophora, classe Zoomastigophorea, ordem Trichomonadida, famlia Trichomonadidae e gnero Tritrichomonas. Os hospedeiros naturais so os bovinos, embora sua presena j tenha sido assinalada em sunos e equinos e, recentemente, em camelos. Como sinonmia, o protozorio recebeu diversas denominaes ao longo dos anos dentre elas Trichomonas uterovaginalis-vitulae (1900), Trichomonas foetus (1928), Trichomonas bovis (1930), Trichomonas

genitalis (1933), Trichomonas bovis genitalis (1935), Trichomonas vaginalis bovis (1935), Trichomonas vaginalis (1935), Trichomonas genitalis (1937), Trichomonas genitalis bovis (1938), Trichomonas bovinus (1938) e Trichomonas mazzanti (1940). 3.2 Aspectos morfolgicos T. foetus (Figuras 1A e 1B) um protozorio ativamente mvel e anaerbio, de aspecto piriforme ou ovide, cujo tamanho varia entre 10 a 25 m de comprimento e 3 a 13 m de largura. Possui trs flagelos anteriores e uma membrana ondulante que se estende pelo comprimento do corpo, terminando em um nico flagelo posterior.

Figura 1A

Figura 1B

O parasito apresenta como estruturas tpicas o axstilo e pelta, constituintes do citoesqueleto, juntamente com a costa e os flagelos, e que esto envolvidos nas funes motoras, reprodutivas e de transporte.

As demais estruturas so o corpo parabasal (aparelho de Golgi e filamentos parabasais), o ncleo oval (localizado no tero anterior do corpo) e os hidrogenosomas (substitutos funcionais das mitocndrias) que so responsveis pela formao do hidrognio molecular. No citoplasma, tambm observada uma variedade de vacolos e vesculas relacionadas com os processos de endocitoses, digesto e transporte, bem como retculo endoplasmtico rugoso, ribosomos livres e grnulos de glicognio. 3.3 Aspectos biolgicos O T. foetus um protozorio adaptado para viver em ambiente anaerbico ou microaerbico. No possui mitocndria e peroxisomas, mas apresenta uma organela de dupla membrana denominada hidrogenosoma, que est envolvida no processo de gliclise. O protozorio multiplica-se por diviso binria longitudinal, sendo sensvel ao calor, aos raios ultravioleta e aos desinfetantes comuns, mas sobrevive ao congelamento. No meio ambiente o parasito sobrevive por poucos dias. Pelo exame a fresco, temperatura de 37oC o T. foetus locomove-se cruzando o campo microscpico em todas as direes em movimento antihorrio. O processo de alimentao do T. foetus realizado pelos processos de fagocitose e pinocitose e tem como resultado a formao de vacolos citoplasmticos de diversos tamanhos.

O parasito obtm energia por meio do catabolismo anaerbico dos carboidratos, embora possa sobreviver em presena de oxignio. O T. foetus no possui mitocndria, sendo capaz de produzir H2 em anaerobiose, devido presena de hidrogenosomas que reduzem o oxignio. No trato genital dos bovinos, o T. foetus tende a produzir um pH prximo de sete, favorvel ao seu desenvolvimento. O T. foetus pode ser cultivado "in vitro" em uma grande variedade de meios de cultivos lquidos. Para isso, o parasito requer uma fonte de protena (tripticasa, peptona, etc), um acar (maltose, dextrose), uma substncia redutora da tenso de oxignio (cistena, tioglicolato, etc) e 10% de soro, cujo cido linolico parece um fator essencial, juntamente com o cido ascrbico que conveniente adicionar. O parasito pode tambm ser cultivado em diversas linhagens de clulas. Cepas de T. foetus podem ser mantidas em laboratrio criopreservadas a -70C ou em nitrognio lquido (-196C), utilizando como crioprotetores o glicerol e dimetilsulfxido (DMSO) nas concentraes entre 5 e 7,5%, j que valores acima desses podem ser txicos para o protozorio, sobretudo o glicerol. 3.4 Aspectos imunolgicos Os estudos sobre a resposta imune da infeco pelo T. foetus em touros so escassos. O fato de animais jovens serem mais resistentes a infeco est relacionado mais estrutura microscpica da mucosa que reveste o pnis e o prepcio que a uma resposta imune efetiva, que provavelmente est ausente nesses animais.

As fmeas so capazes de desenvolver uma resposta imune efetiva contra o T. foetus. O parasito estimula uma resposta inflamatria branda, associada com a interrupo da prenhez. A inflamao mediada por um mecanismo imune que frequentemente elimina a infeco. Em vacas portadoras, provavelmente ocorre falha nesse mecanismo imune, permitindo a manuteno da infeco no rebanho. Aps a infeco inicial com T. foetus, fmeas de bovinos respondem com a secreo local de imunoglobulinas das classes IgG e IgA no muco cervicovaginal secretado pelo tero. A eliminao da infeco provavelmente mediada por imunoglobulinas especficas, j que o organismo um parasito extracelular. Anticorpos monoclonais provocam aglutinao, promovem lise mediada por complemento, previnem a adeso de parasitos nas clulas epiteliais da vagina e facilitam a fagocitose de T. foetus por moncitos de bovinos. A associao entre anticorpos especficos anti-T. foetus e complemento potencializa a morte dos parasitos pelos leuccitos polimorfonucleares. 3.5 Animais suscetveis Espcies sensveis ao T. foetus, mediante inoculaes experimentais do parasito, incluem embrio de pinto, pinto, camundongo, rato branco, coelho, cobaio, macaco, co, cobra, ovelha, vaca e touro. Entre as vias de inoculao empregadas para infectar os animais experimentalmente, j foram relacionadas a via intravaginal (cabras, porcas, hamster dourado, coelhas, cobaias, cadelas, cobras); via intranasal (sunos) e via subcutnea (hamster). Camundongos e ratos so refratrios infeco vaginal, embora possam ser produzidos abcessos subcutneos quando utiliza-se esta mesma via em inoculao experimental.

4. EPIDEMIOLOGIA 4.1 Distribuio geogrfica e prevalncia da tricomonose bovina (TB) A TB uma doena cosmopolita e tem sido detectada nos principais pases produtores de bovinos, sendo considerada uma das mais importantes causas de falhas reprodutivas em rebanhos de corte criados extensivamente e onde predomina a prtica de monta natural. O encontro de T. foetus e da TB tem sido constatado nos EUA, Mxico, Canad, Porto Rico, Irlanda do Norte, Esccia, Inglaterra, Pas de Gales, Frana, Holanda, Blgica, Luxemburgo, Portugal, Bulgria, Dinamarca, Noruega, Alemanha, Sua, Itlia, ustria, Hungria, Romnia, Polnia, Rssia, Argentina, Nova Zelndia, frica do Sul e do Norte, Japo, Peru e Brasil. As taxas de infeco dos touros nessas reas apresentam grandes variaes, com valores de 30% na Austrlia e menos de 1% nos EUA. No oeste da Europa, a doena parece ser rara em sistemas intensivos de produo. Entretanto, em criaes extensivas a prevalncia desconhecida. Na Espanha foram encontrados 2,9% de touros infectados, em rea de criao extensiva. No Brasil, o T. foetus foi identificado pela primeira vez em touros doadores de smen em central de inseminao artificial do estado do Rio Grande do Sul. Posteriormente, foram realizados estudos epidemiolgicos no estado do Rio de Janeiro com ndices de 7 a 15% de touros portadores; no estado de So Paulo com 8% de prevalncia e 27% na Paraiba. Estudos mais

recentes realizados Rio Grande do Sul entre 1972 a 1987 isoloram o T. foetus em 2,3% de 1705 amostras de lavados prepuciais. O protozorio foi identificado pela primeira vez no estado de Minas Gerais em 1963 e, posteriormente, pesquisas realizadas em 1971 encontraram 14% de touros infectados. Na anlise de 118 lavados prepuciais procedentes do estado de Minas Gerais enviados Escola de Veterinria da UFMG, no perodo de 1979 a 1995, observou-se que 5,9% das amostras eram positivas para T. foetus. Na maioria dos estudos citados, os autores consideram que a prevalncia foi subestimada, provavelmente por problemas na coleta e transporte do material, comprometendo a sobrevivncia do parasito e por no ter sido respeitada a exigncia de repouso sexual prvio para os animais. Outro aspecto que deve ser considerado o fato de que normalmente, nesses estudos epidemiolgicos o material mais frequentemente coletado o lavado prepucial, em sua maioria proveniente de uma nica coleta por animal, comprometendo a sensibilidade do teste e aumentando o risco de resultados falso-negativos. 4.3 Transmisso do Tritrichomonas foetus A tricomonose uma doena venrea, ocorrendo a transmisso do T. foetus de touros infectados para vacas sucestveis, e vice-versa, por ocasio do coito (Figura 2); ou ainda pela inseminao artificial (IA) com smen contaminado. A transmisso entre machos pode ocorrer por meio do homossexusualismo ou sodomia, geralmente observado em propriedades onde comum a criao de touros de diferentes idades em um nico local.

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Figura 2 Menos frequente, a transmisso no venrea pode ocorrer por fmites, cama, vagina artificial, intrumentos obsttricos e smen contaminado, fato que poderia justificar a contaminao de touros em centrais de inseminao. A presena do protozorio em novilhas virgens tem sugerido outros mtodos de transmisso, alm do coito. Evidncias sugerem que a TB pode ser propagada indiretamente por meio do corrimento vaginal transferido para a cama de feno ou por instrumento contaminado utilizado para exames ou tratamento de fmeas sadias. O fator mais importante na epidemiologia da tricomonose bovina a utilizao da monta natural, estando essa doena praticamente erradicada

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em pases que utilizam intensamente a inseminao artificial (IA). Entretanto, a TB pode ser transmitida por meio da IA com smen de touros contaminados pelo protozorio. O T. foetus capaz de permanecer vivel no smen, em condies normais de estocagem baixa temperatura por um perodo mnimo de dois dias e na vagina artificial acima de cinco horas. 4.4 Fatores de risco que influenciam epidemiologia da tricomonose bovina No estudo da TB, em sistemas de produo utilizados em pases tropicais, a utilizao de manejo reprodutivo com monta natural, a idade dos touros, a falta de controle sanitrio, persistncia da infeco, portadores assintomticos, dose infectante, prticas de manejo, falta de quarentena nos animais recm-adquiridos e a utilizao de testes com baixa sensibilidade devem ser considerados como fatores de risco para a infeco pelo T. foetus. Idade: a prevalncia de touros infectados aumenta com a idade (Tabela 1). Essa afirmao est associada ao fato de os animais mais velhos apresentarem maior profundidade das criptas da mucosa prepucial, o que favorece a instalao e permanncia do T. foetus, devido s condies ideais de microaerofilia para o seu desenvolvimento. A presena de animais velhos constitui um dos principais fatores que levam a tricomonose a perpetuar-se no rebanho. Em rebanhos infectados recomendado o descarte de touros com 7-8 anos de idade e substituio por reprodutores jovens, se possvel virgens. Durao da infeco: a infeco persiste no macho durante toda a vida. A fmea, embora possa eliminar o parasito, no apresenta imunidade frente s reinfeces, aps transcorrer um perodo muito longo de tempo. Portadores assintomticos: a presena de touros portadores

assintomticos conhecida h vrias dcadas. Estudos recentes tm

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demonstrado que fmeas podem atuar como portadoras assintomticas, mantendo a infeco durante o perodo de gestao e mesmo aps o parto. Dose infectante: quanto maior a dose infectante, maior a porcentagem de animais infectados e a durao da infeco nos mesmos. Monta natural: utilizada durante o ano todo, em vez de um perodo limitado na estao de monta. Fmeas portadoras: so definidas como fmeas infectadas com T. foetus que permanecem com a infeco durante o perodo de gestao e at 6-9 semanas aps o parto. Esses animais tm uma grande importncia epidemiolgica, pois constituem uma fonte de infeco ou reinfeco para os touros e explica, em parte, a persistncia de animais infectados quando as medidas de controle so concentradas na eliminao de machos portadores. A literatura tem assinalado fmeas persistentemente infectadas por periodos que variam entre 16 a 22 meses. Touro de repasse: Trata-se de uma prtica muito comum na pecuria leiteira nacional, que representa um risco potencial para a transmisso da TB comprometendo todo o programa de IA instalado na propriedade e inviabilizando qualquer estratgia de erradicao da doena. Esse touro, via de regra, constitui-se o animal de eleio quando se deseja pesquisar a presena da TB em um rebanho, uma vez que serve quase totalidade das fmeas que retornam ao cio depois da 2 ou 3 inseminao. Caso ocorra a contaminao desse touro, o mesmo ter efeito disseminador, atingindo tambm fmeas que ainda no haviam tido contato com o parasito.

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5. PATOGENIA 5.1 Patogenia do T. foetus no trato genital de fmeas Aps o contgio, praticamente todo o trato genital est contaminado dentro de 15 dias. Inicialmente, o parasita multiplica-se intensamente na vagina e, posteriormente, localiza-se principalmente nas pregas do crvix. A infeco frequentemente induz a uma vaginite moderada com descarga mucopurulenta, uma endometrite discreta e infertilidade transitria, mas que pode progredir para piometrite (Figura 3), salpingite e cervicite.

Figura 3

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Os protozorios so mais numerosos entre o 14o e 18o dia aps a infeco. A resposta inflamatria do tero ocorre entre seis a oito semanas aps a infeco e, provavelmente, responsvel pela morte do embrio. A interrupo da gravidez, geralmente se concentra nas primeiras semanas de gestao, podendo estender-se at o quinto ms. Algumas fmeas no tm o tero invadido, apresentando gestao e partos normais. O T. foetus no interior da vagina via crvix invade o tero, se multiplica nas membranas fetais produzindo placentite, desprendimento e morte do embrio, tanto por ao direta do protozorio como pelos efeitos inflamatrios. Os mecanismos de patogenicidade que provocam morte embrionria ou fetal no foram ainda totalmente esclarecidos. O processo inflamatrio pode variar entre agudo e crnico, caracterizado por acmulo de neutrfilos, macrfagos, linfcitos e, ocasionalmente, clulas plasmticas. A reao inflamatria que se desenvolve no hospedeiro, provocando alterao no ambiente uterino, e a citotoxicidade mediada por linfocinas, so mecanismos sugeridos. A ao deletrica direta sobre o embrio ou o feto, causada pelo T.foetus, tem sido sugerida aps o isolamento de cistena-proteinases em muco cervicovaginal de vacas experimentalmente infectadas. Essas proteinases extracelulares exercem ao proteoltica sobre protenas presentes em secrees do hospedeiro e que participam nos processos de absoro de ferro, aderncia celular ou na imunidade adquirida (albumina, fibrinognio, lactoferrina e imunoglobulinas G1, e G2). O aborto (Figura 4) ocorre usualmente entre o 1 e 3 ms de gestao, excepcionalmente podendo se dar aps o 5 ou 6 ms de prenhez. Quando

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ocorre a liberao completa da placenta e dos anexos fetais, a fmea se recupera espontaneamente. A reteno de placenta (Figura 5) com membranas pode resultar em endometrite purulenta ou catarral crnica que pode conduzir a uma esterilidade permanente.

Figura 4

Figura 5

Aps a morte embrionria ou fetal ocorre um perodo de recuperao gradual que leva a restaurao da fertilidade uterina no prazo de dois a seis meses aps a exposio inicial ao parasito. Em caso de persistncia do corpo lteo e existncia de feto macerado (Figura 6), desenvolve-se piometrite, que pode evoluir para uma infertilidade permanente. O corpo lteo mantido ativo, provavelmente pela falta de secreo de prostaglandina pelo endomtrio.

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Figura 6 Na TB, a macerao fetal caracteriza-se pela presena de estruturas sseas no tero e exsudato aquoso e sem odor na ausncia de bactrias. Nessas condies, o tampo cervical pode permanecer intcto ou permitir apenas o escape de uma pequena quantidade de lquido quando o animal se deita, faz fora para urinar ou defecar. A fmea se comporta como se estivesse gestante, pois animais com piometrite raramente apresentam cio.

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Nas fmeas, a infeco auto-limitante, com durao mdia de 90-95 dias, mas durante esse perodo podem continuar transmitindo o parasito aos touros pelos quais forem cobertas. As vacas infectadas albergam o parasito durante alguns ciclos estrais ou aps a interrupo da gestao. O T. foetus, ento, eliminado simultneamente do tero, crvix e vagina, como resultado de uma resposta imune especfica induzida pela infeco. Entretanto, essa imunidade no permante e as fmeas esto sujeitas a reinfeces em coitos subsequentes. 5.2 Patogenia do T. foetus no trato genital de machos No touro, o parasito encontrado no pnis, na cavidade prepucial e, em alguns casos, ocorre a invaso do orifcio uretral. Na mucosa peniana e nas zonas adjacentes da mucosa prepucial observa-se a maior concentrao de protozorios que no apresentam carter invasivo, situando-se na superfcie da mucosa, nas secrees e na luz glndular. Touros infectados servem como portadores do parasito e, em animais velhos, a infeco torna-se crnica, possivelmente por causa do aumento do nmero e da profundidade das vilosidades do epitlio prepucial nesses animais (Tabela 1). Os machos mais jovens so menos propensos a se tornarem portadores permanentes da infeco em relao aos mais velhos, entretanto, so capazes de transmitir o parasito para fmeas sucetveis. Normalmente, os machos no apresentam nenhuma evidncia macroscpica da infeco que denuncie a presena do parasito, permanecendo como portadores durante toda a sua vida, a no ser que sejam medicados. So raros os casos de balanite e acrobustite. Esses problemas, quando presentes,

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so mais consequncia de infeces associadas do que resultantes da ao do protozorio. No exame histopatolgico da zona subepitelial do pnis e do prepcio, observa-se a presena de um infiltrado moderado de neutrfilos, macrfagos e linfcitos que, frequentemente, est acompanhado de um maior nmero de clulas plasmticas. TABELA 1 - Relao entre a idade e a infeco por T. foetus em touros selecionados aleatoriamente em rebanhos de corte na Califrnia EUA, 1990 Idade (anos) Nmero Total Nmero de Infectados 0 1 7 5 8 7 2 1 29 Porcentagem de infectados 0 <0,5 5,1 3,2 9,3 12,7 6,5 <0,4 6,2

<2 38 2 221 3 137 4 156 5 86 6 55 >6 31 259 2 >2 465 Fonte: Bondurant et al. 1990.

6. MANIFESTAES CLNICAS A tricomonose bovina apresenta como principais manifestaes clnicas a repetio de cio em intervalos irregulares e o aborto, com maior frequncia at os cinco meses de idade, alm de descargas uterinas ou vaginais e piometrites associadas com anestro. Os touros raramente exibem sinais

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clnicos da infeco pelo T. foetus, a no ser em alguns casos uma discreta balanopostiti que na maioria das vezes, passa despercebida. As fmeas podem desenvolver vaginite, cervicite e endometrite, que podem estar acompanhada por uma descarga mucopurulenta. Ocasionalmente a vaca tem piometrite, que detectada durante o exame de gestao. O evento mais frequente a morte embrionria que ocorre com 50 ou mais dias aps a concepo. Aps a monta por um touro infectado, as fmeas podem apresentar uma descarga vaginal mucosa ou mucopurulenta, embora, o normal seja a no exibio de sinais aparentes de infeco. Os casos de abortos passam despercebidos e a piometrite ocorre em 10% das vacas infectadas. Entretanto, sua ocorrncia em um nmero moderado de animais sugestivo de um surto de tricomonose. Em rebanhos com introduo recente da doena, o que chama a ateno a repetio de cio, aumento do nmero de vacas vazias, diminuio dos ndices de fertilidade e abortos que ocorrem geralmente nos primeiros meses de gestao. Em rebanhos nos quais a doena j est estabelecida, as fmeas infectadas com T. foetus manifestam cios aps 60 dias dentro da estao de monta. Alm disso, ocorre uma reduo de 20 a 40% na taxa de prenhez, elevao no nmero de servios por concepo, aumento no intervalo entre partos e variao no peso desmama. 7. DIAGNSTICO Devido a ausncia de sinais clncos patognomnicos em touros ou vacas com tricomonose, o diagnstico da doena est fundamentado no histrico reprodutivo do rebanho e no isolamento e identificao do T. foetus em amostras colhidas de placenta, feto, secrees uterinas ou vaginais,

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esmegma ou smen dos animais suspeitos. Entretanto, o sucesso no diagnstico est intimamente relacionado com as condies de coleta, da agilidade no envio para o laboratrio e com os meios e mtodos de cultura utilizados com a finalidade de garantir a sobrevivncia do T. foetus no transporte do campo para o laboratrio. A realizao de um diagnstico preciso um dos principais obstculos no controle da tricomonose. O exame direto tem uma sensibilidade de 30%, ficando bem abaixo do cultivo que apresenta uma sensibilidade entre 87 e 97% com o emprego do meio de Diamonds, podendo mesmo detectar 100% de touros infectados de um rebanho, quando o teste realizado trs vezes consecutivas, com intervalos quinzenais. A sensibilidade do diagnstico est relacionada ao mtodo e frequncia de coleta e, principalmente, com o acondicionamento e transporte do material, sendo que coletas repetidas no mesmo animal diminuem a probabilidade de um resultado falso-negativo. Um nico teste pode ser adequado para o diagnstico de rebanho quando um ou mais touros esto infectados, mas para exame individual de um touro, trs exames negativos so necessrios para assegurar que o animal no esteja infectado com T. foetus. O diagnstico laboratorial indispensvel. O cultivo e isolamento do protozorio em meios seletivos consistem no mtodo mais eficaz para determinao da tricomonose bovina. Nesses casos, fundamental a utilizao de meio de transporte que mantenha a viabilidade do protozorio da fazenda at o laboratrio. O meio de Rieck modificado, composto de leite em p e suplemento de antibiticos, o meio de transporte mais utilizado e

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difundido, sendo tambm extremamente vivel, com resultados excelentes comparados com a soluo salina como soluo de transporte. No laboratrio, o parasito depositado no meio de cultivo seletivo e mantido incubado a 37C em tubos mantidos em posio vertical para que ocorra a deposiao dos T. foetus no fundo. As culturas so examinadas microscopicamente em intervalos de 24, 48 e 72 horas de incubao e os parasitos podem ser visualizados em microscpio ptico (400x), sendo reconhecidos pelo suas caractersticas morfologicas, ou seja, presena de trs flagelos anteriores, membrana ondulante e movimentos no sentido antihorrio. Tricomondeos no-patognicos, provavelmente de origem entrica, podem algumas vezes ser obtidos pela cavidade prepucial de touros que sodomizam outros machos. Para aumentar a especificidade em preparaes frescas, conveniente efetuar esfregaos com o material colhido e, aps fixao, cor-los, para permitir melhor observao das principais estruturas do T. foetus. Em fmeas bovinas, a utilizao de mtodos de colorao para o diagnstico parasitolgico em secrees vaginais tem sido recomendada, especialmente utilizando como recurso os esfregaos citolgicos corados pelos mtodos de Papanicolaou, Pantico e pelo corante Giemsa. Os protozorios so visualizados como organismos piriformes cianoflicos, com tamanho variando de 10 a 25 m de comprimento, ncleo plido, vesicular e localizado excentricamente. Granulaes citoplasmticas eosinoflicas so frequentemente evidenciadas.

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Mtodos imunolgicos envolvendo a pesquisa de anticorpos aglutinantes especficos no muco vaginal, tm sido utilizados para o diagnstico da TB com pouco sucesso, por tratar-se de uma tcnica laboriosa e de baixa sensibilidade. Aglutininas so detectadas somente a partir de trs a cinco meses aps a fmea ter sido infectada. Estudos utilizando a reao de fixao de complemento e de precipitao para diagosticar a TB no apresentaram resultados satisfatrios. Testes sorolgicos, incluindo imunofluorescncia e Elisa, apresentam limitaes, especialmente pela possibilidade de ocorrer reaes cruzadas com outras doenas. Avanos no campo da biologia molecular com a utilizao de sondas de DNA e PCR apresentam resultados promissores como mtodos alternativos para o diagnstico da tricomonose bovina, mas, considerando a relao custo/benefcio de ambos os mtodos, a cultura e isolamento se mantm como o gold standard ou padro de exatido com o qual os outros testes devem ser comparados. O diagnstico da TB fundamenta-se no encontro do protozorio no macho. Um nico touro infectado suficiente para considerar o rebanho contaminado. Por razes de manejo e baseando-se num clculo de probabilidades, embora apresente divergncia entre os pesquisadores, o touro considerado isento da infeco, depois de trs a seis exames consecutivos negativos com intervalos semanais. A fmea pode ser considerada no infectada se, depois de pelo menos trs exames negativos, tiver um perodo estral normal, conceber e ter, ao final da gestao, um bezerro normal. 7.1 Diagnstico diferencial

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7.1.1 Campylobacter fetus venerealis Doena venrea muito parecida com a tricomonose bovina, entretanto, a ocorrncia de piometrite ps-coital geralmente no se verifica. 7.1.2 Condio corporal e nutricional no perodo pr-parto Fmeas que parem em pobre condio corporal demoram a manifestar o estro novamente, podendo no conceber na prxima estao de monta. Deficincia de microelementos (Cu, Mn, Se, Zn) est associada com anestros, infertilidade de macho ou fmea e aumento de sucetibilidade doenas. Stress trmico (hipertermia) pode provocar queda nas taxas de prenhez, devido infertilidade temporria. 7.1.3 Subfertilidade de touros Touro subfrtil, mas que exerce uma dominncia sobre os demais, reduz a taxa de prenhez do rebanho, porque restringe a monta dos machos submissos que so mais frteis. 8. COLETA DE AMOSTRAS Antes da coleta no macho ou na fmea conveniente proceder limpeza da regio prepucial ou vulvar, evitando nesse processo o uso de desinfetantes ou outras substncias que possam determinar a morte dos protozorios. Deve-se utilizar, para a limpeza, sabo neutro ou, quando a rea estiver limpa, proceder a higiene apenas com toalhas de papel. Para evitar que o animal urine durante a coleta recomenda-se estimular a sua mico.

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8.1 Coleta de material no macho Rotineiramente, utilizado para o diagnstico da tricomonose o isolamento do T. foetus em esmegma coletado do prepcio e pnis de touros, sempre antes do coito. A cavidade prepucial o habitat natural do protozorio, sendo detectado em maior nmero na glande. O isolamento constitui-se o mtodo de eleio (gold standard), com uma especificidade de 100% em relao aos outro mtodos. Em touros, os exames diretos por meio da microscopia ptica

frequentemente, so negativos apresentando sensibilidade de 30%, consequncia do nmero reduzido de espcimes nas criptas prepuciais, especialmente se o reprodutor no passou por um perodo de repouso sexual de, pelo menos, uma semana. Outro aspecto desfavorvel que o esmegma prepucial provavelmente contm microrganismos e contaminantes qumicos que inibem o crescimento do T. foetus. Assim, o nmero de protozorios viveis pode ser muito baixo durante o perodo de inoculao da amostra, prejudicando ou impedindo o estabelecimento do parasito no meio de cultura, principalmente quando esse no apresenta condies timas para o seu desenvolvimento.

8.1.1 Mtodos para coleta no macho Na literatura, so descritas vrias tcnicas para coleta de material no trato genital do macho, vrias delas derivadas das tcnicas desenvolvidas nas fmeas. A seguir, sero apresentadas as tcnicas mais usuais.

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a) Lavado prepucial (Figuras 7 a 10)

Figura 7

Figura 8

Figura 9

Figura 10

um dos mtodos mais eficientes de coleta, permitindo obter um inculo mais rico em protozorios, quando associado a condies timas de manuseio, acondicionamento e transporte do material coletado. Deve-se ter cuidado para evitar a contaminao do meio com urina do touro. Para a coleta do material utiliza-se soluo salina estril a 0,85%, com temperatura mdia de 37C. Realiza-se vigorosa massagem prepucial com o objetivo de remover o maior nmero possvel de protozorios e,

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posteriormente, recolhe-se a soluo salina por gravidade e acrescenta-se o meio de transporte e cultivo. O material examinado nas duas primeiras horas da coleta ou semeado em meio de cultivo especfico e mantido em estufa a 37C. b) Raspagem da mucosa peniana A tcnica consiste em colher o esmegma por meio de uma cureta (desenvolvida pelos criadores da tcnica) na superfcie peniana e prepucial. A secreo obtida colocada em 8 ml de salina estril e examinada posteriormente. O material coletado por essa tcnica, quando conduzido ao laboratrio em meio de transporte e cultivado em meio de crescimento, apresentou-se superior ao mtodo de pipeta, traduzido por um maior nmero de protozorios na amostra. c) Coleta por pipeta de inseminao artificial (Figuras 11 e 12)

Figura 11

Figura 12

Introduz-se uma pipeta de IA acoplada a um bulbo de borracha no stio prepucial e, com movimentos vigorosos para escarificar a mucosa peniana e

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prepucial, o esmegma coletado. O material obtido colocado no meio de transporte ou cultivo. Uma variao desse mtodo a utilizao de uma pra de borracha (Figuras 13 e 14) contendo 10 a 15 ml de soluo estril. Aps a limpeza do stio prepucial com toalha de papel, a pipeta inserida dentro da cavidade prepucial e o lquido injetado pela compresso e relaxamento da pra de borracha. O material coletado semeado em meio de transporte e cultivo e encaminhado para o laboratrio.

Figura 13 d) Coleta por "swab"

Figura 14

Essa tcnica consiste na introduo de um swab de algodo absorvente (68 cm de comprimento por 1-2 cm de dimetro) na cavidade prepucial, aderido a uma haste de ao. No interior do prepcio, o swab movimentado em vrias direes e ao redor da glande. O material obtido colocado em tubo de centrfuga, acrescentando 1 ml de soluo salina. 8.1.2 Coleta de material na fmea

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Em novilhas, o T. foetus pode ser demonstrado em secrees vaginais 14 a 20 dias aps a primeira cobertura por touro infectado. O muco crvicovaginal coletado diretamente atravs de pipetas, zaragatoas ou por lavagem da cavidade vaginal com solues de transporte ou cultivo. Alm do exame de placentomas, os envoltrios fetais e o conteudo do abomaso de fetos recentemente abortados, pode ser utilizado no diagnstico parasitolgico do T. foetus. Na vaca, deve-se coletar amostras da vagina utilizando espculos ou pipetas de IA, especialmente durante o cio, quando h exsudatos uterinos ou vaginais. Em caso de aborto, o T. foetus pode ser demonstrado nos lquidos fetais, no abomaso, no muco em torno da lngua ou dos lbios colhendo-se amostras dos lquidos com pipetas, seringas ou swabs. O isolamento do T. foetus em fmeas mais difcil, entretanto, pode-se inocular o muco cervico-vaginal em meio de cultura, embora, a sensibilidade desse mtodo parea ser menor em vacas que em touros. A razo dessa menor sensibilidade no bem conhecida, mas, provavelmente, est relacionada menor populao de parasitos residentes no trato genital de fmeas, devido ao considervel esforo do sistema imune desses animais em eliminar os protozorios. A coleta do muco crvico-vaginal em fmeas durante o cio proporciona melhores resultados. Em casos de piometra ps-coital, observada durante o diagnstico de gestao, o T. foetus pode ser facilmente demonstrado no fluido piometrtico, aspirado do tero ou do crvix cranial por meio de uma pipeta plstica de inseminao.

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8.1.2.1 Mtodos para coleta na fmea Os primeiros mtodos de coleta nas fmeas adotaram o princpio de pipeta acoplada ao bulbo de borracha contendo meio de cultivo, que era introduzida na vagina de animais suspeitos para a coleta da amostra. Posteriormente, desenvolveu-se a tcnica utilizando basto de ao e mecha de algodo umedecida num meio de cultivo, que era introduzido por meio de espculo na vagina at atingir a crvix. Neste local, o material era coletado por meio de movimentos circulares do basto. No final da dcada de 1970, foi modificada a tcnica do swab descrita anteriormente, substituindo a mecha de algodo por um absorvente feminino (OB mdio) e denominando-a como mtodo OB. Essa tcnica permite, com segurana, a coleta de material para o isolamento de um grande nmero de agentes associados s doenas da reproduo (Campylobacter fetus, Brucella spp., Leptospira spp e Clamydia psittaci). O OB fixo a um barbante com 40 a 50 cm de comprimento introduzido no trato genital preso a uma haste de metal, madeira ou plstico, por meio de um espculo. Aps 20 minutos de contato com a mucosa da crvice e da vagina, retirado para o exame. 9. MEIOS DE TRANSPORTE E CULTIVO DE T. foetus Para o sucesso do cultivo do protozorio, este deve ser semeado, de preferncia, livre de bactrias para evitar a ao deletria das enzimas bacterianas. A contaminao bacteriana pode ser controlada pela adio de

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antibiticos e alguns pesquisadores sugerem tambm a adio de antifngicos. a) Lactopep de fcil manuseio, requer componentes simples, de baixo custo, fcil aquisio, elaborao e manuteno em temperatura ambiente. um excelente meio de transporte e cultivo, podendo ser utilizado com segurana na coleta de amostras de muco vaginal de fmeas e de lavado prepucial de touros, alm da manuteno de cepas de T. foetus em laboratrio. O meio constituido por leite em p 40g, pentabitico veterinrio 1g e peptona 8g, sendo recomendado para utilizao no diagnstico da tricomonose a campo. b) Guida-Kupferberg um excelente meio de transporte e cultivo permitindo, boa multiplicao do T. foetus e podendo ser mantido em temperatura no controlada de 28 3C. Entretanto, um de seus componentes, o Bacto-Kupferberg, de alto custo e difcil aquisio. c) Lquido alantide e amnitico de bovinos Foram utilizados como um das primeiras tentativas de cultivar e manter o T. foetus fora do hospedeiro. So obtidos em matadouros, de vacas com seis meses de gestao. Apesar de possibilitarem excelente resultado, tem como limitaes a difcil aquisio e a necessidade de incubao a 37C por 48 horas.

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d) Rieck modificado um meio muito prtico para o transporte e cultivo do T. foetus, que garante a conservao do protozorio por 16 a 25 dias aps a coleta, sem cuidados especiais. O meio seco de Rieck modificado composto de leite em p 40g; penicilina G sdica cristalizada 2.000.000 UI e estreptomicina 1g. Para o lavado prepucial, recomenda-se utilizar 1,5g de meio em 60 ml de soro fisiolgico e, em caso de muco vaginal ou uterino, aconselha-se a utilizao de 0,25g de meio em 10 ml de soro fisiolgico estril. e) Diamond Cultiva com bons resultados o T. foetus em cultura livre de bactrias. composto por Trypticase 2 g; extrato de levedura 1g; maltose 0,5g; hidrolizado de L-cistena 0,1g; cido L-ascrbico 0,02g; gar 0,05g; gua destilada 90 ml; soro inativado 10ml; penicilina G potssica 100.000 UI e sulfato de estreptomicina 0,10g. f) "InPouch TF test" (Biomed Diagnostics, San Jose CA) Trata-se de um meio de cultivo comercial prprio para o transporte e crescimento de T. foetus, desenvolvido nos EUA e amplamente utilizado naquele pas em condies de campo, com resultados consistentes e uma sensibilidade de 81 a 97%, alm de fcil manuseio. O uso desse kit seria recomendado para o Brasil, uma vez que minimizaria os problemas representados pela coleta e transporte do material at o laboratrio.

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10. TRATAMENTO Fmeas com T. foetus so capazes de eliminar a infeco sem necessidade de tratamento teraputico, aps a adoo de repouso sexual durante 90 dias e com involuo uterina normal. Fmeas que manifestarem piometrite ps-coital devem receber cuidados adequados visando regresso do corpo lteo e eliminao do contedo uterino. Os animais com piometrite e no tratados podem se tornar permanentemente estreis, o que justificaria o seu descarte. O tratamento de touros infectados com T. foetus tem sido proposto por alguns pesquisadores como medida complementar para a erradicao da doena no rebanho. Entretanto, correntemente no existe nenhuma droga efetiva aprovada para o tratamento de machos e fmeas infectados com T. foetus e os resultados nem sempre se mostram satisfatrios. Em machos infectados so recomendadas duas formas diferentes de tratamento: a tpica, na membrana prepucial e no pnis, e a oral. Entretanto, os tratamentos normalmente so demorados, frequentemente requerem muitas repeties, e apresentam efeitos colaterais de grau variado, como destruio de tecidos, inapetncia e desordens digestivas em produtos administrados por via oral. O emprego de agentes tricomonicidas, preferencialmente em touros, justifica-se pelo fato de esses animais serem os veiculadores e hospedeiros

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do parasito. Nas fmeas, apenas o descanso sexual por 90 dias capaz de eliminar o T. foetus. De uso tpico, j foram testadas drogas com diversos princpios ativos na eliminao do T. foetus, como: acriflavina associada tripaflavina; acriflavina mais DMSO, tripaflavina e acriflavina. Por via oral, foram testados derivados imidazlicos como metronidazole, ipromidazole e dimetridazole, com resultados variveis. O tratamento no recomendvel para um grande nmero de touros ou para uso indiscriminado em um rebanho, restrigindo-se queles com um alto valor zootcnico. 11. CONTROLE As medidas adotadas no controle da TB devem levar em considerao o fato de ser essa uma doena de transmisso venrea, os touros serem portadores permanentes do parasito e as fmeas infectadas poderem obter imunidade aps um perodo entre trs e seis meses. Em funo desses aspectos, a eliminao dos touros infectados, a introduo de inseminao artificial (IA), adoo de uma estao de monta e o repouso sexual das fmeas por 90 dias so as principais medidas de controle da tricomonose bovina. 11.1 Inseminao artificial A IA uma das prticas mais efetivas no controle da TB e os pases que a adotaram j no tem resgistrado mais casos desta doena. No Brasil uma

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prtica de manejo ainda pouco adotada, sendo sua utilizao no ano de 1997 estimada em 4,7% das fmeas bovinas. Embora represente um ndice ainda muito baixo, observa-se que ocorreu um aumento significativo em relao dcada de 1980 quando apenas 2 a 3% das matrizes eram inseminadas. Embora no constitua objetivo deste texto debater os motivos da tmida expanso da IA no Brasil, sabe-se, entretanto, tratar-se de uma tcnica impraticvel na maioria dos grandes rebanhos e em regies carentes de infra-estrutura e mo-de-obra especializada. 11.2 Repouso sexual Uma prtica que pode ser utilizada com xito com a finalidade de eliminar a infeco tanto pelo T. foetus, quanto pelo C. fetus venerealis o repouso de fmeas por 60-90 dias, permitindo que o sistema imunolgico produza anticorpos especficos antes de uma nova infeco. Entretanto, estudos mais recentes tm demonstrado que o emprego somente dessa prtica no suficiente para o controle da TB, devido presena de fmeas portadoras que podem manter a infeco por vrios meses. 11.3 Estao de monta Embora dentro da realidade nacional a monta natural constitua a prtica reprodutiva mais utilizada em 96% dos rebanhos, a adoo de uma estao de monta recomendada para minimizar os riscos da utilizao de touro infectado pelo T. foetus, e permitir o repouso sexual das fmeas. Os reprodutores devem ser testados 60 dias antes de entrarem em servio, respeitando um perodo prvio de 15 dias de descanso sexual antes e durante o perodo de testes.

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Aliado a est prtica de manejo, deve-se promover o descarte mais frequente de touros velhos e a reposio por reprodutores jovens, se possvel virgens, ou comprovadamente negativos. Essas medidas, alm de permitir um maior controle sanitrio do rebanho, trariam como benefcios adicionais um ganho gentico com a introduo de touros melhoradores, com melhor desempenho sexual (maior libido e elevada capacidade de servio), alm de diminuir os riscos de transmisso da TB, bem como de outras doenas venreas. 11.4 Esquema de manejo reprodutivo em rebanho infectado: Os animais do rebanho so divididos em dois grupos: 1o grupo: constitudo por vacas que no foram expostas infeco, novilhas virgens e touros virgens. 2o grupo: constitudo por animais expostos infeco e de fmeas e machos suspeitos de terem contraido a infeco. Os dois grupos so mantidos separados, sendo que nenhuma medida tomada em relao aos animais do 1o grupo. As fmeas infectadas passam por um repouso sexual de trs meses. Nesses animais, utilizar IA ou touros livres da infeco para fecundar vacas que tiveram uma involuo uterina normal e que no apresentaram sinais de vaginite. As vacas com piometrite so medicadas e mantidas em repouso sexual por 90 dias. As vacas gestantes so colocadas em uma lista de espera se a prenhez chegar a termo. Essas fmeas so colocadas no lote no infectado e, aps o parto, so deixadas por trs ciclos estrais seguidos sem novas coberturas.

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Finalmente, as fmeas com a esterilidade comprovada devem ser eliminadas. O fato de as vacas apresentarem prenhez e pario normais no exclui a possibilidade de estarem infectadas e disseminarem a infeco no rebanho, apesar de todas as medidas de controle observadas. Medidas mais restritivas devem avaliar a possibilidade de adoo da IA com a eliminao de todos os touros da propriedade. Caso haja interesse em manter os reprodutores, eles devem ser examinados periodicamente e sempre que possvel, fazer a reposio destes animais por touros virgens. 12. PROFILAXIA O desenvolvimento de vacinas na rea reprodutiva complexo, ainda que estrategicamente importante para melhorar o controle das enfermidades venreas. A falta de identificao dos antgenos especficos nas vacinas existentes e o alto custo dos testes de eficcia vacinal e para medir a resposta imune limitam o desenvolvimento desses imungenos. Vacinas comerciais contendo T. foetus mortos e um adjuvante apropriado, disponveis para serem utilizadas em vacas e novilhas, tm demonstrado reduo significativa nas perdas com abortos quando as vacas foram desafiadas. As vacinas no impedem a infeco, mas limitam a sua durao e previnem o efeito patolgico do parasito por permitir que o sistema imunolgico da vaca elimine a infeco antes que ocorra danos ao feto. A vacina deve reduzir ou eliminar as vacas portadoras no rebanho.

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Estudos recentes tm apresentado resultados promissores no controle da tricomonose com vacinas utilizando toda a clula ou antgenos de membrana de T. foetus. Entretanto, a habilidade do parasito em alterar o sorotipo especfico limita a eficcia dessas vacinas. Alguns autores consideram a imunizao de touros uma medida eficaz no controle da infeco pelo T. foetus. Vacinas obtidas de clulas totais do protozorio mostraram-se eficientes em touros com menos de cinco anos de idade quando submetidos ao teste de desafio com o T. foetus a cada seis meses, durante trs anos consecutivos. Vacinas experimentais, preparadas a partir das membranas de T. foetus, retardaram a doena nos touros por um perodo aproximado de um ano. Entretanto, quando a vacina foi administrada em touros com mais de cinco anos de idade no se mostrou eficaz. Apesar de todos os esforos para a obteno de uma vacina eficaz contra o T. foetus, os resultados obtidos at o momento no so totalmente satisfatrios. A imunizao no duradoura e, em touros acima de cinco anos de idade, no confere proteo. 13. BIBLIOGRAFIAS CONSULTADAS

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Anticorpos. molculas produzidas por animais em resposta a um antgeno, capazes de se combinar especificamente com o antgeno que induziu sua formao. Complemento. um grupo de protenas sricas envolvidas no controle da inflamao, da ativao de fagcitos e do ataque ltico s membranas celulares.O sistema pode ser ativado pela interao com o sistema imune (via clssica). Elisa (Enzyme-linked immunosorbent assay). um teste imunoenzimtico comumente utilizado para detectar e/ou titular anticorpos em amostras de soro. Imunofluorescncia. tcnica utilizada para identificar microscopicamente antgenos particulares em tecidos ou clulas pela ligao de um anticorpo fluorescente conjugado. Imunoglobulinas. anticorpos sricos, incluindo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Linfocinas. termo genrico que designa molculas, que no anticorpos, envolvidas na sinalizao entre as clulas do sistema imune e produzidas por linfcitos. PCR. reao de polimerase em cadeia. Esta reao produz cpia exponencial de uma sequncia especfica do cido nucleotdeo de um agente patognico, a partir de, no mnimo, dois pares de cidos nuclicos denominados de pares iniciadores ou primers.

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Sonda de DNA. com o DNA clonado em plasmdeos bacterianos ou em bacterifagos se produz uma sonda marcada com enzimas conjugados, principalmente biotina, sondas especficas para todo e qualquer agente patognico. LISTA DE FIGURAS Figura 1A = T. foetus observado em microscopia ptica em exame a fresco. Figura 1 B= T. foetus observado em microscopia ptica corado pelo mtodo de Giemsa. Figura 2= monta natural em bovinos. Figura 3= tero com piometrite. Figura 4= aborto. Figura 5= reteno de placenta. Figura 6= feto macerado. Figura 7= lavado prepucial. Figura 8= lavado prepucial. Figura 9= lavado prepucial. Figura 10= lavado prepucial. Figura 11= coleta de material com pipeta de inseminao artificial. Figura 12= coleta de material com pipeta de inseminao artificial. Figura 13= coleta de material com pra de borracha. Figura 14= coleta de material com pra de borracha.