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Sige social - 31, av.
de la Division Leclerc 92260 Fontenay-aux-Roses - Standard +33 (0)1 58 35 88 88 - RCS Nanterre B 440 546 018

Systme de management
de la qualit IRSN certifi
Toxicit dun mlange binaire sur
la daphnie Daphnia magna

Etude des effets biologiques de luranium et
du slnium seuls et en mlange

Florence ZEMAN
Octobre 2008
N ISRN/IRSN-2008/103
Laboratoire de Radiocologie et dEcotoxicologie

T H S E
i

Universit Montpellier II

Sciences et Techniques du Languedoc

Thse

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE MONTPELLIER II

spcialit : Evolution, Ecologie, Ressources gntiques, Palontologie

Ecole doctorale : SIBAGHE
Systmes Intgrs en Biologie, Agronomie, Gosciences, Hydrosciences, Environnement

Toxicit d u n m la n ge bin a ir e s u r la d a p h n ie
Da p h n i a m a g n a

Etude des effets biologiques
de luranium et du slnium seuls et en mlange

Florence Zeman

Thse soutenue le 30 octobre 2008 Cadarache

Jury

Pr. Claude Casellas , Professeur lUniversit Montpellier I, Prsidente
Pr. Catherine Aliaume , Professeur lUniversit Montpellier II, Directrice de thse
Dr. Alexandre Pry, Chercheur l INERIS, Verneuil en Halatte, Rapporteur
Dr Patsy-Ann Thompson, Chercheur la CCSN, Ottawa, Rapporteur
Pr. Guy Charmantier, Professeur lUniversit Montpellier II, Examinateur
Dr. Rodolphe Gilbin, Chercheur lIRSN, Cadarache, Tuteur IRSN
Dr. Mathias Grote, Chercheur lEDF, Chatou, Examinateur
ii

iii

Remerciements

Jadresse mes remerciements tous ceux qui ont contribu mon travail de thse et mont entoure au
cours de ces trois annes.

Je tiens en premier lieu remercier les membres du jury. Je remercie particulirement Mme Patsy
Thompson et M. Alexandre Pry davoir accept dtre rapporteurs de ma thse. Je souhaite aussi
remercier sincrement Mme Claude Casellas, M. Guy Charmentier et M. Mathias Grote davoir gentiment
accept de faire partie du jury.

Jadresse toute ma reconnaissance ma directrice de thse, Mme Catherine Aliaume qui ma guide tout
au long de ma thse et ma apport aux moments importants le recul qui mtait ncessaire pour faire les
bons choix.

Je tiens ensuite remercier tous ceux avec qui jai travaill lors de mes trois annes de thse au
Laboratoire de Radiocologie et dEcotoxicologie et leur exprimer toute mon amiti.
Je remercie tout dabord Mme Jacqueline Garnier-Laplace pour son accueil au sein du LRE et lintrt
quelle a port ma thse.
Je tiens remercier trs particulirement Rodolphe Gilbin qui ma encadre tout au long de ces annes. Je
lui suis reconnaissante de son coute et son attention. Je le remercie pour sa grande implication dans ma
thse ainsi que pour sa disponibilit malgr son emploi du temps dj bien charg.
Merci Catherine Pradines pour son aide et ses encouragements.
Merci Claire Della-Vedova pour sa gentillesse et son aide dans les analyses statistiques pour les donnes
mlange.
Merci Magali Floriani pour son soutien ainsi que pour les images au microscope MET qui ont beaucoup
apport mon rapport de thse.
Merci galement Virginie Camilleri, Isabelle Cavali et Daniel Orjollet pour les mesures en ICP-AES,
FIAS et chromatographie ionique.
Un grand merci Nadine pour son nergie, sa bonne humeur et son soutien qui mont souvent redonn du
cur louvrage dans les petits moments de fatigue.
Je tiens remercier trs chaleureusement, Herv, Sylvie, Aurlie, Jrme , Pierre, Stphanie, Laure,
Olivia, Fred A, Fred C, Arnaud, Olivier et Christelle pour leur soutien et leurs encouragements tout au long
de ma thse dont je garde un prcieux souvenir.
Je tiens adresser un merci tout particulier Claudine pour toutes ses gentilles petites attentions.

Enfin merci tous mes proches de mavoir soutenue et encourage tout au long de cette thse.

iv

v

Introduction 1
Chapitre 1. Synthse bibliographique 5
1.1. Etude des effets dun mlange simple 5
1.1.1. Etude des effets dune seule substance 5
1.1.1.1. Valeurs remarquables 5
1.1.1.2. Modle logistique 6
1.1.2. Modles dadditivit 8
1.1.2.1. Modle daddition des effets 8
1.1.2.2. Modle daddition des concentrations (modle CA) 9
1.1.2.3. Modle dindpendance daction (modle IA) 9
1.1.3. Interactions 11
1.1.4. Outils disponibles pour lidentification et la quantification des interactions 13
1.1.4.1. Modles de mlange sans paramtres dinteraction 13
1.1.4.2. Modles de mlange avec paramtres dinteraction 19
1.1.5. Diffrents types de plans dexprience pour ltude des mlanges 24
1.1.5.1. Design factoriel 24
1.1.5.2. Design en raies 24
1.1.5.3. Design composite (factoriel et design en raies) 25
1.2. Modle biologique tudi : La daphnie 27
1.2.1. Biologie et morphologie 27
1.2.2. Cycle de vie de la daphnie 29
1.2.3. Etude des effets aigus et chroniques de substances 32
1.2.3.1. Etude des effets au niveau de lindividu 33
1.2.3.2. Etude des effets au niveau de la population 35
1.2.3.3. Etude des effets au niveau nergtique 36
1.3. Contaminants tudis : luranium et le slnium seuls et en mlange 42
1.3.1. Uranium 42
1.3.1.1. Sources et concentrations en U dans lenvironnement 42
1.3.1.2. Formes chimiques et proprits nuclaires 42
1.3.1.3. Effets sur les organismes 44
1.3.1.4. Mcanismes de toxicit 47
1.3.2. Slnium 50
1.3.2.1. Sources et concentrations de Se dans lenvironnement 50
1.3.2.2. Formes chimiques 50
1.3.2.3. Rles physiologiques 52
1.3.2.4. Mcanismes de toxicit 53
1.3.2.5. Effets sur les organismes 53
1.3.3. Uranium et Slnium en mlange 56
1.3.3.1. Formes chimiques 56
1.3.3.2. Uranium et slnium dans lenvironnement 57
Chapitre 2. Matriel et mthodes 59
2.1. Elevage de daphnie 59
2.1.1. Origine et conditions dlevage 59
2.1.2. Entretien de llevage 60
2.2. Les contaminants tudis 61
2.2.1. Etude des effets du slnium seul 61
2.2.1.1. Solutions stock de slnite et de slniate 61
2.2.1.2. Concentrations tudies 61
2.2.2. Etude des effets de luranium seul 61
2.2.2.1. Solutions stock duranium 61
vi

2.2.3. Etude des effets du mlange uranium-slnium 62
2.2.3.1. Solutions stock duranium et de slnium 62
2.3. Mesures deffet des contaminants 62
2.3.1. Effets sur le dveloppement des ufs de daphnies 62
2.3.2. Tests aigus sur les daphnies juvniles 62
2.3.3. Tests chroniques sur les daphnies adultes 63
2.3.3.1. Conditions exprimentales 63
2.3.3.2. Poids sec 63
2.3.3.3. Respiration 64
2.3.3.4. Ingestion 65
2.3.3.5. Calcul dallocation nergtique la croissance et la reproduction (AECR) 66
2.3.3.6. Mesures des rserves nergtiques : mesures des lipides 66
2.3.3.7. Calcul du budget nergtique et dallocation dnergie 66
2.3.3.8. Matrices de Leslie 67
2.3.3.9. Microscopie lectronique transmission 68
2.4. Suivi des conditions exprimentales 70
2.4.1. Suivi des milieux dexposition 70
2.4.1.1. Dosage des ions majeurs 70
2.4.1.2. Suivi du pH 70
2.4.2. Suivi des concentrations de Se et dU dans le milieu dexposition 70
2.4.2.1. Dosage par ICP-AES 70
2.4.2.2. Dosage par absorption atomique HG-QFAAS 71
2.5. Modlisation de la spciation de luranium et du slnium 72
2.6. Mesure de bioaccumulation de luranium et calcul de dose 73
2.6.1. Minralisation 73
2.6.2. Mesure des concentrations duranium par ICP-MS 73
2.6.3. Calcul de doses 73
2.7. Traitements statistiques 75
2.7.1. Donnes des effets de luranium et du slnium seul 75
2.7.2. Donnes des effets du mlange uranium-slnium 76
2.7.2.1. Test aigu 76
2.7.2.2. Test chronique 77
Chapitre 3. Effets de luranium 78
3.1. Introduction 78
3.2. Rsultats 79
3.2.1. Toxicit aige 79
3.2.2. Toxicit chronique 81
3.2.2.1. Mortalit 81
3.2.2.2. Croissance 81
3.2.2.3. Reproduction 83
3.2.2.4. Allocation dnergie la croissance et la reproduction 86
3.2.2.5. Effets sur la population 89
3.2.2.6. Effets sur le tube digestif de la daphnie 90
3.2.2.7. Bioaccumulation et doses radiologiques dlivres 91
3.3. Discussion 93
3.3.1. Influence de la spciation chimique sur la toxicit de luranium 93
3.3.2. Effets de luranium diffrents niveaux dorganisation : au niveau de la cellule,
de lindividu et de la population. 95
3.3.3. Chimiotoxicit et radiotoxicit de luranium 97
vii

3.4. Principales avances et conclusions 99
3.4.1. Choix du milieu dexposition pour les exprimentations visant tudier la toxicit
du Se seul et du mlange U et Se 99
3.4.2. Un test chronique 21 jours raccourci 7 jours 99
3.4.3. Paramtres dtude retenus pour les exprimentations en mlange 100
3.4.4. Luranium : principalement une substance chimique toxique et non un stresseur
radioactif 100
Chapitre 4. Effets du slnium 101
4.2. Rsultats 102
4.2.2. Toxicit chronique du slnite 104
4.2.2.1. Mortalit 104
4.2.2.4. Cot mtabolique 108
4.2.2.5. Effet sur la population 110
4.3. Discussion 111
4.3.1. Effets aigus du slnite et du slniate 111
4.3.2. Diffrenciation entre la zone de carence et de toxicit du slnium et sensibilit
des diffrents critres deffet du slnite 111
4.4. Principales avances et conclusions 112
4.4.1. Un test chronique raccourci 7 jours pour les exprimentations en mlange 112
4.4.2. Paramtres dtude retenus pour les exprimentations en mlange 112
4.4.3. Le slnium, un lment toxique partir de 22 g.L
-1
Se 113
Chapitre 5. Effets du mlange uranium-slnium 114
5.2. Design exprimental choix des concentrations 116
5.2.1 Toxicit chronique 117
5.3. Rsultats 118
5.3.1. Interactions au niveau de la spciation chimique 118
5.3.2. Identification des interactions sur la toxicit aige 119
5.3.2.1. Substances seules 119
5.3.2.2. Mlange binaire uranium-slnium 119
5.3.3. Identification des interactions sur la toxicit chronique 124
5.3.3.3. Rserves lipidiques 128
5.3.3.4. Evaluation de lnergie disponible pour la croissance et la reproduction chez la daphnie :
Calcul de lallocation dnergie la croissance et la reproduction (AECR) 129
5.3.3.5. Budget nergtique 130
5.3.3.6. Bioaccumulation 132
5.3.4. Effets sur les diverticules et sur le tube digestif de la daphnie 133
5.4. Discussion 136

5.4.1. Comparaison des conclusions issues de deux mthodes statistiques : mthode
de Jonker vs. mthode de Srensen 136
5.4.2. IA (Indpendance daction) vs CA (Addition des concentrations) 137
viii

5.4.3. Etude des effets dun mlange : Des conclusions diffrentes en fonction du temps,
lien toxicit aige - toxicit chronique 138
5.4.4. Etude des effets dun mlange : Des conclusions diffrentes en fonction des critres
deffet tudis 139
5.4.5. De la spciation la bioaccumulation : dmarche pour ltude des effets dun
mlange 140
5.4.6. Vers une comprhension des mcanismes daction 143
Conclusions et perspectives 145
1. Effets du mlange uranium - slnium sur Daphnia magna, identification
dune interaction 145
2. Pertinence et utilit des diffrentes mthodes mises en uvre dans le cadre
de ltude des effets des mlanges binaires. 148
Rfrences 151
Annexes 163
Annexe 1 : Mthode statistique de Jonker et al. (2005) 164
Annexe 2 : Observations des diffrents stades dun dveloppement embryonnaire
dfinis par Kast-Hutcheson et al. (2001) 169
Annexe 3 : Donnes de toxicit aige de luranium chez les cladocres deau
douce 172
Annexe 4 : Donnes test toxicit aige du slnium sur Daphnia magna et
sur Daphnia pulex 173
Annexe 5 : Prparation du milieu M4-pH 7 et M4-pH8 176
Annexe 6 : Protocole de prparation des algues pour les daphnies 179
Annexe 7 : Protocole dextraction de lipides selon la mthode de Bligh et Dyer
(1959) 181
Annexe 8 : Pourcentage moyen de survie et de fcondit en fonction des jours 183
Annexe 9 : Correction des effets de matrice engendrs par le milieu M4-pH7
lors du dosage de luranium par ICP-AES 184
Annexe 10 : Article : Effet de luranium sur la survie, la croissance,
la reproduction et sur les processus physiologiques chez le cladocre
deau douce Daphnia magna 185
Annexe 11 : Donnes de toxicit aige de luranium 193
Annexe 12 : Donnes de toxicit chronique de luranium 194
Annexe 13 : Donnes de toxicit aige du slnium 196
Annexe 14 : Donnes de toxicit chronique du slnite 198
Rfrences des annexes 199

1

Dans lenvironnement en gnral, et plus particulirement dans les cosystmes
aquatiques continentaux, les organismes vivants sont soumis linfluence de multiples
substances de nature et dorigine diverses. Les polluants se retrouvent dans la plupart des cas
en mlange des concentrations relativement faibles mais induisent cependant une
contamination chronique dun nombre croissant dcosystmes. Toutefois, les donnes deffets
relatives des situations dexposition chronique des cosystmes concernent principalement
leffet de stresseurs isols. En effet, la majeure partie des tudes se sont intresses aux effets
de substances isoles et les donnes sur les effets de mlanges sont assez limites (Andersen et
Dennison, 2004). Compte tenu du fait que les organismes sont soumis une trs grande
diversit de stresseurs, tester exprimentalement toutes les combinaisons possibles des
substances toxiques est simplement impossible.
Deux grands types dapproche ont donc t dvelopps pour valuer la toxicit des
mlanges de produits chimiques (Figure 1). La premire, appele approche bottom-up ,
sintresse la toxicit des mlanges simples (Groten et al., 2001). Cette approche est la plus
utilise pour valuer la toxicit et le risque associ l'exposition des mlanges de produits
chimiques. Dans le cas des mlanges simples les substances sont identifies et nexcdent pas
le nombre de 10. Les donnes de toxicit sont recueillies, dans un premier temps pour tous les
composants du mlange, puis la toxicit du mlange est estime selon le principe d'additivit :
la toxicit du mlange est considre comme la rsultante de la toxicit de chaque substance du
mlange.
La seconde approche appele approche top-down consiste quant elle valuer
directement la toxicit dun mlange dans son ensemble afin de gnrer des donnes trs
appliques pour l'valuation du risque (Feron et al., 1998). Cette approche considre donc des
mlanges complexes dont tous les composants ne sont pas forcment identifis ou quantifis.
Dans cette approche, leffet du mlange est valu dans son ensemble. En effet, le mlange
complexe nest plus considr comme une somme de substances mais comme une seule entit.

Introduction
2
Ces deux approches sont assez diffrentes, la premire tant plus thorique et la seconde
plus applique. Lapproche thorique concernant les mlanges simples est trs souvent loin de
la ralit des cosystmes aquatiques o les organismes sont soumis de multiples stress.
Cependant, en raison mme de sa simplicit, elle apporte de nouvelles connaissances sur les
interactions entre les substances et dun point de vue mthodologique, elle permet de
dvelopper des modles prdictifs de toxicit.

Mlanges de composs chimiques
Mlanges simples Mlanges complexes
Test des substances isoles
et des combinaisons de ces
substances
Test des substances en
mlange
Addition des concentrations
(mode daction similaire?)
Addition des rponses,
addition des effets
(mode daction diffrent ou
indpendance daction?)
Dviation de ladditivit
(interaction)
Mlanges de composs chimiques
Mlanges simples Mlanges complexes
Test des substances isoles
et des combinaisons de ces
substances
Test des substances en
mlange
Addition des concentrations
(mode daction similaire?)
Addition des rponses,
addition des effets
(mode daction diffrent ou
indpendance daction?)
Dviation de ladditivit
(interaction)

Figure 1: Diffrents cas dtude de mlanges simples daprs Groten et al. (2001)

Parmi la multitude de polluants qui affectent les cosystmes aquatiques continentaux,
luranium et le slnium sont deux lments qui se retrouvent lchelle mondiale, seuls et en
mlange dans lenvironnement.
Luranium et le slnium sont tous les deux naturellement prsents dans les
cosystmes aquatiques ltat de trace (Coughtrey et al., 1983 ; WHO, 2001 ). Cependant
leurs concentrations dans lenvironnement peuvent se retrouver trs largement accrues par
diffrentes activits anthropiques. Ainsi les concentrations naturelles duranium peuvent tre
augmentes par les activits lies au cycle du combustible nuclaire et les concentrations de
slnium par les activits lies diffrents types de mines, comme celles de charbon ou de
phosphate. Les concentrations dans lenvironnement de ces deux substances peuvent donc
crotre de faon isole dans des conditions particulires chacune delles, mais il arrive aussi
que leurs concentrations croissent de faon concomitante, en particulier au niveau de certaines
mines duranium (Noller, 1991).
3
En effet aux abords de ces mines, diverses tudes ont montr que de luranium pouvait
se retrouver dans les cours deau en aval de sites dextraction et dexploitation du minerai
duranium (Holm et al., 2005 ; Noller, 1991 ; Supervising Scientist, 2007). Dans ces rgions,
comme par exemple aux abords de la rivire Alligator en Australie (Noller, 1991) ou dans le
Saskatchewan au Canada (Liber et al., 2004 ; Muscatello et al., 2006), luranium est rejet en
mlange avec dautres substances non radioactives comme le slnium qui pourraient moduler
la toxicit de luranium (Noller, 1991).

Dans ce contexte, le but de cette thse a t dtudier les effets du mlange binaire
uranium-slnium. Lorganisme qui a t choisi pour cette tude est la daphnie Daphnia
magna. Reprsentative des communauts zooplanctoniques des cosystmes aquatiques
continentaux, cette espce possde des caractristiques, comme son cycle de vie court et sa
reproduction par parthnognse, qui sont autant davantages pour la ralisation
dexprimentations et en font un sujet dtude recommand en cotoxicologie pour les
bioessais standardiss.
Ltude des effets des mlanges peut se faire diffrentes chelles, de lchelle
molculaire lchelle de lindividu ou mme dune population.
En pharmacologie et en toxicologie humaine, la caractrisation des effets de mlange
de substances est couramment ralise au niveau molculaire car les modes daction des
diffrents composs du mlange sont en partie ou mme parfois compltement connus. Des
modles intgrant les mcanismes dactions sont gnralement utiliss dans ce cadre pour
identifier les interactions entre les composs dun mlange.
Dans le cas de ltude des effets du mlange uranium-slnium chez la daphnie, les
modes daction de chacun de ces lments ne sont pas connus avec prcision, comme souvent
en cotoxicologie. Il na donc pas t possible de faire dhypothses sur les interactions
ventuelles entres les mcanismes dactions. Dans cette thse, nous avons choisi dtudier les
effets un niveau macroscopique intgrateur pour mettre en vidence, ou non, les
interactions entre deux stresseurs et valuer leur effet global sur lindividu et sur une
population. Nous nous sommes donc intresss plus particulirement aux effets sur les
diffrents traits de vie de la daphnie lchelle de lindividu et aux effets sur le bilan
nergtique de la daphnie. Ces paramtres ont t choisis car ils apportent les premiers
lments ncessaires pour estimer les effets au niveau dun cosystme. Nous avons choisi
dobserver aussi les effets aux niveaux des tissus de daphnie afin dapporter des lments quant
4
aux mcanismes daction mis en jeu. Ce niveau a t prfr aux niveaux molculaire et
cellulaire car tant plus intgrateur. Trouver un lien entre les effets observs diffrents
niveaux dintgration biologique a permis de mieux comprendre les mcanismes mis en jeu et
leur importance.

Ltude des actions combines de stresseurs en mlange sur un organisme est
gnralement base sur la comparaison des effets observs avec les effets thoriques prdits par
les modles de rfrence dits modles dadditivit . Les valeurs thoriques des modles
dadditivit sont calcules partir des effets connus pour chaque compos du mlange isol.
Concrtement, il est donc tout dabord ncessaire dacqurir les donnes de toxicit pour
chaque substance isole avant dtudier les effets dun mlange de substances.

Dans un premier chapitre est prsente une tude bibliographique portant sur les
modles deffet des mlanges, sur la daphnie et sur les deux substances tudies, uranium et
slnium.
Un second chapitre dcrit le matriel utilis et les mthodes appliques.
Les deux chapitres suivants, chapitres 3 et 4, prsentent les tudes ralises sur les effets
des substances seules : les effets de luranium seul (chapitre 3) et ceux du slnium seul
(chapitre 4). Pour chacun de ces deux chapitres, la dmarche exprimentale mise en uvre est
expose. Les rsultats obtenus sur les substances seules sont ensuite prsents puis confronts
aux donnes de la littrature dans une partie discussion. Ltude des substances isoles permet
dobtenir, non seulement les valeurs de toxicit pour pouvoir appliquer les modles de
rfrence, mais apporte aussi diffrents lments de rflexion importants pour la suite de notre
tude des effets du mlange uranium-slnium.
Le cinquime chapitre est consacr ltude des effets de luranium et du slnium en
mlange. Comme pour les deux chapitres prcdents, la dmarche exprimentale et les rsultats
sont prsents. Les rsultats obtenus sont aussi ensuite discuts en lien avec les donnes de la
littrature. Cette dernire partie permet la fois dtudier la toxicit du mlange uranium-
slnium sur la daphnie et de dgager les lments importants prendre en compte lors de
ltude des effets dun mlange binaire.
Un dernier chapitre de conclusion permet de dresser un bilan des travaux raliss et de
prsenter les perspectives dtudes.
5

1 1. .1 1. . E Et tu ud de e d de es s e ef ff fe et ts s d d u un n m m l la an ng ge e s si im mp pl le e

Lidentification dune interaction entre des stresseurs en mlange est gnralement
base sur la comparaison des effets observs avec les effets thoriques prdits par diffrents
modles de rfrence. Dans ces modles de rfrence, appels modles dadditivit , il est
considr quil ny a pas dinteraction entre les composs. Les valeurs thoriques des modles
dadditivit sont calcules partir des effets connus pour chaque compos du mlange isol. Il
est donc tout dabord ncessaire dacqurir les donnes de toxicit pour chaque substance
isole.
1.1.1. Etude des effets dune seule substance

1.1.1.1. Valeurs remarquables

En cotoxicologie, la ralisation dexprimentations dose-rponse est une dmarche
couramment utilise pour quantifier la toxicit dune substance. Les donnes de toxicit
obtenues lors des tests sont constitues de couples : dose dexposition (concentrations
croissantes du compos test ou dilutions de lchantillon naturel tudi) et effet toxique.
Lutilisation de tests pour caractriser leffet dune ou plusieurs substances passe par la
dfinition de valeurs remarquables (Figure 2).
50%
100%
CE
50
CE
X
X%
concentration
effet
LOEC
NOEC
50%
100%
CE
50
CE
X
X%
concentration
effet
LOEC
NOEC

Figure 2: Exemple dune courbe dose-rponse (concentration-effet)
et valeurs remarquables NOEC, LOEC, CE50 .
Chapitre 1. Synthse bibliographique
6
Les rsultats obtenus sont gnralement exploits pour estimer la dose qui entrane un
effet de 50% par rapport une valeur de rfrence. La CEx (Concentration Effective/Efficace)
correspond la concentration en toxique qui engendre un effet de x% par rapport la rponse
des contrles (milieu de culture standard sans effet). La CE
50
est alors la concentration
affectant 50% de la rponse.
Il est aussi possible d'estimer la NOEC "No Observed Effect Concentration",
concentration de toxique maximale qui ne cause pas d'effet et la LOEC " Lowest Observed
Effect Concentration", concentration minimale pour laquelle un effet est observ. La
dtermination de ces valeurs seffectue sur la base dun test statistique de comparaison des
moyennes. Selon Isnard et al. (2001), les valeurs de NOEC sont souvent critiques puisquelles
dpendent du plan exprimental choisi par lexprimentateur (nombre et valeurs des
concentrations testes). Un traitement statistique par rgression (de type CE
10,
CE
5
ou

CE
1
) est
donc prfrable.

1.1.1.2. Modle logistique

Le modle logistique est le modle le plus frquemment utilis pour dcrire cette
relation dose-rponse de toxicit (Figure 3). Cest un modle non linaire qui sexprime
gnralement laide de 4 paramtres sous les formes suivantes (Streibig et al., 1993) :

Le modle logistique 4 paramtres :

Ou, lorsque le logarithme des doses est utilis :
( ) | | ) ln( ) ln( exp 1 e x b
c d
c y
+

+ =

Les paramtres du modle sont :
c : la limite basse de la rponse (borne 0)
d : la limite haute de la rponse
e : la dose ou la concentration correspondant une variation de 50% de la rponse (CE
50
)
b : la pente au point dinflexion (CE
50
)
x : la concentration
y : la rponse ou la concentration
b
e
x
c d
c y
|
.
|
\
|
+
+ =
1
7
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5
Limite suprieure (d)
Limite infrieure(c)
E
C

5
0

(
e
)
Concentration
R
p
o
n
s
e
P
e
n
t
e

(
b
)
0
10
20
30
40
50
60
0 1 2 3 4 5
Limite suprieure (d)
Limite infrieure(c)
E
C

5
0

(
e
)
Concentration
R
p
o
n
s
e
P
e
n
t
e

(
b
)

Figure 3 : Exemple dune courbe dose-rponse logistique.
Les paramtres dans cet exemple sont : b=5, c=2, d=50, e=2.

Si la limite basse nest pas significativement diffrente de zro, alors le paramtre c,
peut tre nglig. Dans ce cas, le modle logistique ne comporte plus que 3 paramtres et
scrit de la faon suivante :

( ) | | ) ln( ) ln( exp 1 e x b
d
y
+
=

Il peut galement arriver, dans certains cas, que la limite basse soit fixe un niveau
diffrent de 0. De ce fait, le modle logistique ne comporte galement que 3 paramtres. Cette
remarque peut videmment sappliquer de la mme faon la limite haute.

Dans le cas o c est fix 0 et d 100%, le modle logistique nest plus qu 2
paramtres et scrit : b
e
x
y
|
.
|
\
|
+
=
1
1

8
Certains modles, comme celui de leffet mdian propos par Chou et al. (2006),
permettent de gnraliser dautres modles dont le modle logistique qui vient dtre prsent.
Ce modle de leffet mdian est driv du principe de la loi daction de masse lquilibre et
permet ainsi de prendre en compte lensemble des quations non linaires de type : Michaelis-
Menten, logistique, Henderson-Hasselbalch et mme Scartchard.

1.1.2. Modles dadditivit

Pour essayer de prdire les effets de mlange de substances, trois modles dadditivit
de rfrence sont utiliss :
Le modle daddition des effets consistant additionner les effets connus des
substances constituant le mlange est le modle le plus intuitif mais dans la majorit des cas ne
peut tre appliqu.
Les modles daddition des concentrations et dindpendance daction sont les plus
classiquement utiliss pour modliser la toxicit chimique de mlanges de stresseurs. Ils sont
tous deux bass sur lhypothse quil ny a pas dinteraction entre les constituants du mlange.
Cette hypothse est couramment appele hypothse de non-interaction .

1.1.2.1. Modle daddition des effets

Le modle daddition des effets est le modle le plus simple des modles dadditivit.
Leffet dun mlange de substance A+B (E(c
mix
)) est gal leffet de A plus leffet de B :

) ( ) ( ) (
b a mix
c E c E c E + =

E(c
mix
) = effet total dun mlange avec une concentration totale c
mix
; E(c
i
) = effet individuel de
la substance i prsente la concentration c
i
.
Ce modle est applicable uniquement dans le cas de rponse linaire en fonction de la
dose, ce qui est trs rarement le cas. Cest pourquoi, il nest que trs peu utilis dans la
description des effets des mlanges.

9
1.1.2.2. Modle daddition des concentrations (modle CA)

Le modle daddition des concentrations est le modle le plus communment utilis
pour prdire leffet dun mlange. Il est aussi couramment appliqu pour lvaluation des
risques des mlanges de substances. Ce modle est aussi appel modle dadditivit des doses
ou modle dadditivit de Loewe. Les concentrations de chaque constituant toxique du mlange
sont ajoutes pour prdire la toxicit du mlange. Il est considr que les deux substances ont le
mme mcanisme daction de toxicit (Berenbaum, 1985 ; Drescher et Boedecker, 1995 ;
Feron et Groten, 2002) :

1
1
*
=
=
n
i
i
i
CEx
c

c
i
*
reprsente la concentration de la substance i dun mlange de n composs (i=1n) ayant un
effet total E.
CE
xi
est la concentration de la substance i qui provoque leffet E avec x% deffet par rapport au
contrle dans le cas o elle est applique seule.
Si leffet dun mlange de substances peut tre dcrit par le modle daddition des
concentrations, alors les substances sont dites additives.

1.1.2.3. Modle dindpendance daction (modle IA)

Le principe daction indpendante a t dfini pour la premire fois par Bliss en 1939.
Dans le modle daddition des rponses, les substances sont considres comme ayant des
mcanismes daction diffrents et indpendants. Cette indpendance signifie que leffet relatif
dun compos reste inchang en prsence dun autre compos toxique. Ce modle est rencontr
sous diffrentes dnominations : action dissimilaire combine, indpendance de Bliss, raction
indpendante, addition des rponses ou encore action indpendante (IA).

10
Dans le cas dun mlange avec n composs (i=1n)

)) ( 1 ( 1 ) (
1
i
n
i
mix
c E c E =

=

E(c
mix
mix
; E(c
i
i
.
Par exemple : Considrons le cas dun mlange binaire de deux substances A et B. Si
les deux substances A et B sont ajoutes successivement des concentrations connues pour
avoir un effet sur 50% des organismes test quand les substances sont appliques seules, alors la
substance A aura un effet sur 50% des organismes puis la substance B aura un effet sur 50%
des organismes qui nont pas t touchs par la substance A. Il restera donc 25% des
organismes qui nauront t affects ni par A ni par B (Greco et al., 1995).

Certains auteurs suggrent que le modle dindpendance daction est un modle
thorique qui pourrait tre remis en cause dans le cas dun effet joint de paramtres continus
sur un organisme entier (Greco et al., 1995). En effet, si deux substances ont des effets au
niveau dun organisme et mme si ces deux substances ont des modes daction totalement
diffrents, le fait de regarder les effets un niveau intgrateur, cest--dire au niveau de
lindividu, permet de considrer qu ce niveau tous les mcanismes dactions jouent sur le
mme niveau et sont donc lis. Cependant ce modle a t couramment utilis pour prdire
leffet joint de substances chimiques sur les algues, les bactries et les daphnies (Altenburger et
al., 2000 ; Backhaus et al., 2000 ; Cerdergreen et al., 2008 ; Faust et al., 2001).

11
1.1.3. Interactions

Lorsque la rponse observe dun mlange est significativement diffrente dune
rponse additive (cest--dire de la rponse thorique calcule partir des modles
dadditivit), il y a alors interaction entre les diffrents composs du mlange.
Diffrents termes ont t utiliss pour dcrire la varit des actions de substances en
mlange.
Lorsque leffet observ dun mlange est plus important que celui prdit par les
modles dadditivit (Addition des concentrations et indpendance daction), leffet est dit
synergique; un effet plus faible que celui prdit est appel effet antagoniste (Greco et al.,
1995).
Diffrents termes pour des effets suprieurs laddition, dits effets supra-additifs, ont
t dfinis en fonction des effets connus des substances seules : la synergie, la potentialisation
et la coalition (tableau 1).
Pour les effets infrieurs ceux attendus avec les modles daddition, effets sub-
additifs, deux termes ont t dfinis : lantagonisme et linhibition (USEPA, 2000).
Les diffrents termes et synonymes des actions combines les plus couramment
rencontrs dans la littrature sont prsents dans le tableau 2.
12
Tableau 1: Dfinitions des actions combines des composants dun mlange (Daprs USEPA, 2000)
Supra-additivit S Sy yn ne er rg gi ie e
L'effet combin des composants est
plus important que leffet prdit par
les modles dadditivit.
P Po ot te en nt ti ia al li is sa at ti io on n
L'effet d'un composant est accru par
un autre composant qui, seul, n'a
pas d'effet.
Interactions
=Effet suprieur
leffet additif
C Co oa al li it ti io on n
La toxicit des substances en
mlange est suprieure
l'additivit, les substances seules
sont non toxiques.
Pas
d'interactions
Additivit A Ad dd di it ti iv vi it t s st tr ri ic ct te e
La toxicit observe d'un mlange
correspond la toxicit attendue en
se basant sur les concepts d'addition
des concentrations ou d'action
indpendante.
Sub-additivit A An nt ta ag go on ni is sm me e
L'effet des deux composants est
moins important que leffet prdit
par les modles dadditivit.
Interactions
=Effet infrieur
leffet additif
I In nh hi ib bi it ti io on n
L'effet d'un composant est rduit par
un compos qui, seul, n'a pas
d'effet.
- - S Sa an ns s i in nf fl lu ue en nc ce e a ap pp pa ar re en nt te e
Les composants sont sans effet,
seuls et en mlange.

Tableau 2 : Terme et synonyme des actions combines (Daprs UNSCEAR, 2000)

E Ef ff fe et t i in nf f r ri ie eu ur r c ce el lu ui i a ad dd di it ti if f

E Ef ff fe et t a ad dd di it ti if f

E Ef ff fe et t s su up p r ri ie eu ur r c ce el lu ui i a ad dd di it ti if f

Antagonisme
Inhibition
Interaction ngative
Infra-additivit
Sub-additivit
Synergie ngative
Additivit
Indpendance
Non-interaction
Sommation
Zro interaction

Synergie
Augmentation
Interaction positive
Super-additivit
Supra-additivit
Potentialisation
13
1.1.4. Outils disponibles pour lidentification et la quantification des
interactions

Les mthodes danalyse et dinterprtation des donnes de mlange sont assez
nombreuses et peuvent tre classes en plusieurs catgories. Statistiquement, il y a deux grands
types dapproches pour valuer les dviations partir des modles de rfrences (modles
daddition des concentrations et dindpendance daction) :
(i) les mthodes o les valeurs observes sont compares celles prdites par les
modles de rfrence sans spcification dun modle possible dinteraction
(ii) les mthodes o des modles spcifiques sont utiliss pour dcrire une
interaction possible (Sorensen et al., 2007).

1.1.4.1. Modles de mlange sans paramtres dinteraction

Parmi les modles de mlange sans paramtres dinteraction, il est possible de
distinguer les approches statistiques graphiques des approches numriques. Des comparaisons
graphiques sont parfois ralises en traant les courbes doses-rponse observes avec les
courbes prdites selon les modles des rfrence (Backhaus et al., 2000 ; Faust et al., 2001)
mais plus gnralement en traant des graphiques appels isobologrammes. (Altenburger et al.,
1990 ; Gessner et al., 1995).
Les approches numriques sont bases sur les diffrences entre les donnes
exprimentales et les donnes prdites grce aux modles de rfrence. Ces comparaisons
numriques ont gnralement t ralises grce des index comme les indices de toxicit, ou
grce au calcul de surface de rponse. Les indices de toxicit ainsi que les surfaces de rponses
utilisent des tests t pour comparer les donnes exprimentales aux donnes attendues par les
modles de rfrences (IA et CA).

14
1) Isobologrammes

La mthode des isobologrammes est une approche exprimentale couramment utilise
qui applique directement la dfinition daddition des concentrations. Un isobologramme est un
graphique en deux dimensions avec sur chaque axe la concentration dun compos. Les
isoboles relient diffrentes combinaisons de doses qui produisent le mme effet (Figure 4).

Dans le cas dune addition des concentrations (donc pas dinteraction) :
1
* *
= +
xb
b
xa
a
CE
c
CE
c

c
i
*
effet total E.
CE
xi
est la concentration de la substance i qui provoque leffet E dans le cas o elle est
applique seule.

Antagonisme
Synergie
C
a
*
C
b
*
Concentration A
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

B
Antagonisme
Synergie
C
a
*
C
b
*
Concentration A
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

B

Figure 4 : Un isobologramme schmatique.

Dans un isobologramme, le modle daddition des concentrations est caractris par une
ligne droite qui relie les concentrations des deux composs A et B ayant un mme effet. Une
dviation de la ligne droite indique un antagonisme (courbe en pointill en rose) ou une
synergie (courbe en pointill en bleu).
15
Certains auteurs se sont attachs reprsenter le modle dindpendance daction (IA)
dans des isobologrammes afin didentifier, comme pour le modle daddition des
concentrations, si les effets sur diffrents modes daction sont antagonistes, synergiques ou
additifs. Si on considre deux substances A et B, leur toxicit en mlange peut tre estime par
lquation suivante (Faust et al., 2004; Pch, 1993 ; Syberg et al., 2008) :

|
|
.
|
\
|
=
) ( 1
) ( 1
) ( 1
b
mix
a
c E
c E
c E

E(c
mix
mix
; E(c
i
i
.
Comme pour le modle dadition des concentrations (CA), les dviations de lisobole du
modle IA sont dtermines graphiquement.
Les isobologrammes prsentent de nombreux avantages comme leur simplicit, leur
flexibilit et leur caractre intuitif (Greco et al., 1995). De nombreuses tudes portent sur
lutilisation des isobologrammes (Cedergreen et al., 2005 ; Kortenkamp et Altenburger, 1998 ;
Syberg et al., 2008). Cependant comme soulign dans la revue concernant lutilisation des
isoboles dans ltude des effets des mlanges ralise par Kortenkamp et Altenburger (1998),
lutilisation des isoboles prsente un dsavantage important quant lvaluation statistique de
la diffrence entre les donnes thoriques et de la ligne dadditivit.

2) Indices de toxicit
Les isobologrammes combins aux indices de toxicit sont couramment utiliss pour
identifier une interaction entre les composants dun mlange (Altenburger, 2003). Les indices
de toxicit sont bass sur le modle daddition des concentrations (CA). Dans le modle CA,
les concentrations de chaque constituant toxique du mlange sont ajoutes pour prdire la
toxicit du mlange. Cependant chaque contaminant peut avoir des potentialits diffrentes.
Ainsi, diffrentes mthodes ont t proposes pour exprimer les concentrations des composs
chimiques du mlange en des doses qui provoquent le mme effet. Ces doses sont appeles
doses qui-toxiques. Diffrents indices de toxicit ont t dvelopps, dont lunit toxique
(Sprague, 1970).
16
Lunit Toxique

Lunit toxique (TU pour Toxic Unit ) a t introduite par Sprague en 1970. Dans
cette approche, la concentration de chaque compos prsent dans le mlange est divise par la
concentration du compos produisant, lorsquil est seul, un effet toxique. Cet effet toxique (par
exemple, la concentration entranant 50% de mortalit) est le mme pour tous les composs du
mlange. Cette mthode permet ainsi de normaliser la concentration de chaque compos du
mlange par rapport une toxicit et donc de convertir la concentration de chaque compos en
unit toxique (TU).
xi
i
i
CE
c
TU
50
=

o c
i
est la concentration du compos i dans le mlange et CE
50xi
la concentration de la
substance qui cause leffet E =50% si cette substance est seule.

Si la somme des units toxiques observes est gale 1, alors le mlange est strictement
additif (CA), il ny a donc pas dinteraction entre les diffrents composs du mlange. Si la
somme des units toxiques est infrieure 1, leffet est infrieur une simple additivit (effet
antagoniste) et sil est suprieur 1, leffet est synergique. Pour tester si leffet observ est
statistiquement diffrent de celui attendu (TU), un test t est souvent ralis (Ince et al., 1999 ;
Mahar et Watzin, 2005).

Autres indices de toxicit

Dautres indices de toxicit ont t dvelopps comme lindex dadditivit (AI), lindex
daugmentation de toxicit (toxicity enhancement index, TEI) dfinis par Marking (1977) et
lindex de toxicit de mlange (mixture toxicity index) dfini par Knemann et al. (1981). Tous
ces indices peuvent tre exprims par rapport lunit toxique. Comme pour lunit toxique,
des tests t sont gnralement utiliss pour comparer les effets observs aux effets attendus par
les modles de rfrences IA et CA.

17
3) Surfaces de rponse de non-interaction
Principe

Les modles bass sur les surfaces de rponses de non-interaction sont calculs partir
des relations dose-rponse des composs seuls pour les deux critres dindpendance daction
et daddition des concentrations (Figure 5).
Par exemple : Soient deux toxiques (c
1
,c
2
) ayant un effet E avec des courbes dose-rponse
pouvant tre dcrites par des fonctions de Hill avec des CE
50
diffrentes (CE
50 x1 et
CE
50 x2

respectivement) et des index de coopration n diffrents (n
1
et n
2,
respectivement).
Equation gnrale de la fonction de Hill :
n n
n
c CE
c
E y
+
=
50
max

Avec E leffet, E
max
leffet maximum, x la concentration du compos toxique et n lindex de
coopration.
Equation des surface de non-interaction (Vettori et al.,2006 ; Goldoni et al., 2007)
Addition de Loewe :
2 1
2 1
1 2
1 1 1
2 50 1 50
1
1 50 2
1
2 50 1
n n
n n
x x
n
x
n
x
E
E
CE CE
E
E
CE c
E
E
CE c
+
|
.
|
\
|
=
|
.
|
\
|
+
|
.
|
\
|

Indpendance de Bliss :
( ) |
.
|
\
|
+ +
+ +
=
2 2 1 1
2 1 2 1 1 2
2 2 50 1 1 50
2 1 2 1 50 1 2 50
n n
x
n n
x
n n n n
x
n n
x
c CE c CE
c c c CE c CE
E

Le modle dadditivit de Loewe est plus complexe appliquer que le critre
dindpendance daction de Bliss. Dans le modle daddition de Loewe, il est impossible
dcrire leffet comme une fonction des concentrations des composs, car leffet du mlange et
les concentrations des composs du mlange ne sont mathmatiquement pas sparables.
Lexpression mathmatique de la surface de rponse de non-interaction peut tre rsolue
par des techniques ditration (logiciel Combitool : Dressler et al., 1999, logiciel Calculsyn
distribu par Biosoft ) ou graphiquement, comme propos par Vettori et al. (2006).

18
x
0
x
0
Concentration
substance 1
R
p
o
n
s
e
Concentration
substance 2
Contrle
x
0
x
0
Concentration
substance 1
R
p
o
n
s
e
Concentration
substance 2
Contrle

Figure 5 : Exemple de surface de rponse (daprs Jonker et al., 2005)

Diffrents programmes (Combitool et Calculsyn) proposent de calculer les surfaces de
rponse. Dans ces programmes, aucun test statistique nest appliqu ; il est considr que toute
diffrence par rapport au modle indique une interaction.

Une mthode danalyse statistique, propose par Goldoni et al. (2007), estime
lincertitude sur les surfaces de rponse calcules pour les deux modles (addition des
concentrations et indpendance daction) partir des incertitudes des paramtres des courbes
doses-rponse des substances isoles. Dans ce modle, les surfaces minimum et maximum
peuvent tre calcules en prenant en compte lerreur standard sur les paramtres des courbes
dose-rponse des composs isols. Sur ces surfaces de non-interaction chaque point thorique a
un intervalle de confiance. Avec un test t de Student, Goldoni et al. (2007) proposent dvaluer
si la diffrence entre les valeurs exprimentales et les valeurs thoriques est significative.

19
1.1.4.2. Modles de mlange avec paramtres dinteraction

Ces modles qui cherchent dcrire les interactions sont plus robustes statistiquement
que ceux dcrits prcdemment. En effet, contrairement aux modles sans interactions,
prsents prcdemment, qui comparent chaque point observ un point attendu, ils permettent
de prendre en compte tous les points observs ensemble dans un mme modle, qui est ensuite
compar aux modles de rfrence.
Diffrents modles dcrivant diffrents types dinteraction des modles de rfrence
dindpendance daction et daddition des concentrations, ont t dvelopps (Carter et al.,
1995 ; Chou et al., 2006 ; Greco et al., 1995 ; Haas et al., 1996 ; Jonker et al., 2005 ; Sorensen
et al., 2007).
Dans ces mthodes, une relation dose-rponse pour chaque substance isole est associe
une relation entre les concentrations de chaque substance isole dans le mlange et les
concentrations des substances isoles ncessaires pour obtenir le mme effet. Les modles de
surface de rponse permettent donc de dfinir de faon indirecte la relation entre la rponse du
mlange et la concentration des substances du mlange. Des tests sont raliss sur ces modles
prenant en compte les interactions. Ces modles incluent un ou plusieurs paramtres qui
dterminent le degr dinteraction.
Parmi les mthodes bases sur les surfaces de rponse qui prennent en compte les
degrs dinteraction, deux mthodes se distinguent des autres : celles propose par Sorensen et
al. (2007) et par Jonker (2005).
La mthode propose par Sorensen et al. (2007) se distingue par le fait quelle combine
les surfaces de rponse avec les isobologrammes, ce qui lui confre de nombreux avantages :
ceux apports par les surfaces de rponse ainsi que les qualits illustratives des
isobologrammes.
La mthode de Jonker et al. (2005) quant elle permet de dfinir un nombre important
de modles dinteractions et de dtecter des interactions dpendantes du niveau de dose et des
ratios de doses tudies.
Cest pourquoi ces deux mthodes seront prsentes par la suite.

20
1) Le modle combin : isobologramme - surface de rponse
(Sorensen et al., 2007)

Le modle statistique propos par Sorensen et al. (2007) combine les surfaces de
rponses avec la mthode des isobologrammes.
Ce modle combine les courbes doses rponses pour chaque mlange dune exprience
avec un modle disobole capable de dcrire une dviation par rapport laddition des
concentrations CA (Figure 6). Il est bas sur un modle de rgression non linaire pour des
designs en raies appliqu aux mlanges binaires.

R
p
o
n
s
e
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

A
C
o
n
cen
tra
tio
n
B
R
p
o
n
s
e
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

A
C
o
n
cen
tra
tio
n
B

Figure 6 : Reprsentation dune surface de rponse visualise par un design en raies.

La CE
50
pour chaque courbe est matrialise par un point sur chaque courbe. La courbe
en trait plein reprsente le modle disobole ajuste et en trait pointill le modle disobole
thorique pour laddition des concentrations (Cedergreen et al., 2007).
La projection des CE
50
et des modles disoboles sur un plan x-y donne un
isobologramme similaire celui reprsent prcdemment (Figure 4).

21
Pour un effet non-additif Hewlett (1969) propose dintgrer un paramtre dinteraction pour
modliser lisobole.
Modle de Hewlett :
1
/ 1
*
/ 1
*
=
|
|
.
|
\
|
+
|
|
.
|
\
|

xb
b
xa
a
CE
c
CE
c

c
i
*
reprsente la concentration de la substance i dun mlange de n compos (i=1n) ayant un
effet total E.
CE
xi
applique seule.

Dans le cas dune isobole asymtrique ou dun fort antagonisme, des modles plus
complexes sont utiliss comme le modle de Vlund (1992). Dans la modlisation des isoboles,
toutes les donnes, y compris les donnes des effets des substances seules, sont prises en
compte.
Modle de Vlund:
1
1
* * *
1
* * *
=
|
|
.
|
\
|
+
|
|
.
|
\
|
+
|
|
.
|
\
|
+
|
|
.
|
\
|

b b a a
xb
b
xa
a
xb
b
xb
b
xa
a
xa
a
CE
c
CE
c
CE
c
CE
c
CE
c
CE
c

c
i
*
effet total E.
CE
xi
applique seule.
i
est le paramtre dinteraction pour la substance i.

Pour valuer quel modle dcrit le mieux les donnes exprimentales, les carts entre le
modle CA et les deux modles non additifs (Hewlett et Vlund) sont valus en comparant
lajustement de chacun des ces deux modles au modle CA en utilisant un test F.

22
2) La mthode de Jonker (2005)

Jonker et al. (2005) proposent une mthode o les effets des mlanges sont compars
aux deux modles de rfrence (CA et IA) et trois autres modles illustrant des dviations
possibles par rapport ces mmes modles.

- Sans dviation par rapport au modle de rfrence CA ou IA
Dans le cas o il ny a pas de dviation, leffet observ du mlange est en adquation
avec les modles de rfrence CA ou IA (Figure 7).
- Avec dviation

Synergie ou Antagonisme
Dans ce premier modle dinteraction, toutes les combinaisons causent un effet plus
important (synergie) ou moins important (antagonisme) que celui calcul pour chaque modle
de rfrence (Figure 7). Dans ce modle nomm S/A, un seul paramtre dinteraction a
intervient.
Dviation dpendante des niveaux de dose
La dviation partir du modle de rfrence diffre faibles et fortes doses. Par
exemple, un antagonisme peut tre observ de faibles doses et une synergie de fortes doses
(Figure 7). Dans ce modle nomm DR, deux paramtres dinteraction a et b ont t dfinis
pour estimer le degr dinteraction.
Dviation dpendante des ratios de doses

La dviation partir de chaque rfrence dpend de la composition du mlange. Dans le
cas de deux substances, un antagonisme peut tre observ quand la toxicit du mlange est
cause principalement par une substance 1, alors quune synergie peut tre observe quand la
toxicit est cause principalement par la substance 2 (Figure 7). Dans ce modle nomm DL,
deux paramtres dinteraction a et b ont t dfinis comme pour le modle DR pour estimer le
degr dinteraction.
23
Contrle
R
p
o
n
s
e
Concentration
substance 1
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0 x
0
x
Concentration
substance 2
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

s
u
b
s
t
a
n
c
e

1
0 x
0
x
Concentration
substance 2
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

s
u
b
s
t
a
n
c
e

1
0 x
0
x
Concentration
substance 2
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

s
u
b
s
t
a
n
c
e

1
0 x
0
x
Concentration
substance 2
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

s
u
b
s
t
a
n
c
e

1
CA S/A DL DR
Contrle
R
p
o
n
s
e
Concentration
substance 1
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0
x
x
Concentration
substance 2
0
0 x
0
x
Concentration
substance 2
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
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s
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b
s
t
a
n
c
e

1
0 x
0
x
Concentration
substance 2
C
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n
t
r
a
t
i
o
n

s
u
b
s
t
a
n
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0
x
Concentration
substance 2
C
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n
c
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0
x
Concentration
substance 2
C
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t
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b
s
t
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Concentration
substance 2
C
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0
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Concentration
substance 2
C
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x
Concentration
substance 2
C
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0
x
Concentration
substance 2
C
o
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n
t
r
a
t
i
o
n

s
u
b
s
t
a
n
c
e

1
CA S/A DL DR

Figure 7: Relations dose-rponse de mlanges binaires illustrant le modle daddition des concentrations et trois
dviations de cette rfrence: pas de dviation (CA), dviation antagoniste (S/A), dviation dpendante du niveau
de dose (DL), et une dviation dpendante du ratio de dose (DR). En haut: 3D surfaces de rponse. En bas: 2D
reprsentation sous forme disobole des surfaces de rponse. La rponse biologique est leve pour le contrle et
dcrot quand les doses de substances augmentent (e.g., survie ou reproduction) (Jonker et al., 2005).

Le dtail des formules de ces diffrents modles sont prsents en annexe 1. Les
modles sont ajusts aux donnes exprimentales (ajustement par maximum de vraisemblance),
les ajustements des diffrents modles sont ensuite compars (grce un test du Chi-Deux). Il
est donc ensuite possible didentifier quel modle explique le mieux les donnes observes et
ainsi dapprhender les interactions possibles.

24
1.1.5. Diffrents types de plans dexprience pour ltude des mlanges

Paralllement aux mthodes, des outils pour lidentification et la quantification des
interactions ont t dvelopps. Certains auteurs se sont attachs dfinir les designs
exprimentaux les mieux adapts aux diffrents outils mis en uvre (Cassee et al., 1998 ;
Coffey et al., 2005 ; Meadows et al., 2002 ) .
Pour des mlanges binaires de deux substances Si, diffrentes concentrations Ci, trois
plans dexpriences de base sont dcrits dans la littrature : le design factoriel, le design en
raies et un design composite combinant le design factoriel et le design en raies (Altenburger,
2003) (Figure 8). Tous ces designs sont bass sur lhypothse que les courbes dose-rponse
sont monotones.
1.1.5.1. Design factoriel

Le design factoriel est utilis pour dterminer la relation dose-rponse dune substance
en prsence dun ou plusieurs niveaux dun autre compos. Il est employ pour dtecter les
effets non additifs de deux substances dans un mlange. Son utilisation a t suggre par
USEPA (2000) comme une des approches valables dans lvaluation des risques des mlanges
chimiques. Les designs factoriels complets (c'est--dire en testant toutes les combinaisons de
concentrations des substances) sont cependant trs coteux et longs mettre en uvre.
1.1.5.2. Design en raies

Le design en raies est bas sur des ratios constants de mlange. Il est celui qui convient
le mieux pour la comparaison des rponses avec le modle daddition des concentrations ; il
permet aussi une interprtation en accord avec le modle daction indpendante si les rponses
individuelles sont estimes.
Un design en raies peut tre utilis pour calculer un index de combinaison ou des
isoboles pour un mlange. Au moins 10 points (3 points sur chaque raie et un point de contrle)
sont ncessaires pour tudier un mlange de deux substances (Cassee et al., 1998).

25
1.1.5.3. Design composite (factoriel et design en raies)

Le design composite combine les aspects du design factoriel et du design en raies
(Figure 8). Il est souvent utilis dans des cas o les relations dose-rponse des substances ne
sont pas parallles; diffrents ratios sont alors appliqus pour diffrents niveaux deffet.

[C1] S1 [C2] S1 [C3] S1 [C4] S1 [C5] S1 [C6] S1
[C1] S2

[C2] S2

[C3] S2

[C4] S2

[C5] S2

[C6] S2

Points de design thoriques pour des mlanges binaires avec un nombre identique dobservation selon les designs : = design factoriel ; =
design en raie; = design composite
Figure 8: Illustration des diffrents designs pour ltude lun mlange binaire de substances (S1 et S2)
diffrentes concentrations allant de C1 C6 selon (selon Altenburger et al., 2003).

Pour dtecter une interaction entre deux composs dun mlange binaire, les donnes
deffet observes sont compares aux donnes prdites par les modles dadditivit. Les deux
modles dadditivit les plus couramment utiliss sont : le modle daddition des
concentrations (CA) et le modle dindpendance daction (IA). Les donnes deffet du
mlange prdites par ces deux modles sont calcules partir des donnes deffet des
substances seules.
Le modle logistique est couramment appliqu ltude des effets de substances seules
et il peut tre envisag dutiliser dans le cadre de ltude des effets du mlange U-Se chez la
daphnie.
Parmi les diffrents outils dvelopps pour identifier les interactions entre les composs
des mlanges, les modles prenant en compte les interactions semblent les plus robustes
statistiquement. En effet, les tests statistiques appliqus dans ces mthodes permettent de
prendre en compte toutes les donnes exprimentales pour les comparer, ensemble, au modle
de rfrence. Ces modles avec des paramtres dinteractions prsentent aussi lavantage de
pouvoir non seulement identifier mais aussi de quantifier les interactions.

26

Parmi ces modles, deux mthodes se distinguent : la mthode de Sorensen et al. (2007)
et celle de Jonker et al. (2005). La mthode de Sorensen et al. (2007) combine les surfaces de
rponse et les isobologrammes et prsente donc de nombreux avantages cependant elle ne
permet didentifier que les carts avec le modle daddition des concentrations. La mthode
propose par Jonker et al. (2005) prsente, quant elle, lavantage de sintresser aux deux
modles de rfrence (CA et IA) et est donc complmentaire celle de Sorensen et al. (2007).
Utilise en parallle celle de Sorensen et al. (2007), elle permettrait de confirmer les rsultats
obtenus grce aux deux mthodes pour le modle de CA.

Les mthodes slectionnes pour lidentification et la quantification des interactions,
impliquent la mise en place dun design exprimental important. Il semble donc ncessaire
dtablir un plan dexprience, comme le design en raies, afin doptimiser le nombre de
conditions tester.

27
1 1. .2 2. . M Mo od d l le e b bi io ol lo og gi iq qu ue e t tu ud di i : : L La a d da ap ph hn ni ie e

Daphnia magna est un microcrustac deau douce, de l'ordre des cladocres,
recommand en tant quespce modle dans diffrents bioessais standardiss pour lvaluation
de risques chimiques (ASTM, 2004; ISO, 1996; OCDE, 1998). Ce modle biologique a t
choisi car les daphnies sont des organismes dont la manipulation et llevage sont rendus aiss
par leur taille relativement petite, leur cycle de vie court, leur fcondit leve et leur mode de
reproduction par parthnogense (Koiviso, 1995). Dans les cosystmes aquatiques deau
douce, les daphnies ont une place importante dans les transferts de matire et dnergie et
occupent la place de consommateur primaire.

1.2.1. Biologie et morphologie

Le corps de la daphnie est protg par une carapace transparente (Figure 9). Les yeux
composs, sont fusionns sur le plan sagittal et constituent un il mdian, mobile dans une
cavit sans communication vers lextrieur. Les antennes birames assurent une progression
par -coups do lappellation de Puce deau. Les pattes thoraciques assurent la filtration du
plancton. Le cur en forme de sac ne prsente quune paire dostioles. La respiration est
assure par la carapace, les pattes et lintestin postrieur qui aspire et rejette priodiquement
leau (Beaumont et Cassier, 2004).

Figure 9 : Femelle Daphnia magna de 21 jours. Photographie ralise avec un appareil Nikon Coolpix 8400
mont sur une loupe binoculaire base diascopique Nikon SMZ 1000. (Zeman, 2007)
1 mm
ufs
tube digestif
cur
il
pattes
thoraciques
antennes
28
La partie dorsale constitue une chambre de maturation o sont dposs les ufs lors de
chaque ponte. Ces ufs proviennent des ovaires situs de part et d'autre de l'intestin. Les
ovaires sont plus ou moins apparents en fonction de lavance dans un cycle de ponte (Figure
10). Dans cette chambre, les ufs se transforment en juvniles qui sont ensuite relchs dans le
milieu extrieur. La daphnie possde un cur situ dorsalement. Le systme nerveux est
caractris par un ganglion crbral, qui est situ prs du systme digestif et de lil. (Ebert,
2005).

1mm
Ovaires
1mm
Ovaires

Figure 10 : Daphnie de 15 jours avec ovaires forms. Photographie ralise avec un appareil Nikon Coolpix 8400
mont sur une loupe binoculaire base diascopique Nikon SMZ 1000. (Zeman, 2007)

Le systme digestif de la daphnie est assez simple, avec un tube digestif et deux
diverticules (Figure 11). Le tube digestif est plus ou moins tubulaire et est compos de trois
parties : lsophage, une partie mdiane et terminale de lintestin. La partie mdiane de
lintestin est constitue de cellules pithliales et possde des microvillosits. Cette partie
permet la digestion de la nourriture ainsi que lassimilation des nutriments. Les deux
diverticules auraient, quant eux, un rle dans la production de fluides digestifs (Ebert, 2005).
diverticule
intestin
0,5mm
diverticule
intestin
diverticule
intestin
0,5mm

Figure 11 : Intestin dissqu de Daphnia magna. Photographie issue de Ebert (2005).
Sur la gauche, on peut distinguer les deux diverticules. Lsophage nest pas prsent. Lintestin se termine
lextrmit droite de la photographie. Les formes sombres dans le tube digestif sont des composs partiellement
digrs.
29
Chez la daphnie, peu dtudes ont t ralises sur les effets de substances toxiques sur
les cellules et les tissus. Nanmoins celles qui existent, portant sur les effets du slnium et de
cyanobactries, ont pu mettre en vidence des effets dltres sur les tissus du systme digestif
de la daphnie, que ce soit au niveau de lintestin ou des diverticules (Johnston et al., 1989 ;
Nogeria et al, 2006 ; Schultz et al., 1980).

1.2.2. Cycle de vie de la daphnie

Les cladocres pullulent dans les tangs, les lacs, les mares et les ruisseaux o ils se
reproduisent par parthnognse cyclique. De nombreuses gnrations de femelles issues
dufs parthnogntiques dveloppement rapide alternent avec une gnration bisexue
produisant des ufs fconds, durables (ufs dhiver ou phippie) (Figure 12).

Cycle asexu
Cycle sexu
Fille
parthnogntique
Fils
parthnogntique
phippie
Formation
dun uf
haplode
accouplement
closion
aprs la
diapause
Cycle asexu
Cycle sexu
Fille
parthnogntique
Fils
parthnogntique
phippie
Formation
dun uf
haplode
accouplement
closion
aprs la
diapause

Figure 12 : Schma du cycle de vie de la daphnie daprs Ebert (2005)

30
En effet, en conditions favorables, les daphnies se reproduisent par reproduction
asexue : la parthnognse. Les femelles existent seules et engendrent partir d'ovules (non
fconds) d'autres daphnies filles identiques gntiquement leur mre. Les gnrations
parthnogntiques, sans apparition de mles, se succdent tant que les conditions du milieu
restent favorables. En condition favorable, les daphnies deviennent matures, cest--dire ont
leur 1
re
ponte, au bout de 6-7 jours (Figure 13). Les juvniles de cette premire ponte restent
dans la poche incubatrice pendant 3 4 jours, le temps de leur dveloppement (voir annexe 2
pour les diffrentes tapes de dveloppement). Les juvniles issus de la 1
re
ponte sont donc
librs lorsque la daphnie est ge de 9 10 jours. Au plus tard une heure aprs cette libration,
la daphnie mue et dpose une nouvelle ponte dans sa poche incubatrice. Une fois la daphnie
devenue mature, elle pond tous les 3 4 jours jusqu sa mort (50-70 jours).

Juvnile
g de moins
de 24h
6-7 jours
Ponte 1 Ponte 2 Ponte 3 Ponte 4 Ponte 5
3-4 jours 3-4 jours 3-4 jours 3-4 jours 3-4 jours
Ponte 6
21-27j
Libration des juvniles
de la ponte 1
de la ponte 3
de la ponte 2
de la ponte 4
de la ponte 5
Juvnile
g de moins
de 24h
6-7 jours
Ponte 1 Ponte 2 Ponte 3 Ponte 4 Ponte 5
3-4 jours 3-4 jours 3-4 jours 3-4 jours 3-4 jours
Ponte 6
21-27j
de la ponte 1
de la ponte 3
de la ponte 2
de la ponte 4
de la ponte 5

Figure 13: Reproduction de la daphnie en condition favorable par parthnognse

Si les conditions deviennent dfavorables (manque de nourriture, pollution chimique,
densit excessive, asschement du volume d'eau, dsoxygnation svre, abaissement de la
temprature, etc.), les daphnies femelles donnent alors naissance des mles. Ils sont plus
petits et reconnaissables l'absence de poche incubatrice (Figure 14).

La reproduction peut alors tre sexue. Les femelles fcondes portent dans la poche
incubatrice une phippie (Figure 15). Ces ufs de rsistance membrane paisse n'closent
31
pas immdiatement. Ils restent enferms dans leur membrane protectrice qui durcit et s'paissit.
Ils donneront naissance, lorsque les conditions deviennent nouveau favorables, une
population gntiquement diffrente des daphnies mres (Chvre, 2000).

1mm 1mm

Figure 14 : Photographie dun mle 21 jours Figure 15 : Photographie dune phippie
Photographies ralises avec un appareil Nikon Coolpix 8400 mont sur une loupe binoculaire base
diascopique Nikon SMZ 1000. (Zeman, 2007)

1mm
32
1.2.3. Etude des effets aigus et chroniques de substances

Ltude de la rponse des organismes vivants un stress peut se faire diffrents niveaux
dorganisation allant de lchelle molculaire lchelle de lindividu, jusqu lchelle des
populations ou mme des communauts (Figure 16). En cotoxicologie, les tudes ralises ont
pour but dvaluer les effets dune substance sur les cosystmes. En effet, contrairement la
toxicologie humaine, lunit biologique visant tre protge nest pas lindividu mais la
population. Avant que les effets ne soient visibles lchelle de la population, il est souvent
possible de mesurer les effets des niveaux dorganisation infrieurs tels que lindividu, voire
des niveaux tissulaires, cellulaires et mme molculaires.

Figure 16: Les diffrents niveaux dorganisation (modifi daprs van der Oost et al., 2003)
Niveau
dorganisation
biologique
Cellule
Daphnia magna
1 mm
Population
Individu
Molcule
Tissu
Pertinence
cologique
Temps de
rponse
Sensibilit
33

Pour valuer les effets au niveau dune population, la dmarche la plus commune est
dtudier les effets sur les diffrents traits dhistoire de vie des individus pour ensuite les
intgrer dans des modles de dynamique de population.
Une approche nergtique permet quant elle dvaluer les effets sur ltat de sant des
organismes en sintressant aux perturbations des processus mtaboliques. Dans cette
approche, les effets mesurs peuvent aussi tre intgrs dans des modles de budget
nergtique dans le but dvaluer les effets sur la population.

1.2.3.1. Etude des effets au niveau de lindividu

Pour ltude des effets au niveau de lindividu, on peut distinguer les tudes ralises
sur les ufs, les juvniles et celles sur les daphnies adultes.

Effets sur le dveloppement des ufs

Les tests visant tudier les effets de substances sur le dveloppement des ufs de
daphnies sont peu nombreux (Abe et al., 2001 ; Baird et al., 1991 ; Bodar et al., 1989 ; Kast-
Hutcheson et al., 2001 ; Ohta et al., 1998 ; Sobral et al., 2001). Lors de ces tests, les ufs sont
extraits de la chambre de ponte et leur dveloppement est suivi jusqu ce quils atteignent le
stade de juvniles. Les malformations de dveloppement ainsi que les retards de
dveloppement sont les deux critres deffet observs lors ces tests. Les diffrents stades de
dveloppement dfinis par Kast-Hutcheson et al. (2001) sont prsents en annexe 2.
Ces tests ont t utiliss pour tudier la toxicit de diverses substances comme laniline,
lebromure de sodium, le cadmium, le zinc, le cuivre ou le plomb (Abe et al., 2001 ; Baird et al.,
1991 ; Bodar et al., 1989 ). Sobral et al. (2001) suggrent que ces tests bass sur le
dveloppement des ufs permettraient dvaluer dans un temps trs court, les effets subltaux
classiquement tudis dans les tests 21 jours sur des adultes et proposent mme dutiliser ce
test ufs comme une alternative au test 21 jours.

34
Effets sur la survie des juvniles

Les tests classiques raliss sur les juvniles visent valuer les effets aigus dune
substance. Ces tests sont normaliss (ASTM, 2004 ; ISO 1996). Ils consistent dterminer la
concentration de lchantillon qui cause 50% de mortalit aprs 24h et 48h dexposition (CE
50
:
concentration conduisant 50% deffet) dans un systme statique et dans des conditions
contrles. Lors de ces tests, les daphnies juvniles sont considres comme mortes si elles
restent immobiles plus de 10s aprs une lgre stimulation. Pour dterminer cette concentration
(CE
50
), des daphnies sont exposes une srie de concentrations croissantes dune substance.
Pour chaque concentration, et aprs 24 et 48h dexposition, le nombre de daphnies survivantes
par concentration est observ et le pourcentage de mortalit est dtermin.
Ces tests sont trs couramment utiliss dans une premire approche pour valuer les
effets aigus de substances sur les cosystmes aquatiques car ils prsentent de nombreux
avantages : ils sont relativement faciles mettre en uvre et permettent dans des temps trs
courts (24 ou 48h) de tester un trs grand nombre de conditions.

Effets sur la croissance et la reproduction

Pour valuer la toxicit chronique dune substance, des tests sont classiquement raliss
sur les 21 premiers jours de la vie de daphnies. Comme pour les tests aigus, ces tests sont
normaliss (OCDE, 1998). Lors de ce test, les daphnies sont exposes une srie de
concentrations croissantes dune substance dintrt. Diffrents paramtres peuvent tre tudis
comme la mortalit, la fcondit ou la croissance. Plus particulirement, le nombre de juvniles
produits par daphnie en 21 jours est le critre deffet couramment utilis pour valuer les effets
chroniques. Comme pour le test prcdent ralis sur les juvniles, la CE
50
reproduction,
reprsentant la concentration ncessaire pour entraner une baisse de 50% de fcondit, est
dtermine.
Cependant comme ces tests reproduction 21 jours sont assez longs mettre en uvre et
raliser, et donc assez coteux, diffrents auteurs proposent de raccourcir ce test 21 jours 7
jours afin dtudier les effets uniquement sur la 1
re
ponte (Guilhermino et al., 1999 ;
Santojanni, 1995). Dans le cadre de lvaluation des effets chroniques dun mlange binaire sur
la daphnie, Barata et al., (2007) utilisent eux aussi un test raccourci 7 jours. Le test 7 jours
semble donc une alternative intressante au test 21 jours.
35
1.2.3.2. Etude des effets au niveau de la population

Lhistoire de vie des organismes peut tre dcrite par diffrents traits de vie comme la
longvit, lge la maturit sexuelle et la fcondit. Ces mesures au niveau de lindividu
peuvent tre intgres dans des modles de dynamique de population, comme par exemple dans
des matrices de Leslie, afin dvaluer les effets au niveau de la population. Une altration des
traits de vie des organismes peut donc avoir des effets rapides et directs sur la population
comme une diminution de leffectif, de la biomasse ou une altration de la structure de la
population (Durou et al., 2008).

Il existe divers modles de dynamique de population plus ou moins complexes. Le
modle de Leslie prsente lavantage dtre simple et facile mettre en uvre.
Ce modle est un modle de dynamique de population structure en classes dge qui
permet de suivre lvolution de leffectif dune population au cours du temps. Dans ce modle
matriciel, le systme est considr comme ferm; la population nest pas limite par les
ressources du milieu et il ny a pas de phnomnes de densit-dpendance.
Ce modle repose sur trois variables :
lge (variable continue), divis en classes qui sont numrotes de 1 n,
le temps (variable discrte), not t,
et le pas de temps, gal la dure de chacune des classes dge, c'est--dire que de t t+1
tous les individus de la classe dge i passent la classe dge i+1.

Le cycle de vie est reprsent par les classes dge (schmatises sous forme de nuds)
et les transferts dindividus dune classe lautre (schmatiss par une flche).
La structure du modle est la suivante (Figure 17):

1 +1 2 +1 +1
P
1
P
F
+1
11 +1 +1 22 +1 +1 +1 +1
P
1
P
F
+1

Figure 17 : Schma reprsentant la structure dune population (voir la signification des symboles dans le texte)
Avec : : lge de la premire reproduction, : lge de la dernire reproduction et : la longvit maximum.
Les termes F
reprsentent les taux de fcondit et les termes P

1
P

les taux de survie.

36
Grce ce modle assez simple, il est possible de mettre en vidence les effets mesurs
dune substance sur des paramtres lchelle de lindividu (fcondit, survie ) qui ont le
plus dimpact sur la dynamique des populations (Stark et al., 2004).

1.2.3.3. Etude des effets au niveau nergtique

1) Les bilans nergtiques

Chez tous les organismes vivants, lensemble des processus biochimiques et
physiologiques est troitement li au mtabolisme nergtique. Chez les animaux, lnergie
quils acquirent vient de la nourriture qui est ingre puis assimile. Cette nergie acquise par
les organismes est alloue diffrentes fonctions biologiques telles que la maintenance, le
stockage de rserves, la reproduction et la croissance somatique (Baillieul et al., 2005, Glazier
et Calow, 1992 ; Knops et al., 2001). Ces diffrents processus peuvent donc tre relis au sein
de modles nergtiques (Figure 18).

Ingestion
Respiration
Croissance
Reproduction
Energie
Rserves
Ingestion
Respiration
Croissance
Reproduction
Energie
Rserves

Figure 18 : Modle nergtique au niveau individuel

37
2) Lhypothse du cot mtabolique

Lapproche nergtique est base sur lhypothse que les organismes ne peuvent pas
accrotre indfiniment leur acquisition dnergie, en raison la fois de la limitation de la
nourriture dans le milieu et des contraintes propres aux organismes. Une hausse des dpenses
nergtiques pour le mtabolisme de base afin de faire face un stress endur peut conduire
une rduction de linvestissement nergtique dans la croissance ou la reproduction par
exemple. Toute augmentation des cots mtaboliques associe lexposition un stress
intervient donc aux dpens de processus important dans la dynamique de population (Calow et
Sibly, 1990; Calow, 1991).

3) Les diffrents paramtres nergtiques

Tous ces paramtres (nutrition, rserves nergtiques et nergie alloue aux processus
de fcondit et croissance) peuvent tre intgrs dans des modles nergtiques comme le DEB
(Dynamic Energy Budget) afin dvaluer les effets la fois au niveau de lindividu et celui de
la population. Cependant ces modles sont assez complexes et demandent une grande quantit
de donnes.
Diffrents paramtres nergtiques simplifis sont couramment utiliss en
cotoxicologie. Ils ne permettent pas dvaluer les effets au niveau de la dynamique des
populations mais davoir une ide de ltat de sant des organismes. Parmi les diffrents
paramtres lis au mtabolisme nergtique, les plus connus sont (Figure 19) :
- la charge nergtique en adnylate (CEA)
- les rserves nergtiques
- lallocation nergtique cellulaire (AEC)
- lallocation dnergie la croissance et la reproduction (AECR)

Ces diffrents paramtres, permettant dvaluer ltat de sant des organismes grce
une approche nergtique, peuvent tre mesurs diffrents niveau dorganisation biologique
et permettent ainsi dobtenir des rponses plus ou moins prcoces et avec plus ou moins de
pertinence au niveau cologique.
38

Figure 19 : Marqueurs deffet en lien avec la mtabolisme nergtique et la bionergtique selon le niveau
dorganisation (daprs Durou et al., 2008).

La charge nergtique en adnylate (CEA)

La charge nergtique en adnylate est classiquement dfinie comme la mesure de
lnergie disponible, au sein dun organisme vivant sous la forme adnylique (Atkinson et
Walton, 1967). Elle est calcule partir des concentrations en ATP, ADP et AMP et permet
destimer ltat physiologique des cellules (tat optimal, tat perturb de faon partielle, tat
prsentant des perturbations svres) (Thompson et al., 1987). La CEA est un des
biomarqueurs les plus anciennement utiliss. Durou et al., dans leur synthse de 2008,
concluent que les valeurs de CEA sont corrles certains traits de vie mais quen cas
datteinte svre, ces valeurs peuvent varier fortement, vraisemblablement en raison dune
multiplication des atteintes physiologiques des organismes.

Les rserves nergtiques

Chez les animaux, les principales formes de stockage de lnergie sont reprsentes par
le glycogne et les lipides. Lorsque les besoins sont importants, par exemple en priode de
reproduction ou la suite dun stress, ces rserves nergtiques peuvent tre mobilises
(Thmopson et Couture, 1991 et 1993). Lors dun stress, une mobilisation des rserves pour
alimenter des mcanismes de compensation ou de dfense peut entraner une rduction des
Indice de condition
Respiration
Allocation nergtique
la croissance et la
reproduction (AECR)
Allocation nergtique
cellulaire (AEC)
Macro-
molcules
Sub-
cellulaire
Cellulaire Tissulaire Bio-
nergtique
Individu Population Communaut
Densit
Structure taille ge
Sex-ratio
Diversit gntique
Taux de croissance
Rserves nergtiques
Charge nergtique en
adnylates (CEA)
39
rserves dun organisme (Mayer et al., 2002). Les mesures de rserves nergtiques peuvent
alors tre utilises pour valuer leffet dun stress.

Lallocation nergtique cellulaire (AEC)

Alors que la charge en adnylates ou les rserves nergtiques rendent compte de
lnergie disponible des organismes, lAEC est un paramtre qui intgre lnergie disponible et
aussi lnergie dpense par les organismes (Durou et al., 2008). Cette mesure dAEC a t
dveloppe pour valuer les effets dun stress sur le budget nergtique (De Coen et Janssen,
1997). Elle est base sur lvaluation biochimique de changements des rserves nergtiques
(composition en sucres, protines et lipides) et de la consommation dnergie (respiration
cellulaire). Cette mesure dallocation dnergie cellulaire (AEC) permet donc dvaluer les
effets dun stress toxique sur le budget nergtique des organismes et ainsi de corrler des
mesures nergtiques des niveaux dorganisation suprieurs (De Coen et Janssen, 2003).

Lallocation dnergie la croissance et la reproduction (AECR) ou scope for
growth (SFG)

Lors dun stress, un organisme met gnralement en place des processus
compensatoires, qui requirent de lnergie (Knops et al., 2001). Ainsi, le taux mtabolique se
retrouve accru lors dune exposition une substance toxique (Calow, 1991). LAECR
reprsente la fraction dnergie assimile qui nest pas consomme par le mtabolisme de base
et qui est alors disponible pour la croissance et la reproduction (Smolders et al., 2003). Une
AECR positive indique un gain dnergie net et indique ainsi un excs dnergie disponible qui
peut tre investi dans les rserves nergtiques, la croissance ou la reproduction. Une AECR
ngative indique que lanimal est en train de perdre ses rserves nergtiques. LAECR est une
mesure qui a t frquemment utilise pour tudier les effets de conditions environnementales
ou les effets de pollutions sur les conditions physiologiques des organismes mais aussi comme
indicateur de la croissance et de la reproduction (Baillieul et al., 2005 ; Calow et Sibly, 1990 ;
Smolders et al., 2002 ).

40
Gnralement lassimilation par individu et la consommation doxygne lie au
mtabolisme de base par individu changent en fonction de la taille des organismes (Kooijman,
2001). En accord avec lhypothse du cot mtabolique, la croissance est affecte par un stress
environnemental. Les animaux stresss sont donc gnralement plus petits. LAECR chez des
organismes peut se retrouver rduite par rapport celle mesure chez des tmoins lorsque les
organismes sont exposs un stress, mais aussi lorsque leur taille est rduite. Il est donc
difficile de distinguer leffet direct du stress et de leffet d uniquement la taille. Une AECR
masse spcifique est particulirement intressante car elle permet de saffranchir de leffet li
la taille des organismes (Baillieul et al., 2005).

La revue bibliographique ralise sur les diffrents critres deffets mettant en vidence
la toxicit de substances sur la daphnie D.magna, a permis de dfinir les critres retenus dans le
cadre de la prsente tude.
Les deux tests les plus couramment utiliss pour tudier les effets de substances seules
chez les daphnies, sont les tests aigus ainsi que le test de reproduction 21 jours.
Pour tudier les effets des mlanges, le test aigu semble particulirement adapt car il
permet de tester un grand nombre de conditions dans un temps relativement court compatible
avec un grand nombre de conditions tester et un nombre de rplicats important.
Le test de reproduction 21 jours classique semble quant lui trs laborieux utiliser
dans le cadre dexprimentations visant identifier les interactions entre les diffrents
composants dun mlange. Il existe deux alternatives au test reproduction 21 jours : le test
reproduction raccourci 7 jours et le test ufs . Ils permettent sur un temps plus court de
tester un plus grand nombre de conditions quavec le test classique 21 jours tout en valuant
tout de mme les effets subltaux pertinents dun point de vue cologique. Le test raccourci 7
jours permet comme le test 21 jours dtudier les effets grce diffrents paramtres comme la
fcondit, la croissance, la respiration ou lingestion et est donc particulirement intressant.
Grce ces diffrentes mesures il est possible de calculer des bilans dnergie simples. Parmi
les paramtres nergtiques permettant de faire des bilans dnergie simplifis, on peut citer les
mesures dallocation nergtique cellulaire (AEC) et les mesures dallocation la croissance et
la reproduction (AECR). Ces deux mesures pourront tre appliques pour valuer les effets
41
de diverses substances chez la daphnie. La mesure dAEC ncessite plusieurs dizaines de
daphnies pour chaque replicat (De Coen et al., 1995) alors que la mesure dAECR peut se faire
sur une seule daphnie grce des mthodes de mesure non destructives comme propos par
Alonzo et al. 2006. Ce test 7 jours permettrait donc grce la mesure de lAECR dvaluer
ltat de sant des organismes. Ce test raccourci semble donc trs intressant dvelopper et
mettre en uvre dans le cadre de ltude des effets des mlanges simples.

42
1 1. .3 3. . C Co on nt ta am mi in na an nt ts s t tu ud di i s s : : l l u ur ra an ni iu um m e et t l le e s s l l n ni iu um m s se eu ul ls s e et t e en n
m m l la an ng ge e

1.3.1. Uranium

1.3.1.1. Sources et concentrations en U dans lenvironnement

Luranium est un lment ubiquiste dans les eaux naturelles ltat de trace, avec des
niveaux de concentration allant de 0,02g.L
-1
6g.L
-1
. De faon naturelle, des concentrations
leves duranium peuvent atteindre localement 2 mg.L
-1
, refltant principalement la
composition des roches sous-jacentes (Bonin et Blanc, 2001; WHO, 2001). Les concentrations
duranium peuvent aussi tre accrues dans certains cosystmes cause des activits
anthropogniques comme les processus dextraction et dexploitation de luranium. Dans ces
zones dexploitation de luranium, des teneurs en uranium pouvant atteindre 10, voire 20 mg/L
ont t mesures dans leau (Ragnarsdottir et Charlet, 2000).

1.3.1.2. Formes chimiques et proprits nuclaires

1) Proprits chimiques

Luranium (symbole U, numro atomique 92) appartient au groupe des actinides et est
llment naturel le plus lourd. Les deux tats doxydation majeurs de lU sont (+VI) et (+IV)
parmi les 4 tats doxydation que possde lU (allant de (+III) (+VI)). En milieu aqueux,
ltat dquilibre, ltat doxydation de luranium dpend des conditions oxydo-rductrices du
milieu et du pH (Figure 20).

43
p
e
pH
UO
2
(CO
3
)
3
4-
U
O
2
(
C
O
3
)
2
2
-
U
O
2
(
O
H
)
2
(
a
q
)
U
O
2
O
H
+
UO
2
2+
U
O
H
3
+
U
4
+
U
3+
U (OH)
4
p
e
pH
UO
2
(CO
3
)
3
4-
U
O
2
(
C
O
3
)
2
2
-
U
O
2
(
O
H
)
2
(
a
q
)
U
O
2
O
H
+
UO
2
2+
U
O
H
3
+
U
4
+
U
3+
U (OH)
4
p
e
pH
UO
2
(CO
3
)
3
4-
U
O
2
(
C
O
3
)
2
2
-
U
O
2
(
O
H
)
2
(
a
q
)
U
O
2
O
H
+
UO
2
2+
U
O
H
3
+
U
4
+
U
3+
U (OH)
4

Figure 20 : Diagramme pe-pH de luranium obtenu avec le logiciel J-Chess, la base de donnes thermodynamique
dcrite dans le chapitre 3 et avec [U]= 300g.L
-1
dans le milieu M4. La zone en rouge reprsente la zone de pH et
de potentiel doxydo-rduction susceptible dtre rencontre dans lenvironnement.

Dans des milieux oxydants, lion uranyle (+VI), UO
2
2+
est lespce la plus stable et
cest aussi la forme prdominante dans lenvironnement (Sheppard, 2005). Lion uranyle se
complexe facilement avec les carbonates, les phosphates et les ions sulfates. La spciation dun
lment dans un milieu, et en particulier celle des mtaux, dpend des paramtres physico-
chimiques du milieu comme la duret, lalcalinit, le pH ou la prsence de ligands (organiques
ou inorganiques). La rpartition de luranium en fonction des diffrentes espces formes
dpend du pH de la solution, de la concentration en ligand et de la concentration en uranium
total.
Luranium, dans des conditions oxydantes, peut aussi facilement former des complexes
organiques avec des ligands organiques et des substances humiques ou fulviques de faible
poids molculaire. (Sheppard, 2005).
Dans des conditions rductrices, comme celles trouves dans les eaux anoxiques et dans
les sdiments, lU est sous la forme ttravalente U (+IV) qui a tendance se lier avec les
matriaux organiques, prcipiter et, de ce fait, a tendance tre immobile (Gascoyne, 1992).
44
2) Proprits radiologiques

Luranium est un radiolment qui possde dix-sept isotopes, dont trois seulement sont
prsents ltat naturel :
234
U,
235
U et
238
U (WHO, 2001). Leur abondance naturelle est
rsume dans le tableau 3 :
Tableau 3: Proprits nuclaires des 3 isotopes constitutifs de luranium naturel, (daprs Colle et al., 2001)

Isotope Abondance Priode Activit Energie des principaux
naturelle en % radioactive spcifique rayonnements mis en KeV
en annes en Bq.g
-1
(% dmission)

234
U 0,006 2,45.10
5
2,30. 10
8
4777 (72%) ; 4723 (23%)

235
U 0,719 7,13.10
8
8,00. 10
4
4397 (57%) ; 4367 (18%)
186

238
U 99,275 4,47.10
9
1,24. 10
4
4196 (77%) ; 4149 (23%)

1.3.1.3. Effets sur les organismes

1) Bioaccumulation

La bioaccumulation des lments traces comme luranium peut avoir lieu selon deux
voies diffrentes : la voie de contamination directe et la voie trophique.

- Voie de contamination directe
Pour la voie directe, diffrentes tudes ont montr que la toxicit dun mtal ntait pas
corrle sa concentration totale dans un milieu mais sa fraction biodisponible pour les
organismes. Deux modles sont couramment utiliss pour valuer la toxicit chimique de
mtaux : le modle de lion libre (FIAM, Free-Ion Activity Model) ainsi que le modle BLM
(Biotic Ligand Model). Ces deux modles, assez proches, proposent dattribuer la toxicit dun
mtal sa concentration sous forme dion libre plutt qu sa concentration totale.
Dans le modle de lion libre (FIAM), formul par Morel (1983), la toxicit ou la
biodisponibilit dun mtal (lentre dun mtal dans un organisme) varie en fonction de la
concentration de lion mtallique libre en solution. Le modle du BLM, quant lui, intgre la
spciation de llment en solution, la formation du complexe mtal/ligand biotique et la
rponse toxique induite par le complexe (Denison, 2004 ; De Schamphelaere et Janssen, 2002;
Paquin, 2002).
45
De prcdentes tudes sur la toxicit de luranium indiquent que la bioaccumulation
(Fortin et al., 2004) ainsi que la toxicit de luranium (Markich, 1996) sont proportionnelles
la concentration en mtal sous forme ion libre (UO
2
2+
). Cependant, des tudes plus rcentes ont
rapport un certain nombre dexceptions quand le pH varie (Fournier et al., 2004 ; Fortin et al.,
2007 ; Markich et al., 2000 ).
Lorsque le pH augmente, dune part la complexation de lion uranyle par les
hydroxydes et les carbonates est plus importante et rduit ainsi la toxicit de luranium mais
dautre part, la comptition de lion libre (UO
2
2+
) avec les protons diminue et peut ainsi
augmenter la biodisponibilit de luranium (Fortin et al., 2004).
Cependant, Fortin et al. (2007) ont montr quune simple comptition proton mtal ne
permet pas dexpliquer les interactions uranium-algue lorsque le pH varie et suggrent un effet
physiologique qui entranerait une augmentation du taux dinternalisation ou une augmentation
du nombre de transporteurs spcifiques avec une augmentation du pH.
Markich et al. (2000) , quant eux, concluent qu la fois lion libre UO
2
2+
mais aussi la
forme hydroxyle UO
2
OH
+
seraient toxiques, ce qui pourrait expliquer leffet pH observ.
Ces diffrentes tudes suggrent que le lien entre la spciation et la biodisponibilit de
luranium pourrait tre plus complexe que celui attendu par les modles du FIAM et BLM.

- Voie trophique
Peu dtudes ont t ralises sur la bioaccumulation de luranium chez les
consommateurs primaires par des transferts via la chane trophique. Sur dautres mtaux
comme le cadmium, quelques tudes ont t ralises comme celle Barata et al. (2002) et celle
de Taylor et al. (1997). Dans ltude ralise par Barata et al. (2002), il a pu tre mis en
vidence que lassimilation de cadmium tait plus efficace par la voie trophique (13% contre
0,3% par le milieu), bien que les concentrations dans le milieu soient plus importantes que
celles dans la nourriture. Taylor et al. (1997) ont montr que la contamination indirecte par
lingestion tait significative. La fraction du mtal (cadmium) adsorbe la surface de lalgue
pourrait tre suffisante pour contaminer des daphnies et augmenter les effets subltaux comme
linhibition du taux dingestion. Une tude ralise par S. Bourrachot (2005) portant sur les
effets de luranium sur la daphnie par voie trophique a montr une diminution de lingestion
sans mettre en vidence deffet sur la reproduction ni sur la mortalit.

46
2) Donnes de toxicit aige

La plupart des donnes dcotoxicit de luranium sur diffrents organismes deau
douce concernent les effets aigus. Ces donnes montrent une trs forte variabilit en fonction
des caractristiques physico-chimiques et des paramtres tudis.

En effet, Sheppard et al. ont montr dans leur synthse bibliographique de 2005, que la
sensibilit des organismes luranium tait dpendante de plusieurs paramtres
environnementaux comme lalcalinit, due la complexation de lion uranyle UO
2
2+
avec les
carbonates, et la duret, due la complexation avec le calcium et le magnsium.
Ils ont aussi pu mettre en vidence, partir des donnes de la littrature sur la toxicit de
luranium chez les poissons, une relation significative entre la mortalit des poissons et la
duret du milieu :

CL
10
= - 0,52 + 0.96 log
10
(duret du milieu)
avec la CL
10,
la concentration entranant 10% de ltalit.

A partir des donnes de la littrature concernant le crustac cladocre Daphnia magna
(Poston et al., 1984 ; Barata et al., 1998), une mme influence de la duret du milieu sur la
toxicit de luranium semble exister. En effet, Poston et al. (1984) dcrivent une toxicit aige
de l U (48h CL
50
) allant de 5,3 74,3 mg.L
-1
U dpendante de la composition du milieu des
tests. Barata et al. (1998) rapportent une valeur de CL
50
48h similaire celle de Poston et al.
allant de 5,87 25,4 mg.L
-1
U, dpendante du clone de daphnie tudi mais aussi de la
composition chimique du milieu.

Les donnes disponibles sur la toxicit aige de luranium sur les invertbrs deau
douce montrent aussi des valeurs de toxicit assez variables en fonction des espces et des
paramtres tudis. Les donnes de toxicit aige rapportes pour divers invertbrs sont
comprises entre 0,16 et 70 mg.L
-1
, (Barata et al., 1998; Bywater et al., 1991; Kuhne et al.,
2002; Poston et al., 1984; Semaan et al., 2001) et sont prsentes en annexe 3.

47
3) Donnes de toxicit chronique

Les donnes de toxicit chronique de luranium sur les invertbrs deau douce sont, quant
elles, trs limites. Une LOEC reproduction 5 jours chez Moinodaphnia macleayi a t
observe 20-49 mg.L
-1
U (Semaan et al., 2001) alors que chez Ceriodaphnia dubia elle tait
de 3,91 mg.L
-1
U (Kuhne et al., 2002). Dautres rsultats suggrent une plus grande sensibilit
de Ceriodaphnia dubia avec une EC
25
sur la reproduction 7 jours de 3 g.L
-1
U (Pickett et al.,
1993). Chez Daphnia magna une seule tude sest intresse aux effets chroniques (Poston et
al., 1984). Dans leur tude, ils ont pu montrer une inhibition de la reproduction lors dun test de
reproduction 21 jours des concentrations allant de 0,5 3,5mg.L
-1
U (Poston et al., 1984).
1.3.1.4. Mcanismes de toxicit

Lvaluation de limpact des radionuclides est gnralement base sur la dose
radiologique totale dlivre lorganisme concern. Cependant, la toxicit des radionuclides
peut tre attribue dune part aux proprits chimiques de llment et dautre part aux
rayonnements, en particulier pour les radionuclides faible activit spcifique comme les
isotopes de luranium (Figure 21).

Proprits chimiques
Interaction avec les
pr o cessus de
r paration de lADN
Augmentation de la
production de ROS
Radiations ionisantes
Effet indirect
Effet direct
Dommages aux macromolcules

P erox y dation lipidique Oxydation de prot ines Altration de l ADN

altrations disfonctionnement
m embranai res de protines
Pas de
rparation
Rparation de
lADN altr
mutation

C ellules somatiques Cellules germinales
apoptose ncrose
P athologies
tissulaires
Cancer A nomalie
hrditaire

Figure 21: Les effets biologiques induits par une exposition un radionuclide (daprs Ercal et al., 2001).
48
1) Toxicit chimique

La toxicit chimique de luranium a fait lobjet de plusieurs tudes in vitro. Ces tudes
ont montr que luranium augmentait la production de ROS (Reactive Oxygen Species) et aussi
suggr quil pouvait ragir directement avec lADN (Miller et al., 2002). Des tudes ralises
par la mthode de pigeage de spin par spectromtrie par RPE (Rsonance Paramagntique
Electronique) ont montr que luranium peut ragir avec H
2
O
2
pour donner des radicaux
hydroxyles (Miller et al., 2002). Luranium serait en effet capable dinteragir avec les ROS de
faon similaire au nickel. De plus, comme la chimie de luranium est proche de celle des
mtaux de transition comme le fer, Miller et al. (2002) suggrent que luranium se comporterait
comme le fer dans la raction de Fenton et gnre ainsi des ROS.

Outre le stress oxydant et les effets gnotoxiques induits par luranium au sein des
organismes, des perturbations au niveau des cellules du systme nerveux ont t observes. En
effet, la toxicit chimique de luranium peut tre rapproche de celle des mtaux lourds.
Diverses tudes sur les effets de luranium ont pu montrer que luranium est susceptible de
saccumuler principalement la surface des os ainsi quau niveau des tissus rnaux (Cooley et
Klaverkamp, 2000). Outre ces principaux sites daccumulation, luranium peut saccumuler
aussi dans les intestins, le foie ainsi que dans les gonades (Labrot et al., 1996; Ribera et al.,
1996).

2) Toxicit radiologique de luranium

Les proprits radiologiques de luranium peuvent aussi augmenter la production de
radicaux libres par radiolyse de leau, ce qui peut conduire laltration des macromolcules
biologiques. Des tudes in vitro ont montr que les particules mises par luranium peuvent
causer directement des dommages lADN, aux protines et aux lipides (Miller et al., 2002)
(Figure 21).

49

Ltude bibliographique concernant les effets de luranium sur les invertbrs
aquatiques a mis en vidence des valeurs de toxicit variables. Pour expliquer ces diffrences,
certains auteurs sappuient sur la thorie de lion libre et ses drivs (Morel, 1983; Campbell,
1995) qui considre que les effets biologiques de mtaux traces sont gouverns non pas par la
concentration totale du mtal, mais par lactivit de lion libre mtallique en solution. La
concentration de lion uranyle tant influence par sa complexation avec des ligands
organiques et inorganiques (Denison, 2004 ; Madic et Genet, 2001), le choix des
caractristiques du milieu exprimental (duret, pH, alcalinit) est donc important pour
contrler la biodisponibilit. Une comparaison des donnes de toxicit aigu de la littrature en
fonction de la spciation de luranium pourrait permettre dexpliquer les diffrences observes.

Les donnes de la littrature sur les effets chroniques de luranium sur les daphnies sont
assez restreintes. En effet, seule une tude ralise par Poston et al. (1984) porte sur les effets
sur la fcondit de la daphnie. Etudier leffet chronique de luranium sur la reproduction mais
aussi sur des paramtres tels que la croissance, lingestion ou dallocation dnergie la
croissance et la reproduction, permettrait dapprofondir les donnes deffet existantes.

Dautres tudes se sont intresses aux modes daction toxique de luranium et ont
rvl quen raison de ses proprits radiologiques et chimiques, luranium pouvait engendrer
des effets dltres sur les macromolcules. Comparer les effets de luranium ceux connus
lors dexpositions des substances radioactives et des mtaux traces stable permettrait
dvaluer limportance relative de la chimiotoxicit et de la radiotoxicit de luranium.
50
1.3.2. Slnium

1.3.2.1. Sources et concentrations de Se dans lenvironnement

Le slnium est naturellement prsent dans lcorce terrestre une concentration
denviron 0.05 mgkg
-1
(Coughtrey et al., 1983). Les concentrations en Se dans les eaux de
surface, marines et continentales, sont rarement suprieures au gL
-1
en milieu non contamin
(allant du ngL
-1
au g.L
-1
). Cependant son utilisation par lhomme peut induire une
augmentation de ces niveaux, jusqu des concentrations pouvant atteindre plusieurs centaines
de gL
-1
.
Le slnium est en effet largement utilis des fins industrielles et mdicales. Dans le
domaine mdical, le slnium est utilis comme complment alimentaire, mais aussi dans
diffrents traitements de la peau (George, 2003). Dautres activits anthropiques peuvent
conduire des rejets de Se dans lenvironnement, allant jusquau mg.L
-1
, issus de dchets
venant de la production et la combustion du charbon, de lexploitation de diffrentes mines
(Cu, Zn, Ni, Ag et U), des dcharges municipales, des eaux uses, de la production de
fertilisants des fins agricoles, de divers processus industriels (Lemly, 2004).

1.3.2.2. Formes chimiques

Le slnium (symbole Se, numro atomique 34) est un mtallode qui appartient au
groupe VI (oxygne, soufre, polonium, tellurium) du tableau priodique. Ses proprits
chimiques sont comparables celles du soufre (S) au niveau de la taille atomique, des nergies
de liaison, des potentiels dionisation et des principaux degrs doxydation (Tinggi, 2003;
Johansson et al., 2005).
Il existe diffrentes formes organiques et inorganiques du slnium (Tableau 4). Dans
les cosystmes aquatiques, le slnium existe sous quatre tats de valence : slniate (+VI) ;
slnite (+IV) ; slnium lmentaire (0) et slniure (-II).
Dans les cosystmes aquatiques, le slniate (+VI) et le slnite (+IV) sont les formes
les plus communes des eaux de surface, en conditions oxydantes modrment oxydantes
(Coughtrey et al., 1983).
51

Tableau 4 : Principales formes chimiques des composs naturels slnis.
Formes Nom
Etat de
valence
Formes chimiques
slniate Se(+VI) H
2
SeO
4
;HSeO
4
-
;SeO
4
2-

slnite Se(+IV) H
2
SeO
3
;HSeO
3
-
;SeO
3
2-

slnium lmentaire Se(+0)
Inorganiques
slniure Se(-II) H
2
Se ;HSe
-
;Se
2-

slnocystine Se-CH
2
CHNH
2
COOH
slnomthionine CH
3
Se(CH
2
)
2
CHNH
2
COOH
dimthylslniure (CH
3
)
2
Se
dimthyledislniure (CH
3
)
2
Se
2

dimthylslnone CH
3
)
2
SeO
2

Se-mthylslnocystine CH
3
SeCH
2
CHNH
2
COOH
Organiques
Se-mthylslno mthionine
Se(-II)
(CH
3
)
2
Se(CH
2
)
2
CHNH
2
COOH

En milieu aqueux, lquilibre, ltat doxydation du slnium inorganique dpend des
conditions oxydo-rductrices et du pH (Figure 22).

On sattend ce que le slniate soit la forme prdominante dans les environnements
neutres ou alcalins, ou fortement oxyds, tandis que le slnite est prdominant dans les
environnements plutt acides, ou rduits. Cependant, le domaine doxydo-rduction des eaux
douces correspond la zone de transition entre les deux formes ; la transformation dun tat
lautre est lente, et donc lquilibre thermodynamique nest pas forcment atteint dans
lenvironnement. En particulier, loxydation du slnite en slniate est un processus lent, ce
qui permet au slnite thermodynamiquement instable de persister, mme dans des eaux bien
oxygnes. Finalement, dans lenvironnement, on trouve aussi bien des systmes domins par
le slnite que des systmes domins par le slniate (Conde et Sanz Alaejos, 1997).
52
SeO
4
2-
SeO
3
2-
HSeO
3
-
HSeO
4
-
H
2
SeO
3(aq)
Se
(c)
H
2
Se
(aq)
HSe
-
Se
2-
pH
p
e
SeO
4
2-
SeO
3
2-
HSeO
3
-
HSeO
4
-
H
2
SeO
3(aq)
Se
(c)
H
2
Se
(aq)
HSe
-
Se
2-
pH
p
e
SeO
4
2-
SeO
3
2-
HSeO
3
-
HSeO
4
-
H
2
SeO
3(aq)
Se
(c)
H
2
Se
(aq)
HSe
-
Se
2-
pH
p
e

Figure 22 : Diagramme pe-pH du slnium obtenu avec le logiciel J-Chess et la base de donnes
thermodynamique dcrite dans le chapitre 3. [Se]=2200 g.L
-1
dans du milieu M4-pH7. La zone en rouge
reprsente de pH et de potentiel doxydo-rduction susceptible dtre rencontre dans lenvironnement.
1.3.2.3. Rles physiologiques

Le slnium est un lment essentiel pour la majorit des organismes vivants. A faible
concentration, il permet de lutter contre les dommages engendrs par le stress oxydant en
entrant dans la composition de slnoprotines telles que la glutathion proxydase (GPx)
(Ducros et Favier, 2004; Tapiero et al., 2003; Tinggi, 2003). Les GPx sont des enzymes
antioxydantes qui constituent une des principales lignes de dfense contre les agressions
produites par les radicaux libres de loxygne.
Dautres slnoprotines, comme la thiordoxine rductase implique dans des
mcanismes importants de rgulation de la croissance cellulaire normale ou tumorale, ont aussi
un rle protecteur (Ducros et Favier, 2004) ou la slnoprotine P ayant un rle antioxydant
extracellulaire et une activit proxydase spcifique des phospholipides. Un effet anti cancer
est aussi attribu certains mtabolites du slnium (Tapiero et al., 2003).
53
Keating et Dagbusan (1984) ont montr notamment quune population de daphnies
(Daphnia magna) ne pouvait tre maintenue indfiniment dans un milieu contenant moins de
0,1 g.L
-1
de slnium mais quune concentration de 1 g.L
-1
est suffisante pour satisfaire ses
besoins en slnium.
1.3.2.4. Mcanismes de toxicit

Le slnium est non seulement un lment essentiel mais aussi toxique. En effet, forte
concentration, le slnium peut devenir un pro-oxydant. Le caractre pro-oxydant du slnium
provient de la gnration danions superoxydes due linteraction du slnium avec des
groupements thiols. Un mcanisme important met en cause la formation de mthyl slnium
CH
3
Se
-
qui entre dans le cycle redox et gnre des anions superoxydes ou forme des radicaux
libres qui inhibent dimportantes enzymes ou protines en se liant elles (Fournier, 2005).
La toxicit du slnium peut aussi tre due au remplacement du soufre par le slnium
lors de la synthse de protines (Lemly, 2002). En effet, le soufre est un constituant cl des
protines qui forme des ponts disulfures entre les diffrents acides amins. Ces ponts confrent
la protine sa structure tertiaire. Cette structure est ncessaire pour le bon fonctionnement des
protines en tant que composant cellulaire ou comme enzyme. Lorsque le slnium est prsent
en trop grande quantit, il se substitue au soufre et forme des ponts trislniures (Se-Se-Se) ou
slnotrisulfures (S-Se-S) qui empchent la formation des ponts disulfures ncessaires la
bonne conformation des protines. Les protines ne sont alors plus fonctionnelles et ne peuvent
plus jouer leur rle.
Dans le cas o le slnium est incorpor la place du soufre dans la mthionine, on
parle alors de slnomthionine. La slnomthionine naltre pas la structure des protines
mais peut influencer lactivit des enzymes, en particulier si la slnomthionine remplace la
mthionine proximit du site actif de la protine (Schrauzer, 2000).

1.3.2.5. Effets sur les organismes

La gamme de concentrations o le slnium passe dlment essentiel lment toxique
est trs troite (Hodson et Hilton, 1983; USEPA, 2004) comme illustr dans la figure 23.

54

Figure 23 : Profil dose-rponse caractristique dun lment essentiel

De nombreuses tudes se sont intresses aux effets toxiques du slnium (slnite et
slniate) dans les cosystmes aquatiques continentaux. Elles ont montr que les invertbrs
sont la fois les espces les plus sensibles et les plus tolrantes au slnite et au slniate avec
des valeurs de toxicit aigu (valeurs moyennes par espce) pour le slnite allant de 440 g.L
-
1
Se pour le crustac, Ceriodaphnia dubia, 203 000 g.L
-1
Se pour la sangsue, Nephelopsis
obscura, et pour le slniate allant de 593 g.L
-1
Se pour le crustac, Daphnia pulicaria, 1
515 616 g.L
-1
Se pour la sangsue, Nephelopsis obscura (USEPA, 2004). Chez les poissons, la
toxicit du slnite schelonne entre 1 783 g.L
-1
pour le bar amricain, Morone saxatilis, et
35 000 g.L
-1
Se pour la carpe commune Cyprinus carpio. La toxicit du slniate chez les
poissons est comprise entre 10 305 g.L
-1
Se pour le catostome Xyrauchen texanus, et 226 320
g.L
-1
Se pour le barbue de rivire, Ictalurus punctatus (USEPA, 2004).

Plus particulirement, certaines tudes se sont intresses la toxicit aige du
slnium chez les daphnies (Daphnia magna et Daphnia pulex). Les rsultats obtenus sont
assez proches pour les deux espces (annexe 4). Les tudes de toxicit aige du slnite
prsentent une CL
50
48h variant de 0,685 mg.L
-1
Se (Adams et Heildolph, 1984) 2,5 mg.L
-1

Se (Bringmann et Kuhn, 1959). Celles visant tudier la toxicit aige du slniate donnent
des valeurs de CL
50
qui varient de 0,55 (Johnston, 1987) 5,3 mg.L
-1
Se (Dunbar et al., 1983).
Les diffrences entre les tests sexpliquent en partie par les compositions diffrentes dans les
milieux de culture des daphnies ainsi que par les conditions diffrentes dlevage, comme la
temprature. En effet, diffrents paramtres environnementaux sont connus pour influencer la
toxicit du slnium comme, la prsence de sulfates (Maier et al., 1993; Ogle et Knight, 1996),
carence toxicit
?
55
la duret du milieu (Ingersoll et al., 1990) ainsi que la prsence de mtaux lourds, la
temprature ou la longueur du jour (USEPA, 2004).

Seules deux tudes (Halter et al., 1980 ; Adams et Heildolph, 1985 ; Johnston, 1987) se
sont intresses leffet du chronique du slnium sur Daphnia magna et se sont focalises
uniquement sur les effets sur la reproduction et la croissance. Ces tudes donnent des valeurs
de CE
50
fcondit 14 jours allant de 430 g.L
-1
Se 250 g.L
-1
Se. Adams et Heildolph, (1985)
donnent aussi une valeur de CE
50
fcondit 21 jours de 350 g.L
-1
Se. Johnston (1987) a
montr un retard de maturation partir de 50 g.L
-1
Se avec une proportion de daphnies
devenant matures au 6
me
stade de mue, alors que pour les tmoins et pour une concentration
dexposition de 25 g.L
-1
Se, toutes les daphnies sont matures au 5
me
stade de mue. Les
donnes deffets du slnium sur la croissance sont encore plus limites. Johnston (1987) a
montr une rduction de la croissance des daphnies pour des concentrations en slnium de 200
et 500 g.L
-1
Se.

De nombreuses tudes se sont intresses aux effets du slnium sur la daphnie. Il
ressort de ces tudes que les valeurs de toxicit aige pour chacune des formes de slnium
sont relativement proches entre elles.
Les tudes sur les effets chroniques du slnium sont moins nombreuses que celles sur
les effets aigus et sont bases pour la plupart sur des effets sur la reproduction avec des
donnes de CE
50
reproduction (14 ou 21 jours). Des tudes portant sur dautres paramtres
comme la croissance ou la respiration permettraient de complter les donnes de la littrature,
et aussi de dterminer partir de quelle concentration le slnium peut tre considr comme
toxique pour la daphnie.

56
1.3.3. Uranium et Slnium en mlange

1.3.3.1. Formes chimiques

1) Formes aqueuses et prcipites

Le slnium et luranium peuvent former dans leau des complexes comme
UO
2
(SeO
4
)
2
2-
, UO
2
SeO
4(aq)
ou (UO
2
)
2
(OH)
2
SeO
3(aq)
et des prcipits comme USe, USe
2
, U
2
Se,
U
2
Se
3
, UO
2
SeO
3
, dont les constantes thermodynamiques sont plus ou moins bien connues selon
les diffrentes formes (OCDE-NEA, 1996 ; Sby et al., 2001).

2) Minraux de slnite duranyle

Les minraux de slnite duranyle ont t dcouverts dans diffrentes mines duranium
du Zare (mines de Shinkolobwe et de Musonoi) et des Etats-Unis (mine de Repete, dans
lUtah) (Smith, 1984 ; Gaines, 1997 ; Cejka, 1996). Le slnium prsent dans tous les minraux
duranium connus est sous forme dion slnite (Se (IV)). Aucune donne nest disponible sur
la solubilit de ses minraux. Seulement sept sont connus actuellement et sont prsents dans le
tableau 5.

Tableau 5: Slnite duranyle (daprs Finch et Murakami, 1999)

Nom Formes chimiques
Demesmaekerite Pb

2
Cu

5
(UO

2
)

2
(SeO

3
)

6
(OH)

6
2H

2
O

Derriksite Cu

4
UO

2
(SeO

3
)

2
(OH)

6
H

2
O

Guilleminite Ba(UO

2
)

3
(SeO

3
)

2
(OH)

4
3H

2
O

Haynesite (UO

2
)

3
(OH)

2
(SeO

3
)

2
5H

2
O

Larisaite Na(H

3
O)(UO

2
)

3
(SeO

3
)O

2
4H

2
O

Marthozite Cu(UO

2
)

3
(SeO

3
)

3
(OH)

2
7H

2
O

Piretite Ca(UO
2
)
3
(SeO
3
)
2
(OH)
4
-4(H
2
O)

57
1.3.3.2. Uranium et slnium dans lenvironnement

Comme nous lavons voqu prcdemment, lors doprations dextraction et
dexploitation du minerai duranium, diffrentes tudes ont montr que des lments traces
comme lU mais aussi Ni, As, Mo ou Se peuvent se retrouver dans les dchets des mines
(Holm et al., 2005; Noller, 1991 ; Supervising Scientist, 2007). Les deux lments uranium et
slnium peuvent se retrouver alors en mlange dans les cours deau en aval des sites. Des
concentrations leves en Se ont t mesures dans leau, les sdiments et dans les tissus de
poissons (de Rosemond et al., 2005 ; Klaverkamp et al., 2002 ; Muscatello et al., 2006 ;
Muscatello et al., 2008). Cependant, mme si dans certaines tudes les concentrations mesures
en Se dans leau sont trs faibles, infrieures au g.L
-1
, une forte accumulation du Se le long de
la chane trophique, et en particulier chez les poissons, a t mise en vidence (Holm et al.,
2005 ; Pyle et al., 2001). En effet, Holm et al. (2005) ont montr que, dans les cosystmes
aquatiques proches de mines duranium, que la concentration en Se de certains poissons excde
le seuil toxique pour les poissons de 7,91g.g
-1
Se (poids sec) donn par lUSEPA (2004) pour
une exposition une concentration mesure dans leau de 0,009g.L
-1
Se. Pyle et al. (2001) ont
montr des rsultats similaires avec une accumulation de slnium atteignant 10g.g
-1
dans le
poisson Pimephales promelas alors que les concentrations mesures dans leau taient
infrieures 1 g.L
-1
. Muscatello et al. remarquent mme, dans leur tude publie en 2008
visant tudier laccumulation de slnium dans le chane trophique des cosystmes
aquatiques, que la mesure de concentration en slnium dans leau a un faible pouvoir de
prdiction de la concentration dans les invertbrs et les poissons. Dans cette tude ralise aux
abords de mines du Saskatchewan au Canada, Muscatello et al. ont aussi pu montrer que les
organismes contenaient de concentrations suprieures au seuil de toxicit du Se pour les
poissons, suggrant que le slnium relargu dans ces cosystmes aquatiques peut se
bioaccumuler et atteindre des concentrations pouvant affecter la reproduction des poissons.
Les donnes sur les concentrations en uranium sont beaucoup moins nombreuses ainsi
que les donnes deffets sur les cosystmes environnant les mines.
Une tude rcente ralise par Antunes et al., (2007) dans des tangs aux abords de
mines duranium abandonnes au Portugal, rapporte des valeurs de concentrations en uranium
de 1400 g.g
-1
de poids sec de poisson

alors que les concentrations en slnium mesures dans
leau taient infrieures 25 g.L
-1
.

58

Les donnes de la littrature concernant les cosystmes aux abords de mines duranium
soulignent lintrt dtudier limpact du mlange uranium-slnium sur les organismes
aquatiques. Des tudes dans des conditions contrles sur les effets du mlange binaire
uranium-slnium permettraient didentifier une ventuelle interaction entre U et Se.
Des tests aigus en mlange permettraient de dterminer le type dinteraction. Des tests
chroniques avec la mesure de diffrents paramtres diffrents niveaux dorganisation
permettraient dapprhender les mcanismes mis en jeu.

59

2 2. .1 1. . E El le ev va ag ge e d de e d da ap ph hn ni ie e

2.1.1. Origine et conditions dlevage

Dans llevage, les microcrustacs cladocres Daphnia magna Straus (clone A, INERIS,
France) sont maintenus en phase de reproduction parthnogntique conformment aux lignes
directrices 211 de lOCDE (1998). Llevage de daphnies est maintenu dans deux eaux de
composition diffrente : le milieu M4-pH8 (Elendt, 1990) et le milieu M4-pH7. La composition
du milieu M4-pH8 est de: 2mM Ca; 0,5mM Mg; 0,87mM Na; 0,081mM K; 0,51mM SO4; 3,2
M NO3; 2,1 M PO4; 4,9nM NH4; 35 M SiO3; 46 M B; 1,8 M Mn; 7,2 M Li; 0,59 M Rb; 0,57
M Sr; 0,16 M Br; 0,31 M Mo; 98nM Cu; 50nM Zn; 43nM Co; 19nM I; 11nM Se; 4,9nM V; 7,2
M Fe; 13,4 M EDTA and 4,1mM Cl. La composition du milieu M4-pH7 diffre seulement du
M4-pH8 au niveau de la concentration de Cl qui est de 4,8 mM dans le M4-pH7.
Ces milieux ont t prpars partir deau ultrapure (18M.cm) et de diffrentes solutions
mres dont la prparation est dcrite en annexe 5.
Llevage est ralis dans des bouteilles de Pyrex de 2 litres couvertes de leur
bouchon mais non fermes (Figure 24). Les bouteilles sont maintenues dans une enceinte
climatise assurant des conditions stables et optimales (20 1C, clairement de 300 lux,
Photopriode 16 heures de lumire /8 heures dobscurit). Chaque bouteille contient 40
individus.

Figure 24 : Photographie de llevage de daphnies
Chapitre 2. Matriel et mthodes
60
2.1.2. Entretien de llevage

Llevage est nourri avec des algues fraches cultives au laboratoire, Chlamydomonas
reinhardtii, (voir protocole en annexe 6). La ration quotidienne pour une daphnie est
dapproximativement 4,5.10
6
cellules (soit 100 g C.daphnie
-1
.jour
-1
). Les daphnies sont
nourries tous les matins except le samedi et le dimanche. Pour les nourrir, les algues sont
centrifuges (1000 g / 15 min) avant dtre remises en suspension dans du milieu dlevage.

Figure 25 : Photographie des cultures dalgues ( NOAK/Le Bar Floral pour lIRSN)

Pour les daphnies leves dans le milieu M4-pH8, le milieu de chaque bouteille est
renouvel de moiti une fois par semaine. Pour celles leves dans le milieu M4-pH7, le milieu
est renouvel en entier deux fois par semaine. Le milieu est prpar au moins 24h avant chaque
changement de milieu et ar par bullage pendant 24h (air filtr <0,2 m).

Tous les 2 jours (sauf le week-end), chaque bouteille est trie grce 2 tamis
superposs permettant de rcuprer sparment les mres (tamis 1000 m) et les juvniles
(tamis 100 m). Les juvniles (<24h) issus de la 3
e
la 5
e
ponte des mres, servent selon les
besoins, aux tests ou la mise en place de nouvelles bouteilles dlevage.

61
2 2. .2 2. . L Le es s c co on nt ta am mi in na an nt ts s t tu ud di i s s

2.2.1. Etude des effets du slnium seul
2.2.1.1. Solutions stock de slnite et de slniate

Les solutions stock de slnite et de slniate) ont t prpares par dilution de sels de Na
2
SeO
3
(Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France)) et de Na
2
SeO
4
(Sigma-Aldrich (Saint-
Quentin Fallavier, France)) dans de leau ultra-pure (UHQ). Deux solutions mre ont t
tablies :
solution mre de slnite Na
2
SeO
3
2 g.L
-1
Se
solution mre de slniate Na
2
SeO
4
1 g.L
-1
Se
2.2.1.2. Concentrations tudies

Pour les tests aigus visant tudier les effets du slnite et du slniate, les
concentrations en tudies ont t de 0; 0,5; 1; 2 ; 4; 8; 16 mg.L
-1
Se.
Lors du test chronique, les concentrations en slnite tudies ont t de: 0; 1; 22; 110;
220 et 450 g.L
-1
Se.

2.2.2. Etude des effets de luranium seul
2.2.2.1. Solutions stock duranium

Luranium a t obtenu par Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France) sous forme de
nitrate duranyle hexahydrate qui a t mis en solution 0.2% dacide nitrique (1 g.L
-1
U).

Pour les tests aigus visant tudier les effets de luranium dans le milieu M4-pH7, les
concentrations en tudies ont t de 0; 0,3; 0,6 ; 0,8; 1,2; 1,4; 1,7 mg.L
-1
U et dans le M4-pH8
de : 0; 10; 20; 40; 60; 80; 100; 120 mg.L
-1
U
Lors du test chronique dans du milieu M4-pH7, les concentrations en uranium tudies
ont t de: 0; 10; 25; 50; 75; 100 g.L
-1
U.

62
2.2.3. Etude des effets du mlange uranium-slnium

2.2.3.1. Solutions stock duranium et de slnium

Les mmes solutions stock que pour les exprimentations sur les substances seules ont t
utilises.

Les effets aigu du mlange U-Se ont t tudis des concentrations pour le slnium
allant de 200 3000 g.L
-1
Se et pour luranium allant de 37,5 750 g.L
-1
U. Le dtail des
mlanges raliss est prsent dans le chapitre 7.
Les effets chroniques du mlange U-Se aux concentrations suivantes : 100g.L
-1
U -
500g.L
-1
Se; 75 g.L
-1
U - 375g.L
-1
Se ; 50 g.L
-1
U - 250g.L
-1
Se; 25 g.L
-1
U - 125g.L
-1

Se., 10 g.L
-1
U - 50g.L
-1
Se.

2 2. .3 3. . M Me es su ur re es s d d e ef ff fe et t d de es s c co on nt ta am mi in na an nt ts s

2.3.1. Effets sur le dveloppement des ufs de daphnies

Lors de ce test, les daphnies adultes ont t suivies toutes les heures au moment de la
premire ponte pour dterminer lheure de la libration des ufs dans la poche. Les ufs issus
de la premire ponte seront extraits par dissection 6 heures aprs la libration des ufs dans la
poche. Les ufs dissqus sont ensuite dlicatement disposs dans une microplaque en
polycarbonate avec 1 uf par puits dans 200 L de milieu (comme dans les tudes ralises
prcdemment par Kast-Hutcheson et al., 2001 ; Ohta et al., 1998). Leur dveloppement a t
suivi pendant 72h, toutes les heures pendant les 8 premires heures, puis toutes les 8 heures.
Tout retard de dveloppement ou tout dveloppement anormal a t not.

2.3.2. Tests aigus sur les daphnies juvniles

La toxicit des substances sur les juvniles a t value en observant la survie aprs 24
et 48 h dexposition et en appliquant la mthodologie de lOCDE (OCDE, 1998) dans le milieu
M4-pH7 et M4-pH8. Les tests ont t raliss en utilisant des juvniles gs de moins de 24h.
Pour chaque condition, 10 rplicats de 5 daphnies juvniles ges de moins de 24h ont t
63
exposes dans les tubes en polycarbonate de 15 mL contenant 10 mL de milieu non renouvel
au cours le lexprience. Aprs 24 et 48 h dexposition, le nombre de daphnies survivantes dans
chaque tube a t observ. Les individus immobiles pendant plus de 10 secondes ont t
considrs comme morts.

2.3.3. Tests chroniques sur les daphnies adultes

Des tests chroniques ont t raliss pour valuer les effets des substances tudies sur
les daphnies.
2.3.3.1. Conditions exprimentales

Lors des tests chroniques, les expositions ont t conduites en conditions semi-statiques
sur des individus gs de moins de 24h au dbut de lexprience, pour une dure de 21 23
jours. Les flacons en polycarbonate contenaient 50 mL de milieu ainsi quune daphnie isole.
Le milieu a t renouvel quotidiennement pendant les 23 jours du test. Les daphnies
ont t nourries tous les jours avec des algues fraches (Chlamydomonas reinhardti; 4,5.10
6

cellules.daphnie
-1
.jour
-1
). A chaque changement de milieu, les mues ainsi que les juvniles ont
t dnombrs et rcolts pour la mesure de biomasse.
Pour les tudes des effets du slnium, les mesures de respiration, taille, biomasse et
fcondit (nombre dufs prsents) ont t ralises sur 3 daphnies de chaque condition aux
temps de prlvement suivants : 1
re
(ponte 2), 3
me
(ponte 4) et 5
me
(ponte 6) libration de
juvniles.
Pour les tudes des effets de luranium et du mlange uranium-slnium, les mmes
mesures ont t ralises sur 10 daphnies sauf pour la respiration et lingestion avec 3 daphnies.
Les temps de prlvement taient au moment de la 1
re
, 3
me
et 5
me
ponte.
2.3.3.2. Poids sec

Les biomasses sches (schage ltuve 24 h, 60 C aprs rinage leau ultrapure
pese avec une prcision 0.1g sur ultra-microbalance SE2, Sartorius, Goettingen, Allemagne)
des individus, des mues, des juvniles et des ufs ont t suivis au cours des expriences. Pour
chaque unit exprimentale, une observation quotidienne permet denregistrer loccurrence des
mues, la dposition des ufs dans la poche et la libration des juvniles.
64
2.3.3.3. Respiration

La respiration a t mesure grce un systme danalyse de microrespiration
(Unisense S/A, Denmark) sur les daphnies chantillonnes pour les analyses de poids sec. Les
individus sont placs dans des chambres de respiration contenant 1 mL de milieu (Figure 26)
thermostates 20 C. Le suivi des concentrations en oxygne dissous dans les chambres est
ralis pendant 1 h (lectrode oxygne de type Clarke miniaturise, connecte un pico
ampremtre). Une calibration est effectue avec un milieu satur en oxygne dissous et une
solution exempte doxygne (ascorbate de sodium 0,1M en milieu NaOH 0,1 M). Le
pourcentage de saturation mesur a t converti en concentration en utilisant la concentration
doxygne dans leau (20 C, 1 atm) lquilibre de 282,3 mol O
2
.L
-1
.

Figure 26 : Photographie dune chambre de respiration ( NOAK/Le Bar Floral pour lIRSN)

Le taux de consommation doxygne est calcul selon la formule :

t
V e O
i m
t k
respi

=

) 1 ( ] [
) (
0 2

o [O
2
]
0
est la concentration en oxygne dissous (mol.mL
-1
) mesur t = 0, V le volume (mL)
de milieu dans la chambre de respiration, k le coefficient de consommation (min
-1
) et t = 1 min,
obtenus en calant un modle exponentiel aux donnes mesures :

t k
t
e O O

=
0 2 2
] [ ] [

Les taux de respiration sont normaliss par le poids sec des daphnies (mol O
2
g
-1
h
-1
) afin
dliminer les diffrences individuelles de poids sec entre les conditions dexposition.
65
2.3.3.4. Ingestion

Lactivit de nutrition a t mesure, sur la base des changements de densits algales
dans le milieu au cours du temps (entre 0 et 6 h). Les densits algales sont mesures par
comptage au Coulter Z2 (dilution 1:10 avec de la solution isotonique ISOTON II , Beckman
Coulter France SA, Villepinte, France). Deux modles exponentiels sont utiliss pour calculer
le taux dingestion (Frost, 1972).
( )
=
=
t f k
d
t k
a
e C t C
e C t C
0
0
) (
) (

Avec pour les conditions sans daphnies C
a
(t) et pour celles avec les daphnies C
d
(t) : la densit
algale au temps t , C
0
la densit algale au temps 0, k la constante de croissance algale mesure
dans une unit exprimentale sans daphnie, f le coefficient de broutage de la daphnie.

La concentration algale moyenne C (cellule.mL
-1
) et lingestion de la daphnie I
(cellules.daphnie
-1.
jour
-1
) ont t calcules suivant les quations:

t f k
C t C
C
d

=
) (
) (
0

t C f V I =

o V est le volume exprimental par individu (mL) et considrant un temps de broutage de t =
10 h par jour. Les valeurs sont converties en assimilation de carbone en considrant une valeur
de 25 pg C.cellule
-1
, (valeur mesure par ailleurs sur un aliquote dalgues par un analyseur de
carbone organique TOC-5000, Shimadzu Europe, Duisburg, Allemagne).

66
2.3.3.5. Calcul dallocation nergtique la croissance et la
reproduction (AECR)

Lallocation nergtique la croissance et la reproduction (AECR) a t calcule
grce lquation suivante : AECR = E
A
E
R
, o E
A
= reprsente lnergie assimile partir
de la nourriture, E
R
= lnergie mtabolise (respiration). Lnergie perdue par excrtion est
souvent infrieure 10% (Baillieul et al., 1996; Smolders et al., 2002) et a t nglige. La
conversion entre lingestion et lnergie assimile a t calcule en supposant une efficacit
dassimilation de 80% (Mayzaud et Razouls, 2002) et un quivalent nergtique de 36.8 mJ par
g de C assimil. La respiration a t convertie en consommation dnergie en utilisant un
quivalent oxyjoule de 21 kJ.L
-1
O
2
(Elliot and Davison, 1975). LAECR a t rapporte la
masse sche somatique (=AECR masse spcifique, J.mg
-1
.h
-1
) pour prendre en compte les
changements de masse (Baillieul et al., 2005).

2.3.3.6. Mesures des rserves nergtiques : mesures des lipides

Les mesures de rserves nergtiques ont t ralises sur des daphnies congeles dans
de lazote liquide (4 daphnies par chantillon). Les chantillons ont t broys. Lextraction des
lipides a ensuite t ralise selon la mthode de Bligh et Dyer (1959). Une fois les lipides
extraits, ils ont t rcuprs et dposs dans des coupelles en aluminium et schs pour ensuite
tre pess avec la microbalance. Le protocole est prsent annexe 7.

2.3.3.7. Calcul du budget nergtique et dallocation dnergie

Le budget nergtique complet a t calcul selon la formule :

B = E
A
E
R
E
Rep
E
Crois
E
Res

E
Mue

O les diffrentes variables reprsentent E
A
= lnergie assimile partir de la
nourriture, E
R
= lnergie mtabolise ou ncessaire la maintenance, E
Rep=
lnergie alloue
la reproduction, E
Crois
= lnergie alloue la croissance, E
Res
= lnergie alloue aux rserves
lipidiques, E
Mue
= lallocation la formation de la carapace.
67
La conversion entre lingestion et lnergie assimile a t calcule de la mme manire
que pour lAECR. Pour lnergie ncessaire la maintenance, la respiration a t convertie en
consommation dnergie galement selon le calcul de lAECR. Lnergie alloue la
reproduction a t estime grce aux mesures de poids sec de pontes. Pour convertir cette
masse moyenne dufs produite par daphnie, nous avons considr une composition de 50% de
lipides et de 50% de glucides et protines. Nous avons utilis les coefficients de conversion de
39,5 J.mg
-1
pour les lipides et de 23,6 J.mg
-1
pour les glucides et protines (Winberg, 1961).
Lnergie ddie la croissance a t convertie en nergie grce aux mesures de poids
sec et du coefficient de conversion de 22,15 J.mg
-1
de daphnie (Paloheimo et al., 1982, daprs
Richman, 1958 et Schindler, 1968).
Lnergie alloue aux rserves nergtiques a t calcule grce au coefficient de
conversion pour les lipides (Winberg, 1961). Lnergie ncessaire la formation de la carapace
a t estime grce aux mesures du poids sec des mues. Les mues ont t considres comme
tant composes 100% de protines et de sucres. Le coefficient de conversion de 23,6 J.mg
-1

pour les glucides et protines a t utilis (Winberg, 1961).
Lallocation dnergie aux diffrents processus a t exprime en pourcentage de
lnergie totale dpense pour tous les processus (E
R
+ E
Rep
+ E
Crois
+ E
Res
+E
Mue
).

2.3.3.8. Matrices de Leslie

Les matrices de Leslie ont t construites partir des donnes de deux tests chroniques
21 jours sur luranium et le slnium ainsi quen fonction dune exprience sur des daphnies
tmoin avec un suivi quotidien de la mortalit et de la fcondit jusqu leur mort (annexe 8).
Dans les deux expriences sur 21 jours, la mortalit, la fcondit ainsi que les jours de ponte
ont t suivis quotidiennement sur 5 pontes (21 jours). Nous avons ralis partir de ce suivi
quotidien des matrices de Leslie avec un pas de temps de 1 jour pour pouvoir prendre en
compte lge de la maturit ainsi que les retards de ponte.
Pour estimer la fcondit des daphnies aprs 21 jours, nous nous sommes bass sur les
observations recueillies lors de lexprience tmoin. En effet, lors de cette exprience tmoin
nous avons pu observer que la fcondit augmentait au cours des premires pontes pour
atteindre une fcondit maximale la 5
me
ponte et ensuite dcrotre partir de la 17
me
ponte.
68
Grce aux observations ralises sur les daphnies tmoins suivies pendant toute leur
vie, nous avons pu exprimer la fcondit partir de la 5
me
ponte en pourcentage de cette
dernire. Ces pourcentages ont t appliqus par simple multiplication aux donnes recueillies
durant les tests 21 jours avec une exposition luranium et au slnium, pour ainsi pouvoir
estimer la fcondit des daphnies exposes luranium et au slnium pendant toute leur vie.
Pour estimer la mortalit des daphnies aprs 21 jours nous nous sommes bass, comme
pour la fcondit, sur les observations de la survie recueillies lors de lexprience tmoin.
Toujours comme pour la fcondit, nous avons pu tablir un pourcentage de mortalit au cours
du temps que nous avons utiliss pour estimer partir des donnes obtenues avec les tests de
21 jours, la mortalit des daphnies exposes luranium et au slnium pendant toute leur vie.
Ces diffrentes hypothses impliquent que les effets mis en avant dans ltude de la
dynamique de population ne prennent pas en compte des effets qui surviendraient aprs la 5
me

ponte comme une longvit rduite.
Toutes les donnes observes et estimes ont t intgres dans des matrices de Leslie
et ont permis de montrer lvolution de leffectif des populations de daphnies en fonction de
leur exposition luranium ou au slnium.

2.3.3.9. Microscopie lectronique transmission

Ltude des effets toxiques dune substance au niveau cellulaire et tissulaire est un outil
dvaluation des effets biologiques complmentaire ceux prsents prcdemment. En effet,
les paramtres morphologiques constituent des lments dont lexamen permet de rendre
compte deffets observs un niveau dorganisation biologique suprieur. La pertinence de
lutilisation des observations au niveau cellulaire et tissulaire chez les poissons en tant que
biomarqueurs dun vnement contaminant au niveau des cosystmes aquatiques a fait lobjet
de plusieurs articles de synthse (Hinton et al., 1992 ; van der 0ost et al., 2003).

1) Principe

Le principe de la microscopie lectronique est de remplacer le faisceau lumineux
(photons) du microscope optique par un faisceau convergeant dlectrons. Cette technique
permet de visualiser des structures avec une rsolution bien meilleure que dans le cas de la
69
microscopie optique traditionnelle. De plus, linteraction lectrons/matire peut tre mise
partie pour raliser des analyses chimiques locales non destructives de la zone observe, par
couplage du microscope avec une sonde EDS (Energy Dispersive Spectrometry).
Le microscope qui a t utilis est le microscope Tecnai 12 G2 Biotwin (FEI, Eindhoven, Pays-
Bas), avec une tension dacclration maximale de 120 kV, une rsolution de 0,2 nm, et un
grossissement possible de 300 000 x. Le logiciel dont nous nous sommes servis pour effectuer
des analyses morphomtriques est le programme NIH image.

Le microscope tait coupl un dtecteur EDS, quip dune fentre super ultra fine (SUTW,
modle SAPPHIR). Lanalyse par EDS consiste en une dtection de ces photons par un
dtecteur solide. Suite lexcitation des atomes prsents dans le matriau par interaction avec
les lectrons incidents, des photons X sont mis (processus de dsexcitation). Lnergie des
photons X tant caractristique des atomes dont ils sont issus, cette technique permet de
raliser une analyse lmentaire.

2) Prparation des chantillons

Des daphnies ont t prleves 21 jours dans lexprimentation visant tudier les
effets de luranium et 7 jours pour celle du mlange U-Se. Elles ont t ensuite
immdiatement immerges dans un tampon assurant une fixation chimique de la matire
vivante (solution 1,5 % de glutaraldhyde dans du tampon cacodylate maintenu 4 C). Les
chantillons tissulaires y sont alors laisss au minimum 24 h 4 C.

Suite cette fixation chimique, les chantillons ont ensuite t marqus losmium
permettant dobtenir un meilleur contraste lors des observations sous le faisceau lectronique.
Les tissus ont t ensuite dshydrats par des bains successifs dalcool thylique avant dtre
inclus dans des rsines non hydrosolubles. Une fois dshydrats, les tissus ont t inclus dans
des supports de rsine (Epon 812).
Des coupes ultrafines de ces chantillons ont t ensuite ralises au moyen dun
ultramicrotome (Leica Microsystems, Rueil-Malmaison, France). Pour les observations au MET,
des coupes de 110 nm ont t ralises, dposes sur des grilles de cuivre. Pour les analyses X, les
coupes ralises taient de 500 nm; elles ont t dposes sur des grilles de cuivre au pralable
recouvertes dun film formwar/carbone.
70
2 2. .4 4. . S Su ui iv vi i d de es s c co on nd di it ti io on ns s e ex xp p r ri im me en nt ta al le es s

2.4.1. Suivi des milieux dexposition

2.4.1.1. Dosage des ions majeurs

Les anions prsents dans les milieux dexposition ont t doss par chromatographie
ionique (DIONEX-120, Sunnyvale, CA, USA; limites de dtection: Cl
-
50 g.L
-1
; NO
3
-
, NO
2
-
,
PO
4
3-
et SO
4
2-
: 100 g.L
-1
) et les cations par ICP-AES (Spectromtrie dEmission Atomique
Source Plasma couplage inductif; Optima 4300 DV, Perkin Elmer, USA; limites de dtection:
Mg
2+
: 1 g.L
-1
; Na
+
et Ca
2+
5 g.

L
-1
; K
+
: 10 g.L
-1
).

2.4.1.2. Suivi du pH

Le pH des milieux contamins a t mesur, et ajust si ncessaire, chaque jour avant le
renouvellement des milieux et des mesures de contrle ont aussi t ralises juste avant le
renouvellement des milieux (milieu dexposition de 24h).
2.4.2. Suivi des concentrations de Se et dU dans le milieu dexposition

Le suivi des concentrations en U et Se dans les milieux dexposition a t ralis grce
des dosages raliss par ICP-AES et par un spectrophotomtre dabsorption atomique coupl
un gnrateur dhydrures (HG-QFAAS). Les suivis raliss tout au long des exprimentations
ont montr que les diffrences entre concentrations mesures et concentration nominales
taient toujours infrieures 10%.
2.4.2.1. Dosage par ICP-AES

La mthode de dosage par ICP-AES (Spectromtrie dEmission Atomique Source
Plasma couplage inductif; Optima 4300 DV, Perkin Elmer) a t utilise pour suivre les
concentrations duranium et de slnium dans les milieux dexposition. Cette mthode consiste
exciter les lments laide dun plasma (gaz partiellement ionis et macroscopiquement
neutre) atteignant la temprature de 8000 K. A cette temprature, tout lment est excit et
pour revenir un tat stable, met des photons de longueurs donde caractristiques. La mesure
71
se dcompose en plusieurs tapes. Lchantillon introduit sous forme liquide (dans 2 % HNO
3
),
est transform en arosol par nbulisation pneumatique. Larosol est alors transport dans le
plasma dargon o les lments sont atomiss et ioniss. Le retour un tat dnergie stable
saccompagne de lmission de radiations des longueurs dondes caractristiques de chaque
lment, disperses par un monochromateur puis analyses par un dtecteur photomtrique.
Luranium a t dos avec lICP-AES calibr pour une gamme de concentrations entre
10 et 400 g.L
-1
. La concentration en uranium a t obtenue en effectuant la moyenne sur 4
raies dnergie (409, 417, 424, 386 nm). Un effet matrice a t mis en vidence dans le milieu
M4-pH7 (annexe 9), une correction denviron 7 g.L
-1
U a t applique pour toutes les
mesures ralises.
Le slnium a t dos avec lICP-AES calibr pour une gamme de concentrations entre
10 et 400 g.L
-1
. La concentration en slnium a t obtenue avec la raie dnergie (196 nm).
Aucun effet matrice na t mis en vidence dans le dosage du slnium.

2.4.2.2. Dosage par absorption atomique HG-QFAAS

Lors du dosage par absorption atomique HG-QFAAS, lchantillon aqueux (slnite)
est introduit avec du HCl (10 % v/v) au niveau du gnrateur dhydrures. Puis, un agent
rducteur (NaBH4) est ajout et des hydrures de Se sont forms (SeH2) partir du slnite. Les
hydrures volatiles sont ensuite transports par un gaz vecteur (argon) lintrieur dune cellule
en quartz (chauffe lectriquement 1000 C) o ils sont atomiss. Labsorbance est mesure
196 nm laide du spectromtre dabsorption atomique quip dune lampe EDL
(Electrodeless Discharge Lamp). Un intgrateur permet lenregistrement et le traitement du
signal apport par le slnium.
Le suivi de la contamination en slnium du milieu a t ralis pour vrifier les plus
faibles concentrations dexposition en slnite de 0 g.L
-1
Se et de 1 g.L
-1
Se laide dun
spectrophotomtre dabsorption atomique coupl un gnrateur dhydrures (FIAS-100 / AAS
4110-ZL Perkin, CT USA). Cette technique a t utilise car elle est relativement sensible avec
une limite de quantification de 0.04 g.L
-1
.

72
2 2. .5 5. . M Mo od d l li is sa at ti io on n d de e l la a s sp p c ci ia at ti io on n d de e l l u ur ra an ni iu um m e et t d du u s s l l n ni iu um m

Des calculs de spciation de luranium ont t raliss dans les conditions dexposition
en utilisant la mthode de calcul de spciation J-Chess, (Java Chemical Speciation Equilibrium
Speciation with Surfaces, Van der Lee, 1998). J-Chess est, en effet, un modle de spciation
chimique qui permet de calculer ltat de solutions aqueuses complexes, lquilibre ou sous
contrainte cintique, en prenant en compte des centaines despces aqueuses, de minraux,
doxydes, de collodes organiques ou inorganiques, de gaz et les processus dadsorption.

La base de donnes thermodynamique utilise pour les calculs a t compile par
lOCDE-NEA (Organization for Economic Cooperation and Development - Nuclear Energy
Agency, 1996) et mise jour dans une rcente tude (Denison et Garnier-Laplace, 2005). Les
paramtres dentre pour J-Chess ont t bass sur les donnes physico-chimiques mesures au
cours des expriences (temprature, pH et concentrations ioniques). Les calculs J-Chess ont t
contraints lquilibre avec latmosphre (pCO
2
= 3.1610
4
atm).

Pour ltude des effets de luranium seul chez la daphnie, des calculs de spciation
chimique de luranium ont t raliss la CL
50
48 h dans le milieu M4-pH8 et M4-pH7. Des
calculs de spciation ont t effectus pour les conditions de deux tudes qui se sont intresses
la toxicit de luranium : celle de Poston et al. (1984) et celle de Barata et al. (1998). Les
calculs ont permis destimer la limite de solubilit et les concentrations des complexes
duranium ainsi que lion libre uranyle.

Pour ltude des effets du slnium seul chez la daphnie, des calculs de spciation
chimique du slnium ont t raliss la CL
50
48 h dans le milieu M4-pH7.
Dans un dernier temps, des calculs ont t raliss pour les expriences de mlanges.
La base de donnes lOCDE-NEA thermodynamique (Organization for Economic Cooperation
and Development - Nuclear Energy Agency, 1996) mise jour dans une rcente tude
(Denison et Garnier-Laplace, 2005) a t complte avec les ractions suivantes :

73
Prcipits uranium slnium
UO
2
SeO
3
UO
2
2+
+ SeO
3
2-

pKs = 10.42 (Krylov et Chukhlantsev, 1975)
Complexes uranium-slnium
UO
2
SeO
4
0
UO
2
2+
+ SeO
4
2-
pK
d
= 2.64 0.01 (Lubal et Havel, 1997)
UO
2
(SeO
4
)
2
2-
UO
2
2+
+ 2SeO
4
2-
pK
d
= 2.42 0.01 (Lubal et Havel, 1997)

2 2. .6 6. . M Me es su ur re e d de e b bi io oa ac cc cu um mu ul la at ti io on n d de e l l u ur ra an ni iu um m e et t c ca al lc cu ul l d de e d do os se e

2.6.1. Minralisation

Pour mesurer la concentration de luranium appauvri prsent dans les organismes, il est
ncessaire de raliser une tape de minralisation qui permet dobtenir un chantillon liquide.
Cette minralisation consiste en une digestion chaud des chantillons de daphnies sches
dont le poids sec a t pralablement mesur. Les chantillons ont t minraliss dans 1 mL
dHNO
3
(69 %) et 1 mL dH
2
O
2
(30 %), vaporation sec sur bain de sable (105C) puis repris
dans 15 ml dHNO
3
2 % (v/v).

2.6.2. Mesure des concentrations duranium par ICP-MS

Luranium a t analys par ICP-MS (Spectromtrie de masse Source Plasma
couplage inductif, Varian 1000) avec une limite de dtection de 10 ng.L
1

238
U. Luranium a
t analys par ICP-MS et la bioaccumulation est exprime en ng
238
U .mg
DW
1
.

2.6.3. Calcul de doses

Lestimation des doses radiologiques a t ralise grce au logiciel EDEN-v2
(Beaugelin-Seiller et al., 2006). Ce logiciel est ddi au calcul de doses pour le biota non
humain. Cet outil permet de calculer une dose par unit de concentration (DPUC). Le principe
de base de la mthode est de dterminer des DPUC mono-nergtiques basiques,
correspondants des nergies donnes reprsentatives des spectres alpha, bta et gamma
significatifs dans les cas dexposition chronique.
74
La DPUC finale est obtenue par combinaison des DPUC mono-nergtiques
(DPUC(Ei)), en fonction de limportance des nergies Ei associes dans le spectre tudi selon
lquation :
=
i
Ei DPUC Ei DPUCtot ) ( %

Ce calcul est fonction des radionuclides tudis, de la gomtrie de lorganisme tudi
et dun scnario dexposition dfini. La longueur du corps de la daphnie (L, mm) a t estime
partir des mesures de poids sec des daphnies (M, g) en considrant un ellipsode constant
(ratio axial de 1:0.6:0.4) et une relation linaire (L=M.a + b; a= 0.005, b=2.44; R
2
= 0.81)
obtenue par mesures la loupe binoculaire.

Les concentrations en U dans les daphnies (g.mL
-1
U) ont t considres comme
homognes dans lorganisme et ont t converties en activit volumiques (Bq.mL
1
) en
considrant une activit spcifique de 2.54 x 10
4
Bq.g
1
pour luranium naturel (Delacroix et
al., 2004). Les doses dlivres aux daphnies (mGy.h
1
) ont t calcules en considrant
seulement lnergie de dposition des particules alpha provenant de luranium bioaccumul.
Les autres missions provenant de luranium bioaccumul (bta et gamma) et
lexposition aux radiations externes provenant de luranium prsent dans leau sont
ngligeables (<0.1%). Un DPUC de 2.2 x 10
-3
mGy.h
-1
/Bq.ml
-1
calcul par EDEN-v2
(Beaugelin-Seiller, 2006) a t utilis.

75
2 2. .7 7. . T Tr ra ai it te em me en nt ts s s st ta at ti is st ti iq qu ue es s

2.7.1. Donnes des effets de luranium et du slnium seul

Toutes les analyses ont t ralises en utilisant le langage et lenvironnement R (R
Development Core Team) avec le package drc http://bioassay.dk.

Les donnes de mortalit 48h lors des tests aigus et les donnes de fcondit 7 et 21
jours pour les tests de fcondit ont t utilises pour tablir des relations dose-rponse. La
relation dose-rponse qui a t utilise est un modle logistique :

y = c +
| | )) log( ) (log( exp 1 e x b
c d
+

c est la limite infrieure, dest leffet maximum, e est la concentration entranant 50%
deffet, b est la pente, x est la concentration de la substance tudie et y est leffet.

Toutes les autres donnes des tests ont t reprsentes graphiquement en indiquant la
moyenne des rplicats (n) tests avec lerreur standard (SE). Les diffrences deffet entre
conditions sont testes par ANOVA, pour des risques alpha 0,05 (*), 0,01 (**) et 0,001
(***) : aprs vrification de lhomognit de la variance (diagnostic de rgression par QQ-
plot, distribution des rsidus) et de la normalit (test de Shapiro-Wilk). Un test de Tukey a t
utilis ultrieurement pour dterminer le degr de significativit (p value) entre les conditions
prises deux deux. Dans le cas o les donnes ne satisfaisaient pas les tests dhomognit de
la variance ou de normalit, une transformation Boxcox a t applique avant de procder
lANOVA (Box et Cox, 1964). Dans le cas o les donnes ne satisfaisaient pas les tests
dhomognit de la variance ou de normalit, une transformation Boxcox a t applique
avant de procder au test de Tukey. Dans le cas o les donnes, mme transformes, ne
satisfaisaient pas les tests dhomognit de la variance ou de normalit, une ANOVA non
paramtrique (test de Kruskal-Wallis) a t applique.

76
2.7.2. Donnes des effets du mlange uranium-slnium

2.7.2.1. Test aigu

Les donnes des tests aigus ont t analyses en utilisant la mthode de Srensen et al.
(2007). Dans un premier temps, les courbes pour chaque ratio de mlange ont t ajustes de
faon simultane en utilisant un modle logistique avec des EC
50
variant librement. Dans un
second temps, toutes les courbes ont t ajustes en utilisant le modle daddition des
concentrations 50% deffet. Un test F bas sur la somme des rsidus au carr de ces deux
modles a t utilis pour valuer lequel des deux ajuste au mieux les donnes. Deux modles
disoboles ont ensuite t utiliss. Le premier, le modle de Hewlett inclut un seul paramtre
dinteraction, . Le second modle est celui propos par Vlund, qui lui contient deux
paramtres dinteraction (
1
et
2
). Il permet de dcrire un antagonisme plus fort que le modle
de Hewlett et ainsi de prendre en compte une certaine asymtrie. Les carts entre le modle CA
et ces deux modles non additifs ont t valus en comparant leurs ajustements et
lajustement du modle CA en utilisant un test F. Ces analyses ont t ralises, comme pour
les analyses prcdentes, en utilisant le langage et lenvironnement R avec le package drc.

Les donnes du test aigu ont aussi t analyses en utilisant la mthode propose par
Jonker et al. (2005) et le fichier danalyse MixTox disponible sur
http://www.ceh.ac.uk/sections/er/csvedsen.html. Dans cette mthode, les deux modles de
rfrence IA et CA sont considrs. Pour ces deux modles, trois modles drivs ont t
dfinis : le modle de synergie ou antagonisme (S/A), le modle dose ratio dpendant (DR), le
modle dpendant du niveau de dose (DL pour Dose Level). Un test du Chi-deux (X
2
) bas sur
le maximum de vraisemblance a t ralis pour pouvoir mettre en vidence le modle qui
dcrit le mieux les donnes. Les formules de ces diffrents modles sont prsentes en annexe
1.

77
2.7.2.2. Test chronique

Les donnes de fcondit du test chronique sur les effets du mlange uranium-slnium
ont t analyses grce la mthode de Jonker dcrite prcdemment dans la partie test aigu.
Les donnes de croissance, dallocation dnergie la croissance et la fcondit, de
quantit de lipides ont t analyses quant elles grce un test ANOVA. Comme pour les
tests sur les substances seules, la normalit des rsidus ainsi que lhomognit de la variance
ont t vrifies. Un test de Tukey a ensuite t utilis pour dterminer le degr de
significativit (p value) entre les conditions prises deux deux. Les rsultats ont t prsents
avec la moyenne accompagne de lerreur standard (SE) et prenant des risques alpha 0.05 (*),
0.01 (**) et 0.001 (***).
78

3 3. .1 1. . I In nt tr ro od du uc ct ti io on n

Ltude bibliographique portant sur les effets de luranium a permis de mettre en
vidence le fait que les donnes de toxicit sont trs variables. Afin de mieux comprendre la
toxicit de luranium, un premier objectif de ce chapitre a t dvaluer linfluence de la
spciation sur la toxicit de luranium. Dans un premier temps, nous nous sommes intresss
la spciation dans le milieu dexposition des daphnies et avons cherch optimiser la
biodisponibilit de luranium tout en respectant la physiologie de la daphnie. Dans un second
temps, les donnes deffets de la littrature et celles obtenues dans le milieu dfini dans le 1
er

temps, ont t compares en fonction de la spciation chimique de luranium dans le milieu.
Cette seconde partie a t ralise afin de voir si la spciation de luranium dans les diffrentes
tudes permettait dexpliquer les diffrences de toxicit observes.

Compte tenu du fait que les donnes de la littrature concernant les effets chroniques
de luranium sur la daphnie se sont limites uniquement la reproduction, le second objectif de
cette tude a t dacqurir des donnes deffet sur les traits de vie. Des paramtres
nergtiques comme des mesures dallocation nergtique la croissance et la reproduction
(AECR) ont t ralises pour valuer les effets potentiels sur la population.

Les tudes de la littrature portant sur les mcanismes daction de luranium ont montr
que luranium tait toxique non seulement en raison de ses proprits radiologiques mais aussi
en raison de ses proprits chimiques. Le dernier objectif a consist valuer la part de toxicit
due aux proprits radiologiques et celle due aux proprits chimiques de luranium en
comparant les rsultats obtenus pour luranium avec ceux dcrits dans la littrature pour les
substances radioactives et les mtaux trace.

Une partie des rsultats sur les effets de luranium a fait lobjet dune publication dans
la revue Aquatic Toxicology (Zeman et al., 2008) et est prsente en annexe 10.
Chapitre 3. Effets de luranium
79
3 3. .2 2. . R R s su ul lt ta at ts s

3.2.1. Toxicit aige

Le test de toxicit aige a permis de calculer une CE
50
mortalit 48h de 39040 g.L
-1

U et une CE
10
-1
U dans le milieu M4-pH7. Dans le milieu M4-
pH8, la toxicit aigu de luranium est largement plus faible que dans le milieu M4-pH7 avec
une CE
50
mortalit 48h de 7.83.2 mg L
-1
U. Les courbes dose-rponse obtenues ainsi que les
donnes 24h sont prsentes en annexe 11.
Dans le milieu M4, lion uranyle (UO
2
2+
) fait partie des espces dominantes de
luranium jusqu pH 6 (Figure 27). Au-del de ce pH, les formes hydroxyles, carbonates et
carbonates calciques apparaissent. Les espces duranium pH 7 et pH 8 diffrent
beaucoup : pH 7, lespce (UO
2
)
2

CO
3

(OH)

3-
domine, alors qu pH 8 lespce
Ca
2
UO
2
(CO
3
)
3(aq)
est majoritaire. On peut aussi noter limportance de lEDTA sur la spciation
de luranium dans le milieu M4 et en particulier aux faibles pH. Son influence est cependant
ngligeable aux pH tudis.
pH
0%
25%
50%
75%
100%
4 5 6 7 8 9
e
s
p
c
e
s

(
%
)

Ca Ca
2 2
UO UO
2 2
(CO (CO
3 3
) )
3 ( 3 (aq aq) )
(UO (UO
2 2
) )
2 2
CO CO
3 3
(OH) (OH)
3 3- -
UO UO
2 2
H EDTA H EDTA
(UO (UO
2 2
) )
2 + 2 +
UO UO
2 2
SO SO
4( 4(aq aq) )
UO UO
2 2
OH OH
+ +
UO UO
2 2
HPO HPO
4( 4(aq aq) )
UO UO
2 2
OH OH
2( 2(aq aq) )
UO UO
2 2
(CO (CO
3 3
) )
2 2
2 2- -
Ca Ca
2 2
UO UO
2 2
CO CO
3 3
3 3- -
pH
0%
25%
50%
75%
100%
4 5 6 7 8 9
e
s
p
c
e
s

(
%
)

Ca Ca
2 2
UO UO
2 2
(CO (CO
3 3
) )
3 ( 3 (aq aq) )
(UO (UO
2 2
) )
2 2
CO CO
3 3
(OH) (OH)
3 3- -
UO UO
2 2
H EDTA H EDTA
(UO (UO
2 2
) )
2 + 2 +
UO UO
2 2
SO SO
4( 4(aq aq) )
UO UO
2 2
OH OH
+ +
UO UO
2 2
HPO HPO
4( 4(aq aq) )
UO UO
2 2
OH OH
2( 2(aq aq) )
UO UO
2 2
(CO (CO
3 3
) )
2 2
2 2- -
Ca Ca
2 2
UO UO
2 2
CO CO
3 3
3 3- -

Figure 27: Exemple de la spciation de luranium (VI) dans le milieu M4 en fonction du pH. (Simulation J-Chess
ralise la CE
50
-1
U)
80
Lors du test aigu, dans le milieu M4-pH8, un prcipit jaune a t observ aux
concentrations suprieures 10 mg.L
- 1
U. Ces observations sont en accord avec les calculs
raliss avec J-Chess, qui ont permis de dterminer la limite de solubilit de luranium dans nos
milieux dtude. Cette limite de solubilit pour luranium dans le milieu M4-pH7et M4-pH8 est
de 0,8 et 1,8 mg.L
-1
, respectivement.
Nous avons ensuite cherch comparer nos donnes de toxicit aigu aux valeurs de la
littrature (Barata et al., 1998 ; Poston et al., 1984). Cette comparaison entre les diffrentes
tudes a t ralise sur la base de la spciation prdite CE
50
mortalit 48h (Tableau 6).

Tableau 6. Concentrations en uranium (g.L
-1
U), paramtres chimiques de leau et estimation des concentrations
en ion libre (g.L
-1
UO
2
2+
) calcules en utilisant les simulations gochimiques (J-Chess, (Van der Lee, 1998) sur
la base des compositions physico-chimiques des eaux) en se plaant la CE
50
mortalit 48h uranium pour les
conditions donnes par Barata et al. (1998), Poston et al. (1984) et pour les conditions de notre tude (M4-pH8 et
M4-pH7).

M4-pH7 M4-pH8
Eau
moderment
-dure
Eau dure
Eau
douce
Eau
moderment-
dure
Eau dure
Eau synthtique Eau synthtique Eau de la rivire Columbia
(notre tude) Barata et al. (1998) Poston et al. (1984)

Concentration totale en U
(mg.L
-1
U) la CE
50
48h
0.39 7.8 8.3 22.4 6.4 37.5 51.9

pH
7.0 8.0 7.7 8.1 7.9 8.3 8.6
Alcalinit (mg.L
-1
CaCO
3
)
2.7 34 62 126 57 93 129
Duret (mg.L
-1
CaCO
3
)
250 250 90 179 70 133 197
UO
2
2+
libre (g.L
-1
U )
1.7 10
-1
1.7 10
-4
7.0 10
-3
1.5 10
-3
1.3 10
-3
4.5 10
-4
6.5 10
-6

Pour ltude de Poston et al. (1984), nos calculs ont permis destimer des valeurs de 1,3
10
-3
; 4,5 10
-4
; 6,5 10
-6
g.L
-1
UO
2
2+
, respectivement pour les conditions 70, 133 et 197 mg.L
-1
de CaCO
3
. (eau dure, modrment dure et douce). Les espces majoritaires taient
Ca
2
UO
2
(CO
3
)
3(aq)
et (UO
2
)
2
CO
3
(OH)
3
-
, avec une quantit de Ca
2
UO
2
(CO
3
)
3(aq)
augmentant
avec la duret. Les concentrations en ion libre uranyle rapportes par Barata et al. dans ses
deux conditions dtude (eau modrment dure et dure) ont t en accord avec celles que nous
avons recalcules dans notre tude partir des paramtres chimiques des milieux quils ont
reports dans leur article (0,007 et 0,0015 g.L
-1
, respectivement pour leau modrment-dure
et dure). Les concentrations en ion libre uranyle dans le milieu M4-pH7 au niveau de la CE
50

81
mortalit 48h (~1.7x10
-1
g.L
-1
UO
2
2+
) tait au moins de 25 fois suprieure aux concentrations
calcules pour les milieux utiliss par Poston et al. (1984) et Barata et al. (1998).

3.2.2. Toxicit chronique

3.2.2.1. Mortalit

Dans le test ayant pour but de mettre en vidence les effets chroniques de luranium,
aucun phnomne de mortalit na t observ, sauf pour les daphnies exposes la plus forte
concentration en uranium (100g.L
-1
U) qui ont montr un taux de mortalit de 10% aprs 21
jours (2 daphnies mortes /20 daphnies).

3.2.2.2. Croissance

Le suivi de la masse des individus au cours de lexprimentation a permis de mettre en
vidence un effet de luranium sur la masse sche des daphnies (Figure 28). Les rsultats
montrent que la masse sche somatique (sans la ponte) est significativement rduite, par
rapport celle des daphnies tmoin, aprs 7 jours dexposition, des concentrations en
uranium 50g.L
-1
. Aprs 20 jours dexposition, une diminution significative de la masse
sche des daphnies a ensuite t observe ds 25g.L
-1
U.

Tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
0
50
100
150
200
250
0 7 14 21
Age (jours)
B
i
o
m
a
s
s
e

(
g
)
Control
10g/L
25g/L
50g/L
75g/L
100g/L
Tmoins et<50g.L
-1
Exposs 50g.L
-1
***
***
***
***
***
***
Tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
Tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
0
50
100
150
200
250
0 7 14 21
Age (jours)
B
i
o
m
a
s
s
e

(
g
)
Control
10g/L
25g/L
50g/L
75g/L
100g/L
Tmoins et<50g.L
-1
Exposs 50g.L
-1
***
***
***
***
***
***
Tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U

Figure 28: Biomasse sche des daphnies en fonction du temps et de la concentration en uranium. ANOVA :
*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Barre derreur =SE. n=10.
82

Les changements de masse sche w(i) avec lge i (en jours) ont t dcrits en utilisant
un modle exponentiel pour le stade juvnile (ge i 7 jours):

) 1 (
) 1 ( ) (

=
i g
e w i w

avec w(1) = 9,4 g.daphnie
1
, w(7) = 62,5 g.daphnie
1
et g = 0,32 jour
1
(dans les tmoins et
aux concentrations 10 et 25g.L
-1
U) et avec w(7) = 51,5 g.daphnie
1
et g = 0,28 jour
1
(aux
concentrations 50, 75 et 100g.L
-1
U). Ds que les daphnies commencent produire des ufs
(ge i 7 jours, stade adulte), le poids sec w(i) suit alors un modle de Von Bertalanffy:

| |
) 7 (
exp ) 7 ( (max) (max) ) (

=
i k
w w w i w

avec k = 0,5 jour
1
indpendant des conditions dexposition et w(max) changeant entre les
diffrentes conditions dexposition: w(max) = 180 g.daphnie
1
(dans les contrles et aux
concentrations 10 et 25g.L
-1
U, n=90); w(max) = 116 g.daphnie
1
(aux concentrations 50, 75
et 100g.L
-1
U, n=90).
La masse des daphnies augmente trs fortement durant le stade juvnile dans les
conditions dexposition 0, 10 et 25 g.L
-1
U, denviron 38% par jour et ensuite se stabilise avec
un taux de croissance moyen proche de 0 % entre 14 et 21 jours. Les daphnies exposes 50,
75 et 100 g.L
-1
U sont lgrement plus petites que les individus exposs aux plus faibles
concentrations en uranium avec un taux de croissance masse spcifique de 23% pendant le
stade juvnile et proche de 0% entre 14 et 21 jours.
Le suivi des mues au cours du temps a permis de montrer que lexposition luranium
des daphnies naffecte pas leur frquence. En effet, aucune diffrence concernant loccurrence
des mues na t observe entre les mues chez les tmoins et les mues chez les daphnies
exposes. Les mesures de poids sec des mues ont montr que la masse des mues (y) ntait pas
affecte par lexposition luranium et quelle augmente avec lge des daphnies (x) en suivant
une relation linaire (y = 0,18 x + 8,06 ; n = 12 ; r
2
= 0,70).

83
3.2.2.3. Reproduction

La reproduction des daphnies a t affecte ds lexposition 25g.L
-1
U. La fcondit
21 jours (nombre de juvniles par femelle produit en 21 jours) est le paramtre le plus sensible
avec une CE
50
et une CE
10
estimes respectivement 9115 et 147g.L
-1
U (n=10, =0,05)
(Figure 29).

10
20
30
40
50
60
70
80
1 10 100
uranium concentration g.L
-1
f
e
c
u
n
d
i
t
y
0
Concentration en uranium (g.L
-1
)

F
c
o
n
d
i
t

2
1

j
o
u
r
s

Figure 29 : Nombre total de juvniles produits par femelle en 21 jours en fonction de la concentration dexposition
en uranium. Barre derreur =SE. n=10.

Au niveau des pontes 1, 3, et 5, deux paramtres ont t suivis : la fraction des daphnies
se reproduisant ainsi que la fcondit (nombre de juvniles par daphnie par ponte).
La fraction des daphnies se reproduisant na t affecte qu la premire ponte : elle est
de 60 % pour celles exposes 75g.L
-1
U et de 20 % seulement pour celles exposes
100g.L
-1
U. Aux faibles concentrations en uranium (de 10 50 g.L
-1
U) 100% des daphnies
ont produit des ufs (n=10 par concentration teste) et 90% des daphnies ont produit des ufs
parmi les daphnies tmoin.
La fcondit des daphnies la 1
re
et la 3
me
ponte est significativement plus faible que
celle des tmoins aux trois plus fortes concentrations dexposition (de 50 100 g.L
-1
U). A la
5
me
ponte une rduction significative du nombre de juvniles par daphnies a t mise en
vidence partir dune exposition 25 g.L
-1
U (Figure 30).
84

j
u
v
n
i
l
e
s
.
d
a
p
h
n
i
e
-
1
Ponte
1 3 5
0
5
10
15
20
25
30
*
*
*
**
***
***
***
***
***
***
**
j
u
v
n
i
l
e
s
.
d
a
p
h
n
i
e
-
1
Ponte
1 3 5
0
5
10
15
20
25
30
*
*
*
**
***
***
***
***
***
***
**

Figure 30 : Taille des pontes (nombres ufs par ponte) en fonction du numro de ponte et de la concentration en
uranium. ANOVA : *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Barre derreur =SE. n=10.

Le poids sec des ufs augmente de faon significative avec lge des femelles (Figure
31), avec des valeurs allant de 4,30,2 g

au jour 7 (ponte 1, n=10, p<0,05) 8,50,4 g au
jour 21 (ponte 5, n=10, p<0,05). La masse sche des juvniles gs de moins de 24h est, elle
aussi, croissante en fonction de lge des mres, de 5,50,6 g (n=10, p<0,05) pour la ponte 1
9,60,8 (n=10, p<0,05) pour la ponte 3, et ensuite se stabilise 9.60.4 g

(n=10, p<0,05) pour
la ponte 5. Ces observations ont t ralises chez les daphnies tmoins.

Le suivi des daphnies exposes luranium a permis de montrer que luranium entrane
une rduction de la masse sche des ufs. Une rduction significative a t observe pour les
ufs issus de la 3
me
ponte lors dune exposition des concentrations en uranium suprieures
ou gales 25g.L
-1
U (7,60,6 g par uf, n=10, p<0,05) et pour les ufs issus de la 5
me

ponte lors dune exposition suprieure ou gale 50g.L
-1
U (6,80,3 g par uf, n=10,
p<0,05).
Contrairement la masse des ufs, la masse sche des juvniles gs de moins de 24h
na pas t significativement affecte.
tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
85

1 3 5
0
2
4
6
8
10
12
***
**
***
***
***
***
***
***
***
C
Brood
g

D
W

e
g
g
-
1
1 3 5
0
2
4
6
8
10
12
***
**
***
***
***
***
***
***
***
1 3 5
0
2
4
6
8
10
12
***
**
***
***
***
***
***
***
***
C
Brood
g

D
W

e
g
g
-
1
Ponte
g
1 3 5
0
2
4
6
8
10
12
***
**
***
***
***
***
***
***
***
C
Brood
g

D
W

e
g
g
-
1
1 3 5
0
2
4
6
8
10
12
***
**
***
***
***
***
***
***
***
1 3 5
0
2
4
6
8
10
12
***
**
***
***
***
***
***
***
***
C
Brood
g

D
W

e
g
g
-
1
Ponte
g

Figure 31 : Poids sec des ufs en fonction de la ponte et de la concentration en uranium. ANOVA : *p<0,05,
**p<0,01, ***p<0,001. Barre derreur =SE

Nous avons ralis une exprience complmentaire dans le but dvaluer la sensibilit
des ufs de daphnies lexposition luranium. Dans cette tude, les ufs de daphnies tmoin,
dissqus et placs dans du milieu M4-pH7 avec une concentration de 0,4 mg.L
-1
U quivalente
la CE
50
mortalit 48h de luranium, nont montr aucun retard de dveloppement par rapport
aux ufs placs dans des conditions contrle. Aucune malformation na t observe. Les ufs
semblent donc moins sensibles que les juvniles, ce qui est probablement d au fait que les
ufs sont protgs une grande partie de leur dveloppement par la membrane embryonnaire
trs peu permable.

tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
86
3.2.2.4. Allocation dnergie la croissance et la reproduction

Pour raliser un calcul simplifi de lallocation dnergie la croissance et la
reproduction, il est ncessaire de mesurer lentre dnergie chez la daphnie, estime grce aux
mesures dingestion et lnergie du mtabolisme, estime grce la respiration.

Ingestion

Le taux de filtration masse spcifique ne montre pas de diffrence entre les daphnies
contrle et les daphnies exposes aprs 7 jours et 14 jours (pontes 1 et 3). A la 5
me
ponte (jour
21) le taux dingestion masse spcifique dcrot significativement pour les daphnies exposes
des concentrations 75g.L
-1
U (Figure 32). Cependant, lorsque lingestion est exprime par
daphnie, elle est significativement rduite aux concentrations 25, 75 et 100g.L
-1
.U au jour 7
(1
re
ponte) et toutes les concentrations au dessus de 25g.L
-1
U au jour 21 (5
me
ponte).
Aucun effet na t observ la ponte 3.

1 3 5
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
*
* *
C
.

m
g
d
a
p
h
n
i
e
-
1

.
j
-
1
Ponte
1 3 5
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
*
* *
C
.

m
g
d
a
p
h
n
i
e
-
1

.
j
-
1
Ponte

Figure 32 : Taux dingestion en fonction des pontes et de la concentration en uranium
ANOVA : *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Barre derreur =SE. n=5.

tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
87

Respiration

Les taux de respiration masse spcifique (ou taux de consommation doxygne masse
spcifique) taient suprieurs au dessus de 25g.L
-1
U par rapport aux tmoins au jour 7 (ponte
1) (Figure 33).
Au jour 14 (ponte 3), le taux de consommation doxygne masse spcifique est
significativement plus lev uniquement la plus forte concentration dexposition (100g.L
-1

U).
A 21 jours (ponte 5), aucun effet de luranium nest observ sur le taux de respiration.

m
o
l

O
2
.
m
g

d
a
p
h
n
i
e
-
1
.
h
-
1
1 3 5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
* ** **
***
***
*
Ponte
m
o
l

O
2
.
m
g

d
a
p
h
n
i
e
-
1
.
h
-
1
1 3 5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
* ** **
***
***
*
Ponte

Figure 33: Taux de respiration en fonction des pontes et de la concentration en uranium
ANOVA : *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Barre derreur =SE. n=5.

tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
88
Allocation dnergie la croissance et la reproduction

Les calculs dallocation dnergie la croissance et la reproduction masse spcifique
(AECR) montrent une rduction significative de cette nergie la premire ponte aux
concentrations 25 et 100g.L
-1
U (Figure 34). A la 5
me
ponte une rduction significative de
lAECR a t observe pour les concentrations dexposition 25, 75 et 100g.L
-1
U.

1 3 5
g
p
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
* *
** **
*
J
.

m
g

d
a
p
h
n
i
e
-
1
.
h
-
1
Ponte
1 3 5
g
p
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
* *
** **
*
J
.

m
g

d
a
p
h
n
i
e
-
1
.
h
-
1
Ponte

Figure 34 : Allocation dnergie la croissance et la reproduction en fonction des pontes et de la concentration
en uranium. ANOVA : *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Barre derreur =SE. n=5.
tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
89
3.2.2.5. Effets sur la population

Les donnes de mortalit et de reproduction ont t intgres dans une matrice de Leslie
afin de les regrouper et dvaluer limpact de luranium sur la dynamique des populations
(Figure 35).

1E+04
0
20 40
temps (jours)
0
10
25
50
75
100
1E+08
1E+00

g.L
-1
U
g.L
-1
U
g.L
-1
U
g.L
-1
U
g.L
-1
U
g.L
-1
U

Figure 35 : Evolution de leffectif au cours du temps en fonction de la concentration en uranium

Les rsultats prsents dans la figure 35 mettent en vidence un fort impact de la baisse
de reproduction pour la plus forte concentration (100 g.L
-1
U). Les trois concentrations, 25 et
50 et 75 g.L
-1
U, se dtachent de la plus faible concentration dexposition en uranium (10
g.L
-1
U) et de la condition tmoin et montrent ainsi un impact significatif de lexposition
luranium des concentrations suprieures ou gales 25 g.L
-1
U.

E
f
f
e
c
t
i
f

90
3.2.2.6. Effets sur le tube digestif de la daphnie

Suite aux observations ralises au niveau de lindividu, et en particulier suite aux taux
ingestion rduits pour les daphnies les plus exposes luranium, nous nous sommes intresss
ltat des cellules intestinales. Nos observations au microscope optique des cellules
intestinales ont t ralises sur des daphnies exposes pendant 21 jours deux concentrations
en uranium (50 et 100 g.L
-1
U) et sur des daphnies tmoins. Elles ont permis de rvler des
altrations au niveau du tube digestif. Les daphnies tmoin prsentent une paroi intestinale
assez rgulire avec la prsence de quelques espacements entre certaines cellules probablement
dus des cellules manquantes (Figure 36). Les intestins de daphnies exposes 50 g.L
-1
U
prsentent aussi les mmes types despacements que ceux observs chez les daphnies tmoin,
leur nombre est cependant accru par rapport au tmoin. Les cellules intestinales des daphnies
exposes prsentent aussi de nombreuses vacuoles qui, elles, nont pas t retrouves dans les
cellules des daphnies tmoin. Les daphnies exposes 100 g.L
-1
U prsentent un nombre
despacements encore accru par rapport aux daphnies exposes 50 g.L
-1
U avec une quantit
de vacuoles suprieure celle observe chez les daphnies exposes 50 g.L
-1
U. A cette
concentration, nous avons aussi observ un gonflement des cellules refltant une altration
profonde de lintgrit des cellules intestinales (Figure 36).

Tmoins 50 g.L
-1
U 100 g.L
-1
U

Figure 36 : Observations au microscope optique de tube digestif de daphnies contrle et de daphnies exposes 50
et 100 g.L
-1
U

Les observations au microscope lectronique transmission ralises sur ces mmes
daphnies ont permis de confirmer au niveau cellulaire les observations ralises au microscope
10m 10m 10m
lumire lumire lumire
Microvillosits
rgulires
C
e
llu
le
s

m
a
n
q
u
a
n
t
e
s
Dbris dalgues
Nombreuses
vacuoles
10m 10m 10m 10m 10m 10m
lumire lumire lumire
Microvillosits
rgulires
C
e
llu
le
s

m
a
n
q
u
a
n
t
e
s
Dbris dalgues
Nombreuses
vacuoles
91
optique. Ces observations ont t couples des mesures la sonde X et ont permis de mettre
en vidence une accumulation de luranium sous forme de prcipit dans les cellules
intestinales (Figure 37).

Figure 37 : Observations au microscope optique de tube digestif de daphnies exposes 100 g.L
-1
U et spectre
obtenu par EDS. La zone analyse est localise sur le granule observ lintrieur dune cellule intestinale.

3.2.2.7. Bioaccumulation et doses radiologiques dlivres

Les concentrations en uranium dans les daphnies augmentent avec la concentration
dexposition ainsi quavec le temps dexposition (Figure 38).
La bioaccumulation ne diffre pas significativement pour les deux concentrations
dexpositions 75 et 100 g.L
-1
U la ponte 1. Une rduction significative a mme t observe
entre ces deux concentrations dexposition 75 et 100 g.L
-1
, aux pontes 3 et 5. Ce phnomne
est probablement d laltration leve de la physiologie des daphnies 100g.L
-1
U.
Les dbits de dose calculs partir des mesures de bioaccumulation 21 jours (5
me

ponte) sont de 0.020,01; 2.10.2; 4.80.3; 7.90.5; 13.00.3; 8.80.9 Gy.h
-1
(n=5; p<0,05)
respectivement pour les concentrations 0, 10, 25, 50, 75 et 100 g.L
-1
U.
0,2 m
5 m
c
o
u
p
s

Energie (keV)
Prcipit contenant
de luranium
U
U
U
U
microvillosits
noyau
paroi cellulaire
Spectre EDS
Cellule intestinale
92

Ponte
1 3 5
n
g

U
.

m
g

d
a
p
h
n
i
e
-
1
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
*
*
a
b
a
a
a
a
a
b
b
c
a
a
a
b
b
b
c
a
a
a
a
b
b
b
d
d

Figure 38. Bioaccumulation de luranium dans la masse somatique sche des daphnies (ngU.mg
-1
) en fonction de
lexposition en uranium et du numro de ponte. a indique un effet significatif compar au tmoin et la
condition 10g. L
-1
U ; b indique un effet significatif compar la condition 25g. L
-1
U ; c indique un effet
significatif compar la condition 50g. L
-1
U ; d indique un effet significatif compar la condition 75g. L
-1

U avec p < 0,05. Barre derreur =SE.

tmoins
10 g.L
-1
U
25 g.L
-1
U
50 g.L
-1
U
75 g.L
-1
U
100 g.L
-1
U
93
3 3. .3 3. . D Di is sc cu us ss si io on n

3.3.1. Influence de la spciation chimique sur la toxicit de luranium

La biodisponibilit et la toxicit des mtaux trace dissous, comme luranium, sont
connues pour dpendre de leur spciation chimique en solution. Dans nos expriences, nous
avons modifi la composition du milieu dexposition pour augmenter la concentration des
espces biodisponibles de luranium tout en gardant des conditions compatibles avec la
physiologie de la daphnie. Selon le modle de lion libre (Campbell, 1995), lentre duranium
et sa toxicit consquente est proportionnelle la concentration de lion libre UO
2
2+
plutt qu
la concentration en uranium total. Ainsi, la complexation de UO
2
2+
avec des ligands
inorganiques (comme les carbonates et les hydroxyles) conduit une diminution de la
biodisponibilit de luranium (Fortin et al., 2004). De plus, dautres cations (comme Ca
2+
et
Mg
2+
) peuvent aussi contribuer rduire lentre de mtal et ainsi sa toxicit travers des
phnomnes de comptition au niveau des sites de liaison de surface (Di Toro et al., 2005 ;
Riethmuller et al., 2001). En effet, la duret du milieu et lalcalinit sont deux paramtres
entranant une rduction de la toxicit de luranium pour les organismes aquatiques (Barata et
al., 1998 ; Parkhurst et al., 1984 ; Poston et al., 1984 ; Sheppard et al., 2005).
Dans notre tude, en rduisant le pH et donc lalcalinit, la proportion de UO
2
2+
sest
retrouve alors accrue, ce qui a eu pour rsultat une diminution de la CL
50
48h (exprime en
concentration duranium total). A une comptition constante avec les cations (duret
identique), la CL
50
48h devrait logiquement tre associe une concentration constante
dUO
2
2+
. Cependant, la concentration de UO
2
2+
calcule la CL
50
48h varie de 1,7 10
-1
1,7
10
-4
g.L
-1
entre pH 7 et pH 8, et jusqu 6,5 10
-6
g.L
-1
pH 8,6 dans les conditions des eaux
rapportes dans les tudes prcdentes (Tableau 5).
Une corrlation entre la concentration en ion libre uranyle dans les diffrents milieux
la CE
50
mortalit 48h et le pH a pu tre mise en vidence (-log [UO
2
2+
] = 2.55 pH 8.84,
R
2
=0.89; Figure 39). Toutes les valeurs (Barata et al., 1998; Poston et al., 1984; notre tude)
ont t prises en compte pour tablir cette relation.

94
y = 2,55 x - 8,84
R
2
= 0,89, n=7, p=0.0015
8
9
10
11
12
13
14
15
6.5 7 7.5 8 8.5 9
pH
U
O
2
2
+

[

-
l
o
g

(
m
o
l

L
-
1
)

]

Figure 39: Concentration en ion libre uranyl (-log g.L
-1
UO
2
2+
) la CE
50
mortalit 48h uranium en
fonction du pH dans diffrentes conditions chimiques de milieu : celles de notre tude (M4-pH8 et M4-pH7),
celles de ltude de Poston et al. (1984) et de Barata et al. (1998).

La comptition avec Ca
2+
et Mg
2+
ne peut pas, elle seule, expliquer cette variation,
comme la duret de leau ne varie que de 70 250 mg L
-1
CaCO
3
. Ces observations suggrent
que linfluence de la spciation chimique et du pH est plus complexe que celle attendue.

Diffrentes hypothses peuvent tre formules quant au rle du pH sur la toxicit de
luranium comme:
une comptition de lion UO
2
2+
avec le proton H
+
, comme le suggre la relation linaire entre
CL
50
48h (exprime en -log [UO
2
2+
] concentration) et le pH (Figure 39), en accord avec Di
Toro et al. (2005),
une inhibition non-comptitive du transport du mtal par les protons, comme rcemment
report par Fortin et al. (2007) chez les algues (avec une plus grande entre de UO
2
2+
pH=8
plutt qu pH=7).,
une contribution dautres espces toxiques de luranium, incluant UO
2
OH
+
ou des complexes
carbonats (Fortin et al., 2007 ; Markich et al., 2000).
.
95
3.3.2. Effets de luranium diffrents niveaux dorganisation : au niveau
de la cellule, de lindividu et de la population.

Les effets chroniques de luranium ont tout dabord t tudis lchelle de lindividu
grce diffrentes mesures. Les paramtres les plus sensibles, comme la reproduction et la
croissance, sont affects par une exposition de luranium ds 25 g.L
-1
U. Comme nous
lavons montr prcdemment, paralllement cette diminution de croissance et de
reproduction, une diminution de lingestion ainsi quune augmentation significative de la
respiration ont t observes.
Ces deux paramtres ont permis dvaluer lallocation dnergie la croissance et la
reproduction (AECR). En effet, lAECR est dfinie comme la diffrence entre lnergie
assimile partir de la nourriture et lnergie mtabolise pour la maintenance de lorganisme
(respiration et excrtion). Ce paramtre donne une indication valable de ltat de sant dun
organisme (Baillieul et al., 2005). Dans notre tude, luranium a t montr comme induisant
une rduction significative de lAECR masse spcifique ds 25g.L
-1
U (Figure 34). A la plus
forte concentration, lAECR reprsente seulement 10% de la valeur mesure chez les tmoins.
Cette forte diminution de lAECR est principalement associe une rduction de lingestion.
En effet, la baisse dingestion observe explique 64% de la rduction de lnergie disponible
la 1
re
ponte et 100% celle observe la 5
me
. Ces effets ont t complts par des observations
au niveau cellulaire. Les observations des daphnies exposes 50 et 100 g.L
-1
U au
microscope optique et au microscope lectronique transmission nous ont permis de mettre en
vidence une profonde altration du tube digestif avec une accumulation duranium dans ses
cellules. Ces effets dltres au niveau du tube digestif peuvent tre relis au niveau suprieur
c'est--dire au niveau de lindividu la baisse dingestion observe.

Laugmentation de la demande nergtique pour lutter contre le stress engendr par
luranium (mesur grce la respiration) explique quant elle au maximum 28% de la
diminution de lnergie disponible pour la croissance et la reproduction (ponte 1). Ces
observations sont en accord avec la thorie mtabolique du cot nergtique (Calow et Sibly,
1990 ; Calow, 1991 ; De Coen et Janssen, 2003) qui considre que dans des conditions de
stress, un organisme met en place des dfenses et des mcanismes de rparation qui cotent de
lnergie. Ainsi tout stress induit une rduction de lnergie disponible pour la croissance et la
reproduction.
96
Dans notre tude, la croissance et la reproduction montrent la mme sensibilit
lexposition luranium, les deux tant rduites la concentration de 50 g.L
-1
, ds la 1
re

ponte, et 25 g.L
-1
U lors de la 5
me
ponte. Pour la reproduction, le nombre dufs produits
en 21 jours ainsi que la masse des ufs produits aux pontes 3 et 5 ont t affects par les
concentrations croissantes duranium, ce qui potentiellement entranerait des consquences
majeures pour la dynamique des populations. En effet, Ebert (1991) a montr que la production
de petits ufs aurait pour rsultat une croissance somatique rduite et aussi une reproduction
retarde de cette descendance. Les effets significatifs au niveau de lAECR refltent
limportance du stress de luranium sur les rserves nergtiques de la daphnie et ainsi la
capacit de la population se maintenir dans un cosystme.

Les effets mesurs sur la fcondit et sur la mortalit lchelle de lindividu ont t
intgrs dans un modle de dynamique de population simple, une matrice de Leslie. Ce modle
permet de mettre en vidence les effets de luranium au niveau de la population et confirme les
conclusions formules partir des donnes dallocation dnergie la croissance et la
reproduction.

97
3.3.3. Chimiotoxicit et radiotoxicit de luranium

La toxicit chimique de luranium est couramment considre comme plus importante
que sa radiotoxicit (Miller et al., 2002 ; Sheppard et al., 2005). Pour pouvoir comparer
luranium aux substances radioactives, sa radiotoxicit a t value grce des calculs de
doses raliss partir des donnes de bioaccumulation. La bioaccumulation maximale a t
observe chez les daphnies exposes 75 g.L
-1
U. Dans cette condition, les daphnies ont t
exposes un dbit de dose maximal de 13 Gy.h
-1
.
Une prcdente tude ralise par Alonzo et al. (2006), sest intresse aux effets de
lamricium 241 (241-Am, metteur alpha) sur Daphnia magna. Les effets observs lors de
cette exposition l241-Am sont beaucoup moins importants que ceux obtenus dans notre
tude avec luranium, alors que les doses dans ltude des effets de l241-Am taient bien plus
leves que celles de lU. En effet, lors dune exposition l241-Am, lingestion et la fcondit
ne sont pas affects jusqu un dbit de dose de 7900 Gy.h
-1
alors que la masse sche des
ufs et la survie des juvniles non nourris dcrot partir dun dbit de dose de 160 Gy.h
-1
.
La croissance somatique est, quant elle, rduite aprs 16 jours 900 Gy.h
-1
et la respiration
augmente aprs 23 jours 7900 Gy.h
-1
.
Une autre tude (Gilbin et al., 2007) sest, quant elle, attache aux effets dune
exposition une radiation gamma sur la daphnie, avec des dbits de doses allant de 400 3100
Gy.h
-1
. Cette tude a montr que lirradiation gamma affecte la reproduction de Daphnia
magna avec un temps de libration des pontes raccourci pour les daphnies irradies (1 ou 2
jours davance 3100 Gy.h
-1
). A ce dbit de dose, une rduction de la taille des pontes aprs
15 jours dexposition a caus une rduction de la fcondit 21 jours de 21%. Contrairement
aux rsultats obtenus avec luranium, aucun changement na t dtect ni au niveau de la
masse des ufs, ni au niveau de la respiration, de lingestion, ou de la croissance somatique.
Au regard de ces deux tudes, en comparaison avec le dbit de dose maximum issu de
lexposition luranium (13Gy.h
-1
), il est donc peu probable que les effets du stress li la
radiation alpha soient significatifs. Les effets observs ds 25g.L
-1
U sur la reproduction et
lAECR rsultent probablement en grande partie de sa toxicit chimique.
Comme les effets de luranium semblent lis principalement sa toxicit chimique, les
similitudes avec les autres mtaux semblent donc intressantes examiner. Nous avons estim
dans notre tude une CE
10
21 jours de 59 M (14 g.L
-1
U) pour la reproduction. Cette
concentration est comparable aux valeurs rapportes dans la littrature pour le cadmium (33
98
M) et le cuivre (118 M), suggrant que luranium pourrait tre considr comme faisant
partie des mtaux les plus toxiques. Il est aussi important de noter que la toxicit du Cd et du
Cu ressemble celle rapporte pour luranium, en termes de nature deffet produit. En effet,
lAECR lors dun stress au cadmium ou au cuivre est fortement rduite rsultant
principalement dune ingestion rduite. Les consquences dune exposition au Cu ou au Cd
pour les organismes sont une croissance somatique rduite et une fcondit fortement altre
(Bodar et al., 1988 ; Baird et al., 1990 ; Knops et al., 2001 ; Baillieul et al., 2005). Ces
rsultats sont trs diffrents de ceux obtenus avec lAm-241 o le taux ingestion ntait pas
touch et la fcondit des daphnies restait constante (Alonzo et al., 2006).

Les mcanismes de toxicit du cadmium et du cuivre sont connus pour induire la
production despces ractives loxygne lesquelles affectent les processus physiologiques
(Stohs et Bagchi, 1995 ; Livingston, 2001). Comme certains mtaux de transition, luranium
active chimiquement des espces ractives loxygne via des ractions redox (Miller et al.,
2002 ; Yazzie et al., 2003). Des recherches complmentaires seraient ncessaires pour tester si
luranium, le cadmium et le cuivre partagent les mmes mcanismes daction et ainsi amliorer
la comprhension des consquences de lexposition luranium des organismes deau douce.

99
3 3. .4 4. . P Pr ri in nc ci ip pa al le es s a av va an nc c e es s e et t c co on nc cl lu us si io on ns s

Cette tude de la toxicit de luranium a permis non seulement de mieux comprendre les
effets de luranium chez la daphnie sur diffrents paramtres mais a permis aussi dapporter des
lments pour ltude du mlange binaire uranium-slnium. Ces diffrents lments ont t
dvelopps en plusieurs points :

3.4.1. Choix du milieu dexposition pour les exprimentations visant
tudier la toxicit du Se seul et du mlange U et Se

Cette tude ralise sur luranium a montr limportance dutiliser le milieu M4-pH7
pour les exprimentations concernant la toxicit de luranium, pour que luranium ne prcipite
pas et que sa biodisponibilit soit optimise. Nous avons donc choisi de raliser les prochaines
expriences sur la toxicit du slnium et sur la toxicit du mlange binaire uraniumslnium
dans ce milieu. Ce milieu mme milieu bien que moins favorable aux daphnies que le milieu
recommand dans les tests normaliss, le M4-pH8 (Elendt, 1990), il permet malgr tout de
maintenir llevage dans des conditions qui rpondent aux critres de validit des tests
normaliss. En effet, la fcondit de llevage est suprieure 60 juvniles par daphnie en 21
jours. De plus, llevage a t maintenu dans ce milieu M4-pH7 pendant 4 annes conscutives
sans quaucun phnomne de carence napparaisse au cours du temps, dmontrant que ce
milieu permet bien aux daphnies de se maintenir.

3.4.2. Un test chronique 21 jours raccourci 7 jours

La revue bibliographique ralise sur ltude des effets des mlanges a mis en vidence
quun grand nombre de conditions testes avec un nombre de rplicats important tait
ncessaire. Certains auteurs ont propos de raccourcir le test reproduction classique 21 jours
7 jours. Cette alternative nous a sembl intressante envisager, car elle nous permet multiplier
les expriences, la dure dexprience tant divise par 3, et daugmenter le nombre de
conditions lors de chaque test. Les rsultats obtenus de CE
50
fcondit 7 jours et 21 jours sont
assez proches avec un effet plus fort 7 jours qu 21 (annexe 12) avec une CE
50
fcondit 7
jours de 6112g.L
-1
U et celle 21 jours de 9115g.L
-1
U.
100
A 7 jours, la fcondit est estime partir des ufs prsents dans la poche de ponte. Or
le nombre dufs peut ne pas tre reprsentatif de la capacit reproductive, dans le cas o une
partie des ufs ne sont pas viables. Cependant, des tests raliss sur les ufs ont montr que la
viabilit des ufs ntait pas affecte pour la gamme de concentrations tudies en exposition
chronique. Ainsi, le nombre dufs peut tre considr comme reprsentatif du nombre de
juvniles viables. Le test 7 jours semble donc, dans ce cas de ltude, reprsentatif des effets
observs 21 jours.

3.4.3. Paramtres dtude retenus pour les exprimentations en mlange

Parmi tous les paramtres tudis lors du test chronique 21 jours, la fcondit est le
paramtre le plus sensible avec une CE
10
de 147g.L
-1
U. La fcondit a t choisie en premier
pour ltude des effets des mlanges car non seulement elle est sensible mais une relation dose-
rponse suivant un modle logistique a pu tre mise en vidence. Ce paramtre ainsi quune
gamme de concentration allant 10 100 g.L
-1
U (permettant davoir un effet attendu de 0
100%), ont alors t retenus pour tablir le design exprimental des expriences de mlange.
Les autres paramtres tudis ne prsentent pas de relation dose-rponse aussi claire que
celle observe pour la fcondit mais sont assez sensibles et permettent de mettre en vidence
des effets ds la concentration dexposition 25 g.L
-1
U. Ces paramtres ont donc t mesurs
par la suite mme sils nont pas t intgrs dans des modles permettant didentifier les
interactions entre les diffrents composs dun mlange.

3.4.4. Luranium : principalement une substance chimique toxique et non
un stresseur radioactif

Les rsultats de cette tude ont montr que la toxicit de luranium tait principalement
due sa chimiotoxicit. Le fait que luranium puisse tre considr comme une substance
chimique est important pour la suite des exprimentations car cela permet dexprimer
lexposition des daphnies luranium en concentration dans le milieu. Dans le cas des
stresseurs radioactifs, o la toxicit est due principalement leurs proprits radiologiques,
lexposition des individus est exprime en dose en lien avec concentration internalise.
Exprimer lexposition luranium des daphnies en dose aurait rendu plus difficile lutilisation
des modles dose-rponse utilis dans le cadre de ltude des effets de mlange.
101


Comme ltude bibliographique nous la montr, il existe dans les cosystmes
aquatiques continentaux principalement deux formes de slnium : le slnite et le slniate.
De nombreuses tudes se sont intresses la toxicit du slnium sous ces deux formes chez
les organismes aquatiques. Les donnes de la littrature ont aussi montr pour chacune des
formes des toxicits assez proches.

Un premier objectif de cette tude des effets du slnium chez la daphnie a t de
vrifier que la toxicit du slnite et du slniate tait assez proche comme le suggraient les
rsultats de la littrature. Ces exprimentations ont eu pour but de dterminer la toxicit du
slnite et du slniate dans les conditions physico-chimiques de notre milieu choisi suite aux
expriences ralises sur luranium.

La seconde partie de ce travail avait non seulement pour but dtudier les effets
chroniques du slnium, mais aussi dessayer de mettre en vidence les zones de carence et de
toxicit du slnium grce diffrents paramtres et surtout de dterminer la concentration
partir de laquelle le slnium peut tre considr comme toxique. En effet, dans les
exprimentations en mlange il est ncessaire, pour appliquer les modles de mlange utiliss
habituellement pour les substances chimiques, que les deux lments soient considrs comme
toxiques. La difficult de cette tude a rsid dans le fait que la gamme de concentrations pour
laquelle le slnium passe dessentiel toxique est trs troite (Hodson et Hilton, 1983 ;
USEPA, 2004). Diffrents paramtres, tels que la survie, la croissance, la reproduction et la
respiration ont donc t choisis pour identifier ces diffrentes zones.

Chapitre 4. Effets du slnium
102

4.2.1. Toxicit aige

Lobjectif du test a t dtudier les effets aigus du slnite et du slniate sur
Daphnia magna. Dans un tout premier temps, nous avons ralis les calculs J-Chess pour avoir
une ide du comportement du slnite et du slniate dans leau. Ces simulations ont pu mettre
en vidence que, dans le milieu M4-pH7, le slnite soxyde thoriquement entirement sous
forme de slniate lquilibre thermodynamique.
Cependant les mesures ralises par HG-QFAAS nous ont permis de nous assurer
que, dans les exprimentations visant tudier la toxicit du slnite, le slnite que lon
introduisait dans nos chantillons test ntait pas oxyd le temps de lexprimentation (moins
de 10% de slniate prsent correspondant lincertitude de mesure de la technique).
Les tests aigus raliss sur les deux formes de slnium ont donc permis dtablir
des courbes dose-rponse pour chaque substance (Annexe 13). Les concentrations ltales
entranant 50% de mortalit (CE
50
) calcules partir de ces tests ont t prsentes dans le
tableau 7.

Tableau 7: CE
50
issues des courbes doses rponse tablies pour le slnite et slniate aprs 24 et 48 heures
d'exposition. Toutes les valeurs sont donnes avec lintervalle de confiance 95%.

Slnite (g.L
-1
Se) Slniate (g.L
-1
Se)
24h 48h 24h 48h
CE
50
4120145 186885 4635269 1985180

Les donnes prsentes dans le tableau 7 montrent des valeurs de toxicit trs proches
pour les deux formes de slnium (slnite et slniate) comme cela avait t prcdemment
observ dans la littrature. En effet, il a t montr que la bioaccumulation du slnium tait
trs semblable pour les deux formes : Besser et al. (1993) ont mesur une concentration
103
bioaccumule de slnium au bout de 48h dexposition de 18,01,5 g.g
-1
de poids sec de
daphnie pour une exposition 100 g.L
-1
Se sous forme de slnite et de 12,41,2 g.g
-1
de
poids sec pour une exposition 100 g.L
-1
Se sous forme de slniate.

De plus, les valeurs obtenues lors de nos expriences sont trs proches des donnes de
la littrature. En effet, Johnston et al. (1987) ont mesur une CE
5O
48 h de 1680 g.L
-1
Se sous
forme de slnite. Les donnes obtenues par cette mme tude pour le slniate sont un peu
plus faibles avec une CL
5O
48 h de 550 g.L
-1
Se. Cependant dautres tudes prsentent des
valeurs de toxicit trs comparables nos donnes avec une CE
5O
48 h allant de 2560 5300
g.L
-1
Se sous forme de slniate (Ingersoll et al., 1990 ; Dunbar et al., 1983 ; Maier et al.,
1993). Ces informations confirment que la toxicit aige du slnium chez Daphnia magna est
peu sensible la composition du milieu (rsultats dans le milieu M4-pH7 en accord avec les
donnes de la littrature) et ainsi confirment que lutilisation du milieu M4-pH7 na pas
dinfluence majeure inattendue sur la toxicit du slnium. Au vu de ces rsultats, seule la
forme slnite a t retenue pour la poursuite des exprimentations (effets chroniques et effets
en mlange).

104
4.2.2. Toxicit chronique du slnite

Dans cette tude, diffrents paramtres ont t choisis pour tudier la toxicit
chronique du slnite comme la mortalit, la reproduction, la croissance et la respiration. Un
suivi du slnite dans notre milieu dexposition a t ralis afin de nous assurer que le slnite
ntait pas oxyd durant le temps de lexposition.
4.2.2.1. Mortalit

La survie des adultes a t affecte uniquement la plus forte concentration de
slnite tudie (450g.L
-1
Se): 21 jours, 4 daphnies sur 13 ont survcu, ce qui quivaut un
taux de survie de 30,8%.
4.2.2.2. Croissance

Le poids sec des adultes la ponte 2 est plus faible pour les daphnies exposes 0, 110,
220 g.L
-1
Se que pour les daphnies tmoin (Figure 40). Aprs la libration des pontes 4 et 6,
cette rduction de masse sche nest pas significative par rapport au tmoin quelle que soit la
concentration applique.
La croissance des adultes est rduite seulement aprs la libration des juvniles de la
3
me
ponte pour les concentrations 0, 110 et 220 g.L
-1
Se, un phnomne de compensation
semblerait aussi se mettre en place pour ce paramtre partir de cette ponte.

P
o
i
d
s

s
e
c

(
g
)

2
me
ponte
0
50
100
150
200 200

150

100

50

0
* * *

Figure 40: Masse sche des adultes en g la 2
me
ponte en fonction de la concentration en slnium dans le
milieu dexposition. . ANOVA : *p<0,05, Barre derreur =SE, n=10.

0 g.L
-1
Se
1 g.L
-1
Se (tmoin)
22 g.L
-1
Se
110 g.L
-1
Se
220 g.L
-1
Se
450 g.L
-1
Se
105

1) Jour de 1
re
ponte

Les observations quotidiennes des daphnies ont pu mettre en vidence que la 1
re
ponte
(jour de maturation) des daphnies exposes la plus forte concentration en Se (450g.L
-1
Se) a
t plus tardive que celle des tmoins. Un dcalage de 3,42 jours par rapport au tmoin a t
observ.
Le suivi des mues a montr que la maturation a t non seulement plus tardive mais
aussi dcale au niveau des mues (Figure 41). Les dures entre les mues ont t aussi
significativement plus longues au niveau des pontes suivantes pour les trois plus fortes
concentrations 110, 220 et 450 g.L
-1
Se,

avec un dcalage de plus dun jour et demi.

Figure 41: Rpartition du pourcentage des daphnies devenant matures la 5
me
, la 6
me
ou la 7
me
mue en fonction
de la concentration en slnium dans le milieu dexposition. n =10

Le retard de maturit significatif qui a t observ pour la plus forte concentration (450
g.L
-1
Se) indique que la reproduction est affecte, et aussi que la dynamique des populations
serait cette concentration fortement touche. En effet, un retard de la premire ponte peut
avoir des consquences majeures au niveau de la dynamique de population.

Concentration en slnium (g.L
-1
Se)

0%

25%

50%

75%

100%
7
me
mue
6
me
mue
5
me
mue
0 1 22 110 220 450

P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

d
a
p
h
n
i
e
s

0 1 22 110 220 450
106

2) Fcondit 7 jours et 21 jours

Concentration entranant 50% deffet sur la fcondit au bout de 21 jours (CE
50
fcondit 21 j)

Une valeur de CE
50
fcondit 21 jours de

330 30 g.L
-1
Se a t calcule. Cette valeur
est trs proche de celle rapporte par Adams et Heildolph, (1985) : CE
50
fcondit 21 jours de
350 g.L
-1
Se (Figure 42).

Figure 42 : courbe dose-rponse de leffet sur la fcondit 21 jours en fonction de la concentration en slnium
dans le milieu dexposition en g.L
-1
Se

Concentration entranant 50% deffet sur la fcondit au bout de 7 jours (CE
50
fcondit 7 j)

Une CE
50
fcondit 7 jours a t calcule en considrant que le nombre de juvniles librs
par daphnie la 1
re
ponte ( ~ 10 jours) tait gal au nombre dufs 7 jours ; les ufs non
viables nont pas t pris en compte. Une valeur de CE
50
reproduction 7 jours = 35050 g.L
-1
Se a alors t calcule (Annexe 14). Les deux valeurs de CE
50
fcondit calcules 7 et 21
jours sont similaires.

0
10
20
30
40
50
60
1 5 20 100
F
c
o
n
d
i
t

2
1

j
o
u
r
s

-1
Se)
107
3) Fcondit en fonction des pontes

Lors des changements de milieu quotidiens, les juvniles librs par les mres ont t
rcuprs et compts. Ce suivi quotidien a permis de montrer que le nombre de juvniles par
ponte est significativement plus faible aux trois plus fortes concentrations (110, 220 et 450
g.L
-1
Se) par rapport au tmoin pour les pontes 1 et 2 et est plus variable pour les autres
pontes (Figure 43).

0
5
10
15
20
20

15

10

5

0

1 2 3 4 5
Numro de ponte
* * * * * * * *
* * * * *
*

*

*

*
*
*
*
* *
*
*
*

*

*

N
o
m
b
r
e

d
e

j
u
v
n
i
l
e
s

Numro de ponte

Figure 43: Nombre de juvniles par ponte en fonction de la concentration en slnium dans le milieu dexposition.
. ANOVA : *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Barre derreur =SE. n=10.

Le nombre de juvniles est rduit pour les concentrations en Se 110g.L
-1
pour les
deux premires pontes. Pour les pontes suivantes, le nombre de juvniles est trs variable. Le
suivi des pontes et des mues a mis en vidence un temps entre les pontes allong aux plus
fortes concentrations en slnium (110g.L
-1
Se), ce qui suggre un phnomne de
compensation.
4) Poids sec des juvniles et des ufs

Le poids sec des juvniles a t mesur pour toutes les pontes de chaque daphnie. Ce
suivi du poids sec des juvniles, a montr une rduction significative de la masse des juvniles
issus de la 5
me
ponte, pour toutes les concentrations compares au contrle (Figure 44). Pour
les autres pontes, aucune diffrence significative na t observe.

0 g.L
-1
Se
1 g.L
-1
Se (tmoin)
22 g.L
-1
Se
110 g.L
-1
Se
220 g.L
-1
Se
450 g.L
-1
Se
108

Figure 44 : Poids sec des juvniles en g issus de la 5
me
ponte en fonction de lexposition en slnium
ANOVA : *p<0,05, Barre derreur =SE. n=10.

Le suivi du poids sec des ufs na pas montr de diffrences significatives (rsultats non
prsents).

5) Sensibilit des ufs

Les ufs de daphnies dissqus et placs dans une concentration de 2 mg.L
-1
Se
quivalente la CE
50
48h du slnite, nont montr aucun retard de dveloppement par rapport
aux ufs placs dans des conditions contrle. Aucune malformation na t observe. Comme
pour luranium, les ufs semblent donc moins sensibles au slnite que les juvniles, ce qui est
probablement d au fait que les ufs sont protgs une grande partie de leur dveloppement
par la membrane embryonnaire trs peu permable.

4.2.2.4. Cot mtabolique

La respiration, cest--dire la consommation en oxygne, a t mesure la libration
des pontes 2,4 et 6. Une augmentation significative de la consommation en oxygne a t
observe aux concentrations 110, 220 et 450 g.L
-1
Se la 2
me
, 4
me
ponte (pas de donnes
pour la condition 450 g.L
-1
Se) et 6
me
ponte (Figure 45). A la 6
me
ponte, cette augmentation
est aussi significative pour les daphnies exposes la concentration 22 g.L
-1
Se.

0
4
8
1 2
1 6
16

12

8

4

0
* * * * *

0 g.L
-1
Se
1 g.L
-1
Se (tmoin)
22 g.L
-1
Se
110 g.L
-1
Se
220 g.L
-1
Se
450 g.L
-1
Se
P
o
i
d
s

s
e
c

5
me
ponte
109

0
45
90

2
me
4
me
6
me

90

45

0
* *
*
* *
* * * *

Figure 45 : Consommation en oxygne (mol O
2
.h
-1
. mg
-1
) en fonction de la concentration en slnium dans le
milieu dexposition et du numro de ponte. ANOVA : *p<0,05. Barre derreur =SE. n=3

La respiration est le paramtre le plus sensible suivi lors de cette tude. A la 6
me
ponte,
une consommation en oxygne plus leve des daphnies exposes des concentrations
suprieures ou gales 22 g.L
-1
Se

rvle un cot mtabolique plus lev de survie en
condition de stress.
Numro de ponte

0 g.L
-1
Se
1 g.L
-1
Se (tmoin)
22 g.L
-1
Se
110 g.L
-1
Se
220 g.L
-1
Se
450 g.L
-1
Se
m
o
l

O
2

.
h
-
1
.

m
g

-
1

110
4.2.2.5. Effet sur la population

Les donnes de mortalit et de reproduction ont t intgres dans une matrice de Leslie
afin de les regrouper et dvaluer limpact du slnium sur la dynamique des populations
(Figure 46).
1.E+00
1.E+03
1.E+06
1.E+09
0
20 40
temps (jours)
e
f
f
e
c
t
i
f

0 g.L
-1
Se
1 g.L
-1
Se (tmoin)
22 g.L
-1
Se
110 g.L
-1
Se
220 g.L
-1
Se
450 g.L
-1
Se

Figure 46 : Evolution de leffectif au cours du temps en fonction de la concentration en slnium

Les rsultats prsents dans la figure 46 mettent en vidence le fort impact de la baisse
de reproduction pour la plus forte concentration (450 g.L
-1
Se). Les deux concentrations, 110
et 220 g.L
-1
Se, se dtachent des plus faibles concentrations dexposition et montrent ainsi un
impact significatif de lexposition au slnium ces deux concentrations.

111

4.3.1. Effets aigus du slnite et du slniate

Le test aigu a permis de comparer nos donnes celles de la littrature et de confirmer
que, chez la daphnie, le slnite et le slniate avaient des valeurs de toxicit aige proches.

4.3.2. Diffrenciation entre la zone de carence et de toxicit du slnium et
sensibilit des diffrents critres deffet du slnite

Le test chronique de toxicit du slnium a pu montrer qu la plus forte concentration
tudie, 450g.L
-1
de Se (concentration ltale), des effets ont t observs sur tous les
paramtres suivis au cours de lexprimentation.
Pour une exposition des concentrations sub-ltales (110-220g.L
-1
Se), une croissance
rduite a t observe uniquement au moment de la 1
re
ponte. Une rduction significative du
nombre de juvniles par daphnie a t mise en vidence pour les deux premires pontes. A
partir de la 3
me
ponte, une dure plus grande du temps entre les mues illustrerait le phnomne
de compensation observ. Cependant malgr cette compensation, la masse sche des juvniles
issus de la 5
me
ponte est rduite. Une augmentation significative de la consommation en
oxygne chez les daphnies exposes ces concentrations en slnium sub-ltales traduirait le
cot mtabolique supplmentaire li au stress engendr par le slnium. Une modlisation
simple de dynamique de population grce des matrices de Leslie utilisant les paramtres
dmographiques issus des expriences a permis de mettre en vidence limpact potentiel sur la
population.
Lexposition des daphnies 22 g.L
-1
Se na apparemment pas deffet significatif
tudi sur la croissance et la fcondit, pendant la dure dexposition. Nanmoins la 5
me

ponte, une rduction du poids sec des juvniles ainsi quune augmentation de la consommation
en oxygne semblent montrer que le slnium cette concentration induit dj un stress qui
pourrait potentiellement saccentuer aux gnrations suivantes. Le slnium semble donc
toxique chez la daphnie ds une concentration dexposition de 22 g.L
-1
Se.

112
Lexposition des daphnies un milieu ne contenant pas de slnium entrane une
rduction des poids secs des adultes la 2
me
ponte. Cependant aucun effet na t observ la
premire gnration sur la fcondit et sur la respiration. Seuls les poids secs des juvniles
issus de la 5
me
ponte sont significativement plus faibles. Pour observer des effets de carence en
slnium plus marqus, il serait ncessaire de raliser des tests multi-gnrations.

4 4. .4 4. . P Pr ri in nc ci ip pa al le es s a av va an nc c e es s e et t c co on nc cl lu us si io on ns s

4.4.1. Un test chronique raccourci 7 jours pour les exprimentations en
mlange

Ltude des effets chroniques du slnium a montr grce aux diffrents paramtres pris
en compte que des phnomnes de compensation semblaient se mettre en place au cours du
temps. Dans le cas de ltude des effets des mlanges, il semble trs difficile de pouvoir
distinguer les effets de compensation des interactions entre les diffrents composs du
mlange. Ces phnomnes conduiraient une interprtation difficile des rsultats de mlange.
Nanmoins, les rsultats sur 7 jours ont dmontr que lon pouvait estimer une CE
50

proche de celle dtermine sur le critre fcondit 21 jours. En effet, la CE
50
fcondit 7 jours
et la CE
50
fcondit 21 jours sont quasiment identiques.
Comme pour ltude ralise sur les effets de luranium, des tests ufs ont t raliss.
Ils ont montr que la viabilit des ufs ntait pas affecte pour la gamme de concentrations
tudies. Lors une exposition du slnite, le nombre dufs peut donc tre considr comme
reprsentatif du nombre de juvniles viables. Des tests chroniques sur une dure de 7 jours
sembleraient donc tout fait adapts ltude des mlanges, en particulier slnium-uranium.

4.4.2. Paramtres dtude retenus pour les exprimentations en mlange

Comme pour luranium, parmi les paramtres tudis lors du test chronique 21 jours, la
fcondit est le paramtre le plus sensible et le seul o une relation dose-rponse a pu tre mise
en vidence. Ce paramtre ainsi quune gamme de concentration allant 22 450 g.L
-1
U
(permettant davoir un effet attendu de 0 100%), ont alors t retenus pour tablir le design
exprimental des expriences de mlange.
113
Parmi les autres paramtres, la mesure de respiration semble assez sensible (effet
significatif ds 22 g.L
-1
Se) et intressante tudier dans le cadre des effets du mlange
uranium-slnium (mme si ce paramtre na pas permis dtablir de relation dose-rponse et
ne pourra pas tre intgr dans des modles de mlange permettant didentifier les
interactions).

4.4.3. Le slnium, un lment toxique partir de 22 g.L
-1
Se

Le test chronique 21 jours avec la mesure de diffrents paramtres au niveau
macroscopique a permis de mettre en vidence que le slnium est un lment toxique pour la
daphnie partir dune exposition 22g.
-1
Se. Cette concentration toxique tait importante
dterminer car dans ltude des effets de mlange, il est ncessaire dappliquer les diffrents
modles sur deux lments toxiques.
En conclusion, un test de 7 jours avec des concentrations en slnium suprieures 22
g.L
-1
Se semble, au vu des rsultats de toxicit du slnium, adapt pour tudier les effets du
mlange uranium-slnium chez Daphnia magna.
114


Les deux premires parties de cette tude consacres la dtermination des effets des
substances seules, ont permis non seulement damliorer les connaissances sur les effets
toxiques de ces deux lments sur la daphnie, mais aussi dobtenir les donnes ncessaires pour
tablir le design exprimental utiliser et de dgager un certains nombre de points prendre en
compte dans ltude du mlange uranium-slnium.

Il nous a t possible dtablir que le mlange uranium-slnium pouvait tre tudi
comme un mlange de deux substances chimiques classiques. En effet, ltude des effets de
luranium a mis en vidence le fait que luranium tait principalement chimiotoxique. Ltude
consacre aux effets du slnium a, quant elle, pu montrer que, bien que le slnium soit un
lment essentiel, il est toxique pour la daphnie ds 22 g.L
-1
Se. Grce aux modles classiques
dadditivit, dindpendance daction et daddition des concentrations, nous avons pu dfinir
un design exprimental adquat.

Deux grands objectifs se dgagent de ltude des effets du mlange uranium-slnium.
Le premier est de tester les outils, les modles et les mthodes danalyses utiliss afin
didentifier une interaction entre deux substances dun mlange. Le second, plus spcifique, est
didentifier et de caractriser les ventuelles interactions entre luranium et le slnium.

Etude des mlanges binaires
Dans le cadre du premier objectif, nous avons choisi deux mthodes danalyse des effets
de mlanges binaires : celle de Sorensen et al. (2007) et celle de Jonker et al. (2005). Ces deux
mthodes ont t choisies car elles permettent de mettre en vidence une interaction de faon
robuste entre deux substances dun mlange et aussi de dfinir un paramtre dinteraction.
La premire partie a t consacre la comparaison des deux mthodes statistiques de
Sorensen et al. (2007) et de Jonker et al. (2005).
Chapitre 5. Effets du mlange uranium-slnium
115
La deuxime partie a t de sattacher la comparaison des rsultats des deux modles
de rfrences CA et IA pour ainsi observer lequel de ces deux modles est le plus proche de
nos donnes.
Dans un troisime point, nous avons cherch si les conclusions taient diffrentes en
fonction du temps et sil tait possible dtablir un lien entre les effets aigus et chroniques.
La quatrime partie a eu pour but de prsenter les rsultats obtenus pour les diffrents
paramtres tudis et monter lintrt des mesures intgratrices comme les bilans dnergie
pour mieux apprhender les interactions.

Etude du mlange uranium-slnium
Le second objectif tait didentifier une ventuelle interaction entre luranium et le
slnium lorsquils sont en mlange. Utiliser deux mthodes danalyse statistique pour traiter
les donnes deffet aigu du mlange, nous a permis de tester la cohrence de leur conclusion.
Les effets aigus mais aussi chroniques du mlange nous ont sembl complmentaires et
ncessaires pour essayer de comprendre les mcanismes dactions mis en jeu.
Les prcdentes expriences sur substances seules ont permis de montrer lintrt dun
test raccourci 7 jours et de choisir les paramtres les plus sensibles : fcondit, croissance et
allocation de lnergie la croissance et la reproduction (AECR). Des mesures de la quantit
de lipides par daphnie ont t ajoutes cette liste dans le but destimer les rserves
nergtiques des daphnies. Les diffrents paramtres mesurs ont t choisis afin dtablir des
bilans dnergie.

Pour rpondre ces deux principaux objectifs, nous avons choisi de raliser deux tests :
un test aigu et un test chronique. Diffrents paramtres, diffrents temps dexposition ainsi que
diffrentes mthodes danalyses statistiques ont t choisis.

116
5 5. .2 2. . D De es si ig gn n e ex xp p r ri im me en nt ta al l c ch ho oi ix x d de es s c co on nc ce en nt tr ra at ti io on ns s

5.2.1.1. Toxicit aige

A partir des donnes de toxicit aige obtenues 48h avec les substances seules, nous
avons choisi de nous placer 5 ratios fixes de mlanges diffrents (le ratio des CE
10
, CE
25
,
CE
50
, CE
75
, CE
90
) avec 5 concentrations sur chaque ratio.
Pour se placer, par exemple, au ratio des CE
10
, comme la CE
10
U 48h ~ 170g.L
-1
U et
CE
10
Se 48h ~ 1600g.L
-1
Se, le rapport des CE
10
est de 9,5 soit un ratio denviron 1:10 (U:Se).
Pour ce ratio

des CE
10
, nous avons rparti les concentrations du mlange pour obtenir des effets
prdits par le modle dindpendance daction (IA) et celui daddition des concentrations (CA)
entre 0 et 100% deffet. Sur le mme principe, les calculs ont t raliss pour les autres ratios
et sont prsents dans le tableau 8.

Tableau 8 : Design exprimental avec les concentrations tudies du mlange et leffet attendu de chaque mlange
selon les modles daddition des concentrations (CA) et dindpendance daction (IA).

U Se dilution IA CA
300 3000 87% 72%
240 2400 1.25 73% 55%
150 1500 2 34% 19%
75 750 4 6% 2%
37.5 375 8 1% 0%
300 2250 76% 51%
240 1800 1.25 58% 33%
150 1125 2 24% 9%
75 562.5 4 5% 1%
37.5 281.25 8 1% 0%
500 2500 90% 63%
400 2000 1.25 80% 44%
250 1250 2 47% 13%
125 625 4 13% 1%
62.5 312.5 8 3% 0%
750 2800 97% 73%
600 2240 1.25 91% 56%
375 1400 2 68% 19%
187.5 700 4 27% 2%
93.75 350 8 7% 0%
640 1600 88% 30%
512 1280 1.25 80% 14%
320 800 2 55% 3%
160 400 4 20% 0%
80 200 8 5% 0%
Ratio de mlange 4 Ratio
des EC
75
U et Se Ratio de
concentration 2:7 (U:Se)
des EC
90
U et Se Ratio de
Effet attendu calcul partir des
donnes des substances seules Concentration en g.L
-1
des EC
10
U et Se Ratio de
des EC
25
U et Se Ratio de
des EC
50
U et Se Ratio de

117
5.2.1.2. Toxicit chronique

Pour tudier la toxicit chronique, nous avons choisi le design exprimental en raies en
fonction des donnes de reproduction 7 jours obtenues prcdemment avec une EC
50
pour le
slnium et pour luranium respectivement de 35050 g.L
-1
Se et de 6115 g.L
-1
U. Les
exprimentations chroniques tant exprimentalement plus lourdes mettre en uvre que les
exprimentations aiges, nous avons choisi dtudier un seul ratio de mlange sur lequel,
comme pour le test aigu, 5 concentrations de mlange ont t rparties.

Un ratio 1:5 a donc t choisi car il permet la fois dtre proche du ratio des CE
50
et
des concentrations dj tudies pour la toxicit des substances isoles qui sont pour luranium
de 100, 75, 50, 25 et 10 g.L
-1
U et pour le slnium de 450, 220, 110, 22 g.L
-1
Se. Nous
avons donc tudi les effets du mlange U-Se aux concentrations suivantes :

Tableau 9 : Design exprimental avec les concentrations tudies du mlange et leffet attendu de chaque mlange
selon les modles daddition des concentrations (CA) et dindpendance daction (IA).

Concentration en g.L
-1

Effet attendu calcul partir
des donnes des substances
seules
Se U dilution IA CA
500 100 97% 70%
375 75 1.33 94% 44%
250 50 2 85% 13%
125 25 4 49% 0%
Ratio des EC
50
U et Se
Ratio de concentration 1:5
(U:Se)
50 10 10 10% 0%

118

5.3.1. Interactions au niveau de la spciation chimique

Des calculs de spciation ont t raliss dans le but de sassurer que, dans nos
conditions M4-pH7, il ny a pas de modification de la concentration de lion libre uranium dans
le milieu contenant uniquement de luranium et dans celui contenant le mlange uranium-
slnium.

Les calculs ont t raliss grce au logiciel J-Chess et avec la base de donnes OEDC-
NEA complte avec des donnes de Sby et al., (2001) permettant de prendre en compte la
formation de complexes entre luranyle et le slniate (il ny a pas de complexes connus pour le
slnite) UO
2
SeO
4
et UO
2
(SeO
4
)
2-
. Ces calculs ont t raliss pour lEC
50
U (~390 g.L
-1
U)
et lEC
50
Se (~2000 g.L
-1
Se) 48h en prenant en compte ou non loxydo-rduction. Dans le
cas o loxydo-rduction est prise en compte, le slnite introduit est majoritairement
transform en slniate lquilibre (voir chapitre 4). Les rsultats des simulations J-Chess
sont prsents dans le tableau 10.

Tableau 10 : Concentrations en UO
2
2+
, UO
2
SeO
4
et UO
2
(SeO
4
)
2-
dans du milieu M4-pH7 lEC
50
U (~390 g.L
-1

U) et lEC
50
Se (~2000 g.L
-1
Se) obtenues grce des simulations J-Chess en prenant en compte loxydo-
rduction (redox) ou non.

concentration en U
en g.L
-1
concentration en Se
en g.L
-1
concentration en UO
2
2+
en mol.L
-1
concentration en UO
2
SeO
4

en
mol.L
-1
concentration en UO
2
(SeO
4
)
2-
en
mol.L
-1
redox
390 - 6,019 x 10
-10
- - non
390 - 6,019 x 10
-10
- - oui
390 2000 6,019x 10
-10
- - non
390 2000 6,018 x 10
-10
3,436 x 10
-13
5,477 x 10
-18
oui

Les rsultats montrent que la concentration en ion libre UO
2
2+
nest pas
significativement modifie par lajout de slnite dans le milieu. Les deux espces UO
2
SeO
4
et
UO
2
(SeO
4
)
2-
ne sont formes que dans les conditions o loxydo-rduction est prise en compte,
cest--dire quand le slnite soxyde en de slniate. Or les mesures prcdentes (chapitre 4)
ont montr que loxydation du slnite en slniate ntait pas visible (<10%, au regard des
incertitudes de mesures).
119
Ces calculs nous ont ainsi permis de nous assurer que, mme avec la prsence rsiduelle de
slniate, la spciation de luranium ntait pas modifie dans nos conditions de mlange
uranium-slnium. Ainsi, aucune interaction nest attendue au niveau de la spciation chimique
des deux substances dans le milieu, ni au niveau de la biodisponibilit.

5.3.2. Identification des interactions sur la toxicit aige

5.3.2.1. Substances seules

Une relation dose-rponse suivant un modle logistique a t observe dans les
expriences o les substances seules ont t testes allant de 0 100% deffet. Les paramtres
dose-rponse des expriences de toxicit de luranium et du slnium sont donns dans le
tableau 11. Pour luranium et le slnium les valeurs des CE
50
(e) sont plus faibles 48h qu
24h. La diffrence entre les effets de luranium 24h et 48h dexposition est dun facteur 8
environ alors que cette mme diffrence pour le slnium est dun facteur 2 environ.

Tableau 11 : Paramtres dose-rponse de la courbe logistique ajusts sur les donnes des substances seules (U et
Se). Dans cette quation logistique c=0, d=1, b est la pente au niveau de e qui est la CE
50
de la courbe dose-
rponse. Toutes les valeurs sont donnes +/- leur erreur standard.
U Se
Paramtres 24h 48h 24h 48h
b (pente) 2.2 0.4 2.20.3 4.90.8 3.60.5
e (CE
50
) 2514321 30332 4141217 2217147

5.3.2.2. Mlange binaire uranium-slnium

Les rsultats danalyse des donnes avec les mthodes proposes par Srensen et al.
(2007) et Jonker et al. (2005) sont prsents dans le tableau 12.

120

Tableau 12: Valeurs issues des analyses de donnes du mlange binaire uranium-slnium ralises avec les deux mthodes: Srensen et al. (2007) et Jonker et al. (2005).

Paramtres du modle ref Hewlett Vlund Paramtres du modle S/A DR DL S/A DR DL
=1.1
1
=-0.08 a=0.713 a=3.699 a=1.117 a=-1.994 a=-3.707 a=-2.179
2
=2.43 b=-4.365 b=0.404 b=-8.918 b=-0.246
Comparaison avec le modle
des CE
50
variant librement (p),
test F 0.506 0.410 0.322
Comparaison avec le modle de
rfrence CA (p), test F 0.563 0.664
rfrence CA ou IA (p[
2
])
2.00E-03 2.00E-03 9.00E-03 0.012 0.011 0.046
S/A (p[
2
])
0.069 - 0.09 -
Conclusion Conclusion Antagonisme x x Synergie x x
=0.08
1
=1.82 a=2.346 a=3.506 a=0.811 a=1.473 a=4.201 a=2.064
2
=1.86 b=2.101 b=1.040 b=-4.568 b=0.465
des CE
50
variant librement (p),
test F 8.92E-14 0.035 0.001
rfrence CA (p), test F 9.66 E-15 1.39 E-12
rfrence CA ou IA (p[
2
])
6.84E-28 4.27E-28 1.52E-20 0.033 0.106 0.091
S/A (p[
2
])
0.0128 - - 0.598
Conclusion Conclusion Antagonisme dpendance DR X Antagonisme x x
Srensen et al. (2007) Jonker et al. (2005)
CA CA IA
24h
CA
48h
Antagonisme
Paramtre(s) d'interaction
(,
1
,
2
)
(,
1
,
2
)
(a,b
DR
, b
DL
)
(a,b
DR
, b
DL
)

121
Lestimation des paramtres et de la valeur de p avec la mthode de Srensen et al. (2007) ont t
prsents dans le tableau 12 avec :
- la valeur moyenne des paramtres dinteraction des modles disobole de Hewlett () et de Vlund (
1
,
2
).
- la valeur de p du test F pour la comparaison du modle de lisobole avec le modle des CE
50
variant librement
- la valeur de p du test F pour la comparaison du modle de rfrence daddition des concentrations CA avec
lisobole de Hewlett et de Vlund.

Lestimation des paramtres et de la valeur de p des tests de Chi-deux avec la mthode de Jonker et al.
(2005) ont t prsents de la faon suivante dans le tableau 12: Pour les deux modles de rfrence daddition
des concentrations (CA) et dindpendance daction (IA), trois types de dviation de ces deux modles (CA) et
(IA) ont t tests: le modle de dviation synergique et antagoniste (S/A), le modle dpendant du niveau (DL) et
le modle dpendant du ratio de dose (DR). Le modle S/A prsente un paramtre dinteraction (a), alors que les
modles DR et DL en ont deux (a et b). Pour tous les tests de Chi-deux la valeur de p correspondante indique si la
surface de rponse dvie significativement du modle de rfrence et du modle S/A. Les formules ainsi que la
signification des paramtres des diffrents modles sont prsents en annexe 1.

-1
)
0 1000 2000 3000 4000 0 500 1000 1500 2000 3500
0

5
0
0

1
0
0
0

1
5
0
0

2
0
0
0

2
5
0
0

3
0
0
0
0

1
0
0

2
0
0

3
0
0
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
-1
)
A B
-1
)
0 1000 2000 3000 4000 0 500 1000 1500 2000 3500
0

5
0
0

1
0
0
0

1
5
0
0

2
0
0
0

2
5
0
0

3
0
0
0
0

1
0
0

2
0
0

3
0
0
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
-1
) Concentration en slnium (g.L
-1
)
0 1000 2000 3000 4000 0 500 1000 1500 2000 3500
0

5
0
0

1
0
0
0

1
5
0
0

2
0
0
0

2
5
0
0

3
0
0
0
0

1
0
0

2
0
0

3
0
0
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
-1
) Concentration en slnium (g.L
-1
)
0 1000 2000 3000 4000 0 500 1000 1500 2000 3500
0

5
0
0

1
0
0
0

1
5
0
0

2
0
0
0

2
5
0
0

3
0
0
0
0

1
0
0

2
0
0

3
0
0
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

e
n

u
r
a
n
i
u
m

(
g
.
L
-
1
)
-1
)
A B

Figure 47 : Isobologramme pour le mlange uranium-slnium la concentration deffet entranant 50% de
mortalit aprs 24h (A) et 48h (B) dexposition. La ligne en trait plein dcrit les isoboles ajustes. Les donnes
des CE
50
sont prsentes leur erreur standard. Les traits pointills reprsentent les ratios de mlange.

122
1) Analyse des donnes 24h

Lanalyse des donnes de toxicit aprs 24h dexposition par la mthode de Srensen et
al. (2007) montre que lhypothse de non interaction par le modle daddition des
concentrations (CA) nest pas rejete. En effet, des tests F ont t raliss pour comparer
lajustement par le modle de rfrence CA avec celui du modle Hewlett, puis avec celui du
modle Vlund. Ces tests F nont pas montr de diffrences statistiques significatives (p=0,563
pour le modle de Hewlett et p=0,664 pour le modle de Vlund). De plus, selon la rgle de
parcimonie, le modle CA est le modle qui apparat comme convenir le mieux. Lisobole
correspondante est reprsente sur la figure 47.

Contrairement aux rsultats obtenus en utilisant la mthode statistique propose par
Srensen et al. (2007), lanalyse des donnes de toxicit 24h dexposition par la mthode
propose par Jonker et al. (2005), amne rejeter lhypothse de non interaction, pour les deux
concepts de rfrences IA et CA. En effet, pour ces deux concepts, lajustement du modle
synergie/antagonisme (S/A) est celui qui apparat comme tant significativement meilleur que
celui des modles de rfrence IA et CA (test du chi-deux, p=0,002 pour le concept CA et
p=0,012 pour le concept IA). Deux autres dviations possibles de ces modles de rfrence ont
t testes: le modle DL (Niveau de dose), le modle DR (Dose Ratio). Les rsultats montrent
que les deux modles DL et DR ne dcrivent pas mieux les donnes que les modles S/A.
Selon la rgle de parcimonie, il a donc t conclu que les modles S/A taient ceux qui
convenaient le mieux. Cependant, les types dinteraction qui ont t identifis pour les deux
concepts de IA et de CA ne vont pas dans le mme sens. En effet, le modle S/A prsente une
valeur positive du paramtre dinteraction a de 0,713 ; conduisant la conclusion quil y a un
phnomne antagoniste entre luranium et le slnium. Pour le modle de rfrence IA, le S/A
modle ajuste aussi mieux les donnes que le modle de rfrence IA. Cependant, dans ce cas,
a est ngatif (a = -1,99) indiquant un effet synergique.

123
2) Analyse des donnes 48h

Lanalyse des donnes de toxicit aprs 48h dexposition par la mthode de Srensen et
al. (2007), amne rejeter lhypothse de non-interaction CA. Les comparaisons des 3
modles (CA, Hewlett et Vlund) avec le modle avec les CE
50
variant librement montrent que
le meilleur modle est celui de Hewlett et cela mme si la valeur de p du test F est seulement
lgrement significative (0,035). Le paramtre dinteraction du modle de Hewlett est positif
(=0,08) indiquant que, dans le mlange U-Se, il y a un effet antagoniste, ce qui apparat
clairement sur lisobole reprsente sur la figure 47 B.

De la mme faon, lutilisation de la mthode danalyse statistique de Jonker et al.
(2005) conduit rejeter les deux hypothses de non interaction des concepts IA et CA, pour
conclure un effet antagoniste. Pour laddition des concentrations, il apparat que le modle
DR ajuste mieux les donnes (test du chi-deux, p=0,0128). Comme les valeurs des deux
paramtres a et b sont positives, cela indique un effet antagoniste quand leffet du mlange
est considr comme principalement caus par luranium et un effet encore plus antagoniste si
leffet du mlange est principalement attribu au slnium. Pour le concept du IA, le modle
S/A apparat comme celui qui ajuste au mieux les donnes. En effet, la comparaison de
lajustement de ce modle avec celui des deux modles DL et DR nest pas significative (test
du chi-deux, p= 0,106 et 0,091 respectivement pour les modles DR et DL). Le paramtre
dinteraction du modle S/A a est positif indiquant un effet antagoniste.
Pour conclure, quel que soit le concept de non interaction IA ou CA considr et quelle
que soit la mthode statistique utilise, celle de Sorensen ou de Jonker, toutes les analyses
convergent et montrent un effet antagoniste du mlange uraniumslnium 48h.

124
5.3.3. Identification des interactions sur la toxicit chronique


Substances seules
Une relation dose-rponse suivant un modle logistique a t observe dans les
expriences o les substances seules ont t testes allant de 0 100% deffet. La CE
50

fcondit 7 jours pour le slnium calcule est de 31515 Se g.L
-1
et de 615g.L
-1
U pour
luranium. Ces deux valeurs sont trs proches de celles obtenues 21 jours lors de nos
prcdentes tudes et de celles reportes dans la littrature. Ces rsultats confirment lintrt
dun test chronique raccourci 7 jours pour valuer les effets sur la reproduction de la daphnie.

Mlange binaire

Les rsultats des effets du mlange duranium-slnium sur la fcondit ont t
prsents dans la figure 48 ainsi que les effets thoriques calculs selon les concepts de
rfrence CA et IA. La toxicit du mlange observe est plus faible que celle prdite partir
des deux modles de rfrence indiquant un effet antagoniste. Si on compare la CE
50
calcule
partir des valeurs observes et celle prdite par les deux modles CA et IA, on remarque que la
diffrence entre la CE
50
calcule partir des valeurs observes et celle prdite par le modle de
IA est plus faible que celle entre la CE
50
calcule partir des valeurs observes et celle prdite
par le modle de CA.
En effet, un facteur de 1,9 est observ entre la CE
50
calcule partir des valeurs
observes (340 g.L
-1
exprim en concentration du mlange) et celle prdite par le modle de
CA (180 g.L
-1
mlange). Ce facteur nest plus que de 1,13 si lon compare CE
50
des valeurs
observes et CE
50
calcule par le modle IA qui est de 300 g.L
-1
.

125
0%
25%
50%
75%
100%
0 100 200 300 400 500 600 700
Concentration (g.L
-1
)
%

d
e
f
f
e
t

s
u
r

l
a

f
e
c
o
n
d
i
t
7
j
0%
25%
50%
75%
100%
0 100 200 300 400 500 600 700
Concentration (g.L
-1
)
%

d
e
f
f
e
t

s
u
r

l
a

f
e
c
o
n
d
i
t
7
j

Figure 48 : Toxicit prdite et observe. Le ratio du mlange tudi est le ratio des CE
50
s des substances seules U
et Se, ---+--- Modle de CA; , Modle IA. Valeurs observes (moyenne erreur standard)

Les donnes de mlange ont t analyses avec la mthode statistique propose par
Jonker et al. (2005). Les rsultats montrent un paramtre dinteraction a positif quand le
concept du IA ou du CA est considr (tableau 12), indiquant un effet antagoniste (a=2,41 pour
le modle S/A venant du modle CA et a=2,34 pour le modle S/A venant du modle IA). Les
tests du Chi-deux utiliss pour comparer les modles S/A avec les modles de rfrence de non
interaction CA ou IA prsentent des valeurs (p[
2
]) significatives indiquant que le modle
antagoniste dcrit mieux les donnes observes que le modle de rfrence. Cependant cette
valeur de p pour le modle de IA compare au modle S/A est de 0,034 ; ce qui confirme que
mme sil y a un effet antagoniste, le modle IA est relativement proche des donnes
observes. Pour conclure, les rsultats obtenus 7 jours confirment lantagonisme observ
48h dexposition.

126
Tableau 13: Paramtres dinteraction de la mthode de Jonker et al. (2005) pour les modles S/A drivs des
modles de rfrence CA et IA ainsi que les valeurs de p des tests de comparaison des modles de rfrence et
leur modle driv S/A.

Jonker et al. (2005)
CA, S/A IA, S/A
Paramtre d'interaction (a) a=2,41 a=2,34
comparaison avec les
modles de rfrence IA ou
CA (p) 4,49 10
-17
0,034
conclusion Antagonisme Antagonisme

Les rsultats de fcondit et de mesure du poids sec des ufs montrent que les ufs des
daphnies exposes au slnium sont moins nombreux aux plus fortes concentrations mais leur
masse reste constante (Figure 49). Le nombre dufs ainsi que leur masse sont
significativement rduits aux deux plus fortes concentrations en uranium ainsi quaux trois plus
fortes concentrations du mlange uranium-slnium.

0
2
4
6
8
g
Uranium Slnium
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
Mlange
Uranium-Slnium
**
**
* *
*
0
2
4
6
8
g
Uranium Slnium
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
Mlange
Uranium-Slnium
**
**
* *
*

Figure 49 : Poids sec moyen des ufs en fonction des concentrations dexposition en uranium et en slnium (g).
ANOVA: ***p < 0,01, **p < 0,1 par rapport au contrle. Barre derreur: SE.

Ces rsultats sur le poids sec des ufs mettent en vidence la difficult dapprhender
les interactions dun mlange binaire quand un des deux composs du mlange est sans effet.
Leffet du mlange uranium-slnium sur la masse des ufs semble donc principalement d
la toxicit de luranium, et semble tre accru par la prsence de slnium

127

5.3.3.2. Croissance

A 7 jours, les daphnies exposes luranium prsentent un poids sec rduit (Figure 50).
Cette masse sche somatique, cest--dire sans les ufs, est significativement rduite compare
celle des daphnies contrle aprs 7 jours dexposition pour des concentrations en uranium
50g.L
-1
. La masse sche des daphnies exposes au slnium est significativement plus faible
que chez les contrles mais seulement la plus forte des concentrations tudies (500g.L
-1

Se). Pour les daphnies exposes au mlange uranium-slnium, la masse somatique sche est
significativement rduite aux trois plus fortes concentrations par rapport aux daphnies
contrles : 100g.L
-1
U - 500g.L
-1
Se; 75 g.L
-1
U - 375g.L
-1
Se ; 50 g.L
-1
U - 100g.L
-1

Se.

0
1
0
2
5
5
0
7
5
1
0
0
0
5
0
1
2
5
2
5
0
3
7
5
5
0
0
0
20
40
60
80
100
120
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c
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n

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-
1 )
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-1
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g
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***
***
***
***
***
**
0
1
0
2
5
5
0
7
5
1
0
0
0
5
0
1
2
5
2
5
0
3
7
5
5
0
0
0
20
40
60
80
100
120
C
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i
q
u
e

(
g
)
***
***
***
***
***
**

Figure 50: Masse somatique sche aprs 7 jours dexposition en fonction des concentrations dexposition en
uranium et en slnium (g). ANOVA: ***p < 0,01, **p < 0,1 par rapport au contrle. Barre derreur: SE.
Les analyses statistiques ont montr que le poids sec des daphnies exposes 10 g.L
-1

U nest pas diffrent de celui des daphnies exposes au mlange 10 g.L
-1
U+50 g.L
-1
Se. Il
en est de mme pour celles exposes 25 g.L
-1
U et celles exposes au mlange 25 g.L
-1

U+125 g.L
-1
Se ; 50 g.L
-1
U et au mlange 50 g.L
-1
U+250g.L
-1
Se ; 75 g.L
-1
U et au

128
mlange 75 g.L
-1
U+375g.L
-1
Se ; 100 g.L
-1
U et au mlange 100 g.L
-1
U+500g.L
-1
Se.
Il ne semble donc pas y avoir dinfluence du slnium, lorsquil est en mlange avec luranium,
sur la masse somatique.
Ces mmes comparaisons deux deux montrent que la masse sche somatique nest pas
diffrente pour les daphnies exposes 500 g.L
-1
Se et au mlange 100 g.L
-1
U+ 500g.L
-1

Se ; 125 g.L
-1
Se et 25 g.L
-1
U+ 125g.L
-1
Se ; 50 g.L
-1
-1
U+
50g.L
-1
Se. Une diffrence significative a t observe pour les daphnies exposes 375 g.L
-
1
-1
U+ 375 g.L
-1
Se. Il en est de mme pour celles exposes 250
g.L
-1
Se et 50 g.L
-1
U+ 250g.L
-1
Se. La diminution du poids sec observe dans les
conditions de mlange uranium-slnium semble donc principalement due la toxicit de
luranium.
5.3.3.3. Rserves lipidiques

La quantit de lipides par daphnie pour une exposition luranium est significativement
plus faible par rapport aux tmoins partir de 50g.L
-1
U de mme un diminution significative
est observe partir de la plus faible concentration en slnium (50 g.L
-1
Se) et partir de la
plus faible concentration du mlange uranium-slnium (50 g.L
-1
Se+10g.L
-1
U)(Figure 51).
0
5
10
15
20
25
Uranium Slnium
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
g

d
e

l
i
p
i
d
e
s

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r

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p
h
n
i
e
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
Mlange
Uranium-Slnium
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
0
5
10
15
20
25
Uranium Slnium
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
g

d
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l
i
p
i
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p
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p
h
n
i
e
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
Mlange
Uranium-Slnium
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
Uranium Slnium
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
g

d
e

l
i
p
i
d
e
s

p
a
r

d
a
p
h
n
i
e
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
Mlange
Uranium-Slnium
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***

Figure 51 : Masse sche de lipide par daphnie en fonction de la concentration en uranium et en slnium dans le
milieu dexposition (%). ANOVA: *p < 0,05 ; **p < 0,01 par rapport au tmoin. Barre derreur: SE.
Cependant, paralllement cette diminution de la quantit de lipides, une diminution de
la masse sche a t observe. Nous avons donc choisi dexprimer la quantit de lipides (g)
en fonction du poids sec des daphnies (g), cest--dire en pourcentage de lipides par daphnie.

129
Les rsultats montrent que le pourcentage de lipides par daphnie nest pas affect
significativement par une exposition luranium allant jusqu 100g.L
-1
U (Figure 52). Une
diminution significative de ce pourcentage a nanmoins t observe pour toutes les
concentrations en slnium tudies (de 50 500 g.L
-1
Se) alors que pour les daphnies
exposes au mlange, aucune tendance na pu tre identifie.

0
5
10
15
20
25
Uranium Slnium
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
%

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e
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
Mlange
Uranium-Slnium
**
***
*
**
**
**
*
0
5
10
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20
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Uranium Slnium
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
%

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l
i
p
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e

p
a
r

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p
h
n
i
e
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
Mlange
Uranium-Slnium
**
***
*
**
**
**
*

Figure 52 : Mesure du pourcentage de lipides par daphnie en fonction de la concentration en uranium et en
slnium dans le milieu dexposition (%). ANOVA: *p < 0,05 ; **p < 0,01 par rapport au tmoin. Barre derreur:
SE.

5.3.3.4. Evaluation de lnergie disponible pour la croissance et la
reproduction chez la daphnie : Calcul de lallocation
dnergie la croissance et la reproduction (AECR)

Lallocation dnergie la croissance et la reproduction est un paramtre qui est
calcul en faisant la diffrence entre lnergie ingre et celle mtabolise. Les rsultats de
calculs dallocation dnergie la croissance et la reproduction montrent que cette nergie
dcrot significativement aux deux plus fortes concentrations dexposition luranium (Figure
53). Aucune diffrence significative na t observe entre lAECR calcule pour les daphnies
contrle et celle calcule pour les daphnies exposes toutes les concentrations de slnium et
du mlange uranium-slnium ainsi quaux 3 plus faibles concentrations en uranium.

130
0
1
0
2
5
5
0
7
5
1
0
0
0
5
0
1
2
5
2
5
0
3
7
5
5
0
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
U
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n
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m

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n
c
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n
t
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1 )
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1
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-
1
)
0
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2
5
5
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1
0
0
0
5
0
1
2
5
2
5
0
3
7
5
5
0
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
U
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c
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g
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1 )
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(
J
.
m
g

d
a
p
h
n
i
e
-
1
.
h
-
1
)

Figure 53 : Allocation dnergie la croissance et la reproduction en fonction de la concentration en uranium et
en slnium dans le milieu dexposition (J.mg daphnies
1
.h
1
). ANOVA: *p < 0,05 par rapport au tmoin. Barre
derreur: SE.

5.3.3.5. Budget nergtique

Le budget nergtique total a t calcul en faisant la diffrence entre lnergie
assimile et celle alloue la croissance, la reproduction, la formation de la carapace (mue), les
rserves nergtiques, la maintenance (respiration). Les rsultats montrent des donnes trs
similaires celle de lAECR (Figure 54). La seule diffrence est une diminution significative
du budget nergtique pour la concentration 50g.L
-1
. Ces rsultats montrent que la mesure du
paramtre dAECR est une bonne approximation de lnergie disponible pour la daphnie.

131
-0.02
-0.01
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
Uranium Slnium Mlange
Uranium-Slnium
B
u
d
g
e
t

n
e
r
g
t
i
q
u
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p
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J
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h
a
a
a
b
b
b
-0.02
-0.01
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100 [U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
Uranium Slnium Mlange
Uranium-Slnium
B
u
d
g
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t

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g
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p
a
r

d
a
p
h
n
i
e

e
n

J
/
h
a
a
a
b
b
b

Figure 54 : Budget nergtique total par daphnie exprim en J/h. ANOVA: (a)) p < 0,05 par rapport au tmoin et
(b) p < 0,05 par rapport la mme concentration en mlange. Barre derreur: SE.

Le pourcentage du budget nergtique total allou la croissance, la reproduction, la
maintenance (respiration), la formation de la carapace (mue), les rserves nergtiques (lipides)
est reprsent figure 55.

0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Mue
Lipides
Reproduction
Croissance
Respiration
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
Uranium
Slnium Mlange
Uranium-Slnium
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Mue
Lipides
Reproduction
Croissance
Respiration
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Mue
Lipides
Reproduction
Croissance
Respiration
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 10 25 50 75 100
[U] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
0 50 75 125 375 500 [Se] en g.L
-1
Uranium
Slnium Mlange
Uranium-Slnium

Figure 55 : Pourcentage du budget nergtique allou la mue, aux lipides, la reproduction, la croissance et
la respiration en fonction de la concentration en uranium et en slnium dans le milieu dexposition (%).

132
La figure 55 montre que quelle que soient les conditions, une partie importante de
lnergie est alloue la maintenance (respiration) et la formation de la carapace. Les
rsultats montrent aussi que la croissance prend une part importante de lnergie avec une forte
diminution de lnergie alloue la reproduction aux plus fortes concentrations en U, en
slnium et en mlange (75 et 100g.L
-1
U, 375 et 500 g.L
-1
Se ; 75 g.L
-1
U+ 375 g.L
-1
Se
et 100g.L
-1
U+500 g.L
-1
Se).

5.3.3.6. Bioaccumulation

La bioaccumulation de luranium a t mesure pour les daphnies exposes de
luranium et au mlange U et Se (Figure 56). Les rsultats montrent que lorsque luranium est
mlang au slnium, la quantit duranium bioaccumule dans les daphnies est
significativement plus faible ds 25 g.L
-1
Se .

0
5000
10000
15000
20000
25000
10 25 50 75 100
Concentration d'exposition (g.L
-1
U)
n
g

U
/
m
g

d
e

d
a
p
h
n
i
e
U
U+Se

Figure 56 : Bioaccumulation de luranium en (ngU/ mg de daphnie) en fonction de la concentration dexposition
en uranium. ANOVA (comparaison des conditions U et U+Se): ** p < 0,01 ; *** p < 0,001

**
***
***
***

133
5.3.4. Effets sur les diverticules et sur le tube digestif de la daphnie

1) Effets sur les diverticules

Lobservation par microscopie optique des diverticules a t ralise sur 3 daphnies par
condition. Ces observations ont permis de montrer les effets de luranium, du slnium et du
mlange U-Se (Figure 57). Les diverticules des daphnies tmoin prsentent des cellules
rgulires ainsi que des microvillosits dans lensemble rgulires. Les diverticules des
daphnies exposes luranium (75g.L
-1
) montrent galement des cellules rgulires comme
chez les tmoins, cependant on observe une vacuolisation des cellules. Les microvillosits de
ces diverticules sont aussi plus courtes et moins rgulires que chez les tmoins. Les effets
observs pour luranium 7 jours sont proches de ceux qui ont t observs 21 jours o les
effets taient plus marqus avec notamment beaucoup de cellules manquantes et une trs forte
vacuolisation des cellules.
Pour les diverticules des daphnies exposes au slnium, lpaisseur de la paroi est trs
irrgulire. Il ny a pas de cellules manquantes.
Chez les daphnies exposes au mlange uranium-slnium, les mmes effets que ceux
observs pour le slnium ont t observs avec une paroi plus ou moins paisse en fonction
des endroits.

134
Exposition 75 g.L
-1
U
et 375 g.L
-1
Se
Exposition 375 g.L
-1
Se Exposition 75 g.L
-1
U
tmoin slnium uranium mlange U-Se
0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm
paroi rgulire
microvillosit rgulires
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
nombreuses
vacuoles
paisseur de
la paroi trs
irrgulire
paisseur de
la paroi assez
irrgulire
prsence de
vacuoles
Exposition 75 g.L
-1
U
et 375 g.L
-1
Se
Exposition 375 g.L
-1
-1
U
0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm
paroi rgulire
microvillosit rgulires
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
lumire
nombreuses
vacuoles
paisseur de
la paroi trs
irrgulire
paisseur de
la paroi assez
irrgulire
prsence de
vacuoles

Figure 57 : Observations au microscope optique des effets de luranium, du slnium, du mlange uranium-
slnium sur les diverticules des daphnies.
2) Effets sur le tube digestif

Les effets sur le tube digestif ont t observs par microscopie optique sur 3 daphnies
par condition (Figure 58). Lobservation du tube digestif des daphnies exposes de luranium
montrent des manques de cellules intestinales et la prsence de vacuoles. Aucun effet du
slnium par rapport au tmoin nest visible par microscopie optique. Lexamen des tubes
digestifs de daphnies exposes au mlange U-Se ne montre par de diffrence par rapport au
tmoin.

135
Exposition 75 g.L
-1
U
et 375 g.L
-1
Se
Exposition 375 g.L
-1
-1
U
0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm
lumire lumire lumire lumire
cellules rgulires
et microvillosits rgulires
cellules rgulires
cellules rgulires
cellules manquantes
Exposition 75 g.L
-1
U
et 375 g.L
-1
Se
Exposition 375 g.L
-1
-1
U
cellules rgulires
cellules rgulires
cellules rgulires
cellules manquantes
Exposition 75 g.L
-1
U
et 375 g.L
-1
Se
Exposition 375 g.L
-1
-1
U
cellules rgulires
cellules rgulires
cellules rgulires
cellules manquantes
Exposition 75 g.L
-1
U
et 375 g.L
-1
Se
Exposition 375 g.L
-1
-1
U
cellules rgulires
cellules rgulires
cellules rgulires
cellules manquantes

Figure 58 : Observations au microscope optique des effets de luranium, du slnium, du mlange uranium-
slnium sur le tube digestif des daphnies.

Pour conclure ces observations, le slnium aurait un effet plutt sur les diverticules,
luranium plutt sur lintestin. Pour le mlange U-Se, les effets au niveau du diverticule
seraient trs semblables ceux observs chez les daphnies exposes au slnium alors quau
niveau de lintestin les effets sembleraient beaucoup moins prononcs que ceux observs chez
les daphnies exposes luranium. Les observations du tube digestif semblent donc corroborer
un effet antagoniste de luranium et du slnium.

136

5.4.1. Comparaison des conclusions issues de deux mthodes
statistiques : mthode de Jonker vs. mthode de Srensen

Deux mthodes ont t utilises pour dtecter les diffrences statistiques entre nos
donnes et celles prdites par le modle de CA : la mthode des isoboles dcrite par Srensen
et al. (2007) et celle sur les surfaces de rponse dcrite par Jonker et al. (2005).
Les conclusions de ces deux modles concernant la toxicit du mlange uranium-
slnium 24h sont contradictoires (Tableau 12). En effet, la mthode de Srensen conduit la
conclusion que le modle de non interaction selon CA est celui qui dcrit le mieux les donnes
observes, alors que le modle de Jonker conclue que le modle antagoniste ajuste mieux les
donnes que le modle CA. Cependant, il y a plusieurs donnes dans le modle de Srensen
qui confirment un antagonisme potentiel. En effet, les rsultats de la comparaison du modle
de Hewlett et de Vlund avec le modle des CE
50
variant librement montrent pour le test F
des valeurs de p non significatives indiquant que ces deux modles peuvent tre utiliss aussi
bien que le modle de CA pour expliquer les donnes. De plus, les rsultats du test F pour le
CA et pour les deux modles ne sont pas significatifs. Seule la rgle de parcimonie nous
permet de choisir le modle de CA parmi les deux autres modles.
Pour la mthode de Jonker, le paramtre dinteraction est relativement faible, indiquant
que lantagonisme dtect dans ce modle nest pas trs important. Mme si les conclusions
sont opposes, les rsultats des deux modles ne sont pas compltement diffrents. Nos
rsultats confirment lobservation faite par Cedergreen et al. (2007) que la mthode des
isoboles a donc gnralement tendance accepter plus souvent le modle de non interaction
que la mthode de Jonker.
Pour les donnes de toxicit 48h, les modles mnent la mme conclusion dun effet
antagoniste. Dans la mthode de Srensen, le modle de Hewlett est celui qui a t choisi pour
dcrire les donnes, mme si la valeur de p du test F visant comparer ce modle avec le
modle des CE
50
variant librement est significative. Ce phnomne pourrait sexpliquer par
leffet dose-ratio dtect dans la mthode de Jonker. La similarit des rsultats des deux
mthodes confirme leffet antagoniste.

137

5.4.2. IA (Indpendance daction) vs CA (Addition des concentrations)

Pour les donnes de toxicit 24h, la mthode de Jonker applique au modle
dindpendance daction met en vidence un effet synergique, alors quun effet antagoniste est
observ si on considre le modle de CA. Ce rsultat indique que les donnes sont comprises
entre les valeurs prdites des deux surfaces de rponse de IA et CA. La lgre surestimation
observe avec le modle de CA par rapport nos donnes est en accord avec ltude de Faust
et Scholze, (2004) qui ont remarqu dans leurs tudes que le modle de CA entrane la plupart
du temps une surestimation de la toxicit des mlanges.

Pour les donnes de toxicit 48h, les deux modles de rfrence CA et IA montrent tous
deux un effet antagoniste. La comparaison des paramtres dinteraction entre CA et IA
indiquent que leffet antagoniste dtect pour le modle de CA est plus important que celui
observ pour le modle IA, indiquant que le modle IA est plus proche des donnes, que le
modle CA. En effet, le modle IA semble tre pour diffrents auteurs celui conduisant une
meilleure prdiction des effets dun mlange (Faust et al., 2001; Backhaus et al., 2000).

Pour le test chronique, la diffrence entre la CE
50
observe pour la fcondit et celle
prdite par les modles de rfrence est assez faible bien quune diffrence significative ait t
dtecte. Ces rsultats montrent que le modle IA est plus proche de nos donnes, ce qui est en
opposition avec les observations de Cedergreen et al. (2008) qui montrent que le modle IA est
plus pertinent que le modle CA dans les tudes de mlange chez Daphnia magna.

138
5.4.3. Etude des effets dun mlange : Des conclusions diffrentes en
fonction du temps, lien toxicit aige - toxicit chronique

Dans lvaluation des risques environnementaux, lestimation des effets chroniques sur
les espces aquatiques partir des donnes de toxicit aige est souvent ncessaire. Certains
auteurs suggrent lutilisation de ratios aigu-chronique ACR (Lange et al., 1998; Bianchini et
al., 2008) mais pour ltude des mlanges de tels ratios semblent difficiles appliquer. Dans
cette tude, les rsultats de toxicit aigu et chronique ont t compars. Les paramtres
classiquement tudis comme la mortalit pour le test aigu et la fcondit pour le test
chronique ont t compars. Ces paramtres couramment utiliss ont t choisis car les modes
daction de ces deux composs du mlange ne sont pas connus. En effet, Cedergreen et al.
(2005) ont montr que le choix du paramtre tudi peut conduire des rsultats
contradictoires dans les exprimentations de toxicit des mlanges. De faon similaire nous
avons montr que les rsultats pouvaient tre fonction du temps dexposition. Les
exprimentations ralises sur les substances seules ont montr une trs forte variation de la
toxicit de luranium entre 24 et 48h, qui pourrait expliquer les diffrences de conclusion pour
ltude des effets du mlange entre 24 et 48h. Le choix du temps dexposition pour tudier les
effets dun mlange est donc un paramtre trs important prendre en compte avant de tirer
des conclusions gnrales sur la toxicit dun mlange. Il semble donc judicieux dtudier les
interactions diffrents temps dexposition.

139
5.4.4. Etude des effets dun mlange : Des conclusions diffrentes en
fonction des critres deffet tudis

Les mesures de fcondit ont montr grce la mthode danalyse statistique de Jonker
et al. (2005) quil y une interaction entre luranium et le slnium avec un effet antagoniste.
Les donnes de croissance ne nous ont pas permis dappliquer les modles statistiques
classiquement utiliss comme celui de Jonker et al.(2005). En effet, dans notre cas, les effets
du slnium ne suivent pas une relation dose-rponse nous permettant dappliquer les modles
daddition des concentrations et dindpendance daction puisque son effet est trs limit. Ces
donnes mettent en lumire la difficult dappliquer ces diffrents modles de mlange pour les
substances sans effet sur les paramtres observs. Les effets du mlange uranium-slnium sur
la croissance sont trs proches des effets observs pour luranium seul.
Les donnes de mesures de rserves nergtiques, montrent que le pourcentage de
lipides par daphnie est plus faible pour les daphnies exposes au slnium que pour celles
exposes luranium ou au mlange U-Se.

Suite ces diffrentes mesures, il semble alors assez difficile dtablir une conclusion
gnrale pour linteraction uranium-slnium. En effet, les diffrents paramtres tudis
amnent des conclusions diffrentes. Cette observation a aussi t faite par Cedergreen et al.
(2005) qui ont montr quen fonction des paramtres tudis, les conclusions sur les effets dun
mlange pouvaient tre contradictoires et que la sensibilit des processus physiologiques
pouvaient expliquer les diffrences observes.

Pour complter ces observations il nous a sembl intressant dtudier les effets du
mlange au niveau nergtique. En effet, chez tous les organismes vivants, lensemble des
processus biochimiques et physiologiques sont troitement dpendants de la quantit dnergie
disponible. Cette approche nergtique permet de relier les diffrents paramtres tudis, qui
sont, la croissance, la reproduction, la respiration et les rserves nergtiques. Cette approche
intgre permet davoir une vision plus globale des effets et ainsi destimer les effets sur ltat
de sant des organismes, cest--dire, sur la capacit des organismes rsister un stress
supplmentaire. Les paramtres nergtiques sont particulirement adapts dans le cadre de

140
ltude des effets dun mlange au niveau de lindividu. Parmi les diffrents paramtres
nergtiques, la mesure dallocation dnergie la croissance et la reproduction (AECR)
nous a permis de montrer que pour les deux plus fortes concentrations en uranium, il y avait un
effet trs important qui ne se retrouve pas pour lexposition au mlange U-Se et au slnium
seul (Figure 53). Le budget nergtique total, reprsentant la diffrence entre lnergie
assimile et celle alloue la croissance, la reproduction, la formation de la carapace (mue), les
rserves nergtiques et la maintenance (respiration), a montr des rsultats trs similaires
ceux obtenus avec lestimation de lAECR (Figure 54). Ces rsultats montrent que la mesure
du paramtre dAECR est une bonne approximation des calculs plus complets de budget
nergtique. Les rsultats des calculs du paramtre nergtique AECR et de budget nergtique
confirment leffet antagoniste de luranium et du slnium.

5.4.5. De la spciation la bioaccumulation : dmarche pour ltude des
effets dun mlange

Aprs avoir identifi le type dinteraction entre uranium et slnium, nous avons essay de
dterminer quel niveau se situait linteraction.
Les interactions entre deux substances dun mlange peuvent avoir lieu diffrents
niveaux (Figure 59):
Au niveau de la biodisponibilit :
En effet, dans un mlange les substances peuvent interagir chimiquement et modifier la
spciation chimique.
Au niveau de la concentration au niveau du site daction :
Ces interactions sont alors qualifies de toxico-cintiques. Elles ont lieu quand un des
composants dun mlange joue sur la concentration dun autre composant au niveau du site
daction.
Au niveau des mcanismes daction :
Ces interactions, appeles interactions toxico-dynamiques, ont lieu quand un des composants
dun mlange modifie la rponse dun autre composant.

141

Figure 59 : Les diffrents niveaux dinteraction

Les calculs de spciation (Tableau 10) ont montr quil ny a pas dinteraction U-Se
dans nos conditions dtude entranant une diminution de la biodisponibilit de luranium et du
slnium. Linteraction U-Se ne se situe donc pas ce niveau.

Pour pouvoir estimer les interactions toxico-cintiques, la bioaccumulation de
luranium a t mesure chez les daphnies exposes luranium et au mlange uranium-
slnium. Les rsultats montrent une accumulation plus faible de luranium chez les daphnies
exposes au mlange U-Se (Figure 56).
La majorit des interactions connues sont de nature toxico-cintique (Hertzberd et
MacDonnel, 2002). Les interactions toxico-dynamiques sont, quant elles, plus difficiles
caractriser car la rponse dun organisme un lment toxique peut apparaitre de multiples
niveaux dorganisation et que le niveau auquel linteraction a lieu nest trs souvent pas connu
(Rider et al., 2005). Rider et al. suggrent alors dtudier les effets toxico-dynamiques grce
des paramtres du budget nergtique.

142

Nous donc avons ensuite choisi dexprimer les calculs dAECR en fonction de la
concentration en uranium bioaccumul et de la concentration en slnium dans le milieu
(Figure 60). LAECR exprim en fonction de la bioaccumulation de luranium permet de
mettre en vidence le fait que, pour les conditions de mlange, lAECR nest pas affecte, ce
qui peut tre li la baisse daccumulation duranium dans les daphnies exposes au mlange
par rapport aux conditions dexposition luranium seul (Figure 60).

Figure 60: Allocation dnergie la croissance et la reproduction (AECR) en fonction de la concentration en
uranium bioaccumul dans les daphnies et en slnium dans le milieu dexposition (J.mg daphnies
1
.h
1
).
ANOVA: ***p < 0,001 par rapport au tmoin. Barre derreur: SE

La bioaccumulation permet de fournir des lments permettant dexpliquer
lantagonisme dtect et de montrer quil y a une interaction entre luranium et le slnium au
niveau de lentre de luranium dans lorganisme. Ces rsultats suggrent quil ny avait pas
dinteraction toxico-dynamique entre luranium et le slnium mais que linteraction aurait
plutt lieu au niveau de lentre de luranium dans lorganisme.

143

Lantagonisme dtect entre uranium et slnium serait donc d une interaction toxico-
cintique entre les deux substances. Pour vrifier cette hypothse, des mesures de
bioaccumulation du slnium nont pas pu tre envisages du fait de la limite de dtection
leve de la mthode utilise par rapport aux niveaux daccumulation du Se. En effet, daprs
diffrents auteurs, Besser et al. (1993), Ingersoll et al. (1990) et Ogle et Knight (1996), nous
avons pu estimer pour la plus forte de nos concentrations dexposition de 500 g.L
-1
Se une
bioaccumulation de 40 ng Se /g de daphnie, ce qui nous amne 2,28 ng Se par daphnie,
difficilement quantifiable au HG-QAAFS.

5.4.6. Vers une comprhension des mcanismes daction

Lobservation des diverticules par microscopie optique a mis en vidence un effet du
slnium et du mlange uranium-slnium. Une tude prcdente a montr que lors dune
exposition au slnium, les diverticules des daphnies taient trs affects (Johnston et al.,
1989). Ces diverticules seraient lquivalent de lhpatopancras de crustacs suprieurs,
comme lcrevisse, et joueraient un rle dans les processus dassimilation par la production de
fluides digestifs (Ebert et al., 2005). Johnston et al., concluent, dans leur tude de 1989, une
profonde altration des processus dassimilation, chez la daphnie, lors dune exposition au
slnium.
Lobservation du tube digestif a pu mettre en vidence le fait que les effets du mlange
sur les cellules taient peu visibles et diffrents de ceux observs pour luranium. Deux
hypothses ont pu alors tre formules :
La premire est que les effets du mlange sont moins importants car luranium rentre
moins dans les cellules du tube digestif comme le suggrent les rsultats de bioaccumulation.
La seconde est que le slnium protgerait les cellules de lintestin. En effet, les
rsultats de toxicit aigu ont montr que le slnium avait un effet plus rapide sur la daphnie
que luranium, suggrant que le slnium agirait plus tt que luranium.

Les mesures de budget nergtique montrent une diminution significative pour les
daphnies exposes aux plus fortes concentrations en uranium et aucun effet sur les autres

144
conditions testes. Les mesures de lallocation de lnergie ont montr que malgr le stress subi
par les daphnies, les profils restaient assez similaires avec une grande partie alloue la
maintenance et la formation de la carapace. Les rsultats dallocation de lnergie mettent
aussi en vidence le fait que les daphnies, la premire ponte et quelles que soient les
conditions de stress, allouent en majorit leur nergie la croissance plutt qu la
reproduction. Cette mme relation de priorit a t observe par Glazier et Calow (1992) chez
Daphnia magna lors dune limitation de la quantit de nourriture. Cette priorit dallocation
dnergie la croissance se fait aussi au dtriment des rserves nergtiques pour les daphnies
exposes au slnium. En effet, dans ces conditions, une diminution significative du
pourcentage de lipides est observe.

Pour conclure, aucune baisse significative de lnergie totale na t observe pour les
daphnies exposes au slnium et au mlange uranium-slnium. Cependant, la reproduction et
la croissance des daphnies exposes au mlange uranium-slnium, sont fortement affectes.
Lensemble des rsultats montrent alors que nos calculs nergtiques ne refltent pas les
observations faites au niveau de la croissance et de la fcondit pour les daphnies exposes au
mlange uranium-slnium.

Diffrentes hypothses peuvent expliquer le fait que bien que lAECR ne soit pas
rduite, la reproduction et la croissance sont affectes :
La premire hypothse est que le slnium ainsi que le mlange uranium-
slnium affectent directement les processus impliqus dans la croissance et la reproduction.
Dans ce cas, la croissance et la reproduction seraient affectes bien que lAECR ne soit pas
modifie.
La seconde serait lie aux hypothses des calculs de lAECR qui ne seraient pas
vrifies. En effet, une explication possible vient du fait que pour raliser ces bilans dnergie
plus ou moins simplifis (AECR ou budget nergtique), nous posons lhypothse que
lassimilation est fonction de lingestion et que ce pourcentage dassimilation en fonction de
lingestion nest pas modifi par lexposition des daphnies nos contaminants. Latteinte des
cellules des diverticules chez les daphnies exposes au slnium et au mlange U-Se soutient
cette hypothse.

145

1 1. . E Ef ff fe et ts s d du u m m l la an ng ge e u ur ra an ni iu um m - - s s l l n ni iu um m s su ur r D Da ap ph hn ni ia a m ma ag gn na a, ,
i id de en nt ti if fi ic ca at ti io on n d d u un ne e i in nt te er ra ac ct ti io on n

Conclusion

Ltude des effets du mlange uranium-slnium a pu montrer grce aux diffrents
paramtres et aux diffrents temps dexposition choisis que luranium et le slnium ont des
effets antagonistes. Les mesures de bioaccumulation ont pu mettre en vidence, que lentre de
luranium tait modifie par la prsence de slnium et donc quune interaction toxico-
cintique semblait avoir lieu entre ces deux lments
Le systme digestif de la daphnie est une interface importante o a lieu la fois lentre
des lments toxiques et des nutriments. Notre tude a montr que le systme digestif de la
daphnie semblait tre un lment cl dans la comprhension des mcanismes dinteraction
entre uranium et slnium. Un effet antagoniste au niveau des cellules du tube digestif semble
se dgager des observations microscopiques ainsi quune atteinte diffrente des diverticules
selon une exposition luranium, au slnium et au mlange.

Perspectives

Pour mieux comprendre les mcanismes dinteraction entre uranium-slnium chez la
daphnie, diffrentes pistes peuvent tre envisages comme :

- Ltude des effets U-Se sur ltat oxydatif de la daphnie:

Le slnium est la fois un antioxydant et un pro-oxydant. Luranium quant lui est un
pro-oxydant. Dans un contexte de multipollution uranium-slnium, il pourrait tre intressant
Conclusions et perspectives

146
dtudier ltat oxydatif des cellules de daphnies. En effet, un drglement de la balance entre
mcanismes pro-oxydants et mcanismes antioxydants conduit des dommages oxydatifs
impliquant les lipides, les protines et lADN (Bonnefont-Rousselot et al., 1994). Il pourrait
donc tre intressant de mesurer la production de radicaux libres (par exemple par la mthode
de dtermination de la production de ROS par H
2
DCFDA (dichlorofluorescine) en
fluorescence (Xie et al., 2006)). Ltude du stress oxydatif pourrait tre ralise grce la
mesure dactivits enzymatiques antioxydantes comme la glutathion proxydase, la superoxyde
dismutase, la catalase. Dautres antioxydants non enzymatiques comme le glutathion rduit et
oxyd ou lascorbate sont importants dans la rgulation de la balance oxydative des cellules.
Un stress oxydatif peut entraner une atteinte des membranes biologiques par
oxydation, fragmentation ou formation de nouvelles liaisons au niveau des lipides
membranaires (Gardner, 1989). Lobservation des cellules digestives des daphnies exposes
de luranium ont montr une atteinte des membranes cellulaires. Ces effets pourraient tre
potentiellement lis au stress oxydatif engendr par luranium qui se retrouve bioaccumul
dans ces cellules. Une mesure de la peroxydation de lipides peut donc tre un outil intressant
pour valuer les dommages lis au stress oxydatif chez les daphnies lors des exprimentations.
Toutes ces mesures biochimiques concernant le stress oxydatif permettaient de mieux
comprendre les mcanismes daction de luranium et du slnium mis en jeu.
De faon complmentaire, une tude des effets de luranium sur des daphnies carences
en slnium grce des paramtres lis au stress oxydatif permettrait de mieux comprendre le
caractre antioxydant du slnium et son rle protecteur lors dune exposition un lment
pro-oxydant.

- Ltude des effets U-Se sur les enzymes digestives :

Les observations histologiques ont montr une atteinte des diverticules. Les diverticules
sont connus pour avoir un rle cl dans les processus dassimilation chez la daphnie. Des
mesures dactivit denzymes digestives comme lamylase, la cellulase, la galactosidase, la
trypsine, lestrase semblent donc intressantes pour faire le lien entre atteinte cellulaire et
effet au niveau de lindividu. En effet, De Coen et Janssen (2003) ont montr quil y a un lien
entre lactivit des enzymes digestives et les valeurs de CEA (Allocation dnergie cellulaire).

147
Ces mesures permettraient aussi de faire le lien avec les mesures de rserves nergtiques ainsi
que les calculs de bilan dnergie qui ont t raliss dans cette tude. La mesure de ces
activits enzymatiques permettrait de dtecter une atteinte au niveau de lassimilation et de
mieux comprendre les mcanismes daction du slnium en particulier.

- Ltude des effets U-Se sur lassimilation avec des mesures de
14
C :

Pour mieux comprendre les effets sur la nutrition, des mesures au
14
C permettraient de
dissocier une atteinte de lingestion de nourriture de lassimilation du carbone. De prcdentes
tudes ont montr quil tait, en effet, possible dtablir des bilans de carbone et destimer en
particulier lefficacit dassimilation des daphnies adultes et juvniles (He et Wang, 2006). Ces
mesures dassimilation au
14
C au combines des mesures des enzymes digestives
permettraient de comprendre les atteintes au niveau des processus dassimilation.
Un marquage au
14
C permettrait destimer non seulement lassimilation mais aussi la
respiration et les phnomnes dexcrtion. Ces diffrentes mesures seraient utiles pour tablir
les bilans nergtiques. Les mesures au
14
C semblent des outils intressants pour dtablir des
bilans nergtiques prcis.

- Ltude des effets U-Se grce des outils de gnomique fonctionnelle:

Les tudes bases sur les profils dexpression gntique sont de plus en plus utiliss en
cotoxicologie afin didentifier ou de confirmer des modes daction de substances toxiques
(Lettieri, 2006 ; Poynton et al., 2007 ; Soetaert et al., 2006 et 2007 ; Watanabe et al., 2007 ).
Des tudes utilisant des mthodes de gnomique fonctionnelle comme les puces ADN
permettraient didentifier les mcanismes daction mis en jeu lors dune exposition du
slnium et de luranium seuls et en mlange ainsi que les interactions potentielles.
De telles tudes en complment de celles cites prcdemment avec des marqueurs
biochimiques permettraient de mieux comprendre les mcanismes daction des substances
seules et en mlange.

148
-Ltude toxico-cintique avec double marquage
233
U -
75
Se

Pour vrifier lhypothse quil ny pas dinteraction toxico-dynamique entre luranium
et le slnium mais que linteraction aurait plutt lieu au niveau de lentre de luranium dans
lorganisme, il serait intressant de raliser des mesures prcises de bioaccumulation de
luranium et du slnium. Ces mesures de bioaccumulation pourraient se faire grce un
double marquage
233
U -
75
Se par scintillation liquide et par spectromtrie . Ce double
marquage ncessiterait au pralable une mise au point pour ajuster les fentres de mesure et
sassurer quil na pas de phnomne dinterfrence entre les deux mesures.

2 2. . P Pe er rt ti in ne en nc ce e e et t u ut ti il li it t d de es s d di if ff f r re en nt te es s m m t th ho od de es s m mi is se es s e en n u uv vr re e d da an ns s
l le e c ca ad dr re e d de e l l t tu ud de e d de es s e ef ff fe et ts s d de es s m m l la an ng ge es s b bi in na ai ir re es s. .

Conclusion

Ltude du mlange uranium-slnium permet de conclure sur la pertinence et lutilit
des diffrentes mthodes mises en uvre dans le cadre de ltude des effets des mlanges
binaires. Les rsultats de cette tude ont montr un effet antagoniste de luranium et du
slnium. La comparaison des rsultats estims dans le cas de labsence dinteraction U-Se
grce au modle de rfrence dindpendance daction (IA) avec nos donnes exprimentales a
mis en vidence que les diffrences bien que significatives taient assez faibles (<20%). Ces
rsultats nous amnent donc la conclusion que le modle IA semble un modle trs utile en
premire approximation pour prdire les effets toxiques entre deux substances bien quil soit
parfois remis en cause (Greco et al., 2005). Cette conclusion est en accord avec celles
formules prcdemment par dautres auteurs sur des mlanges diffrents et des organismes
diffrents (Altenburger et al., 2000 ; Backhaus et al., 2000 ; Faust et al., 2001).

Pour valuer le niveau dinteraction entre deux substances, une tude de la
bioaccumulation des lments ainsi que des formes biodisponibles des lments toxiques du
mlange est ncessaire. En effet, lorsque les mcanismes daction des composs des mlanges
ne sont pas connus, il semble important avant de sintresser aux mcanismes, de dterminer si

149
linteraction entre deux composs dun mlange est dordre toxico-dynamique ou toxico-
cintique.

Ltude des effets du mlange uranium-slnium sur la daphnie a notamment permis de
mettre en vidence limportance des choix raliss pour les exprimentations. En effet, ltude
des effets des mlanges multiplie le nombre de conditions tester et un effort particulier quant
au choix des paramtres dtude ainsi quaux diffrents temps dexposition est ncessaire.
Notre tude a permis de montrer quun test raccourci 7 jours (1
re
ponte) permettait dallger
les exprimentations au niveau du temps au profit du nombre de conditions testes, ce qui
serait particulirement intressant dans les exprimentations de mlange o il faut prcisment
tester un trs grand nombre de conditions. Ces exprimentations raccourcies permettent
nanmoins dobtenir des donnes cologiquement pertinentes sur des paramtres tels que la
reproduction, la croissance ou des donnes de budget nergtique.

Lors dexprimentations visant identifier des interactions entre substances, une fois
les donnes rcoltes sur les diffrents paramtres choisis, il est souvent difficile de tirer des
conclusions sur linteraction ou non des composs du mlange. En effet, les rponses obtenues
suivant les diffrents paramtres dtude choisis ne vont pas toujours dans le mme sens. Dans
notre tude, nous avons obtenu, en fonction du temps dexposition ainsi que des paramtres
choisis, des conclusions contradictoires. Cette observation a galement t faite par Cedergreen
et al. dans son tude de 2005. Il semble donc ncessaire lors dune tude des effets dun
mlange de ne pas se limiter un seul paramtre un temps donn et de sintresser galement
des paramtres intgrateurs. Les paramtres nergtiques sont intgrateurs dun certain
nombre de processus et sont donc trs utiles pour ltude des mlanges. Ces paramtres
permettent aussi dvaluer les effets potentiels au niveau de la population et en font donc des
outils particulirement adapts ltude des effets des mlanges.

150
Perspectives

Il serait intressant suite cette tude de valider lutilisation des modles nergtiques
dans le cadre de ltude des effets des mlanges simples mais aussi des mlanges complexes.
En effet, il serait intressant dintgrer les mesures nergtiques pour connatre leffet de
substances en mlange dont on ne connat pas les mcanismes dactions.

Des tudes futures sur diffrents toxiques appliqus pendant 48 heures et 21 jours
pourraient tre intressantes aussi mettre en uvre pour dterminer si dans la majorit des cas
le type dinteraction identifi 48h est conserv 7 et 21 jours. Ces tudes permettraient de
faire le lien entre la toxicit aige et la toxicit chronique dun mlange et de valider
lalternative dun test rduit 7 jours pour effectuer des plans dexprience complexes.

Toutes ces tudes permettraient de mieux comprendre les interactions entre les
diffrents stresseurs auxquels sont soumis les organismes pour ensuite mieux valuer les
risques qui leur sont associs.

151

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163

Annexe 1 : Mthode statistique de Jonker et al. (2005)
Annexe 2 : Observations des diffrents stades dun dveloppement embryonnaire dfinis par
Kast-Hutcheson et al. (2001)
Annexe 3 : Donnes de toxicit aige de luranium chez les cladocres deau douce
Annexe 4 : Donnes test toxicit aige du slnium sur Daphnia magna et sur Daphnia pulex
Annexe 5 : Prparation du milieu M4-pH7 et M4-pH8
Annexe 6 : Protocole de prparation des algues pour les daphnies
Annexe 7 : Protocole dextraction de lipides selon la mthode de Bligh et Dyer (1959)
Annexe 8 : Pourcentage moyen de survie et de fcondit en fonction des jours
Annexe 9 : Correction des effets de matrice engendrs par le milieu M4-pH7 lors du dosage de
luranium par ICP-AES
Annexe 10 : Article : Effet de luranium sur la survie, la croissance, la reproduction et sur les
processus physiologiques chez le cladocre deau douce Daphnia
Annexe 11 : Donnes de toxicit aige de luranium
Annexe 12 : Donnes de toxicit chronique de luranium
Annexe 13 : Donnes de toxicit aige du slnium
Annexe 14 : Donnes de toxicit chronique du slnite
Rfrences des annexes
Annexes

164
A An nn ne ex xe e 1 1 : : M M t th ho od de e s st ta at ti is st ti iq qu ue e d de e J Jo on nk ke er r e et t a al l. . ( (2 20 00 05 5) )
Relation dose-rponse pour les substances seules:

Il a t considr que la rponse biologique de chaque paramtre change de faon monotone
entre 0 et une rponse maximum et peut tre exprime de la faon suivante :

) ( ) (
max i i
c f c h u Y = = (1)

Y est la rponse biologique mesure, u
max
est la fois la rponse maximum du contrle quand
le paramtre tudi diminue quand la dose augmente (par exemple la survie ou la reproduction)
ou la rponse maximum pour les paramtres qui croissent avec une dose croissante (par
exemple la mortalit ou linduction denzyme), h(ci) est une fonction qui est lie la
concentration du compos c (par exemple un loi log-Weibull, log-logistic ou lognormal).

Les modles de mlange

Modle daddition des concentrations
Si on considre un mlange avec n composs chimiques qui a un pourcentage deffet
x% par rapport au tmoin, alors le modle daddition des concentrations peut tre formul de la
faon suivante :
1
1
=
=
n
i xi
i
CE
c
(2)
c
i
effet total E et CE
xi
est la concentration de la substance i qui provoque leffet E dans le cas o
elle est applique seule.
Le quotient ci/CExi est lunit toxique sans dimension: (TUxi) qui quantifie la contribution
relative de chaque substance i la toxicit du mlange de n substances.
Pour pourvoir quantifier les dviations du modle daddition des concentrations, lquation 2 a
t reformule de la faon suivante:
) exp(
) (
1
1
G
Y f
c
n
i i
i
=
=

(3)

165

Y est la rponse biologique. La concentration de la substance isole i qui donnera la mme
rponse que le mlange (Y) pourra tre calcule en utilisant la relation dose-rponse inverse.
( ) (
1
Y f
i
). La concentration calcule est relie directement la valeur numrique i pour la

rponse biologique plutt quun pourcentage de la rponse du contrle comme dans lquation
2. Le degr de dviation partir de laddition des concentrations est donn par la quantit G.
Lquation 3 peut tre rsolue par itration.

Modle daddition des concentrations
Pour lindpendance daction, la relation dose-rponse peut tre calcule en multipliant
les probabilits de non-rponse, qi(ci) et peut tre formule de la faon suivante :

=
=
n
i
i i
c q u Y
1
max
) ( (4)

Pour pourvoir quantifier les dviations du modle dindpendance daction, une fonction de
dviation a t introduite dans lquation 4.
Une rponse qui diminue avec laugmentation de la dose (en termes de probabilit de non-
rponse) peut tre gnralise grce lquation 5a. Une rponse qui augmente avec la dose
(en termes de probabilit de non-rponse | |
=
n
i
i i n
c q P 1
,..., 1
) amne lquation 5b :

)
`
+
(
=

=
G c q u Y
n
i
i i
1
1
max
(5a)

| | { } G P u Y
n
=

,..., 1
1
max
(5b)

166
Les fonctions de dviation

Les fonctions de dviation dpendent de la contribution de chaque substance chimique la
toxicit du mlange (TUx). La somme relative des units toxiques de chaque substance
chimique i dans un mlange peut tre calcule de la faon suivante :

j
n
j
i
i
TUx
TUx
z
=
=
&
, avec
i
i
i
CEx
c
TUx = (6)

La fonction de dviation est exprime en fonction de la contribution relative des substances la
toxicit z
i
et est note ) ,..., (
1 n
z z G = .

Synergie/ Antagonisme (S/A)
La dviation appele Synergie/ Antagonisme peut tre formule en substituant la fonction
suivante dans lquation 3 et/ou les quations 5a/b :

=
= =
n
i
i n
z a z z G
1
1
) ,..., ( (7)
Cette fonction de dviation dcrit un antagonisme si la valeur a est positive et une synergie si a
est ngatif (voir tableau rcapitulatif).

Dviation dpendante du ration de dose (DR)
Pour un mlange binaire, la fonction synergie/antagonisme exprime dans lquation 7 peut
tre rendue dose ratio dpendante grce lquation suivante :

2 1 1 1 2 1
) ( ) , ( z z z b a z z G + = (8)

z
1
et z
2
reprsentent respectivement

la contribution de la substance 1et 2 ; le paramtre b
1

reprsente lamplitude de changement associ la substance 1 et le paramtre a celui associ
la substance 2.

167
Dviation dpendante du niveau de dose (DL)
Pour dcrire une synergie ou un antagonisme dpendant du niveau de dose, la fonction de base
(S/A) est complte en ajoutant des isoboles quantifies. Comme les isoboles sont dfinies sur
la base des concentrations deffet pour laddition des concentrations, alors quelles sont
dfinies sur la base de probabilit de rponse pour le modle dindpendance daction, leurs
dviations doivent tre considres sparment.

Pour laddition des concentrations, lisobole la CE
50
est donne par lquation
suivante :
=
n
i
i
TU 1 50 et peut tre incorpore dans la fonction de dviation de la faon
suivante :
( )

= =
|
.
|
\
|
=
n
i
i
n
i
i DL n
z TU b a z z G
1 1
1
50 1 ...., (12)

Pour lindpendance daction lisobole la CE
50
est dfinie par 5 , 0
,..., 1
=
n
P . Ainsi la fonction
de dviation scrit de la faon suivante :
( )
=
= =
n
i
i n DL n
z P b a z z G
1
,..., 1 1
1 ) ,..., ( (13)

168
Tableau : Interprtation des paramtres introduits dans les modles daddition des
concentrations (CA) et dindpendance daction (IA) qui dfinissent le type de dviation
observe

Valeur
paramtre CA IA Signification
Synergie/Antagonisme
> 0 > 0 Antagonisme
a
< 0 < 0 Synergie
Dpendance Dose-Ratio
> 0 > 0
Antagonisme, except pour les ratios de dose o bi est
significativement ngatif indiquant une synergie
a
< 0 < 0
Synergie, except pour les ratios de dose o bi est
significativement positif indiquant un antagonisme
> 0 > 0
Antagonisme, o la toxicit du mlange est principalement cause
par la substance i
b
i

< 0 < 0
Synergie o la toxicit du mlange est principalement cause par
la substance i
Dpendance Dose-Niveau
> 0 > 0
Antagonisme aux niveaux de dose levs et synergie aux faibles
niveaux de dose
a
< 0 < 0
Synergie aux niveaux de dose levs et antagonisme aux faibles
niveaux de dose
> 1 > 2 Changement des doses plus faibles que la CE
50

= 1 = 2 Changement au niveau de la CE
50

0<b
DL
<1 0<b
DL
<2 Changement des doses plus leves que la CE
50

b
DL

< 0 < 1
Pas de changement mais l'intensit de la synergie ou de
lantagonisme est dpendante du niveau de dose (CA) ou du
niveau d'effet (IA)

169
A An nn ne ex xe e 2 2 : : O Ob bs se er rv va at ti io on ns s d de es s d di if ff f r re en nt ts s s st ta ad de es s d d u un n d d v ve el lo op pp pe em me en nt t
e em mb br ry yo on nn na ai ir re e d d f fi in ni is s p pa ar r K Ka as st t- -H Hu ut tc ch he es so on n e et t a al l. . ( (2 20 00 01 1) )

Stade 1 ~(0-15h) aprs la dposition des ufs dans la chambre de ponte
Les diff Les diff rents stades d rents stades d un d un d veloppement veloppement
embryonnaire normal embryonnaire normal
Embryons parfaitement sphriques
Pas de diffrenciation cellulaire apparente
Blastopore
Etape de gastrulation
Organisation cellulaire et
diffrenciation apparentes
Membrane
embryonnaire
Asymtrie de lembryon
temps

170
Maturation embryonnaire prcoce
capsule de la tte
aeconde antenne
il
pigment
antenne dveloppe mais
confine dans la seconde
membrane embryonnaire
Maturation embryonnaire moyenne
Fin stade 4
seconde membrane
embryonnaire

171
Stade 6 ~(50h) aprs la dposition des ufs dans la chambre de ponte
Stade 5 (45-50h) aprs la dposition des ufs dans la chambre de ponte
Maturation embryonnaire tardive
extension partielle de la seconde antenne
setae des antennes peu dvelopp
pine caudale plie contre la carapace
Juvnile compltement dvelopp
setae des antennes dvelopp
pine caudale totalement dploye de la
carapace
Le juvnile nage librement.
Fin stade 5: dbut de nage
tube digestif

172

A An nn ne ex xe e 3 3 : : D Do on nn n e es s d de e t to ox xi ic ci it t a ai ig g e e d de e l l u ur ra an ni iu um m c ch he ez z l le es s c cl la ad do oc c r re es s
d d e ea au u d do ou uc ce e

Espce de cladoodre tudie Paramtre observ mg.L
-1
U Rfrence
Moinodaphnia macleayi 1,29
Diaphanosoma excisum 0,41
Latonopsis fasciculata
24h CE
50

1,10
(Bywater et al., 1991)
Moinodaphnia macleayi 48h CE
50
0,16-0,39 (Seeman et al., 2001)
Ceriodaphnia dubia 96h CE
50
10,5 (Kuhne et al., 2002)
Daphnia magna 48h CE
50
5,8-25,4 (Barata et al.,1998)
Daphnia magna 48h CE
50
5,3-74,3 Poston et al., 1984)

173
A An nn ne ex xe e 4 4 : : D Do on nn n e es s t te es st t t to ox xi ic ci it t a ai ig g e e d du u s s l l n ni iu um m s su ur r D Da ap ph hn ni ia a m ma ag gn na a
e et t s su ur r D Da ap ph hn ni ia a p pu ul le ex x

174
Daphnia magna

forme chimique paramtres observs mg.L
-1
Se [SO
4
2-
] duret (mg.L
-1
CaCO
3
) pH particularit du test Rfrences
LC
50
48h 2,5 214 (Bringmann et Kuhn, 1959)
LC
50
48h 1,10 129 8,15-8,4 (Dunbar et al., 1983)
LC
50
48h 0,70 41 45,5
LC
50
48h 3,02 68 136
(Ingersoll et al., 1990)
LC
50
48h 0,55 82 80-100 8,20,1 (Maier et al., 1993)
LC
50
48h 0,71
LC
50
96h 0,43
329 7,3

(Halter et al., 1980)
LC
50
48h 0,685 240-310 (Adams et Heildolph, 1985)
LC
50
24h 1,65
LC
50
48h 1,68
Na
2
SeO
3

LC
50
96h 0,44
8,4

test sur adultes (Johnston, 1987)

LC
50
48h 2,56 41 45,5
LC
50
48h 4,07 68 136
(Ingersoll et al., 1990)
LC
50
48h 2,84 82 80-100 8,20,1 (Maier et al., 1993)
LC
50
48h 5,30 163 129 8,15-8,4 (Dunbar et al., 1983)
LC
50
24h 1,51
LC
50
48h 0,75
LC
50
96h 0,58
test sur adultes
LC
50
48h 0,55 test sur jvniles
Na
2
SeO
4

LC
50
72h 1,4
8,4
test sur oeufs
(Johnston, 1987)

175

Daphnia pulex

forme chimique paramtres observs mg.L
-1
Se [SO
4
2-
] duret (mg.L
-1
CaCO
3
) pH particularit du test Rfrences
LC
50
48h 2,5 0,6
LC
50
96h 1,10 0,1
LC
50
48h 0,70 1,375
LC
50
48h 3,02 0,098
LC
50
96h 0,55 0,5
Na
2
SeO
3

LC
50
96h 0,71 0,071
70 7,4+/-0,1

(Schultz et al., 1980)

176
A An nn ne ex xe e 5 5 : : P Pr r p pa ar ra at ti io on n d du u m mi il li ie eu u M M4 4- -p pH H 7 7 e et t M M4 4- -p pH H8 8

Prparation du milieu M4-pH 7

Solutions mres
Pour prparer 1L de
milieu M4-pH7 (mL)
Pour prparer 10L de
milieu M4-pH7 (mL)
Solution mre I 50 500
Chlorure de calcium
CaCl
2
,2H
2
O
1,0 10
Sulfate de magnsium
MgSO
4
,7H
2
O
0,5 5
Chlorure de potassium
KCl
0,1 1
Hydrognocarbonate de sodium
NaHCO
3

0,67 10
Sodium mtasillicate
Na
2
SiO
3
,5H
2
O
0,2 2
Nitrate de sodium
NaNO
3

0,1 1
Potassium dihydrognophosphate
KH
2
PO
4

0,1 1
Di-potassium Hydrognophosphate
K
2
HPO
4

0,1 1
Solution mre de vitamines

0,1 1

Prparation du milieu M4-pH 8

Solutions mres
Pour prparer 1L de
milieu M4-pH8 (mL)
Pour prparer 10L de
milieu M4-pH8 (mL)
Solution mre I 50 500
Chlorure de calcium
CaCl
2
,2H
2
O
1,0 10
Sulfate de magnsium
MgSO
4
,7H
2
O
0,5 5
KCl
0,1 1
NaHCO
3

1,0 10
Sodium mtasillicate
Na
2
SiO
3
,5H
2
O
0,2 2
Nitrate de sodium
NaNO
3

0,1 1
KH
2
PO
4

0,1 1
K
2
HPO
4

0,1 1
Solution mre de vitamines

0,1 1

177

Prparation de la solution de vitamines

Vitamine
Concentration
(mg.L
-1
)
Chlorhydrate de thiamine
C
12
H
17
ClN
4
OS,HCl,5H
2
O
750
Cyanoccobalamine (B
12
)
C
63
H
88
CoN
14
O
14
P
--

10
Biotine
C
10
H
16
N
2
O
3
S
7,5

Cette solution est conserver en petites portions aliquotes au conglateur 18C. Les ajouter
au milieu juste avant emploi.

Solutions mres de macro-nutriment

Solutions mres
Concentration
(mg.L
-1
)
g/200mL
Chlorure de calcium
CaCl
2
,2H
2
O
293 800 58,76
Sulfate de magnsium
MgSO
4
,7H
2
O
246 600 49,32
KCl
58 000 11,6
NaHCO
3

64 800 12,96
Sodium mtasillicate
Na
2
SiO
3
,5H
2
O
37 324 7,4648
Nitrate de sodium
NaNO
3

2 740 0,548
KH
2
PO
4

1 430 0,286
K
2
HPO
4

1 840 0,368

Ces solutions sont conserver au rfrigrateur +4C et doivent tre renouveles au maximum
tous les 3 mois.

178
Solution mre 1

Elments traces
Concentration des
lments trace (mg.L
-1
)
g/100mL
Volume introduire
pour prparer la
solution mre I (mL/L)
Acide borique
H
3
BO
3
28 595
2,8595
Faire 200mL soit
5,719g/200mL
2
Chlorure de
Manganse
MnCl
2
.4H
2
O
7 210 0,721 1
Lithium hydroxyl
LiOh,H
2
O
6 054 0,6054 1
Carbonate de
rubidium
Rb
2
CO
3
1355 0,1355 1
Chlorure de strontium
hexahydrat
SrCl
2
.6H
2
O
3 040 0,304 1
Bromure de sodium
NaBr
320 0,032 1
Sodium molybdate
Na
2
MoO
4
,2H
2
O
1 260 0,126 1
Sulfate de cuivre
CuSO
4
, 5H
2
O
490 0,049 1
Sulfate de zinc
ZnSO
4
,7H
2
O
285,4
0,2854g/100mL
1/10 : 0,02854g/100mL
1
Chlorure de cobalt
CoCl
2
, 6H
2
O
200 0,020 1
Iodure de potassium
KI
65
0,65g/100mL
1/100: 0,0065g/100mL
1
Ammonium
monovanadate
NH4VO3
11,5
0,115g/100mL
1/100: 0,0015g/100mL
1
Na
2
EDTA.2H
2
O a) 5 000 2,5g/500mL
Sulfate de fer
FeSO
4
,7H
2
O a)
1 991 0,9955g/500mL
a) les solutions Na
2
EDTA et FeSO
4
sont prpares sparment, puis rassembles et immdiatement mises
ltuve 120 C pendant 30 min, ce qui donne
Solution Fe-EDTA
20

Cette solution est conserver au rfrigrateur +4C et doit tre renouvele au maximum
tous les mois.

179
A An nn ne ex xe e 6 6 : : P Pr ro ot to oc co ol le e d de e p pr r p pa ar ra at ti io on n d de es s a al lg gu ue es s p po ou ur r l le es s d da ap ph hn ni ie es s

Une nouvelle culture de Chlamydomonas de 1 litre est mise en route au moins deux fois par
semaine en fonction du nombre de daphnies nourrir. Chaque culture est utilise la semaine
suivante pour nourrir les daphnies. La meilleure valeur nutritionnelle (teneur importante en
protines) est obtenue pour des cellules en croissance exponentielle dans des cultures ayant une
concentration leve ( environ 15.10
6
cellules par ml). Une phase exponentielle est
caractrise par de petites cellules homognes de 4.0-5.0m de diamtre. De plus grosses
cellules (suprieures 6.5-7m de diamtre) dnotent de linduction de la phase de snescence.

Le milieu HSM

Le milieu HSM est prpar grce 3 solutions stocks :

Composition et proportion des solutions stock servant la prparation du milieu de
culture HSM

Solutions stock Quantits
Phosphates #2 25 mL.L
-1

Beijerink (*10)
5 mL.L
-1

AAP 1 mL.L
-1

Solutions Cristaux Quantits (en g.L
-1
)
Phosphates #2 KH
2
PO
4
K
2
HPO
4

29,6
57,6
Beijerink NH
4
Cl

MgSO
4
, 7H
2
O
CaCl
2
, 2H
2
O
100
4
2
AAP (*10) H
3
BO
3

Mn (10 g.L
-1
)
FeCl
3
, 6H
2
O
Na
2
EDTA, 2H
2
O
ZnSO
4
, 7 H
2
O
Co (1 g.L
-1
)
Na
2
MoO
4
, 2H
2
O
CuSO
4
, 5H
2
O
186
115
160
300
3,5
0,64
3,63
8,79

180
Concentrations des cations et anions (en mol/L) composant le milieu de culture HSM

Prparation derlens striles contenant du milieu HSM (Autoclave)

Pour prparer 1L de milieu HSM, il faut mettre dans un erlen de 2 litres, 70 ml deau
ultra-pure (UHQ) puis 25 ml de la solution stock de Phosphates #2 et 5 ml de la solution stock
de Beijerink. Cette prparation est ralise sous la hotte pour ne pas contaminer les solutions
stock striles. Les erlens sont ensuite referm, autoclavs et stocks en chambre froide.
Ions Concentration en mol.L
-1

NH
4
9,35 x 10
-3

Cl 9,49 x 10
-3

K 2,20 x 10
-2

PO
4
1,37 x 10
-2

SO
4
8,12 x 10
-5

Mg 8,12 x 10
-5

Ca 6,80 x 10
-5

Na 1,7 x 10
-6

BO
3
3,01 x 10
-6

Mn 2,10 x 10
-6

EDTA 8,06 x 10
-7

Fe 5,92 x 10
-7

MoO
4
3,00 x 10
-8

Zn 2,43 x 10
-8

Co 1,09 x 10
-8

Cu 7,04 x 10
-11

181
A An nn ne ex xe e 7 7 : : P Pr ro ot to oc co ol le e d d e ex xt tr ra ac ct ti io on n d de e l li ip pi id de es s s se el lo on n l la a m m t th ho od de e d de e B Bl li ig gh h
e et t D Dy ye er r ( (1 19 95 59 9) )
Matriel utilis
- Actone, chloroforme, mthanol, eau UHQ
- Tubes en verre pour centrifugation, pipettes pasteur, coupelles en aluminium
- Potter, vaporateur sous flux dazote avec bain marie (N-EVAP), plaque chauffante,
microbalance

Protocole
- Rincer tout le matriel avec de lactone (tubes, potter, pointes du N-EVAP)
- Disposer les chantillons (tubes eppendorf contenant une coupelle avec 1ou 2 daphnies) sur
de la glace
- Dposer la ou les daphnies dans le tube du Potter en faisant couler 1.2 mL deau sur la
coupelle.
- Ajouter 1.5 mL de chloroforme
- Homogniser 30 secondes 2000 rpm tout en maintenant le tube du Potter dans de la glace
- Verser lhomognat dans un tube en verre dispos sur de la glace
- Rincer deux fois le Potter avec 1.5 mL de mthanol et ajouter le mthanol de rinage
lhomognat
- Rincer une dernire fois le Potter avec 1.5 mL de mthanol et jeter le mthanol dans la
poubelle solvant
- Refermer lchantillon et le maintenir sur de la glace le temps de prparer les autres
chantillons
- Vortexer les chantillons ainsi obtenus puis les disposer dans la centrifugeuse.
- Centrifugation 4500 RCF pendant 15 minutes (Acclration 3 et frein 2) 4C
- Verser lchantillon dans un autre tube avec prcaution pour ne pas remettre en suspension
les dbris qui se sont dposs au fond du tube
- Ajouter 1.5 mL deau UHQ et 1.5 mL de chloroforme.
- Agiter fortement pour que les deux phases se mlangent bien
- Centrifuger nouveau 4500 RCF pendant 15 minutes 4C
- Sortir dlicatement les chantillons de la centrifugeuse pour ne pas mlanger nouveau les 2
phases
- Enlever la phase suprieure laide dune pipette pasteur et faisant bien attention ne pas
enlever une partie la phase infrieure contenant les lipides et ne pas laisser de la phase
suprieure

182
- Une fois la partie suprieure correctement enleve, les chantillons sont disposs sur le N-
EVAP. (Temprature du bain-marie 34C)
Le flux dazote sera rgl pour quun cne se forme sur la surface des chantillons mais pas
de bulles
- Lvaporation dure environ 15 20 minutes
-Un culot de lipides au fond du tube se forme
- Ajouter quelques gouttes de chloroforme au fond du tube et les rcuprer pour les dposer sur
une coupelle en aluminium pralablement pese et place sur la plaque chauffante 24C
- Renouveler lopration 2 fois puis laisser scher les coupelles jusqu vaporation totale du
chloroforme.
- Peser les coupelles

183
A An nn ne ex xe e 8 8 : : P Po ou ur rc ce en nt ta ag ge e m mo oy ye en n d de e s su ur rv vi ie e e et t d de e f f c co on nd di it t e en n f fo on nc ct ti io on n
d de es s j jo ou ur rs s

Suivi ralis sur 2 bouteilles dlevage de 2L contenant chacune 40 daphnies

jours % de survie fcondit
1 100 0
2 100 0
3 100 0
4 100 0
5 100 0
6 100 0
7 100 0
8 100 0
9 100 0
10 100 5.3
11 100 0
12 100 0
13 100 0
14 99 10.4
15 99 0
16 99 0
17 99 15
18 98 0
19 95 0
20 94 0
21 93 12.6
22 92 0
23 92 0
24 92 23.6
25 90 0
26 90 0
27 90 25
28 90 0
29 88 0
30 88 30.8
31 88 0
32 86 0
33 86 31.3
34 86 0
35 86 0
36 85 0
37 85 29.9
38 85 0
39 85 0
40 84 0
41 84 32.8
42 84 0
43 84 0
44 84 31.7
45 84 0
46 82 0
47 82 30.6
48 82 0
49 82 0
50 82 29.5

jours % de survie fcondit
51 82 0
52 82 0
53 80 28.4
54 78 0
55 77 0
56 76 0
57 71 27.3
58 71 0
59 71 0
60 71 26.2
61 71 0
62 67 0
63 67 20.9
64 64 0
65 64 0
66 64 15.5
67 50 0
67 43 0
68 43 12.2
69 40 0
70 39 0
71 33 8.9
72 27 0
73 24 0
74 24 5.6
75 24 0
76 15 0
77 12 2.3
78 10 0
79 10 0
80 10 0
81 10 0
82 10 0
83 9 0
84 8 0
85 7 0
86 7 0
87 5 0
88 5 0
89 5 0
90 2 0
91 2 0
92 2 0
93 0 0

184
A An nn ne ex xe e 9 9 : : C Co or rr re ec ct ti io on n d de es s e ef ff fe et ts s d de e m ma at tr ri ic ce e e en ng ge en nd dr r s s p pa ar r l le e m mi il li ie eu u
M M4 4- -p pH H7 7 l lo or rs s d du u d do os sa ag ge e d de e l l u ur ra an ni iu um m p pa ar r I IC CP P- -A AE ES S

Une gamme dtalonnage avec des concentrations en uranium croissantes allant de 25
200 g.L
-1
U a t tablie dans le milieu M4-pH7. En exprimant la concentration mesure
dans en fonction de la concentration attendue, un effet matrice a pu tre mis en vidence
(Figure ci-dessous). Toutes les mesures ralises dans du M4-pH7 ont donc t corriges grce
la relation identifie : y=0.992+7.69.

Figure : Concentrations mesures en U dans du M4-pH7 en fonction de celles attendues.
y = 0.992x + 7.69
R
2
= 0.998
0
50
100
150
200
250
0 50 100 150 200 250
concentration mesure M4 pH7
(g.L-1 U)
c
o
n
c
e
n
t
r
a
t
i
o
n

a
t
t
e
n
d
u
e

(
g
.
L
-
1

U
)
Concentration en uranium mesure (g.L
-1
U)
Matrice= milieu M4-pH7

185
A An nn ne ex xe e 1 10 0 : : A Ar rt ti ic cl le e : : E Ef ff fe et t d de e l l u ur ra an ni iu um m s su ur r l la a s su ur rv vi ie e, , l la a c cr ro oi is ss sa an nc ce e, , l la a
r re ep pr ro od du uc ct ti io on n e et t s su ur r l le es s p pr ro oc ce es ss su us s p ph hy ys si io ol lo og gi iq qu ue es s c ch he ez z l le e c cl la ad do oc c r re e d d e ea au u
d do ou uc ce e D Da ap ph hn ni ia a m ma ag gn na a

186

187

188

189

190

191

192

193

A An nn ne ex xe e 1 11 1 : : D Do on nn n e es s d de e t to ox xi ic ci it t a ai ig g e e d de e l l u ur ra an ni iu um m

- M4-pH8

Mortalit 24h

CE
50
=23,00,6 mg.L
-1
U

CE
10
=15,30,6 mg.L
-1
U

Mortalit 48h

CE
50
=7,83,2 mg.L
-1
U

CE
10
=5,40,6 mg.L
-1
U

0
1
2
3
4
5
0 0.1 1 10 100

0
1
2
3
4
5
0 0.1 1 10 100
Concentration en uranium mg.L
-1
U
-1
U

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

194

- M4-pH7

Mortalit 24h

CE
50
=2,00,5 mg.L
-1
U

CE
10
=1,10,2 mg.L
-1
U

Mortalit 48h

CE
50
=0,390,04 mg.L
-1
U

CE
10
=0,170,04 mg.L
-1
U

0
1
2
3
4
5
0 0.05 0.2 1

0
1
2
3
4
5
0 0.05 0.2 1

-1
U
-1
U

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

195
A An nn ne ex xe e 1 12 2 : : D Do on nn n e es s d de e t to ox xi ic ci it t c ch hr ro on ni iq qu ue e d de e l l u ur ra an ni iu um m

Fcondit 7 jours

CE
50
= 6112g.L
-1
U

CE
10
= 147g.L
-1
U

Fcondit 21 jours

CE
50
= 9115g.L
-1
U

CE
10
= 147g.L
-1
U

2
4
6
8
0 0.1 1 10 100

20
30
40
50
60
70
0 0.1 1 10 100
Concentration en uranium g.L
-1
U
Concentration en uranium g.L
-1
U
F
c
o
n
d
i
t

2
1

j
o
u
r
s

F
c
o
n
d
i
t

7

j
o
u
r
s

196

A An nn ne ex xe e 1 13 3 : : D Do on nn n e es s d de e t to ox xi ic ci it t a ai ig g e e d du u s s l l n ni iu um m

- slnite

Mortalit 24h

CE
50
=4,120,6 mg.L
-1
Se

CE
10
=2,231,1 mg.L
-1
Se

Mortalit 48h

CE
50
=1,860,85 mg.L
-1
Se

CE
10
=0,790,07 mg.L
-1
Se

0
1
2
3
4
5
0 0.1 1

0
1
2
3
4
5
0 0.1 1
Concentration en slnium mg.L
-1
Se
-1
Se

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

197

- slniate

Mortalit 24h

CE
50
=4,630,26 mg.L
-1
Se

CE
10
=3,011,61 mg.L
-1
Se

Mortalit 48h

CE
50
=1,990,18 mg.L
-1
Se

CE
10
=1,010,39 mg.L
-1
Se

0
1
2
3
4
5
0 0.1 1

0
1
2
3
4
5
0 0.1 1
-1
Se

-1
Se

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

100

80

60

40

20

0
P
o
u
r
c
e
n
t
a
g
e

d
e

s
u
r
v
i
e

(
%
)

198

A An nn ne ex xe e 1 14 4 : : D Do on nn n e es s d de e t to ox xi ic ci it t c ch hr ro on ni iq qu ue e d du u s s l l n ni it te e

Fcondit 7 jours

CE
50
= 35050 g.L
-1
Se

CE
10
= 20030 g.L
-1
Se

Fcondit 21 jours

CE
50
= 330 30 g.L
-1
Se

CE
10
= 21525g.L
-1
Se

0
10
20
30
40
50
60
1 5 20 100
Concentration en slnium g.L
-1
Se
Concentration en slnium g.L
-1
Se
F
c
o
n
d
i
t

2
1

j
o
u
r
s

F
c
o
n
d
i
t

7

j
o
u
r
s

0
5
10
15
1 5 20 100

199

R R f f r re en nc ce es s d de es s a an nn ne ex xe es s

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200

201
Rsum
Parmi la multitude de polluants qui affectent les cosystmes aquatiques continentaux, luranium et le
slnium sont deux lments qui se retrouvent lchelle mondiale, seuls et en mlange dans lenvironnement.
Lobjectif de cette thse a t dtudier les effets de luranium et du slnium en mlange chez la daphnie
(Daphnia magna). Ltude des effets des mlanges implique de connatre au pralable leffet de chaque stresseur
isol. Ainsi dans un premier temps, des tudes ont t ralises sparment sur les effets de luranium et du
slnium qui ont permis dobtenir des donnes de toxicit aige comme une CE
50
48h de 0,390,04 mg.L
-1
pour
luranium et une CE
50
48h de 1,860,85mg.L
-1
pour le slnium. Des donnes de toxicit chronique notamment
sur la fcondit avec une CE
10
reproduction de 147g. L
-1
pour luranium et de 21525g. L
-1
pour le slnium
ont pu tre obtenues. Ensuite, ltude des effets du mlange uranium-slnium a montr un antagonisme entre
luranium et le slnium. Cette tude a permis de mettre en vidence diffrents lments de rflexion prendre en
compte dans une tude de mlanges binaires, comme limportance du choix des modles de rfrence (addition
des concentrations ou indpendance daction), des mthodes danalyse statistique, du temps dexposition et des
critres deffet. Elle a de plus montr lintrt dutiliser des paramtres intgrateurs comme les bilans dnergie
pour mieux apprhender les interactions. Sattacher la spciation chimique dans le milieu et la
bioaccumulation dans les organismes permet de faire des hypothses quant la nature des interactions prsentes
au sein dun mlange (interactions toxico-dynamiques et toxico-cintiques).

Mots cls : Uranium, slnium, mlange, antagonisme, Daphnia magna.

Abstract
Among the multiple substances that affect freshwaters ecosystems, uranium and selenium are two
pollutants found worldwide in the environment, alone and in mixture. The aim of this thesis work was to
investigate the effect of uranium and selenium mixture on daphnid (Daphnia magna). Studying effects of a
mixture requires the assessment of the effect of single substances. Thus, the first experiments were performed on
single substance. Acute toxicity data were obtained: EC
50
48h = 0,390,04 mg.L
-1
for uranium and EC
50
48h =
1,860,85mg.L
-1
for selenium. Chronic effects were also studied. Data on fecundity showed an EC
10
reproduction
of 147g. L
-1
for uranium and of 21525g. L
-1
for selenium. Uranium-selenium mixture toxicity experiments
were performed and revealed an antagonistic effect. This study further demonstrates the importance of taking into
consideration different elements in binary mixture studies such as the choice of reference models (concentration
addition or independent action), statistical method, time exposure and endpoints. Using integrated parameters like
energy budget was shown to be an interesting way to better understand interactions. An approach including
calculation of chemical speciation in the medium and bioaccumulation measurements in the organism permits
assumptions to be made on the nature of possible interactions between mixture components (toxico-dynamic et
toxico-kinetic interactions).

Key words: Uranium, selenium, mixture, antagonism, Daphnia magna.

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