1. Testes bioqumicos com bactrias da espcie Klebsiella(tudo o ttulo em maisculo) 1.1. Introduo A espcie Klebsiella pertence a famlia Enterobacteriaceae.

Estes microrganismos so bastonetes gram negativos, imveis, aerbicos ou anaerbicos facultativos que medem 0,5 u de espessura por 1 a 5 u de comprimento. Esta espcie de enterobactria caracteriza-se como um patgeno oportunista, logo que pertence a flora intestinal normal porm pode atingir locais fora do trato alimentar, causando por exemplo, mastite em vacas e porcas, pneumonia em ces, bezerros e potros e cistites em ces. O objetivo deste relatrio apresentar como bacterias da espcie Klebsiella, reagem a diferntes testes bioquimicos para indentificao. 1.2. Materiais e mtodos As bactrias utilizadas para repique estavam cultivadas em meio MacConkey, pois este seletivo e diferencial, prprio para bactrias gram negativas. Para reconhecimento e confirmao de que a bactria que se analisava eram da espcie Klebsiella, foram feitos os testes que seguem abaixo. 1.2.1.Teste da Urease Este mtodo utiliza a ureia que por ao das enzimas ureases, presentes ou no nas bactrias, transformam o nitrognio da uria em amnia. A inoculao foi realizada a partir da cultura bacteriana em meio semi-slido inclinado, em tubo de ensaio tendo como meio de cultura uria de Cristensen, em seguida, a amostra foi incubada em estufa a 37 C por 24 a 48 horas. A leitura dos dados se faz atravs da colorao da amostra. Se a colorao continuar amarelo alaranjado o resultado ser negativo, logo se a amostra apresentar colorao rseo avermelhado o resultado ser positivo, ou seja, ocorrer a liberao de amnia. (Figura 1, tubo 2). 1.2.2.Teste do citrato de sdio: O objetivo deste teste verificar a utilizao do citrato como nica fonte de carbono e nitrognio. A inoculao foi realizada a partir da cultura bacteriana em meio semi-slido inclinado em tubo de ensaio contendo gar citrato de Simmons que apresenta colorao verde, em seguida a amostra foi incubada em estufa a 37 C de 24 a 48 horas. Para leitura dos resultados observa-se a colorao da amostra, se a cor da amostra se mantiver verde o teste negativo, porm se a amostra obtiver colorao azul esta ser positiva (Figura 2, Tubo 3). 1.2.3.Teste da produo de sulfito de nitrognio (H2S), indol e motilidade (SIM) Atravs desse teste pode se observar se o microrganismo produtor de sulfito de hidrognio (H2S), ou seja, se ele capaz de reduzir enxofre por hidrogenao produzindo gs sulfdrico. Se o cido for produzido ele reagir com os constituintes com o meio de cultura formando sulfetos que tornaro a amostra preta(teste positivo), caso contrario a amostra sera negativa (figura 3). No teste indol verifica-se se ocorre produo de triptofanase, enzima que quebra triptofano, liberando o indol, este teste revelado adicionando-se o reativo de Kovacs, observando-se se h formao de um anel vermelho na superfcie do meio. A inoculao foi realizada a partir da cultura bacteriana em meio caldo semi-slido (SIM) em tubo de ensaio, em seguida a amostra foi incubada em estufa a 37 C de 24 a 48 horas. Aps a incubao adicionou-se alguma gotas do reativo de Kovacs. Se o alo formando na superfcie da amostra apresentar ou possuir colorao rosa a amostra ser positiva, se a colorao do alo mantiver-se da cor do reativo (marron) o teste ser negativo (Figura 4, tubo 4). O teste da mobilidade tende a observar se a colonia analisada mvel ou imvel. Para realizao desse teste utiliza-se como meio de cultura gar semi-slido (SIM). A amostra foi inoculada fazendo uma picada na profundidade do tubo evitando encostar nas laterais do tubo de ensaio. Para leitura observa-se o crescimento bacteriolgico. Se ocorrer crescimento fora do local da picada a bactria

considerada mvel, logo seu crescimento ocorrer somente ao redor da picada esse micro-organismo considerado imvel. 1.2.4. TSI ( Triple Sugar Iron) um teste utilizado para determinar se um bacilo gram negativo fermenta glicose, lactose ou sacarose com produo de sulfito de hidrognio. O meio de cultura TSI tem como indicador o vermelho de fenol que amarelo em pH abaixo de 6.8, assim sendo, como o meio est estabilizado a produo de quantidades pequenas de cido resultam em mudana visvel de cor. A colonia analisada foi inoculada na parte profunda do meio, fazendo-se estrias na superfcie inclinada do meio. Os tubos inoculados foram colocados em estufa a 37C por 24 horas a 48 horas. O resultado ser negativo para a degradao de lactose, sacarose e glicose a colorao ser vermelha por causa do vermelho de fenol,caso o resultado for positivo ocorrer a degradao desses aucares a colorao ser amarela. Se a anlise da formao de sulfeto for positiva ocorre produo de gs na amostra, casa negativo a amostra mantm-se com ausncia de precipitao (Figura 5, tubo 6). 1.2.5.Teste VM VP 1.2.5.1.Prova do vermelho de metila (VM) O vermelho de metila indicador de pH com faixa de variao ente 4.4 (vermelho) e 6.0 (amarelo), sendo o pH cido sensvel a este indicador ligeiramente mais baixo que os demais. A incubao foi feita no meio Clark e Lubis, meio lquido e incubado por no mnimo 48 horas, aps este perodo adicionou-se algumas gotas de vermelho de metila. Para leitura observa-se a colorao da amostra. Se a amostra analisada possuir cor vermelha ser positiva, ou seja, ocorre a produo de cido. A cor amarela indica negativo (Figura 6, tubo 1) 1.2.5.2. Prova de Voges-Prouskauer (VP): O objetivo desse teste verificar a ocorrencia da fermentao acetoinica, ou seja, degradao de glicose em acetona. A inoculao foi realizada a partir da cultura bacteriana em meio caldo lquido de clark e lubis (meio glicosado e tamponado) em tubo de ensaio, em seguida a amostra foi incubada em estufa a 37 C de 24 a 48 horas. A leitura se faz adicionando alfa-naftol em seguida adiciona-se o hidroxido de potssio na mesma quantidade que o alfa-naftol, aps agitou-se o tubo e deixa em repouso em temperatura ambiente. Os testes VM-VP so realizados em sequencia e a partir da mesma semeadura. O resultado ser positivo se ocorrer a formao de uma colorao vermelha na superfcie da amostra, caso contrrio ser negativo (Figura 7, tubo1). 1.2.6. Teste gar lisina ferro (LIA): recomendado para diferenciao de organismos entricos. Sua capacidade de descarboxilar ou de examinar lisina para formar o sulfito de hidrogenio. Os cidos produzidos pelas bactrias a partir da fermentao do meio vo inicialmente baixar o ph e causar mudana de cor de prpura para amarelo. O ph cido ativa e enzima que causa descarboxilao da lisina a aminas e a subsequente neutralizao do meio que muda de amarelo para prpura outra vez. A inoculao foi realizada a partir da cultura bacteriana em meio semi-slido em tubo de ensaio, em seguida a amostra foi incubada em estufa a 37 C de 24 a 48 horas. Se a amostra for positiva apresentar colorao prpura caso contrrio o meio ter colorao amarela(Figura 8, tubo 5).

1.3. Resultados Os resultados encontrados na anlise esto expressos na Tabela 1 Teste Uria Citrato de SIM(indol [-]; TSI VM VP LIA

sdio klebsiella 1.4. + Concluso +

motilidade[-]; H2S[-]) + +

Tabela 1: Resultados para os testes realizados com bactrias da espcie Klebsiella

Os dados obtidos em aula pratica condizem com os expressos por QUINN et al. (2005), confirmando de tal forma que se trabalhou com bactrias da especie Klebisiella, e consequentemente a anlise foi realizada com sucesso.