PRODUO DE BIOSSURFACTANTES POR MICRORGANISMOS ISOLADOS DE SOLO CONTAMINADO COM LEO DIESEL

BIOSURFACTANTE PRODUCTION BY MICRORGANISMS ISOLATED FROM SOIL CONTAMINATED WITH DIESEL OIL
Andressa Decesaro, Magali Rejane Rigon1, Luciane Maria Colla Acadmica de Engenharia Ambiental, Faculdade de Engenharia e Arquitetura, Universidade de Passo Fundo - BR 285, Km 171. Passo Fundo/RS. E-mail: andressa_decesaro@hotmail.com. Doutora em Engenharia e Cincia de Alimentos, Professora do Curso de Engenharia de Alimentos, Universidade de Passo Fundo - BR 285, Km 171. Passo Fundo/RS. E-mail: lmcolla@upf.br.
Formatado: Italiano (Itlia)

RESUMO Os biossurfactantes so subprodutos metablicos que apresentam uma poro hidroflica e outra hidrofbica e devido a isso se acumulam na interface leo-gua. Como resultado, reduzem as foras de repulso entre diferentes fases na interface ou superfcie e permitem que elas se misturem mais facilmente, podendo ser aplicados na biorremediao de guas e solos contaminados por hidrocarbonetos, acelerando a degradao destes compostos no ambiente. Objetivou-se a produo de biossurfactantes em fermentao submersa a partir de microrganismos isolados de solo contaminado com leo diesel, verificando a influncia do tipo de indutor (leo diesel - leo de soja), concentrao de indutor (1% - 2%) e presena da fonte de nitrognio (sulfato de amnio (NH4)2SO4). Inicialmente realizou-se o isolamento e a seleo dos microrganismos produtores de biossurfactantes, para posterior identificao. A fermentao foi realizada durante 5 d na etapa de seleo e 4 d na avaliao da produo, sendo em ambos os casos mantida a temperatura em 30C. Na etapa de seleo utilizou-se a atividade emulsificante A/O e O/A como determinao analtica, j na avaliao da produo de biossurfactantes utilizou-se a tenso superficial nos tempos inicial e final de fermentao. Os microrganismos que apresentaram melhores resultados na etapa de seleo foram: X4 e X5, identificados como bactrias, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus pumilus, sendo que na etapa de melhoramento do meio demonstraram alta capacidade de reduzir a tenso superficial. Para ambos os microrganismos a maior produo de biossurfactante, ou seja, a menor tensiometria foram obtidas com leo de soja como indutor na menor concentrao e sem a presena de (NH4)2SO4, como fonte adicional de nitrognio. Palavras-chaves: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus pumilus, fermentao submersa, meio de cultivo, biorremediao.

ABSTRACT

1. INTRODUO O petrleo e seus derivados continuam sendo a principal fonte de energia tornando necessria sua extrao, processamento e distribuio dos locais de produo para diferentes locais de consumo, seja atravs de oleodutos, ferrovias, rodovias, por terra ou por mar (adicionar referncia). Este fato, entretanto, tem sido causa de acidentes ambientais ocorridos durante o transporte, vazamento de poos de petrleo, descargas ilegais de efluentes e limpeza de tanques de navios, tendo como efeito a poluio do ambiente e destruio da fauna e da flora circundante, o que traz problemas econmicos e sociais para os habitantes locais (DIAS, 2007). Adicionar alguma informao sobre a biorremediao como tcnica de tratamento e dos biossurfactantes como auxiliares dos processos de biorremediao. O tratamento de reas contaminadas com hidrocarbonetos pode ser realizado com o uso de biossurfactantes, os quais no so amplamente utilizados devido ao seu alto custo de produo, associado a mtodos ineficientes de recuperao do produto e ao uso de substratos caros. A diminuio

Excludo: Este processo muitas vezes resulta em Excludo: causados Formatado: Realce

dos custos de produo destes compostos pode ser realizada a partir da otimizao dos processos e dos meios de cultivo utilizados (NITSCHKE e PASTORE, 2003). Adicionar alguma definio de biossurfactantes e do porque so produzidos por microrganismos que encontram-se em contato com substratos oleosos. A produo de biossurfactantes justifica-se pelas inmeras aplicaes que estes possuem em diferentes setores industriais, tais como .....adicionar as aplicaes e algumas referncias, especialmente na indstria do petrleo e para a descontaminao ambiental atravs da biorremediao. Alm disso, apresentam baixa toxicidade, alta biodegradabilidade, variedade de estruturas qumicas, estabilidade em condies extremas de pH, temperatura e salinidade (FARIA, 2010). Objetivou-se o isolamento de microrganismos produtores de biossurfactantes a partir de solo contaminado com leo diesel, bem como a seleo dos microrganismos melhores produtores e o estudo do meio de cultivo. O uso de microrganismos adaptados utilizao de resduos oleosos, como o caso deste trabalho, pode possibilitar a obteno de elevadas produtividades de biossurfactantes, em virtude da possvel capacidade destes microrganismos em produzirem compostos como resposta s condies ambientais, a fim de utilizarem os resduos oleosos como fonte de carbono para obteno de energia.

Formatado: Realce [G1] Comentrio: Este contedo pode ser usado acima para justificar a produo de biossurfactantes por microrganismos quando em contato com substratos oleosos. Formatado: Realce Excludo: Tem-se como objetivo geral a produo de biossurfactantes a partir de microrganismos isolados de solo contaminado com leo diesel. E os objetivos especficos so definidos como: isolar os microrganismos, identificar os gneros dos microrganismos selecionados para a produo dos biossurfactantes, verificar a influncia do tipo de indutor, concentrao de indutor e presena da fonte de nitrognio para a produo de biossurfactantes pelos microrganismos selecionados em fermentao submersa e avaliar a melhor tcnica para verificar a produo de biossurfactantes. COLOCAR?? Excludo: 2.1 Microrganismos Formatado: Recuo: Primeira linha: 0 cm Excludo: combustvel oleoso, Excludo: . Excludo: Formatado: Recuo: Primeira linha: 0 cm [G2] Comentrio: Buscar uma referncia para a caracterizao bioqumica Excludo: Dos microrganismos isolados, cinco foram testados. (NO TEM COMO FORAM ISOLADOS...) A identificao dos microrganismos foi realizada no Laboratrio de Bacteriologia Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade de Passo Fundo. A caracterizao das amostras seguiu os seguintes passos: as amostras que chegaram ao laboratrio pr isoladas foram plaqueadas em AS (Agar Sangue) e MAC (Macocnkey). - Agar Sangue: meio no seletivo enriquecido que favorece o crescimento da maioria das ... [1] bactrias patognicas e que Formatado: Realce Formatado: Realce [G3] Comentrio: Buscar referncia para isso. Formatado: Recuo: Primeira linha: 0,75 cm

A introduo precisa de mais peso. Adicionar mais referncias nos pargrafos, preferencialmente recentes. 2. MATERIAL E MTODOS 2.1 Isolamento e manuteno dos microrganismos Os microrganismos foram isolados de um solo contaminado por leo diesel, ocorrido por um vazamento em um posto de combustvel, na cidade de Passo Fundo, estado do Rio Grande do Sul, Brasil. O isolamento foi realizado a partir de uma amostra do solo contaminado,realizando-se diluies seriadas em gua peptonada 0,1% e plaqueamento em gar PCA (Plate Count gar). As colnias foram sucessivamente isoladas no mesmo meio e posteriormente mantidas em refrigerador a 4C.

Seleo de microrganismos produtores de biossurfactantes Para uma pr verificao da produo de biossurfactantes, as colnias foram repicadas por estriamento em gar azul de metileno, composto por casena de peptona (10 g/L), lactose (10 g/L), fosfato monobsico de potssio (2,0 g/L), azul de metileno (0,065 g/L) e gar (15,0 g/L). As placas foram incubadas 48 h em estufa a 30C. A produo de biossurfactantes tipo raminolipdios era indicada pela formao de um halo no entorno das colnias (...). As cepas que apresentaram halo foram testadas para a produo de biossurfactantes em fermentao submersa utilizando o meio de cultivo composto por: extrato de levedura (10 g/L), sulfato de amnio (5 g/L), fosfato de potssio (5 g/L), sulfato de magnsio (0,5 g/L) (Arakaki, 2010) e 1% de leo diesel como indutor da produo de biossurfactantes. O inculo foi preparado em meio Plate Count (PC), a partir da inoculao de uma alada de colnias dos microrganismos previamente mantidos em meio PCA, em erlenmeyers de 300 mL contendo 100 mL do meio PC, com posterior incubao em agitador orbital a 160 rpm por 48 h a 30C. A fermentao foi realizada em erlenmeyers de 300 mL contendo 30 mL do inculo previamente preparado e 70 mL do meio de cultivo, a 30C, em agitador orbital a 160 rpm durante 5 d.

Amostragens foram realizadas no tempo inicial e a cada 24 h para a determinao das atividades emulsificantes leo em gua (O/A) e gua em leo (A/O), a fim de estimar a produo de biossurfactantes extracelulares.

2.2 Identificao das cepas pr-selecionadas para a produo de biossurfactantes Os microrganismos selecionados como bons produtores de biossurfactantes foram identificados no Laboratrio de Bacteriologia Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade de Passo Fundo. Os pr-isolados foram plaqueados em Agar Sangue e gar Maconkey e posteriormente submetidas caracterizao fisiolgica e bioqumica (...) 2.3 Estudo de meio de cultivo para aumento de produo As cepas selecionadas na etapa anterior foram utilizadas para a avaliao da produo de biossurfactantes objetivando-se o aumento de produo atravs da modificao do meio de cultivo. As modificaes realizadas no meio de cultivo utilizado na seleo foram em relao a concentrao e tipo de indutor e adio ou no do extrato de levedura como fonte de nitrognio. Para tanto, foi utilizado um Planejamento Fatorial Completo 23 (Tabela 1), a fim de se determinar as variveis significativas sobre a produo de biossurfactantes. O mesmo planejamento foi aplicado para cada uma das cepas selecionadas na etapa anterior.
Tabela 1: Planejamento Fatorial Completo 23 para a avaliao da influncia do tipo de indutor, concentrao do indutor e presena da fonte de nitrognio sobre a produo de biosurfactantes em fermentao submersa

Excludo: 2.2 Manuteno e preparo de inculo O inculo foi preparado em meio Plate Count (PC) a partir de placas de Petri contendo os microrganismos isolados em meio PCA, onde estes estavam mantidos, com a finalidade de multiplicao das clulas para dar incio ao processo fermentativo. Em erlenmeyer de 300 mL foi adicionado 100 mL do meio PC, sendo inoculada uma alada de colnias, com posterior incubao em agitador orbital por 48 h a 30C. 2.3 Meios de cultivo 2.3.1 Seleo Para uma pr verificao da produo de biossurfactantes, as colnias foram colocados em gar azul de metileno contendo peptona casena 10 g/L, lactose 10 g/L, fosfato monobsico de potssio 2,0 g/L, azul de metileno 0,065 g/L e gar 15,0 g/L, o meio foi autoclavado e vertido em placas[2] ... de petri estreis, logo aps sua [G4] Comentrio: Buscar uma referncia para a caracterizao[3] ... Excludo: 2.3.2 Excludo: para cepas selecionadas Excludo: Aps a seleo das cepas variou-se a composio do ... [4] meio de cultivo a partir de um Formatado: Sobrescrito Excludo: Fracionrio, Excludo: , conforme Tabela 1. Excludo: os dois microrganismos Excludo: Fracionrio Formatado: Sobrescrito Excludo: e

Experimento 1 2 3 4 5 6 7 8

Indutor OS (-1) OD (+1) OS (-1) OD (+1) OS (-1) OD (+1) OS (-1) OD (+1)

Concentrao de Indutor 1% (-1) 1% (-1) 2% (+1) 2% (+1) 1% (-1) 1% (-1) 2% (+1) 2% (+1)

Adio de fonte de nitrognio (1%) Sem (-1) Sem (-1) Sem (-1) Sem (-1) Com (+1) Com (+1) Com (+1) Com (+1)

Os experimentos foram realizados em erlenmeyers de 300 mL com 100 mL de meio inicial e inoculao na razo de 1:10 com inculo previamente preparado conforme item xxxx. Os experimentos foram mantidos em agitador orbital a 30C durante 4 d, sendo retiradas alquotas no tempo inicial e nos tempos de 2 d e de 4 d. A produo de biossurfactantes nesta etapa foi avaliada atravs da determinao tenso superficial do meio. 2.3.3 Determinaes analticas As atividades emulsificantes leo em gua e gua em leo foram determinadas segundo metodologia proposta por (MARTINS et al., 2006), utilizando-se 3,5 mL de extrato e 2 mL de leo de milho. A mistura foi agitada em agitador vrtex a 700 rpm, por 1 min. Aps 60 min de repouso foi lida a absorbncia do meio emulsificado leo/gua em espectrofotmetro a 610 nm. A leitura foi realizada diminuindo-se da absorbncia do branco, obtida a partir da leitura da amostra, dessa forma, obteve-se a

Excludo: , Excludo: emulsificantes Excludo: . Excludo: 5 Excludo: de cultivo para realizao da fermentao. A... [5] Excludo: erlenmeyers [G5] Comentrio: Ser que no tiramos nada de til dos ... [6] Excludo: para a Excludo: da atividade emulsificante e da [G6] Comentrio: Estes experimentos foram realizados em ... [7]

atividade emulsificante leo em gua. Aps 24 h de repouso foi realizada a leitura da altura da emulso gua/leo formada e da altura total (altura da emulso mais altura da camada remanescente de leo), gerando a atividade emulsificante gua em leo. O branco foi preparado utilizando gua no lugar da amostra. Adicionar equaes utilizadas no clculo. A tenso superficial dos meios foi realizada na ausncia de clulas de acordo com o mtodo do anel (Du-Nuoys ring method). Tratamento dos dados Os resultados foram avaliados atravs de anlise de varincia. 3 RESULTADOS E DISCUSSES 3.1 Seleo de microrganismos produtores de biossurfactantes
Foram isolados cinco cepas de microrganismos do solo contaminado com leo diesel, sendo que todas apresentaram formao de halo durante o crescimento em gar azul de metileno,

Formatado: Realce Formatado: Recuo: Primeira linha: 0 cm Excludo: dados Excludo: tabelados, graficados e posteriormente analisados atravs de A Excludo: V Excludo: 3.1.1 Teste Agar azul de metileno Quadro 1: Produo de halos pelos microrganismos. Microrganismo ... [8] Formatado: Realce Excludo: , sendo de interesse testar todos em fermentao submersa para a verificao da produo de compostos com atividade de emulsificao. Excludo: 3.1.2 Crescimento em PDA e PCA Quadro 2: Verificao do crescimento em meios PCA e PDA. Microrganismo ... [9] Excludo: O Quadro 2 apresenta os resultados de crescimento nos meios PDA e PCA. Como no houve crescimento do microrganismo X4 em gar PDA, h uma indicao de que este microrganismo possa ser uma bactria, uma vez que fungos filamentosos e leveduras possuem habilidade de crescimento em meio PDA. Porm, no pode ser desconsiderada a possibilidade de ter ocorrido erros experimentais na etapa de inoculao. X5 no deveria ter crescido, pq bactria, tambm. Desta forma, devido a caractersticas das colnias (circulares, lisas e brilhantes), os microrganismos X1, X2, X3 e X5 foram classificados como leveduras, enquanto que o microrganismo X4 pode ser um fungo ou bactria filamentosa devida s caractersticas de estriamento das colnias no meio. AQUI VERIFICOU-SE QUE NO ISSO..., da tirar?? 3.1.3 Atividades emulsificantes A Tabela 2 apresenta os resultados das atividades emulsificantes leo em gua (O/A) durante 5 dias de fermentao pelos 5 ... [10] microrganismos isolados. Formatado: Realce

indicando a possibilidade de produo de biossurfactantes tipo raminolpideos (adicionar referncia). Assim, todos foram testados para a produode biossurfactantes em fermentao submersa. As Figuras 1 e 2 apresentam as atividades emulsificantes O/A e A/O obtidas durante a fermentao a partir dos cinco microrganismos isolados. Com exceo do microrganismo X1, todos apresentaram aumento na atividade de emulso O/A em relao ao tempo inicial. As mximas atividades O/A foram alcanadas para X2 no tempo 3, para X3 no tempo 2, para X4 no tempo de 3 d e para X5 no 4 dia. O microrganismo X5 foi o que produziu a maior atividade de emulsificao O/A no caldo de fermentao. Em relao s atividades emulsificantes A/O, pode-se observar que os microrganismos X2 e X3 no apresentaram atividade de emulsificao gua em leo, enquanto que os microrganismo X1 e X4 apresentara mxima atividade no 4 dia de fermentao. No 2 dia de fermentao foi observada a mxima capacidade de emulsificao obtida a partir dos extratos do microrganismo X5.

Tirar a frase abaixo do tempo. No tenho os dados para refazer a linha de tendncia.

Figura 1: Atividade emulsificante O/A durante a fermentao submersa para a produo de biossurfactantes a partir de microrganismos isolados de solo contaminado com leo diesel

Excludo: das 5 cepas de microrganismos durante 5 dias de fermentao.

Tirar a frase abaixo do tempo

Figura 2: Atividade emulsificante A/O durante a fermentao submersa para a produo de biossurfactantes a partir de microrganismos isolados de solo contaminado com leo diesel No trabalho realizado por Rodrigues et al (2011) foram analisados a influncia da adio de uria (0% e 1%) e o substrato (farelos de trigo e soja) sobre a produo de biossurfactantes por A. fumigatus sendo fundamental para a obteno de maior produtividade de biossurfactante. Os ensaios foram realizados com 25 g de meio inicial, pH 4,5, umidade de 60%, 30 C. As mximas atividades emulsificantes leo em gua (O/A) foram obtidas utilizando farelo de soja como substrato obtendo-se 4,550,21 UE e 6,090,29UE, porm as variveis no foram significativas para a produo de emulso O/A. No trabalho realizado por Bortoluzzi et al (2011) verificou-se a produo de biossurfactantes a partir de uma cepa de Aspergillus sp. em fermentao em estado slido objetivando selecionar fontes de carbono e nitrognio e as melhores concentraes destas para obter elevadas concentraes de biossurfactantes. Os melhores resultados foram obtidos nos experimentos com 5% de uria e 3% de leo de soja, obtendo-se uma mxima atividade emulsificante O/A de 6,520,33 UE. As atividades mximas foram de 7,16 UE produzidas pelo microrganismo X5 sendo consideradas muito altas quando comparadas as atividades produzidas em meios j otimizados com fontes de carbono e nitrognio. Rodrigues et al (2011) obteve as maiores AE A/O com o uso de farelo de trigo com ou sem adio de fonte de nitrognio(uria) ao meio de cultivo (137,104,63 UE e 144,533,65 UE), sendo estas variveis significativas na atividade emulsificante A/O. Bortoluzzi et al (2011) obteve os melhores resultados com 5% de uria e 5% de leo de soja, com uma atividade emulsificante gua em leo (A/O) de 112,714,41. COLOCAR? As atividades emulsificantes A/O obtidas pelo microrganismo X4 de 201,6 UE so consideradas muito altas quando comparadas as atividades de meios j otimizados.

Excludo: EU REFIZ OS GRFICOS DA MAGALI PRA FICAR COM AS MESMAS CORES... MAS AS LINHAS DE TENDNCIA PRA X3 E X5, NO FICAM CERTAS... VE SE A PROF. CONSEGUE COLOCAR... A Figura 1 apresenta as atividades emulsificantes O/A durante 5 dias de fermentao de cada um dos 5 microrganismos isolados. Com exceo do microrganismo X1, todos apresentaram aumento na atividade de emulso O/A em relao ao tempo inicial. As atividades mximas foram alcanadas para X2 no tempo 3, para X3 no tempo 2, para X4 no tempo de 3 d e para X5 no 4 dia. O microrganismo X5 foi o que produziu a maior atividade de emulsificao O/A no caldo de fermentao. Excludo: Excludo: COLOCAR? Excludo: E Excludo: A Tabela 3 apresenta os resultados das atividades emulsificantes gua em leo (A/O) durante 5 dias de fermentao produzida pelos 5 microrganismos isolados. Tabela 3: Atividade emulsificante A/O. AE A/O ... [11] [G7] Comentrio: Esta discusso precisa ser aprimorada

A partir dos resultados de atividades emulsificantes O/A e A/O foram calculadas as produtividades, atravs da Equao x, sendo os resultados apresentados na Tabela 4. (juntar os resultados das duas tabelas em uma s.

Formatado: Realce

Microrganismo X1 X2 X3 X4 X5

Tabela 2: Produtividade mxima de emulso O/A. Produtividade mxima de emulso O/A Atividade Atividade Tempo(d) Inicial (UE) mxima (UE) 6,21 5,18 7,3 3 4,39 6,9 2 3,2 5,1 3 2,38 7,0 4 Produtividade mxima de emulso O/A Atividade Atividade Tempo(d) Inicial (UE) mxima (UE) 0 80 4 0 201,6 4 0 154,5 2

[G8] Comentrio: Rever ttulo

Produtividade mxima (UE/d) 0,70 1,25 0,63 1,15

Excludo: 3.1.4 Clculo das Produtividades mximas de atividades emulsificantes Excludo: 4

Tabela formatada

Microrganismo X1 X2 X3 X4 X5

Produtividade mxima (UE/d) 20 50,4 77,25

Excludo: A Tabela 4 apresenta os resultados das atividades mximas de emulso O/A produzidas diariamente por cada cepa de microrganismo. Excludo: 3.1.5 Produo mxima de emulso A/O Tabela 5: Produo mxima de emulso A/O. A Tabela 5 apresenta os resultados das atividades mximas de emulso A/O produzidas diariamente por cada cepa de microrganismo. [G9] Comentrio: Reescrever esta parte Excludo: 3

Considerando somente a produo de emulso leo em gua o melhor microrganismo produtor de compostos com este tipo de atividade foi o X3 seguido pelo X5. Os microrganismos X5 e X4, respectivamente, foram os melhores produtores de compostos com atividade emulsificante A/O. Observando as Tabelas 4 e 5, verifica-se que o microrganismo X5 se destacou na produo de emulso nas fases O/A e A/O, e o microrganismo X4 na produo na fase A/O. 3.2 Identificao dos microrganismos selecionados Aps a anlise das tabelas anteriores selecionou-se os microrganismos X4 e X5 para serem identificados e para utiliz-los na produo de biossurfactantes em meio otimizado. O Quadro 3 demonstra os resultados obtidos durante o processo de identificao dos microrganismos, sendo possvel, aps a anlise, a obteno da espcie e gnero dos microrganismos. Quadro 1: Resultados obtidos durante a identificao dos microrganismos - X4 e X5. gar Sangue gar Sangue gar MacConkey gar MORFOLOGIA/COLNIAS Pequeno Pequeno Pequeno Tamanho Bordas/Forma Irregular Irregular Circular Colnias Achatada Umbilical Convexa Tipo de Elevao Opaca Opaca Translcida Densidade Trasnlcida

Excludo: Trasnlcida

Consistncia Cor Lactose/Hemlise Bacilo/Coco Gram Catalase Oxidase Coagulase OF + Glicose TSI - Base TSI - Bisel TSI - H2S TSI - Gs LIA - Base LIA - Bisel LIA - H2S SIM - Motilidade SIM - H2S SIM - Indol UREASE CITRATO VM NITRATONITRITO Diagnstico

Cremosa Cremosa Verde Escuro Verde Escuro X X Bacilo Longo Bacilo Longo (+) (+) PROVAS BIOQUMICAS (+) (+) (-) (+) NR cido cido (-) (+) cida Alcalino (-) Imvel (-) (-) (-) (+) (+) (-) Bacillus pumilus Fermentao Alcalino cido (-) (+) Alcalino Alcalino (-) Mvel (-) (-) (-) (+) (-) (-) Pseudomonas aeruginosa

Mucosa Rosa (-) Bacilo Curto (-) (+) (+) Fermentao (oxidativo) NR NR (-) (-) cida Alcalino (-) Mvel (-) (-) (-) (+) (+) (-) Pseudomonas aeruginosa

Ambos os microrganismo foram identificados como sendo bactrias. O microrganismo X4 foi identificado como Pseudomonas aeruginosa, e o microrganismo X5 como Bacillus pumilus. 3.3Estudo de meio para aumento da produo
3.3.1 Fermentaes com Pseudmonas aeruginosa
Excludo: 3.2.1 Tenso superficial Excludo: Dentre as determinaes analticas realizadas a que apresentou melhor resultado foi a da tenso superficial, por ser uma tcnica menos sensvel e mais fcil de ser padronizada, sendo que foi tomada esta anlise para avaliao da produo de biossurfactantes. Tenso superficial para Pseudomonas aeruginosa

Na Figura 3 encontram-se os resultados de tenso superficial dos meios de cultivo nos tempos: inicial (coleta 1), 2 d (coleta 2) e 4 d (coleta 3) de fermentao com a bactria Pseudomonas aeruginosa.

Figura 3: Tenso superficial dos meios durante a fermentao com a bactria Pseudomonas aeruginosa. Avaliando os resultados pode-se observar uma queda significativa da tenso superficial do lquido no decorrer do tempo de fermentao, o que indica a produo de compostos tensoativos no meio de cultivo. Para melhor entendimento da influncia das variveis sobre a tenso superficial realizou-se anlise de varincia dos resultados atravs do mdulo Experimental Design do Software Statistica 8.0, utilizando os valores referentes reduo da tenso superficial no quarto dia de fermentao. A Tabela 6 apresenta a anlise de varincia dos dados de reduo da tenso superficial em 4 d de fermentao em comparao com o tempo inicial em funo das variveis indutor, concentrao de indutor e presena da fonte de nitrognio.
Tabela 3: Anlise de varincia dos dados de reduo da tenso superficial em 4 d de fermentao em comparao com o tempo inicial em funo das variveis do Planejamento Fatorial Completo 23.
Excludo: 6

Fonte de variao (1) Indutor (2) Conc. indutor (3) Presena da fonte de nitrognio 1 by 2 1 by 3 2 by 3 Erro Soma dos quadrados total

Soma dos quadrados 4,646 197,846 50,561 1,396 177,303 11,107 157,094 599,952

Graus de liberdade 1 1 1 1 1 1 17 23

Quadrado mdio 4,646 197,846 50,561 1,395 177,303 11,107 9,241

F 0,502 21,410 5,471 0,151 19,187 1,202

P 0,487 <0,001 0,032 0,702 0,0004 0,288

A Tabela 7 apresenta os efeitos estimados das variveis e os coeficientes de regresso do modelo matemtico que representa a tenso superficial em funo das variveis.
Tabela 4: Efeitos estimados das variveis e coeficientes de regresso do modelo matemtico que representa a tenso superficial em funo das variveis
Excludo: 7

Fonte de variao Mdia (1)Indutor (2)Conc. indutor (3)Presena da fonte de nitrognio 1 by 2 1 by 3 2 by 3

Efeitos estimados 11,186 -0,879 -5,742 -2,902 0,482 5,436 1,360

Coeficientes de regresso 11,186 -0,439 -2,871 -1,451 0,241 2,718 0,680

P 0,000 0,487 0,0002 0,031 0,702 0,0004 0,288

Verifica-se que todas as variveis estudadas apresentaram efeitos principais negativos, o que significa que a maior reduo na tenso superficial dos meios ocorreu nos nveis inferiores das variveis, ou seja, com leo de soja como indutor na concentrao de 1% e sem a fonte de nitrognio. O coeficiente de determinao (R), do modelo matemtico (Equao 1) que uma medida de qualidade do modelo em relao sua habilidade de estimar corretamente os valores da varivel resposta, foi de 0,73, validando a superfcie de resposta apresentada na Figura 2. (1)

Figura 4: Superfcie de resposta da reduo da tenso superficial dos meios considerando os resultados de 4 d de fermentao em comparao com o tempo inicial para a bactria Pseudomonas aeruginosa em funo da presena de sulfato de amnio e da concentrao de indutor. Observando a Figura 4, verifica-se que quanto menor a concentrao de indutor e sem a presena de (NH4)2SO4 como fonte adicional de nitrognio, a reduo da tenso superficial foi maior, resultado da maior produo de biossurfactantes pelo microrganismo Pseudomonas aeruginosa. 3.3.2 Fermentaes com Bacillus pumilus
Excludo: Tenso superficial para

Na Figura 5 encontram-se os resultados de tenso superficial dos meios de cultivo durante a fermentao com a bactria Bacillus pumilus.

Figura 5: Tenso superficial dos meios durante a fermentao com a bactria Bacillus pumilus. A tenso superficial dos meios fermentados com a bactria Bacillus pumilus tambm decaiu significativamente no decorrer do tempo de fermentao, chegando a valores de tenso superficial ainda menores quando comparados com os valores obtidos com a bactria Pseudomonas aeruginosa. Aps isso se realizou anlise de varincia dos resultados atravs do mdulo Experimental Design do Software Statistica 8.0, utilizando os valores referentes reduo da tenso superficial no quarto dia de fermentao, para melhor compreenso dos resultados. A Tabela 8 apresenta a anlise de varincia dos dados de reduo da tenso superficial em 4 d de fermentao em comparao com o tempo inicial em funo das variveis.
Tabela 5: Anlise de varincia dos dados de reduo da tenso superficial em 4 d de fermentao em comparao com o tempo inicial em funo das variveis do Planejamento Fatorial Completo 23.
Excludo: 8

Fonte de Variao (1) Indutor (2) Conc. indutor (3) Presena da fonte de nitrognio 1 by 2 1 by 3 2 by 3 Erro Soma dos quadrados total

Soma dos quadrados 2854,334 2,050 8,932 0,003 7,296 22,685 45,489 2940,789

Graus de Liberdade 1 1 1 1 1 1 17 23

Quadrado mdio 2854,334 2,050 8,932 0,003 7,296 22,685 2,676

F 1066,709 0,766 3,338 0,001 2,727 8,478

P 0,000 0,394 0,085 0,973 0,117 0,009

A Tabela 9 apresenta os efeitos estimados das variveis e os coeficientes de regresso do modelo matemtico que representa a tenso superficial em funo das variveis.

Tabela 6: Efeitos estimados das variveis e coeficientes de regresso do modelo matemtico que representa a tenso superficial em funo das variveis.

Excludo: 9

Fonte de variao Mdia (1)Indutor (2)Conc. indutor (3)Presena da fonte de nitrognio 1 by 2 1 by 3 2 by 3

Efeitos estimados 21,388 -21,811 -0,584 -1,220 -0,023 -1,103 1,944

Coeficientes de regresso 21,388 -10,905 -0,292 -0,610 -0,011 -0,551 0,972

P 0,000 0,000 0,394 0,0853 0,973 0,117 0,009

Como para Pseudomonas aeruginosa, para Bacillus pumilus, verifica-se que todas as variveis estudadas apresentaram efeitos principais negativos, o que significa que a maior reduo na tenso superficial dos meios ocorreu, com leo de soja como indutor na concentrao de 1% e sem a fonte de nitrognio, sendo estes os nveis inferiores das variveis. O R, do modelo matemtico (Equao 2) foi de 0,98, validando as superfcies de resposta apresentadas na Figura 5, com preciso da estimativa ainda maior. (2)

Figura 6: Superfcie de resposta da reduo da tenso superficial dos meios considerando os resultados de 4 d de fermentao em comparao com o tempo inicial para a bactria Bacillus pumilus em funo da presena de sulfato de amnio e da concentrao de indutor. Ao analisarmos a Figura 6, observa que com o indutor leo de soja a reduo da tenso superficial foi maior e quando variado a concentrao do indutor foi com a menor concentrao que se obteve os melhores resultados.

Nos grficos ainda pode-se verificar que sem a presena de (NH4)2SO4, a tenso superficial obtida foi menor, caracterizada pela maior produo de biossurfactantes. Ser que no conseguimos tirar nada dos resultados de AE A/o e O/A nesta etapa???/

Formatado: Realce

3. CONCLUSO Na etapa de seleo, os microrganismos X4 e X5 foram os que apresentaram melhores resultados em relao a produo de biossurfactantes, tendo maiores valores de atividades emulsificantes A/O e O/A. O microrganismo X4 foi identificado como sendo Pseudomonas aeruginosa, e o microrganismo X5 como Bacillus pumilus Dentre as determinaes analticas realizadas a que apresentou melhor resultado foi a da tenso superficial, sendo esta uma anlise menos sensvel e mais fcil de ser padronizada; Na comparao estatstica entre os diversos experimentos, para ambos os microrganismos a maior produo de biossurfactante, ou seja, maior atividade emulsificante e menor tensiometria foram obtidas com leo de soja como indutor na menor concentrao sem a presena de (NH4)2SO4, como fonte adicional de nitrognio. A menor tenso superficial foi obtida com o microrganismo Bacillus pumilus, com um valor de 34 mN/m, reduzindo 47 % em relao a gua, a qual possui uma tenso de 71, 97 mN/m a 25C; A bactria Pseudomonas aeruginosa, conseguiu atingir um valor mnimo de 39 mN/m, tenso essa considerada boa, pois segundo Parra (1989), a Pseudomonas aeruginosa capazes de reduzir a tenso superficial em no mximo 30 mN/m.
Excludo: ;

Precisamos implementar a introduo e a discusso com mais referncias. 4. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS DIAS, F.G. Utilizao de consrcio microbiano para biorremediao do meio ambiente contaminado com derivados de petrleo. 2007. Tese (Doutor em Cincia de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2007. FARIA, A. F. de. Produo, purificao e caracterizao qumica de biossurfactantes produzidos por Bacillus Subtilis em glicerina residual. 2010. Tese (Doutora em Cincia de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2010. MARTINS, V.G. et al., Solid state biosurfactant production in a fixed-bed column bioreactor. Z. Naturforsch., v. 61c, p. 721-726, 2006. NITSCHKE,M.; PASTORE, G. M. Biossurfactantes a partir de resduos agroindustriais: avaliao de resduos agroindustriais como substrato para produo de biossurfactantes por Bacillus. Biotecnologia, Cincia e Desenvolvimento, v. 3, n. 31, p. 63-67, jul/dez. 2003. PARRA, J. et. al. Chemical characterization and physico-chemical behavior of biosurfactants. Journal Of The American Oil Chemists Society, Chicago, v.66, n.1, p.141-145, 1989.

Formatado: Realce

Formatado: Alemo (Alemanha)

Formatado: Ingls (EUA)

Pgina 2: [1] Excludo

Grmio

5/1/2012 22:38:00

Dos microrganismos isolados, cinco foram testados. (NO TEM COMO FORAM ISOLADOS...) A identificao dos microrganismos foi realizada no Laboratrio de Bacteriologia Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade de Passo Fundo. A caracterizao das amostras seguiu os seguintes passos: as amostras que chegaram ao laboratrio pr isoladas foram plaqueadas em AS (Agar Sangue) e MAC (Macocnkey). - Agar Sangue: meio no seletivo enriquecido que favorece o crescimento da maioria das bactrias patognicas e que utilizado para isolamento primrio. Permite o reconhecimento da produo de hemlise bacteriana. Crescem bactrias gram positivas e negativas. - Agar MacConkey: meio seletivo, contendo bile, que especialmente til para isolar enterobactrias e outras bactrias gram negativas. Permitindo ainda identificar bactrias fermentadoras e no fermentadoras de lactose. As colnias fermentadoras de lactose tornam - se o meio ao redor rosas. Seletivo para enterobacteriaceae. Aps o pr isolamento destas amostras foram selecionadas as colnias a realizado os seguintes procedimentos: caracterizao fisiolgica dos isolados, perfil bioqumico, teste da citocromo c oxidase, teste da catalase, testes para enterobactrias, testes para no enterobactrias[G1].
Pgina 3: [2] Excludo Grmio 5/1/2012 22:27:00

2.2 Manuteno e preparo de inculo O inculo foi preparado em meio Plate Count (PC) a partir de placas de Petri contendo os microrganismos isolados em meio PCA, onde estes estavam mantidos, com a finalidade de multiplicao das clulas para dar incio ao processo fermentativo. Em erlenmeyer de 300 mL foi adicionado 100 mL do meio PC, sendo inoculada uma alada de colnias, com posterior incubao em agitador orbital por 48 h a 30C. 2.3 Meios de cultivo 2.3.1 Seleo Para uma pr verificao da produo de biossurfactantes, as colnias foram colocados em gar azul de metileno contendo peptona casena 10 g/L, lactose 10 g/L, fosfato monobsico de potssio 2,0 g/L, azul de metileno 0,065 g/L e gar 15,0 g/L, o meio foi autoclavado e vertido em placas de petri estreis, logo aps sua solidificao com o auxio de uma ala os microorganismo s foram fixados por estriamento. As placas foram incubadas 48 h em estufa a 30C. O PDA (Potato Dextrose Agar) um meio de cultivo seletivo, no qual crescem somente fungos e leveduras. No preparo do meio foram adicionados 39 g do PDA em 1 litro de gua destilada, que possui os seguintes componentes: Agar 15g/L, Dextrose 20g/L, Infuso de batata desidratada 4g/L. Aps autoclavado por 15 min a 121C, o meio foi vertido nas placas de petri esterilizadas seguindo-se a inoculao das colnias de microrganismos por estriamento, com posterior incubao das colnias em estufa a 30 C durante 48 a 96 h. O PCA (Plate Count gar) um gar nutritivo que contm extrato de levedura 2,5 g/L , glicose 1 g/L, gar 15 g/L, triptona 5 g/L. Nas placas de petri estreis foi adicionado o meio de cultura Plate Count Agar (PCA) autoclavado e com o auxlio de uma ala foi feito o estriamento das colnias para o crescimento dos microrganismos por 24 h em estufa a 30C. ISSO AQUI??

No processo para seleo dos microrganismo produtores de biossurfactantes a fermentao submersa foi realizada utilizando o meio de cultivo composto por: extrato de levedura, 10 g/L; sulfato de amnio (NH4)2SO4, 5 g/L; fosfato de potssioKH2PO4, 5 g/L; sulfato de magnsio MgSO4, 0,5g/L, e adicionado 1% de leo diesel como indutor da produo de microrganismos, sendo que est composio foi baseada no trabalho de Arakaki (2010). Os erlenmeyers contendo 30 mL do inculo foram vertidos nos erlenmeyers contendo 70 mL do meio de cultivo para a realizao da fermentao. A fermentao ocorreu em agitador orbital a 160 rpm, 30C, sendo coletadas amostras para a determinao das atividades emulsificantes nos tempos de 0, 1, 2, 3, 4 e 5 d.
Pgina 3: [3] [G4] Comentrio Grmio 5/1/2012 22:57:00

Buscar uma referncia para a caracterizao bioqumica

Pgina 3: [4] Excludo Grmio 5/1/2012 22:31:00

Aps a seleo das cepas variou-se a composio do meio de cultivo a partir de um

Pgina 3: [5] Excludo Grmio 5/1/2012 22:35:00

de cultivo para realizao da fermentao. A inoculao foi realizada com 10% de inoculo.
Pgina 3: [6] [G5] Comentrio Grmio 5/1/2012 22:57:00

Ser que no tiramos nada de til dos resultados de AE o/a e AEa/o nesta etapa?
Pgina 3: [7] [G6] Comentrio Grmio 5/1/2012 22:57:00

Estes experimentos foram realizados em duplicata???

Pgina 4: [8] Excludo Grmio 5/1/2012 22:40:00

3.1.1 Teste Agar azul de metileno

Quadro 1: Produo de halos pelos microrganismos.

Microrganismo X1 X2 X3 X4 X5

Produo de halo Sim Sim Sim Sim Sim

O Quadro 1 apresenta os resultados de produo de halo no teste azul de metileno.Todos os microrganismos isolados apresentaram a produo de halo,

Pgina 4: [9] Excludo

Grmio

5/1/2012 22:41:00

3.1.2 Crescimento em PDA e PCA Quadro 2: Verificao do crescimento em meios PCA e PDA. Microrganismo X1 X2 X3 X4 X5
Pgina 4: [10] Excludo

Crescimento PCA Sim Sim Sim Sim Sim

Grmio

Crescimento PDA Sim Sim Sim No Sim

5/1/2012 22:41:00

O Quadro 2 apresenta os resultados de crescimento nos meios PDA e PCA. Como no houve crescimento do microrganismo X4 em gar PDA, h uma indicao de que este microrganismo possa ser uma bactria, uma vez que fungos filamentosos e leveduras possuem habilidade de crescimento em meio PDA. Porm, no pode ser desconsiderada a possibilidade de ter ocorrido erros experimentais na etapa de inoculao. X5 no deveria ter crescido, pq bactria, tambm. Desta forma, devido a caractersticas das colnias (circulares, lisas e brilhantes), os microrganismos X1, X2, X3 e X5 foram classificados como leveduras, enquanto que o microrganismo X4 pode ser um fungo ou bactria filamentosa devida s caractersticas de estriamento das colnias no meio. AQUI VERIFICOU-SE QUE NO ISSO..., da tirar?? 3.1.3 Atividades emulsificantes A Tabela 2 apresenta os resultados das atividades emulsificantes leo em gua (O/A) durante 5 dias de fermentao pelos 5 microrganismos isolados. Tabela 2: Atividade emulsificante O/A. AE O/A X3 4,39 6,09 6,89 6,99 -

Tempo 0 1 2 3 4

X1 6,21 4,82 6,05 3,81

X2 5,18 5,02 5,82 7,31 6,13

X4 3,12 3,89 3,82 5,13 5,14

X5 2,38 2,83 6,43 6,97

3,08

5,77

7,10

4,40

7,16

Pgina 5: [11] Excludo

Grmio

5/1/2012 22:49:00

A Tabela 3 apresenta os resultados das atividades emulsificantes gua em leo (A/O) durante 5 dias de fermentao produzida pelos 5 microrganismos isolados. Tabela 3: Atividade emulsificante A/O. AE A/O X2 X3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tempo 0 1 2 3 4 5

X1 0 0 59,19 62,74

X4 0 0 145,63 183,44 164,51 201,60

X5 0 91,24 154,52 149,70 58,94 0

Figura 2: Atividade emulsificante A/O das 5 cepas de microrganismos durante 5 dias de fermentao. A Figura 2 apresenta as atividades emulsificantes A/O durante 5 dias de fermentao de cada um dos 5 microrganismos isolados. Pode-se observar que os microrganismos X2 e X3 no apresentaram atividade de emulsificao gua em leo, enquanto que os microrganismo X1 e X4 apresentara mxima atividade no 4 dia de fermentao. No 2 dia de fermentao foi observada a mxima capacidade de emulsificao obtida a partir dos extratos do microrganismo X5.