IEDA DALLA PRIA BLANCO

ASPIRAO FOLICULAR VIA TRANSVAGINAL GUIADA POR ULTRASSONOGRAFIA PARA OBTENO DE OCITOS EQINOS

Monografia apresentada para Exame Geral de Qualificao do Programa de Ps-graduao em Medicina Veterinria, Curso de Mestrado, rea de Reproduo Animal, da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da UNESP Campus de Botucatu.

BOTUCATU SP 2007

Resumo

A aplicao de tcnicas de reproduo assistida em eqinos encontra limitaes decorrentes da resposta insatisfatria a tratamentos hormonais e da baixa taxa de recuperao de ocitos in vivo de fmeas de alto valor. Dentre as alternativas para coleta de ocitos, para que estes possam ser utilizados em programas de produo in vitro de embries, inoculao intra-citoplasmtica de espermatozoides (ICSI) e transferncia de ocitos (TO), demonstrou-se que a mais prtica e segura atualmente a aspirao trans-vaginal guiada por ultrassonografia (OPU), a qual ainda apresenta resultados inferiores aos observados em bovinos, em funo de particularidades anatmicas da espcie eqina. O objetivo desta reviso comparar os resultados de estudos conduzidos no intuito de padronizar uma tcnica para OPU que permita um ndice de recuperao de ocitos satisfatrio e que torne a tcnica economicamente vivel. Para tanto, a influncia de fatores como tipo de agulha, presso de vcuo utilizada, tratamento hormonal, lavagem e escarificao do folculo, intervalo de aspirao e fase do ciclo estral deve ser observada.

Palavras-chave: OPU, eqinos, ocitos, aspirao folicular

SUMRIO

1.INTRODUO.............................................................................................................4 2. REVISO DE LITERATURA 2.1 CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DOS FOLCULOS EQINOS.............5 2.2 MTODOS DE ASPIRAO FOLICULAR............................................................6 2.3 ASPIRAO FOLICULAR GUIADA POR ULTRASSONOGRAFIA: CONSIDERAES TCNICAS 2.3.1 INFLUNCIA DA PRESSO DE VCUO, AGULHA, LAVAGEM E ESCARIFICAO DO FOLCULO................................................................................7 2.3.3 INTERVALO DE ASPIRAO.............................................................................9 2.4 USO DE HORMNIOS EXGENOS.......................................................................9 2.5 INFLUNCIA DA FASE DO CICLO E DA GESTACAO NO MOMENTO DA ASPIRAO FOLICULAR...........................................................................................12 2.6 EFEITOS DA ASPIRAO FOLICULAR NO CICLO ESTRAL.........................14 3.CONSIDERAES FINAIS.......................................................................................16 4. REFERNCIAS..........................................................................................................17

1. INTRODUO

Em guas, a aplicao de tcnicas de reproduo assistida encontra limitaes como a relativamente baixa taxa de resposta aos tratamentos superovulatrios, de recuperao embrionria e de recuperao de ovcitos por aspirao trans-vaginal (OPU) quando comparados aos ndices observados em bovinos. Estes resultados insatisfatrios dificultam o aproveitamento de fmeas de alto valor atravs de tcnicas como a transferncia de embries (TE), fertilizao in vitro (FIV), transferncia de ocitos para fertilizao in vivo na receptora (TO) e a produo de embries por injeo intra-citoplasmtica de espermatozides (ICSI), as quais permitem que uma mesma fmea produza um nmero maior de potros durante sua vida reprodutiva, alm de possibilitar a utilizao de fmeas infrteis ou sub frteis em programas de reproduo e melhoramento gentico. Para a utilizao de grande parte destas tcnicas, a disponibilidade de ocitos um fator limitante. Em centros de pesquisa, a possibilidade de se trabalhar com ocitos oriundos de ovrios coletados em matadouros encontra entraves em decorrncia da escassez de matadouros eqinos no Brasil, enquanto a campo as baixas taxas de recuperao de ocitos por folculo aspirado tambm limitam a aplicao das referidas tcnicas. Algumas particularidades da espcie eqina influenciam negativamente os resultados, como o ocito mais aderido ao folculo e a dificuldade de manipulao do ciclo estral com hormnios exgenos. Alm disso, os ocitos recuperados devem ter a capacidade de retomarem a meiose e completarem a maturao in vitro, para que estejam aptos fertilizao. No mundo todo poucos laboratrios desenvolvem pesquisas nesta rea, o que dificulta o progresso da tcnica e a anlise de dados disponveis para o estabelecimento de um protocolo adequado que proporcione taxas de recuperao satisfatrias. O objetivo desta reviso comparar os resultados de estudos conduzidos no intuito de

padronizar uma tcnica para OPU que permita um ndice de recuperao satisfatrio e que torne a tcnica economicamente vivel. Para tanto, a influncia de fatores como tipo de agulha, presso de vcuo utilizada, tratamento hormonal, lavagem do folculo, intervalo de aspirao e fase do ciclo estral deve ser considerada.

2. REVISO DE LITERATURA

1. . CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DOS FOLCULOS EQINOS

Hawley et al (1995) analisaram comparativamente folculos dissecados de ovrios de bovinos e eqinos provenientes de matadouro, e concluram que h entre eles diferenas que justificam a dificuldade de obteno de ocitos eqinos. A gua possui um cumulus oophorus mais espesso e menos fenestrado que a vaca, que se apresenta menos saliente em relao lamina basal, com uma ampla base na regio em que o cumulus est fixado. Alm disso, estes autores observaram que, somente em alguns folculos eqinos, na teca interna imediatamente abaixo do ocito, havia uma rea relativamente acelular, fibrilar e vacuolizada na qual se estendiam processos celulares das clulas do cumulus, e concluram que esta regio serve como ncora para o ocito, impedindo que ele seja facilmente destacado da parede folicular. Para folculos pr - ovulatrios, entretanto, a deposio de cido hialurnico mediada por LH favorece o destacamento do ocito (Goudet, 1997; Hafez, 2000). Carnevale et al (2005), obtiveram uma taxa de recuperao de ocitos a partir de folculos pr - ovulatrios de 77%, preconizando a aspirao desta categoria de folculos como melhor alternativa para coleta em programas comerciais de transferncia de ocitos. Esta taxa relativamente alta se deve provavelmente s alteraes morfolgicas observadas nos folculos pr - ovulatrios.

2. . MTODOS DE ASPIRAO FOLICULAR

Palmer (1987) foi o primeiro a descrever uma tcnica de aspirao com o animal em estao, onde o operador manipulava o ovrio pelo reto e guiava uma agulha pelo flanco at os folculos. Os primeiros milmetros do fluido folicular eram reinjetados para recuperar o ocito e ento o folculo era lavado com 20 ml de soluo Dulbecco com heparina. A taxa de recuperao obtida neste trabalho pioneiro foi 63%. Vogelsang et al (1988) compararam a coleta de ocitos via puno trans-cutnea pelo flanco com a coleta via laparotomia e exposio do ovrio. O primeiro experimento obteve taxas recuperao entre 10% e 38%. Com a laparotomia, esta taxa aumentou para 14% a 60%, indicando que a coleta de ocitos com o animal em estao era possvel, com sucesso moderado, sem danos ao ocito. McKinnon et al (1988) relataram excelentes taxas de recuperao (71,4%) quando usaram uma cnula e uma agulha de 9,8 mm para aspirar folculos pr-ovulatrios pelo flanco. Outro procedimento, o da colpotomia, foi descrito por Hinrichs et al (1987) com taxas de recuperao de 73%: alm da inciso pelo flanco, outra era feita em fundo de vagina, permitindo que o operador introduzisse sua mo na cavidade peritoneal e direcionasse o ovrio diretamente contra a cnula. Entretanto, todas estas tcnicas envolvendo procedimentos cirrgicos apresentam efeitos colaterais indesejveis, como aderncias ovarianas que limitam o nmero de vezes em que o procedimento pode ser repetido, infeces e complicaes anestsicas, entre outros fatores (SQUIRES, 1996). A aspirao trans-vaginal guiada por ultrassom um mtodo pouco invasivo e relativamente simples para punes repetidas de folculos imaturos e pr-ovulatrios na

gua. O procedimento bem tolerado, entretanto Wandervall e Woods (2002) relataram hemorragia severa aps a OPU em funo de comprometimento vascular da artria do ligamento uterino em uma gua. Alm disso, Bogh et al (2003), analisaram a funo e morfologia ovariana aps punes freqentes por um perodo de oito anos, e concluram que embora no ocorram alteraes na foliculognese, ovulao e formao do corpo lteo, as punes induzem fibrose reparativa no estroma ovariano e h risco de formao de abscessos. A tcnica foi inicialmente descrita por Brck et al (1992), que baseando-se nos mtodos utilizados em programas de FIV humana e bovina, usaram um transdutor digital conectado a um monitor de ultrassom, que mostrava uma linha de puno na tela, para aspirar folculos pr-ovulatrios. Uma agulha de lmen simples acoplada a uma seringa de 50 ml foi usada para lavar a cavidade folicular por at trs vezes com PBS com heparina. Um ocito foi recuperado de quatro folculos aspirados, demonstrando que a tcnica era acurada, rpida e pouco complicada para efetuar coleta de ocitos em guas.

3.

ASPIRAO FOLICULAR GUIADA POR ULTRASSONOGRAFIA: CONSIDERAES TCNICAS

2.3.1. INFLUNCIA DA PRESSO DE VCUO, AGULHA, LAVAGEM E ESCARIFICAO DO FOLCULO.

Vogelsang (1998) puncionou foliculos pr-ovulatrios pelo flanco com uma agulha de 13 G e obteve melhores ndices com sistema de aspirao vcuo e irrigao contnua do que efetuando a aspirao com seringa de 50 ml (38% x 10%, respectivamente). Por laparotomia, a presso de vcuo tambm incrementou os resultados: obteve-se 14% de recuperao no sistema simples e 60% no sistema de irrigao/aspirao vcuo.

A influncia da presso de vcuo nas taxas de recuperao de ocitos tambm foi estudada por Kanitz e Berger (1995). Quatorze ovrios de matadouro forneceram 37 complexos cumulus - ocito (COC) de 134 folculos entre 5 e 46 mm quando uma presso de 0,2 ou 0,4 bar (1 mmHg = 1,333 x 10-3 bars) era usada. No houve diferena na taxa de recuperao (28,8% x 26,4%) quando comparadas as duas presses de vcuo. Bruck e Greeve (1997) investigaram os efeitos da aspirao e lavagem do folculo usando uma agulha de 18G e uma seringa de 60 ml, comparado suco e lavagem do folculo com bomba de eltrica. O uso da bomba eltrica s aumentou 1% o indice de recuperao, o que no foi considerado um aumento efetivo (33% x 34%). A presso de vcuo utilizada para aspirao varia de 150 mmHg (CARNEVALE, 2001 e 2005; PURCELL, 2007) at 300 mmHg (DUCHAMP, 1995; SQUIRES, 1996; BOGH, 2002), mas em funo do grande nmero de outras variveis envolvidas nestes experimentos, possveis diferenas nos resultados devem ser atribudas a outros fatores. Hinrichs et al (1987), aspiraram por colpotomia 13 folculos, e obtiveram 9 ocitos, dos quais apenas 3 foram encontrados no fluido aspirado inicial e os outros no lavado. Alm disso, Cook et al (1992) determinaram que a lavagem do folculo aspirado era essencial para a coleta de ovcitos, j que nenhum foi encontrado no fluido folicular, enquanto repetidas lavagens do mesmo folculo resultaram em taxas de recuperao de 52% para folculos pr-ovulatrios previamente tratados com hCG. A turbulncia criada pela lavagem do folculo aps a aspirao facilita o destacamento do ocito em folculos pr-ovulatrios, onde a conexo entre o ocito e as clulas da parede folicular mais fraca, porque aps o estmulo gonadotrfico pr-ovulatorio ocorre deposio de cido hialuronico que causa a expanso das clulas do cumulus (Brck, 1996; Hafez, 2000). Pode-se utilizar presso para a lavagem do foliculo, alm da presso utilizada na aspirao. Bogh et al (2002) obtiveram entre 42-50% de recuperao de ocitos, a partir de folculos de at 30 mm, utilizando 500 mmHg para a lavagem. Duchamp et al (1995)

btiveram em mdia 29% de recuperao, efetuando lavagem com fluxo contnuo de 500 mmHg e agulha de lmen duplo, ndice superior ao obtido com lmen simples e presso de 380 mmHg na lavagem (23%, p<0,05). Enquanto para folculos em estro a lavagem efetivamente aumentou as taxas de recuperao (46,4% x 12,5%), esta melhora no foi observada em foliculos de diestro: obteve-se 10% x 5,6% para folculos < 20 mm e 30% x 26% para os maiores que 20, lavados e no lavados, respectivamente.Alm disso os autores sugerem que em folculos de diestro, s a lavagem no suficiente para a retirada do ocito, recomendando a escarificao da parede folicular com agulha para que seja liberado o ocito imaturo (Mari, 2005). Em estudo conduzido por Squires et al (1996), a escarificao da parede de folculos pr-ovulatrios no produziu ndices satisfatrios (22%). Neste mesmo estudo o uso da agulha de lmen duplo para a lavagem com fluxo contnuo por 2 a 4 minutos ocasionou 84% de recuperao de ocitos por folculo, enquanto com lmen simples e 3 a 5 lavagens alternadas com a aspirao obtiveram 51%. A curetagem da parede folicular mais facilmente realizada quando o folculo apresenta dimetro pequeno, no entanto, os ocitos oriundos de folculos com menos de 10 mm de dimetro apresentam baixa capacidade de sofrer maturao in vitro (Goudet, 1997). Segundo Erice (1998), considerando que um complexo-cumulus-ocito apresenta um dimetro entre 0,3-1mm, melhores resultados so obtidos com agulhas de pelo menos 18 G, cujo diametro interno de 0,9 mm. Agulhas melhores poderiam danificar as estruturas.

1.

INTERVALO DE ASPIRAO

Bruck et al (1996) compararam os resultados da aspirao a intervalos de 6 e 23 dias e obtiveram maiores taxas quando as guas eram aspiradas a cada 23 dias (35,8% contra

18,4%), alm de no encontrarem melhora significativa com o uso de FSH. Duchamp et al (1995) obtiveram uma taxa de 29% quando as aspiraes eram efetuadas uma vez por ciclo, enquanto para aspiraes semanais o ndice de recuperao foi de 18%. Estes resultados indicam que aspiraes a intervalos maiores proporcionam recuperao de maior nmero de ocitos, embora a intervalos menores a taxa final de todas as aspiraes somadas possa ser equivalente ou superior. Com uma aplicao de anlogo de prostaglandina no diestro, Meintjes et al (1999) encurtavam o ciclo das guas e dessa forma conseguiram efetuar entre 1 e 3 aspiraes em um intervalo de 32 dias, obtendo 42,9% de recuperao de ocitos por foliculo pre-ovulatrio e previamente estimulado com hCG (2500 UI). Tambm com intervalo de 10-11 dias, Purcell et al (2007) obtiveram at 23% de recuperao aspirando foliculos durante o diestro.

1.

USO DE HORMNIOS EXGENOS

O uso de hCG amplamente disseminado para acelerar a maturao folicular e melhorar o ndice de recuperao de ocitos por OPU de folculos pr-ovulatrios. As doses utilizadas variam de 1500 a 3300 UI, e aps sua aplicao a aspirao efetuada entre 20-36 horas depois. O critrio para o momento da administrao a presena de folculo dominante (27-35mm), edema uterino, tero e crvix relaxada e comportamento de cio (VOGELSANG, 1988; HINRICHS, 1987 e 1998; BRUCK, 1992; SQUIRES e COOK, 1996; CARNEVALE, 2001 e 2005; CARNEVALE e GINTHER, 1995). Vogelsang et al (1988) trataram 14 guas com 2000 UI de hCG ou 2 mg de gonadorrelina quando um folculo dominante estava presente, sendo ento efetuada a laparotomia para aspirao folicular, cuja taxa de recuperao foi maior para o grupo das guas tratadas (83%) que para o das no tratadas (18%). Em um segundo experimento, 6

guas foram submetidas a aspirao no cirrgica: 5 receberam 1000 UI de hCG e uma recebeu 20 mg de buserelina, e a taxa de recuperao foi de 15% para as no tratadas contra 31% para as tratadas. Apesar do pequeno nmero de guas utilizado neste experimento, concluiu-se que o tratamento com hormnios exgenos era benfico para a recuperao de ocitos. Hinrichs e Kenney (1987) relataram um procedimento que associava colpotomia com aspirao pelo flanco onde no foram encontradas diferenas significativas nas taxas de recuperao de guas tratadas com hCG , em comparao ao grupo no tratado. O ndice de recuperao obtido com a administrao de 2200 UI de hCG 36 horas antes da coleta foi 75% (3 ocitos obtidos de 4 folculos) enquanto para as guas no tratadas obteve-se 66% de recuperao (6 ocitos de 9 folculos aspirados). Entretanto a colpotomia proporciona uma facilidade de manipulao que pode ter influenciado estes resultados, j que os autores relatam neste mesmo trabalho ndices de apenas 17% sem hCG e at 62% com hCG em estudos anteriores. Carnevale et al (2005) relataram 77% de recuperao de ocitos com protocolo de aspirao de folculos pr-ovulatrios, aps em mdia 21 horas da induo da ovulao com hCG (1500-2500) e deslorrelina (4 horas antes do hCG), j que em estudos prvios o hCG sozinho algumas vezes resultou em falhas na resposta folicular e obteno de ocitos imaturos. Repetidas aplicaes de hCG induzem a formao de anticorpos, por isso seria interessante utilizar outros indutores de ovulao antes da aspirao. O GnRH (deslorelina, 2,2 mg, s.c) e o EPE (80 mg, i.m), ambos aplicados 36 horas antes da OPU, proporcionaram 47 e 63% de recuperao de ocitos por folculo. No mesmo estudo este ndice foi de 82% quando se utilizou 3300 UI de hCG, i.v, 36 horas antes da OPU (SQUIRES e COOK, 1996). Bogh (2002), induzindo a ovulao com EPE (25 mg, i.m) obteve 68% de recuperao de ocitos por foliculo > 30 mm aspirado.

Se no momento da aspirao houvesse uma maior disponibilidade de folculos, provavelmente mais ocitos poderiam ser obtidos por ciclo. Por isso vrios trabalhos utilizaram protocolos de superovulao, na tentativa de incrementar os ndices de recuperao (BZARD, 1995; SQUIRES e COOK, 1996; BRUCK, 1997 e 2000; MACLELLAN, 2002; PURCELL, 2007). Segundo Bruck et al (1997), o tratamento com FSH suno (100mg/dia por 4 dias) no influenciou a taxa de recuperao de ocitos por folculo aspirado, embora tenha aumentado a disponibilidade de folculos. Bzard et al (1995), utilizaram EPE enriquecido com FSH (12,5% FSH + 3% LH) em tratamento de curta durao (iniciava-se quando um folculo atingia 17 mm) ou de longa durao (a partir da aplicao de PGF2 no stimo dia do ciclo) e induziram a ovulao com hCG quando o maior folculo atingiu 35 mm nas guas controle (no estimuladas) ou 30-35 mm nas superovuladas. Desta forma obtiveram 79,2% de recuperao de ocitos por folculo no grupo controle, 67,9% no grupo submetido tratamento de curta durao e 50% no de longa durao. Embora o maior ndice tenha sido obtido no grupo controle, esta diferena no foi significativa (p>0,05), e o nmero total de ocitos recuperados foi maior nos grupos superovulados, em funo da maior disponibilidade de folculos no momento da aspirao. Bruck et al (2000) iniciaram a aplicao de EPE (25 mg uma vez por dia) imediatamente aps a aspirao de todos os folculos maiores que 4 mm durante o estro (D0) e novamente aspiraram todos os folculos no oitavo dia de tratamento (D8). No houve diferena entre o nmero de folculos presentes entre os grupos no tratados e o grupo tratado no dia das aspiraes. O ndice de recuperao de ocitos tambm no aumentou com o tratamento, sendo obtidos em mdia 37% (ocitos/folculo) nas aspiraes no D0 e 48% x 40% no D8 para os grupos controle e EPE, respectivamente. Tambm utilizando EPE, Squires et al (1996) obtiveram 61% de recuperao aspirando folculos

pr-ovulatrios 36 6 horas aps induo da ovulao efetuada com hCG, GnRH ou EPE. Maclellan et al (2002) obtiveram melhores ndices a partir de guas no estimuladas (69%) que de guas superovuladas (20%) utilizando 25 mg de EPE duas vezes por dia, a partir do stimo dia do ciclo, e induzindo a ovulao quando a maioria dos folculos atingia 35 mm. Os autores atriburam estes baixos ndices dificuldade de manipulao dos ovrios com grande nmero de folculos, em funo do tratamento superovulatrio, e a deficincias na maturao folicular. Purcell et al (2007) utilizaram FSH purificado eqino (FSHe) em guas transicionais e cclicas, e no obtiveram melhora significativa nos ndices de recuperao de ocitos por folculo das guas tratadas (11-21%) em comparao s do grupo controle (5,8- 23%).

2.3.4 INFLUNCIA DA FASE DO CICLO, DO TAMANHO DOS FOLCULOS E DA GESTAO NO MOMENTO DA ASPIRAO FOLICULAR

A aspirao de folculos pr-ovulatrios proporciona ndices de at 78- 84% (GOUDET, 1999; CARNEVALE, 2005; SQUIRES, 1996), conforme descrito anteriormente. Entretanto, em folculos de diestro, estes ndices so bastante inferiores, variando de 6,9% a 43% (KANITZ e BERGER, 1995; DIPPERT, 1995; SQUIRES e COOK, 1996; BOGH, 2002). Squires et al (1996) obtiveram em mdia 52% de recuperao de ocitos por folculo aspirado durante o estro e apenas 22% durante o diestro, onde maiores ndices foram observados para folculos menores que 15 mm (31%) que para os maiores que 20 mm (8%). Os autores citam dificuldades para efetuar a OPU em folculos de diestro devido profundidade em que estes se encontram no estroma ovariano, o que ocasiona demora no procedimento e o torna mais doloroso. Kanitz e Berger (1995), relataram um decrscimo na taxa de recuperao de ocitos por folculo no diestro conforme progredia o ciclo estral (26,3% para folculos do dia 5 do

ciclo e 12,4% para folculos do dia 12). Quando foram comparados os resultados em relao ao dimetro folicular, esta diferena foi ainda maior, com ndices de 38,9 para foliculos menores que 10 mm e 6,9% para foliculos entre 21-30mm. Entretanto, Bruck et al (1996), trabalhando com ovrios provenientes de abatedouro obteve mais oocitos de foliculos entre 11 e 20 mm que dos menores que 10mm (61,3% x 43,7% ocitos/foliculo, respectivamente). Dippert et al (1995) tentaram aumentar o nmero de foliculos pequenos e mdios aspirando o folculo dominante antes da inibio do crescimento de outros folculos. Para isso efetuavam a aspirao do foliculo dominante e dos outros foliculos (>15mm) 3 ou 6 dias depois, comparando os resultados com guas onde o folculo dominante era identificado mas no aspirado e os outros eram puncionados tambm 3 ou 6 dias depois. Desta forma no observaram aumento do nmero de folculos pequenos e mdios, mas diminuram a quantidade de foliculos que entraram em processo de atresia. As taxas de recuperao de folculos aspirados 3 dias aps a puno do folculo dominante foi maior que as do grupo controle, no qual o folculo dominante era identificado mas no aspirado (35% x 22%). Bogh et al (2002) obtiveram em mdia 0,4 ocitos por folculo aspirado no oitavo dia do ciclo e 0,5 ocitos por folculo para as aspiraes efetuadas no estro e aps a induo da ovulao com EPE (D0), no havendo diferena estatistica entre estes grupos para p<0,01. Os foliculos aspirados eram dividos em categorias de acordo com seu tamanho (4-9 mm, 10-19mm, 20-29 mm, >30mm). Para os folculos aspirados no D0, no houve influncia do tamanho na recuperao de ocitos at 29 mm (45-52%) e 68% de recuperao foi obtido para os foliculos maiores que 30. Quanto aos folculos de diestro, nenhum atingiu 30 mm e os ndices foram maiores para folculos com menos de 20 mm que para os de 20-29 mm (45% x 30%, respectivamente). guas prenhes fornecem uma fonte adicional de ovcitos (Meintjes, 1995; COCHRAN, 1998; PURCELL, 2007). A recuperao de ocitos de guas prenhes parece ser

mais alta quando comparada a guas em diestro. Meintjes et al (1995) obtiveram 75% de recuperao de ocitos em guas prenhes contra 42.9% no grupo controle de guas com folculos pr-ovulatrios. Onze aspiraes foram realizadas por gua num perodo de 44 dias (entre os dias 22 a 66 de gestao) com um mximo de 7 ovcitos sendo recolhidos por seo. Eram aspirados todos os folculos quando um deles atingia 25 mm de dimetro. Este mesmo grupo, trabalhando com guas que se encontravam entre os dias 22 e 150 de gestao, obteve 40,2% de recuperao quando s os folculos maiores que 20 mm eram aspirados e 43% quando aspiraram todos os folculos maiores que 4 mm. O numero mdio de aspiraes por gua foi 7.6 e o nmero mdio de ocitos obtidos 18.9 por gua. Os autores concluram que cerca de 2,5 ovcitos podem ser coletados a cada 7 a 10 dias em guas prenhes. Cochran et al(1998) aspiravam todos os folculos maiores que 5 mm entre os dias 14 e 70 de gestao, obtendo desta forma 66% ocitos/folculo aspirado. Segundo Purcell et al (2007) os melhores ndices de recuperao de ocitos de guas prenhes foram observados no 25 dia de gestao e diminuram conforme progredia a gestao. As guas foram submetidas OPU at o 55 dia de gestao e os ndices de recuperao variaram de 1038%.

2.4 EFEITOS DA ASPIRAO FOLICULAR NO CICLO ESTRAL

Bruck et al (1994) avaliaram os nveis de progesterona em guas cujos folculos eram aspirados durante o diestro. Aspiraes sucessivas dos mesmos folculos nos dias 6, 14, 18 e 22 no afetaram os nveis de progesterona nem interferiram no comprimento do ciclo . Okolski e Bezard et al (1995) efetuaram punes sucessivas e analisaram o fluido folicular para determinar se este procedimento influenciava o crescimento folicular e a qualidade dos ocitos. A primeira puno era realizada quando o folculo tinha 25mm de

dimetro, uma segunda aspirao era feita 48 horas depois da primeira e a terceira 34-35 horas aps. As guas eram tratadas com EPE para induzir a ovulao no momento em que a terceira aspirao era realizada. Sessenta e cinco por cento dos folculos sobreviveram aps a primeira puno, 64% aps a segunda e 45% ovularam depois das terceira aspirao. Os autores concluram que a coleo de uma pequena quantidade de fluido folicular (0,5 ml) de cada vez ainda permite um bom ambiente folicular para o ocito ser fertilizado e produzir embries. Watson e Sertich (1990) trataram guas com hCG quando o folculo dominante estava maior que 35 mm de dimetro e aspiraram o contedo folicular 12, 24 ou 36 horas depois. Neste estudo no se observou diferena entre as concentraes plasmaticas de progesterona entre as eguas que ovularam normalmente e as que foram submetidas OPU. Alm disso, os autores concluiram que o fluido folicular poderia ser aspirado a qualquer momento aps a administrao de hCG (efetuada no momento da deteco de um foliculo>35mm), porque embora as concentraes de P4 tenham sido inferiores nos grupos aspirados entre 0-12 horas aps o hCG, a luteinizao est mais relacionada ao momento da aplicao do hCG que ao momento da aspirao. Em um estudo anterior, McKinnon et al (1987) observaram que as concentraes de progesterona nos dias 5 e 8 ps aspirao foram normais para guas cclicas durante o diestro. No dia 1 aps aspirao, 50% dos corpos lteos foram classificados como centralmente anecognicos, e no dia 8 ps aspirao, 38%. Os nveis de progesterona aps a aspirao de folculos pr-ovulatrios em guas tratadas com hCG permaneceram normais (Bracher, 1993; Cook , 1993). Estes resultados indicaram que a funo do CL pode ser normal aps a aspirao de folculos provulatrios, particularmente se o hCG administrado 24 a 36 horas antes da aspirao e a lavagem do folculo no remove todas as clulas da granulosa. Hayna et al (2006) observaram variao na formao de tecido luteal de acordo com

o tamanho dos folculos aspirados: a maioria resultou em estrutura hiperecica ultrassonografia, mas s uma parte das guas apresentou concentraes plasmticas de progesterona indicativas de presena de corpo lteo funcionante (> 1 ng/ml). Observou-se presena de tecido luteal em 88% das guas com folculos aspirados entre 26-30mm, em 100% das com folulos maiores que 30 mm e em nenhuma com foliculos menores que 25 mm, concluindo-se que a aspirao de foliculos maiores que 25 mm em guas em estro induz a formao de tecido luteal com atividade hormonal. Segundo Hinrichs et al (1991) a aspirao de folculos maiores que 30 mm no prejudicou a funo luteal de eguas cclicas. Para guas transicionais a aspirao de folculos maiores que 30 mm aps a administrao de hCG resultou em apenas 38% de luteinizao (ALVARENGA, 1999) e todas as guas onde se verificou a formao de tecido luteal retornaram ciclicidade.

1.

CONSIDERAES FINAIS

A aspirao folicular via trans-vaginal guiada por ultrassonografia representa uma alternativa vivel para a coleta de ocitos in vivo de guas de alto valor econmico e gentico, sem a necessidade de submet-las a procedimentos cirrgicos, entretanto, os resultados obtidos em eqinos com o uso desta tcnica ainda so muito inferiores aos observados em bovinos, uma vez que os melhores indices so obtidos com aspirao de foliculos pr-ovulatorios, proporcionando, portanto, a recuperao de cerca de um ocito por ciclo. Quanto ao efeito do tratamento hormonal, o hCG e outros indutores da ovulao como EPE e GnRH apresentam bons resultados, sendo o hCG mais utilizado. Os protocolos de superovulo no aumentam efetivamente o indice de recuperao de oocitos por foliculo e ocasionam dificuldade de manipulao do ovario, mas um

protocolo de superovulao que proporcione um aumento da disponibilidade de folculos para aspirao provavelmente aumenta os ndices de recuperao de ocitos por gua, mesmo que no influencie a taxa de recuperao por folculo. Nenhum efeito na fertilidade subseqente aspirao folicular foi observado, e a incidncia de alteraes no ciclo (m formao do corpo lteo ou deficincias hormonais) muito baixa, sendo inclusive a aspirao dos folculos estudada como forma de induzir a formao de corpo lteo em programas de transferncia de ocitos. Embora os melhores resultados tenham sido observados em folculos pr-ovulatrios, seria interessante que os ndices de recuperao de ocitos a partir de folculos imaturos fossem melhores, uma vez que estes se apresentam em maior nmero. Ocitos podem ser obtidos de folculos com menos de 25 mm com auxlio de lavagem do folculo e escarificao da parede folicular, embora no caso de folculos muito pequenos (10mm) os ndices de maturao oocitria se mostrem inferiores. guas prenhes tambm podem ser aspiradas, com taxas de recuperao superiores s de guas cclicas. A ausncia de uma padronizao para a tcnica torna difcil a comparao entre resultados de trabalhos diferentes no intuito de escolher o melhor mtodo, mas melhores ndices de recuperao foram observados em folculos pr - ovulatrios, com o uso de agulhas de lmen duplo e presso de vcuo alta (entre 200 e 300 mmHg) e lavando-se o folculo por 3-5 vezes, aps a aspirao, com soluo de PBS e heparina. Portanto, conclui-se que dentre as tcnicas disponveis para obteno de ocitos, a aspirao folicular via trans-vaginal guiada por ultrassonografia atualmente a melhor escolha, embora ainda haja necessidade de estudos para que os ndices de recuperao possam ser aumentados, tornando o mtodo mais acessvel e economicamente vivel.

2.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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