06-12-2011 LEZ 34 BIOCHIMICA DEL SANGUE PROTEINE E COAGULAZIONE

Prof.ssa Palestini

Nel sangue -oltre agli elementi figurati- ci sono le proteine plasmatiche. Le proteine plasmatiche fisiologicamente sono un centinaio e hanno una concentrazione pari a 7-7,5 g/100 ml. Le proteine hanno un ruolo importante nel mantenimento del pH del sangue cedendo e accettando ioni H+. Un importante famiglia di proteine sono quelle implicate nei meccanismi di coagulazione che innescandosi con un meccanismo di azione proteolitica a cascata portano al blocco della fuoriuscita del sangue. Un altra importante classe sono quelle di difesa: gli anticorpi. Inoltre tutte le proteine poco (o non) solubili presenti nel sangue sono trasportate da altre proteine. Nel sangue sono presenti inoltre inibitori enzimatici che possono bloccare l azione degli enzimi proteolitici se questi si attivano in modo non controllato nell organismo. Infine ci sono ormoni. Come si separano le proteine del plasma? Lo studio dei tracciati della separazione delle proteine del plasma un classico esame che si fa in biochimica clinica. Le proteine si separano mediante la tecnica dell elettroforesi, questa tecnica permette di separare le proteine in base al peso molecolare. Caricando negativamente le proteine e sottoponendole a un campo elettrico, inoltre, possibile velocizzare la separazione delle proteine. La separazione delle proteine del plasma d origine un picco come quello in figura. Il picco pi alto quello dell albumina, poi ci sono -1, -2 , -1, -2 e -globuline. Di solito, prima dell albumina c un piccolo abbastanza basso, detto pre-albumina . Nel picco della pre-albumina frazionano proteine legate al trasporto della tiroxina. Nel picco dell albumina fraziona solo l albumina. Sotto le -1 ci sono una serie elevata di proteine: proteine di coagulazione, proteine inibitori, proteine che servono per il trasporto e possono essere presenti anche altre proteine come l -fetoproteina (indice di marker tumorale) che normalmente non dovrebbero essere presenti. Il CEA un altra proteina espressa solo a livello fetale, se presente negli adulti marker di tumore mammario. Tra le proteine -2 frazionano le proteine che trasportano la vitamina D, la ceruloplasmina (che trasporta il rame) e altre proteine come le HDL. Nei picchi -1 e -2 c fraziona la proteina C-reattiva, una proteina che aumenta molto negli eventi infiammatori. In questo picco fraziona anche la transferrina. Nelle -2 c il fibrinogeno (un fattore di coagulazione) e nell ultimo picco ci sono le -globuline. Le -globuline si dividono in varie classi (IgA, IgG, IgM e IgD). Alterazioni dell altezza dei picchi e alterazioni tra i rapporti dei vari picchi indicano che c qualcosa che non funziona. IgA, IgM e IgG sono le immunoglobuline pi presenti nel plasma.

Una variazione dell ultimo picco che fa fondere le -globuline con le -globuline d un indice di una -patia di tipo policlonale (1). Un aumento enorme del picco delle -globuline indice di un tumore -monoclonale, c uno sviluppo di plasmacellule che producono un solo tipo di -globuline (2). Una diminuzione dell albumina, l aumento delle -2 un indice di un danno a livello renale (3). Una aumento di -1 e di -2 pu essere un indice di neoplasia maligna (4). L assenza del picco del dovuta a una patologia di non produzione di -globuline (5).

-globuline
Le -globuline sono proteine specializzate nella difesa dell organismo e sono prodotte dalle plasmacellule. Hanno una forma particolare, hanno due catene pesanti e da due catene leggere. Sono unite con cerniere a ponte di solfuro e la parte terminale delle catene leggere e delle catene pesanti sono quelle che determinano il riconoscimento specifico di un determinato antigene. Le 5 famiglie sono: y IgG, sono gli anticorpi caratteristici della risposta secondaria. Sono quelli che vengono mantenuti all interno dell organismo, permettono di non essere colpiti una seconda volta da una malattia perch le plasmacellule che producono gli anticorpi contro il virus responsabile del morbillo riconoscono l antigene e nel momento in cui esso entra nel corpo producono subito anticorpi contro quel determinato antigene. Possono attraversare la placenta e permettono la difesa del neonato contro agenti patogeni nei primi mesi di vita post-uterina; y IgA, sono di tipo secretorie, sono una percentuale molto bassa, impediscono il legame dei batteri e dei virus alle membrane mucose; y IgM, danno una risposta primaria e non sono altamente specifiche. Non riconoscono l antigene ma danno una prima difesa e lasciano il tempo ala cellula per trovare la sequenza adatta per creare IgG che danno risposta secondaria. Non sono presenti nel siero ma si pensa che vengano perse per shelding da alcune cellule in cui sono presenti solo sulla superficie. La percentuale di IgM aumenta durante un infezione, nella fase successiva aumentano IgG; y IgE, sono presenti in percentuale molto bassa e sono responsabili dei fenomeni allergici. Sono le responsabili della cosiddetta ipersensibilit immediata e del rilascio da parte delle mast cellule dell istamina. IgB, IgE e IgA sono le immunoglobuline presenti in percentuali pi basse, IgG e IgM sono quelle presenti in percentuali pi alte.

Le proteine possono essere classificate per funzione: y funzione trasportatrice; y funzione legate a fenomeni infiammatori; y funzione ormonale; y funzione enzimatica; y funzione antiproteasica, bloccano l attivit di alcuni enzimi proteolitici la cui attivazione non controllata potrebbe creare danni gravi all organismo.

Elementi figurati nel sangue

Il globulo rosso non nient altro che una membrana ripiena di emoglobina. La funzione del globulo rosso di compartimentare l emoglobina e quindi concentrare l emoglobina per il trasporto dell ossigeno. Dal punto di vista metabolico nel globulo rosso deve funzionare l integrit della membrana plasmatica. La membrana plasmatica dopo 120 giorni non riesce a mantenere le differenze di concentrazione e si danneggia la cosiddetta proteina della banda III, responsabile del trasporto della CO2. Gli acidi grassi della membrana devono avere caratteristiche ben determinate. Essendo l ambiente altamente ossidante, si alterano le strutture degli acidi grassi che vanno incontro a ferro-ossidazione e questo provoca il non mantenimento delle differenze di concentrazione. I globuli rossi presentano delle glicoproteine sulla superficie, queste sono le responsabili dei gruppi sanguigni (chi ha gruppo 0 non presenta queste determinate glicoproteine sulla superficie). La membrana del globulo rosso stata molto studiata perch molto facile da preparare: basta far scoppiare i globuli rossi, si fa uscire l emoglobina e il rimanente costituito solo da membrane. Le membrane delle cellule sono delle tensiostrutture: sotto c l impalcatura e sopra il doppio strato. Senza lo scheletro la membrana si affloscerebbe su se stessa. La capacit del globulo rosso di potersi piegare quando passa nei capillari data dalla presenza di queste proteine ancorate nella membrana plasmatica. Nel globulo rosso c principalmente emoglobina e l unico metabolismo dal punto di vista energetico che pu fare quello della glicolisi anaerobica. I globuli rossi sono quindi i pi grandi produttori di acido lattico. L acido lattico prodotto dai globuli rossi va nel fegato, il fegato lo trasforma in piruvato e questo entra in gliconeogenesi. La produzione molto bassa di ATP uno dei fattori che fa fare fatica al globulo rosso per mantenere le differenze di concentrazioni ioniche. Lo shunt ha la funzione importante di formare NADPH (al globulo rosso non interessa la produzione di atomi a 5 atomi di carbonio). Quando si formano ribosio e ribulosio questi rientrano nella glicolisi mediante la trasformazione degli zuccheri a 5 atomi di carbonio. Il NADPH permette al glutatione di rimanere ridotto e questo fa s che si mantenga funzionante e non perossidati gli acidi grassi di membrana, ma soprattutto mantenere l emoglobina allo stato ridotto Fe2+ in

modo tale che il ferro non vada incontro a ossidazione e non possa pi funzionare. I radicali liberi tendono a ossidare il ferro formando la meta-emoglobina che contiene Fe3+ che non funziona.

Emostasi e coagulazione
Nel momento in cui c una perdita di sangue l organismo mette in atto sistemi per limitare al minimo la perdita di sangue e permettergli di defluire all interno dei vasi. La concentrazione del sangue dev essere mantenuta: il sangue contiene emoglobina e questa trasporta ossigeno, l organismo non si pu permettere di perdere ossigeno lungo la strada. L emostasi dev essere velocissima e localizzata solo sul sito della lesione. Non ci dev essere un aumento dell attivit coagulativa e neanche, al contrario, dell attivit anticoagulativa. Se il processo di coagulazione aumenta si va incontro a malattie trombotiche con la formazione di masse semisolide all interno dei vasi che possono andare in circolo e occludere piccoli vasi. Non ci dev essere un aumento dell attivit anticoagulativa altrimenti si andrebbe incontro alle malattie emorragiche o alterazioni del sistema vascolare come porpore, petecchie ed ecchimosi. I successivi quattro processi avvengono contemporaneamente. Fase vascolare E una contrazione estremamente rapida che avviene a livello del vaso nel momento in cui c una lacerazione a livello del vaso. Avviene anche una vasocostrizione periferica per diminuire l afflusso di sangue in periferia. Fase piastrinica E la fase che consiste nella costruzione del primo tappo provvisorio che blocca la fuoriuscita di sangue. E fatta da una serie in sequenza in cui entrano in gioco gli elementi corpuscolati. Fase coagulativa Si attivano a cascata tutti i sistemi a formare il coagulo di fibrina, il tappo non provvisorio e che limita al minimo la perdita di sangue. Fase fibrinolitica In questa fase c la dissoluzione del coagulo. Queste fasi vengono tutte assieme, tranne quest ultima che avviene un po pi avanti nel tempo. In questa fase c la demolizione del coagulo di fibrina e avviene quando l endotelio si perfettamente ricostruito. La prima fase avviene nel momento in cui nel vaso c una perdita di sangue e non c integrit nell endotelio, la tonaca muscolare del vaso si contrae e porta a vasocostrizione. La vasocostrizione un riflesso da noi non controllato. A livello locale, le cellule vicine alla lesione liberano sostanze vasocostrittrici, la principale l endotelina. A livello dell endotelio vengono attivate le vie che portano alla produzione della famosa famiglia delle prostaglandine e prostacicline che presentano attivit aggregante. Per fare questo l acido arachidonico, legato ai fosfolipidi di membrana, viene tagliato da fosfolipasi A-2 la quale taglia l acido arachidonico legato sul carbonio 2, libera l acido arachidonico e questo inizia a essere utilizzato nelle produzione di queste famiglie. Normalmente il rapporto di queste sostanze all equilibrio, il tromboxano porta all aumento dell aggregazione piastrinica, le prostacicline e le prostaglandine diminuiscono l aggregazione piastrinica. Se sono all equilibrio non prevale una sull altra.

Quando parte la vasocostrizione, e deve partire la fase di aggregazione piastrinica, dove c la lesione le piastrine devono arrivare in massa. Devono intervenire fattori che hanno propriet aggregante. Nel frattempo viene limitata la sintesi degli altri fattori che servono alla vasodilatazione (NO e PGI). In questa fase aumenta la liberazione di endotelina e aumenta la produzione da parte dell acido arachidonico del tromboxano-A2 che inizia a richiamare le piastrine.

Le piastrine che in quel momento si trovano in quella zona entrano in contatto quello che c sotto l endotelio, il che normalmente non avviene. Le piastrine sono frammenti cellulari privi di nucleo, hanno una vita abbastanza breve, dai 9 ai 12 giorni. Sono ricche di actina che ne mantiene la loro forma sferica. Le membrane sono ricche di recettori, le integrine, questi recettori entrano in contatto con quello che di solito non vedono: il collagene, il fibrinogeno, la laminina e il fattore di von Willebrand sotto l endotelio. Nel momento in cui le piastrine si accorgono della lesione, si bloccano su di essa grazie al riconoscimento delle integrine. All interno delle piastrine ci sono lisosomi che contengono calcio, ADP, fattore che permette l aggregazione piastrinica), la serotonina (una sostanza vasocostrittrice) e il fibrinogeno (un altra molecola importante per il meccanismo di coagulazione). Contengono anche un sistema tubulare che contiene acido arachidonico, COX e fosfolipasi-A2. Chi attiva le piastrine? Le piastrine sono attivate dall ADP, dal collagene, alcune molecole e lo shear stress (lo stress che il sangue provoca quando scorre troppo veloce sull endotelio). Nel momento in cui le piastrine, che stanno passando per caso, incontrano i recettori che normalmente non incontrano (perch posti sotto l endotelio) si fermano l. Il fattore principale che le blocca il fattore di von Willebrand (vWF), un integrina del sottoendotelio che permette il primo aggancio delle proteine alla lesione. Nel momento in cui la piastrina si attacca, da sferica, si trasforma in sfera spinosa. Si iniziano a formare delle protuberanze nella sfera perch iniziata la polimerizzazione dell actina (ATP-dipendente). Tutto questo porta a un aumento del calcio e questo a sua volta porta alla degranulazione (rottura dei granuli) e alla liberazione di ADP, serotonina, fibrinogeno e trombina.

Nel momento in cui c l attivazione delle piastrine si ha anche che le membrane vengono esposte sulla faccia esterna. Nel momento in cui la serina si affaccia nella faccia esterna aumenter l aggregazione piastrinica. Nel frattempo c l attivazione delle fosfolipasi e aumenta la produzione e il rilascio del tromboxano A-2 che richiama altre piastrine le quali si attaccano a formare un tappo sempre pi grosso. Quando la piastrina lega i recettori, c l attivazione della cascata del segnale intracellulare che porta un aumento di ATP e questo comporta un aumento della polimerizzazione dell actina (che fa diventare la piastrina da sferica a stellata) e la liberazione dei granuli che contengono serotonina (vasocostrittore), ADP (importante per attivare e richiamare altre piastrine), fibrinogeno e fibrina (importanti per la formazione del coagulo). La cascata attiva anche la contrazione del citoscheletro: i filamenti di actina si contraggono e le piastrine si agganciano fortemente aumentando la resistenza del tappo Le piastrine vengono richiamate una vicina all altra formando un coagulo sempre pi grosso che inizia a formare il primo tappo che limita la perdita di sangue. Le piastrine poi espongono i recettori che riconoscono il fibrinogeno e si forma un vero e proprio ponte di fibrinogeno. Nel frattempo partita la formazione del coagulo che former un tappo pi resistente di quello delle piastrine per permettere all endotelio di riformarsi e riformare normalmente la parete del vaso. La fase coagulativa si divide in due fasi chiamate: y sistema intrinseco, intrinseco del sangue, non ci sono fattori esterni che intervengono. Il sangue si accorge di variazioni e attiva il sistema; y sistema estrinseco, nel momento in cui si lede una zona dell endotelio si liberano fattori tissutali che attivano la coagulazione. Entrambi i sistemi si uniscono in un punto della via che porta alla formazione del coagulo di fibrina. Tutti i fattori che concorrono in questo meccanismo a cascata sono molecole presenti nel sangue sotto forma di precursori inattivi: l attivazione del primo attiver a cascata gli altri fino alla formazione della fibrina. I fattori sono proteasi in serina che tagliano nella zona della serina e sono indicati con numeri romani secondo l ordine della scoperta.

Sistema intrinseco
Nel momento in cui il sangue vede che c qualcosa che non va, il fattore XII, una proteasi inattiva si automutila un pezzo e forma il fattore XIIa (fattore XII attivato), questo con meccanismo a cascata attiva i fattori a valle. Il fattore XIIa taglia un pezzo del fattore XI trasformandolo in XIa che taglia un pezzo al fattore IX trasformandolo in IXa. Il fattore IXa taglia un pezzo del fattore X trasformandolo in Xa. Il fattore X a viene attivato in presenza del fattore IX e VIII. Nel momento in cui il fattore XII si attiva in fattore XIIa si attiva anche la callicreina. Con il fattore X si uniscono sistema estrinseco e intrinseco. Nel momento in cui l endotelio lesionato si formano i fattori tissutali, segnali di danno a livello dell endotelio. I fattori tissutali convertono il fattore VII (proconvertina), nel fattore VIIa (convertina). Per fare questo il fattore tissutale ha bisogno di fattore III. La convertina quella che attiva direttamente il fattore X in fattore Xa.

Il fattore X quindi pu essere attivato o dalla cascata iniziata dal fattore XII (sistema intrinseco) o partendo dalla proconvertina attivata da un fattore tissutale. Il fattore Xa attiva il fattore II, che prende il nome di protrombina, e diventa trombina o fattore IIa. Affinch la trombina sia trasformata a partire dalla protrombina c bisogno del calcio rilasciato dalle piastrine, della fosfatidil-serina esposta dalle piastrine sulla superficie esterna, del fosfatidilinositolo, presente sia sulle membrane delle piastrine che sulle cellule endoteliali, e del fattore Va. L attivazione della coagulazione parallela all attivazione delle piastrine e alla formazione del primo tappo piastrinico. La protrombina viene tagliata in due punti, si forma un dimero tenuto insieme da un ponte disolfuro e la trombina funzionante. La trombina agisce sul fibrinogeno, di cui taglia dei pezzi per formare fibrina. Le molecole di fibrina legandosi tra loro formano il tappo di coagulo, in cui sono intrappolate piastrine e globuli rossi.

La fibrina formata da diversi filamenti con un nucleo centrale tenuti insieme da ponti disolfuro. La parte centrale ha dei capelli rivolti verso l alto. Sono una parte delle catene e . La trombina taglia i capelli del fibrinogeno, il quale privato dei capelli diventa appiccicoso e i monomeri si appiccicano tra loro. La formazione del primo tappo di fibrina (tappo morbido) quindi dovuta unicamente al fatto che i vari pezzi di fibrina si appiccicano tra loro. Il fibrinogeno presente nel plasma in una concentrazione di 0,3 g/100 ml. E sintetizzato dal fegato, ed formato da 3 coppie di catene, 2 , 2 e 2 , tenute insieme da ponti disolfuro. Ha un tempo di emivita breve, ogni 4 giorni viene riformato. Mentre il fibrinogeno solubile, senza ciuffi diventa appiccicoso e si assembla in una struttura insolubile.

Tutto questo stabilizzato dal fattore XIII, questo enzima (transaminasi) forma un legame tra un gruppo amminico di un monomero della fibrina e il gruppo -CO-NH2 del glutammato: si ha liberazione di ammoniaca, e si forma un legame simile a un legame peptidico, molto forte; unisce tra loro i monomeri della fibrina. A questo punto il coagulo si compatta, diventa sempre pi duro e chiude completamente il buco. A questo punto callicreina (la proteina che si attivata con il fattore XII) attiva la proteina plasminogeno, che una volta mutilata di un pezzo si trasforma in plasmina, la quale taglia i coaguli di fibrina. La callicreina ha azione degradativa. Quindi, nel momento in cui viene attivata la coagulazione, parallelamente viene attivato un meccanismo che porta alla sua demolizione. Il coagulo di fibrina quindi dura poco, solo il tempo necessario per riparare il buco nell endotelio. Questa via ha meccanismi importanti di regolazione. Un alterazione della plasmina pu portare all alterazione della demolizione del coagulo di fibrina. In biochimica clinica vengono usati molto dosaggi di PAI-1 o tPA (fattori che regolano il sistema di demolizione della fibrina) per vedere la concentrazione di callicreina. Siccome questa molecola un attivatore, una carenza significherebbe diminuzione della plasmina e aumento dei fenomeni di coagulazione. Un attivazione elevata della callicreina in un momento un cui dev essere presente il coagulo blocca l azione della plasmina. Il glutammato presente nella sequenza primaria di moltissimi fattori (II, VII, IX e X) deve andare incontro a una modificazione che si chiama carbossilazione. Al carbonio 4 viene aggiunto un gruppo carbossilico. Per fare questa reazione c bisogno di un enzima ma anche di un cofattore, la vitamina K. Senza vitamina K l enzima non fa la carbossilazione. Esistono 3 forme di vitamina K: y K 1, presente nei vegetali; y K 2, deriva da K2 ad opera dei batteri intestinali; y K 3, un preparato industriale. Di solito mangiando vegetali si introduce K1, questa molecola liposolubile. Viene assorbita dalla mucosa intestinale come tutte le sostanze liposolubili (chilomicroni). Le vitamine K1 o K2 sono presenti in alcune vie che modificano alcune proteine che permettono una perfetta coagulazione. Dicumarolo e warfarina sono agonisti della vitamina K e pertanto vengono usati come anticoagulanti. Le piastrine devono esporre la fosfatidil-serina e il calcio: la fosfatidil-serina, il calcio e i vari fattori nominati formano dei ponti. Questo aumenta enormemente l aggregazione piastrinica e la formazione del coagulo. I glutammati presenti nei fattori si legano tramite ponti di calcio alla fosfatidil-serina delle piastrine. Se questi fattori vengono concentrati in alcuni punti l enzima trova il substrato e la reazione va pi veloce. Se non c la carbossilazione non si formano i ponti tra calcio e fosfatidil-serina che aumenta la concentrazione in alcuni punti di questi fattori e facilita la cascata prima nominata. Se non ci sono i gruppi carbossilici, non si formano i ponti la coagulazione avviene in tempi pi lunghi. Tutte queste fase sono fasi avvengono pressoch in contemporanea, tranne l ultima che avviene con un po di ritardo.

Patologie
Ci sono moltissime patologie legate alla coagulazione. La pi frequente la sindrome di von Willebrand. Questa sindrome caratterizzata dall assenza del recettore che riconosce il fattore di von Willebrand e le piastrine non riconoscono il danno e non si attaccano. Molte patologie sono dovute a deficit dei recettori che riconoscono il collagene. Alcune malattie acquisite possono essere caratterizzate da bassi livelli di piastrine. L aspirina aumenta la fluidit del sangue perch diminuisce la produzione del tromboxano-A2, un classico farmaco antipiastrinico. L uso dell aspirina assolutamente sconsigliato nelle persone che hanno una diminuzione di piastrine congenita. Si registra un aumento di fibrinogeno anche in condizioni di gravidanza, menopausa, fumo, ipercolesterolemia, ipertensione, diabete o in chi assume contraccettivi orali. Esistono malattie genetiche (afibrinogenemie) in cui non c la sintesi del fibrinogeno, queste patologie non sono compatibili con la vita. Esistono anche patologie in cui il fibrinogeno viene sintetizzato ma non funziona bene, queste patologie sono chiamate disfibrinogenemie.

Deficit di vitamina K
I deficit di vitamina K sono rari, sono dovuti al malassorbimento o a diete completamente prive di grassi. Possono essere dovuti anche all ittero ostruttivo: la vitamina K si forma soprattutto a livello del fegato. Alcune cure antibiotiche possono portare alla perdita della flora batterica che modifica la vitamina K. Le emofilie sono alterazioni dei fattori della cascata della coagulazione. L alterazione del fattore di Christmas chiamata emofilia di tipo B: manca il fattore IX, quindi non si attiva la via intrinseca, queste persone hanno nel sangue una capacit di coagulare molto ridotta. L emofilia pi conosciuta quella di tipo A, data dall alterazione del fattore VIII. E legata al cromosoma X, quindi pi frequente che i maschi manifestino la patologia e le femmine siano portatrici. Queste persone hanno nel sangue la capacit di coagulare molto ridotta. Non infrequente, in quanto colpisce 1:5000-10000 nati maschi. D origine a emorragie, l infusione del fattore VIII viene a limitare i danni. L emofilia come le porfirie correva forte nelle case regnante inglese e russa. La regina Vittoria d Inghilterra ha distribuito l emofilia in tutte le case regnanti.