1. INTRODUO A maioria das indstrias gera resduos muitas vezes indesejveis e de difcil utilizao.

Considerando a importncia mundial das questes ambientais e a relao com os processos produtivos, atualmente o aproveitamento destes subprodutos, que apresentam vantagem em relao presena de nutrientes naturalmente presentes no meio, de extrema importncia para o setor produtivo brasileiro (PANDEY, 1992; SOCCOL,1994; SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003). Consequentemente, tem sido frequente a utilizao com maior eficiencia dos resduos agroindustriais em processos e produtos, incluindo o bagao da cana-de-acar (PESSOA JR. et al., 1996), a casca do eucalipto (ALMEIDA; SILVA et al., 1995; SILVA, 1991), a casca do arroz (ALMEIDA, 1991; REYES et al., 1998), sabugo de milho (GONZALEX-VALDES; MOO-YOUNG, 1981) e farelo de mandioca (LEONEL; CEREDA, 1999), como matrias primas. Esses processos incluem gerao de energia, produtos qumicos e metablitos, tais como lcool e alcalides, alimento animal enriquecido com protena e enzimas (CHEN; JIN, 2006; PANDEY et al., 2000). Dentro deste contexto, os materiais lignocelulsicos ocupam um lugar de destaque, principalmente em funo da sua abundancia e do seu carter renovvel, o que tem despertado grande interesse por este tipo de material. Resduos lignocelulsicos caracterizam-se pelo seu baixo contedo de protenas e difcil digestibilidade, o que dificulta a utilizao como alimento animal no seu estado original. Por este motivo, a utilizao de tratamentos prvios, que permitam aumentar a digestibilidade e valor nutritivo, essencial. A maior dificuldade para o aproveitamento dos resduos lignocelulsicos est representada pela barreira fsica formada pela lignina, o que impede o aproveitamento da celulose nativa. Vrios tipos de pr-tratamentos podem ser aplicados com o objetivo de diminuir o teor de lignina e facilitar a posterior hidrlise enzimtica por celulases resultando na produo final de glicose (BAYER; LAMED, 1992; REYES et al., 1998). Dentre os microrganismos que atuam na decomposio dessas substncias celulsicas, os fungos que colonizam vegetais, suas razes e resduos, tais como Paecilomyces variotii (ALMEIDA; SILVA et al., 1995), Penicillium decumbens (CHEN; JIN, 2006), Trichoderma harzianum (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004), Candida guilliermondii (FELIPE et al., 1997), C. tropicalis (PESSOA JR et al., 1997), C. langeronii (NIGAM, 2000) C. shehatae, Pichia stipitis (SARAOGLU-

EKEN; ARSLAN, 2000), apresentam importante funo na reciclagem desses nutrientes, sendo utilizados na industria alimenticia. A degradao microbiana da celulose total e especfica e tem estimulado o uso dos processos de fermentao celuloltica por vrios setores da indstria (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004). Na industria alimenticia, as celulases so usadas em vrios processos, principalmente na extrao de componentes do ch verde, protena de soja, leos essenciais, aromatizantes e do amido da batata doce. Essas enzimas participam, ainda, dos processos de produo do vinagre de laranja, gar, extrao e clarificao de sucos de frutas ctricas (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004). A mamoneira (Ricinus communis L.) o principal foco de dois programas do governo federal: Fome Zero e Produo do Biodiesel. O cultivo desta Euphorbiaceae constitui uma atividade econmica bastante explorada no Nordeste brasileiro, sendo desta forma, fonte promissora de resduos com grande potencial biotecnolgico. Com relao aos resduos oriundos da produo do biodiesel, estima-se a gerao 180 mil toneladas por ano de resduos para suprir uma produo de biocombustvel suficiente para atender uma mistura de 2% com diesel. No caso da mistura de 5% de biocombustvel com diesel, os resduos gerados sero em torno de 540 mil toneladas por ano passveis de aproveitamento. Entre esses resduos esto o resto da prensagem das sementes para a extrao do leo, como a casca e a torta da mamona e as folhas, possibilitando sua ampla utilizao industrial (FREITAS; FREDO, 2005). Desta forma, tornam-se relevantes novas pesquisas que viabilizem o aproveitamento do resduo obtido da prensagem das sementes da mamona (torta da mamona), que tende a aumentar, de modo que fornea novas possibilidades indstria, contribuindo para o desenvolvimento de processos alternativos para a produo de celulases e de fermentaes alcolicas. O sistema de duas fases aquosas poder ser aplicado, o qual permite a separao e anlise de partculas biolgicas com altos rendimentos, e melhor relao custo-benefcio (PORTO et al., 2007).

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2. REVISO DA LITERATURA

2.1. RESDUOS AGROINDUSTRIAIS

A crescente expanso da atividade agroindustrial levou ao acmulo de uma grande quantidade de resduos lignocelulsicos, dentre os de maior importncia destacam-se: bagao e palha de cana de acar (PESSOA JR. et al., 1996), sabugo e palha de milho (GONZALEX-VALDES; MOO-YOUNG, 1981), palhas de trigo, soja, cco e arroz (ALMEIDA, 1991; REYES et al., 1998), casca do eucalipto (ALMEIDA; SILVA, et al., 1995; SILVA, 1991), farelo de mandioca (LEONEL; CEREDA, 1999) e restos de madeira processada, entre vrios outros resduos industriais em todo o mundo (SNCHEZ, 2009). Segundo Abarca (1999), o setor agroindustrial no reconhecido pela sociedade como um setor que afeta o meio ambiente. De acordo com este autor, tal fato ocorre devido sociedade valorizar mais a contribuio da atividade agroindustrial na produo de alimentos, sendo, entretanto, desconhecido para a maior parte dela, a complexidade dos processos tecnolgicos existentes neste tipo de atividade, bem como o montante de subprodutos poluidores que so gerados e depositados no meio ambiente. No contexto brasileiro, estima-se que somente o setor sucroalcooleiro gera, aproximadamente 16 milhes de toneladas de bagao de cana excedente e 76 milhes de toneladas de palha. um enorme potencial, que no pode ser subestimado e exige que estes materiais tenham aproveitamento mais racional (MAPA, 2009). Estes materiais, sendo aproveitados para gerar novos produtos, no seriam mais considerados resduos slidos e sim matrias-primas valiosas para a produo de combustveis e de uma variedade de substncias qumicas, dentro do novo conceito de Biorrefinaria (BON et al., 2004). Os principais componentes dos resduos lignocelulsicos referem-se parte do vegetal que forma as paredes celulares, constitudas por uma matriz dura e fibrosa, onde fibras flexveis, celulose, hemicelulose, esto embebidas em uma matriz de lignina (Figura 1), uma macromolcula tridimensional que possui na sua estrutura compostos aromticos (BON et al., 2008).

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Figura 1. Composio da parede celular vegetal. Fonte: SANCHES (2009).

A celulose,

maior

carboidrato

sintetizado

pelos

vegetais,

um

homopolissacardeo de ocorrncia natural, formado por resduos de -D-glicose unidas entre si por ligaes glicosdicas -1,4, e que mantm uma estrutura linear e plana, predominante nos resduos vegetais, representando entre 30 e 60% do peso seco total (Figura 2). O estabelecimento de pontes de hidrognio intracadeias resulta na formao de fibrilas, estrutura altamente ordenada que se associam formando as fibras de celulose. As fibrilas apresentam regies com alto grau de cristalinidade altamente resistente (BON et al., 2008). O ataque s fibras de celulose realizado pelos microrganismos celulolticos, por intermdio das celulases, que agem em stios onde a estrutura do substrato mais acessvel, ou seja, onde a fibra perdeu seu aspecto reticulado (cristalino), em proveito de um aspecto frouxo e amorfo (BHAT, 2000).

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Figura 2. Formao da ligao glicosdica entre duas unidades de -D-glicose. Fonte: MEDVE (1997).

A hemicelulose so heteropolissacardeos, no-celulsicos, encontrados em tecidos vegetais. So compostos de duas cadeias ramificadas de acares, cujas unidades incluem principalmente aldopentoses, como xilose e arabinose, e aldohexoses, como glicose, manose e galactose. Este heteropolissacardeo contm ainda, substituintes, como grupamentos acetila, L-arabinofuranosila, cido D-glicurnico e cido 4-O-metilglicurnico, na cadeia principal ou nas ramificaes. Representa o segundo maior componente dos resduos, representando at 40% do seu peso seco (BON et al., 2008). A lignina, junto com a hemicelulose e a pectina, preenche os espaos entre as fibras de celulose alm de atuar como material ligante entre os componentes da parede celular. uma macromolcula tridimensional formada por unidades de -propilfenol, onde no existe ligao repetida na construo dos blocos monomricos. A lignina, que representa grande resistncia ao ataque microbiano, corresponde a cerca de 25% da biomassa fotossinttica produzida anualmente no mundo (BON et al., 2008). Diversos empregos tm sido sugeridos para a bioconverso de resduos lignocelulsicos teis, a fim de agregar valor econmico de forma a reaproveitar esta abundante e renovvel fonte de substratos que podem ser biologicamente convertidos em biomassa microbiana de elevado valor nutricional (SNCHEZ, 2009; SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003). Estes resduos so usados como matria-prima para a produo de etanol, papel, compostos orgnicos para adubao e cultivo, sendo tambm utilizados diretamente como alimento para animais. Contudo, a alternativa mais atraente nos dias de hoje, so as pesquisas que tm sido realizadas com o intuito em encontrar uma alternativa de combustvel utilizando mtodos biolgicos, devido aos benefcios ambientais dos

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biocombustveis, reduzindo emisses de gases de estufa e melhorando a qualidade do ar, bem como oferecendo vantagens econmicas e estratgicas (MOSIER et al., 2005; PRASAD et al., 2007). Dos resduos produzidos pela agroindstria com crescente potencialidade para serem utilizados em bioprocessos, a torta de mamona que possui alta concentrao de material lignocelulsico (SEVERINO, 2005) ainda pouco estudada para fins de aplicaes biotecnolgicas.

2.2. RESIDUOS DA MAMONEIRA

A mamoneira (Ricinus communis L.), planta de origem africana, espcie da famlia Euphorbiaceae, que engloba vasto nmero de tipos de plantas nativas da regio tropical que vegeta naturalmente desde a longitude 40 Norte at 40 Sul, tm potencial de explorao econmica no Nordeste brasileiro, devido suas caractersticas de xerofilismo e heliofilismo (SAVY FILHO et al., 1999, 2003). Segundo Azevedo e Lima
(2001), a mamona possui um considervel potencial de explorao para a economia do pas e uma alternativa vivel para a Regio Nordeste por ser um arbusto de grande resistncia a perodos de estiagem. Acrescenta-se a isso, o fato de seu leo ser um produto renovvel, de custos baixos, de grande versatilidade e de utilidade comparvel apenas ao petrleo.

Esta planta produz quantidade considervel de biomassa (20 t ha-1), onde as folhas servem de alimento para o bicho da seda, as hastes contm celulose para fabricao de papel e das sementes so obtidos o leo e a torta, rica em protena, que entre suas diversas utilidades, so empregados na indstria de plsticos, siderurgia, saboaria, perfumaria, curtume, tintas e vernizes, alm de ser excelente leo lubrificante para motores de alta rotao e carburante de motores a diesel. Entretanto nas sementes de mamona que est o maior interesse econmico, contendo o leo aproximadamente 90% de cido graxo ricinolico, o que lhe confere caractersticas singulares e valor energtico, possibilitando ampla gama de utilizao industrial (AMORIM NETO et al., 2001; CAVALCANTI et al., 2005; SOUZA et al., 2004). Os teores foliares de nitrognio chegam a 41,3 g/kg aos 64 dias da germinao e comum se encontrar na torta de mamona 45 a 46 g/kg desse nutriente, teor considerado muito alto (COSTA et al., 2004; NAKAGAWA; NEPTUNE, 1971; RAIJ et al., 1996). O nitrognio faz parte da estrutura da planta, sendo componente de aminocidos, protenas, enzimas, RNA, DNA, ATP, clorofila dentre outras molculas.

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Sua deficincia geralmente reduz o crescimento da planta, tornando-a amarelada pela perda da clorofila e provocando amadurecimento precoce, diminuio da produtividade e da qualidade dos frutos (MALAVOLTA et al., 1989; MARSCHNER, 1995; SANTOS et al., 2004a). A mamona muito sensvel acidez (SEVERINO, et al., 2006; SOUZA; NEPTUNE, 1976) e a baixos teores de Ca, Mg, S, B e Cu no solo (FERREIRA et al., 2004; SANTOS et al., 2004b), condies que impem redues na produtividade superiores a 50%. Esta planta mais tolerante a deficincia de Fe, Mn, Mo e Zn, seja por sua baixa necessidade ou pela alta capacidade de extrao desses nutrientes do solo (FERREIRA et al., 2004). 2.2.1. Importncia econmica do cultivo da mamoneira no Brasil A cultura da mamoneira, conhecida tambm como ricinocultura, de grande importncia econmica para o Brasil, notadamente para o Estado da Bahia, podendo tornar-se, em breve, o maior produtor mundial de mamona, superando pases produtores que ora dominam o mercado, como a ndia e a China (COSTA et al., 2004). Com a implementao do Programa Nacional de Biodiesel do Governo Federal, criaram-se oportunidades de gerao de milhares de postos de trabalho, no Semi-rido brasileiro, onde a mamona ser a principal alternativa para produo de leo (AZEVEDO; LIMA, 2001; BELTRO et al., 2006). A grande importncia da ricinocultura justifica-se pelo fato de que existe um crescente interesse por fontes alternativas de energia, principalmente aquelas que contribuam em mitigar as emisses de CO2, caracterstica das fontes tradicionais de energia fssil. Para isso, o uso de biocombustveis, como bioetanol, leo de dend e biodiesel produzido pela esterificao de leos vegetais com metanol e etanol, so vistos como alternativas viveis, tendo justificativas econmicas, sociais e ambientais (URQUIAGA et al., 2005). 2.2.2. O resduo do processamento das sementes de mamona O mais tradicional e importante resduo da mamona a torta, que obtida por prensagem a alta presso. Define-se como torta de mamona o resduo da extrao do leo das sementes da mamoneira (SEVERINO, 2005). A torta da mamona representa um composto ricamente nitrogenado, eficiente na recuperao de terras esgotadas. Seu alto teor de protena a torna atraente como alternativa para utilizao como suplemento alimentar, aps ser modo e obtido o farelo,

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para formulaes de rao animal. Porm, a torta de mamona, produzida na proporo aproximada de 1,2 tonelada para cada tonelada de leo extrado, possui limitaes para o uso devido elevada toxicidade em virtude, principalmente, da presena de ricina, que limita seu emprego como adubo orgnico (SEVERINO, 2005). Toda a ricina, protena presente na semente da mamona, permanece na torta aps o processo de extrao do leo, at mesmo porque tal protena insolvel em leo (AZEVEDO; LIMA, 2001). De acordo com Costa et al. (2004), devido inexistncia de um mtodo seguro para destoxicao, a torta de mamona tem sido utilizada predominantemente como adubo orgnico que tem valor inferior ao alimento animal. A torta de mamona bruta apresenta trs componentes txicos e alergnicos, que so a ricina, a ricinina e o complexo alergnico CB-1 (WEISS, 1983). A toxidez da mamona conhecida desde a antiguidade, a qual foi relatada pelos antigos hebreus, egpcios, persas, gregos e romanos, embora somente na segunda metade do sculo XX se tenha descoberto que esta toxidez e alergenicidade se deviam a diferentes compostos (ICOA, 1989). Costa et al. (2004) citam os teores de alguns componentes qumicos da torta de mamona: 8,13% de umidade, 13,10% de leo, 12,11% de cinzas, 28,74% de protenas, 3,00% de fsforo e 0,96% de potssio. Os autores consideram que esse produto um adubo orgnico de alta qualidade podendo ser utilizado predominantemente em jardinagem ou em cultivos de alto valor agregado que exijam caractersticas especiais como rpida mineralizao dos nutrientes. Na ndia, principal pas produtor de mamona do mundo, cerca de 85% da torta de mamona utilizada como fertilizante orgnico (KONNUR; SUBBARAO, 2004; UDESHI, 2004). Alm de ser uma excelente fonte de nitrognio, cuja liberao no to rpida quanto a de fertilizantes qumicos, nem to lenta quanto de esterco animal, apresenta ainda propriedades inseticida e nematicida (Directorate of Oil Seeds Research, 2004). Severino et al. (2004) demonstraram que a velocidade de mineralizao da torta de mamona, medida pela respirao microbiana, cerca de seis vezes mais rpida que a de esterco bovino e quatorze vezes mais rpida que o bagao de cana. Akhtar e Mahmood (1996) demonstraram o efeito da adubao com torta de mamona sobre a reduo da populao de nematides fitoparasitas e ainda o aumento da populao de nematides predadores de vida livre, o que propiciou melhor 22

desenvolvimento das plantas de Cajanus cajan Millsp. Mashela e Nthangeni (2002) tambm demonstraram a eficcia de sementes de mamona na supresso do crescimento da populao do nematide Meloidogyne incognita Kofoid & White em tomateiros. Outros autores confirmam o efeito nematicida da torta de mamona (ANVER; ALAM, 2001; BERTRAND; LIZOT, 2000; SIDDIQUI; ALAM, 1999). Alm do uso como adubo e alimento animal, a torta de mamona pode ser usada como matria-prima para a produo de aminocidos, plsticos, colas, inseticidas e outros produtos (MACHADO et al., 1957; SOUZA et al., 2004). Quanto ao poder calorfico da torta de mamona, verifica-se que os valores variam entre 4.250 e 4.750 kcal.kg-1, apresentando valor mdio de 4.500 kcal.kg -1. Outras oleaginosas indicadas pelo Programa Nacional de Biodiesel so o girassol, soja e dend cujos poderes calorficos so respectivamente 1.700, 2.200 e 4.300 kcal.kg -1, que comparados aos valores da torta de mamona, ficam nivelados ao do dend, e bem mais energtico que os dos outros resduos (girassol e soja). O poder calorfico de outros resduos e materiais vegetais vastamente utilizados no Estado de Pernambuco como fontes alternativas de energia, so: bagao de cana de acar (2.300 kcal.kg -1), casca de coco (3.500 kcal.kg -1), serragem (2.400 kcal.kg -1) e eucalipto (4.600 kcal.kg-1) (SHELL, 1985).

2.3. FUNGOS ISOLADOS DE RESDUOS

Os fungos so utilizados pela humanidade h milhares de anos, como alimento e para fins medicinais e biotecnolgicos (CHANG; MILES, 2004). Ecologicamente, os fungos so classificados como organismos redutores, participando ativamente dos processos de biodeteriorao e biodegradao e atuando desta forma na ciclagem dos nutrientes e manuteno dos ecossistemas. atravs da ao de enzimas produzidas pelos fungos que a matria orgnica transformada em produtos naturais mais simples e assimilveis (MANGIAROTTI; CARETTA, 1984). Os fungos lignocelulsicos tm recebido ateno especial dos pesquisadores, nas ltimas dcadas, devido a sua aplicabilidade no tratamento de efluentes (indstrias txteis e papelaria), na biorremediao e na produo de antibiticos (BLANCHETTE, 1995; BON et al., 2008; KOTTERMAN et al., 1994; SMNIA et al., 1997). Tambm vem sendo discutido o papel desses organismos na produtividade das florestas, as quais

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so estritamente dependentes da reciclagem de nutrientes imobilizados da madeira e, portanto, na dinmica dos processos da decomposio (RAYNER; BODDY, 1998). A concentrao e atividade dos microrganismos do solo so influenciados pela disponibilidade de matria orgnica e pela qualidade dos resduos orgnicos adicionados. Fatores inerentes matria orgnica, como a relao carbono/nitrognio, presena de lignina e granulometria, so fatores que interferem na composio microbiana (MIELNICZUK, 1999). Schulten e Hempfling (1992) demonstraram que o crescimento da microbiota do solo limitado quando ocorre intenso cultivo e baixa disponibilidade ou baixa qualidade de fonte energtica (matria orgnica). A medio da atividade microbiolgica atravs da respirao, fixao biolgica do nitrognio, mineralizao de compostos orgnicos, atividade enzimtica e biomassa microbiana realizada por tcnicas bem estabelecidas, sendo essas caractersticas utilizadas, entre outros fins, como indicadores sensveis da poluio (BROOKES, 1995). A medio da respirao microbiana uma forma de estimar o nvel de atividade dos microrganismos do solo, a qual reflete a velocidade de decomposio da matria orgnica do solo ou de algum material a este adicionado. Quando um material orgnico adicionado ao solo, os microrganismos realizam sua decomposio, a qual pode ocorrer de forma rpida se existir fatores propcios como umidade, pH, temperatura, mas principalmente nutrientes e carbono como fonte de energia. A ocorrncia de alta atividade microbiana indica que a decomposio do material adicionado rpida e os nutrientes so mineralizados e disponibilizado para as plantas em menor tempo, o que muitas vezes uma caracterstica desejada em um adubo orgnico (BROOKES, 1995). Pesquisas realizadas pela Companhia de Abastecimento de Pernambuco (CEASA) objetivando o monitoramento da microbiologia, dos resduos de frutas e verduras da CEASA misturados com bagao de cana e folhas de bananeira, foi verificado o alto ndice de bactrias e a baixa ocorrncia de fungos, entretanto, foi possvel diagnosticar a presena dos gneros Aspergillus, Penicillium e Rhizopus (ARAGO et al., 2000). Kazmierczak et al. (2003) constataram a presena de fungos em amostras de resduos de contrafortes termoplsticos provenientes da indstria coureiro-caladista e indicam que a contaminao do resduo ocorre nas diferentes etapas do processo industrial de fabricao, corte e moagem de contraforte. De acordo com os autores, entre os gneros isolados, os mais representativos foram Penicillium e Trichoderma, 24

que cresceram sobre maior quantidade de amostras de contraforte laminado. Foi constatado que em todas as amostras de contraforte colhidas aps a moagem houve crescimento de fungos sobre o papel filtro da cmara mida, entretanto, sobre as amostras que no foram submetidas cmara mida, o crescimento de fungos no foi expressivo. Ficou evidente que o aumento da umidade e da temperatura favorecem o crescimento dos fungos. Em continuidade pesquisa Kazmierczak et al. (2003), colocaram amostras sem contaminao aparente em cmara tropical constituda de uma camada de 2 cm de solo, na qual foram adicionados 10 mL de suspenses (106 condios/mL) de cada um dos fungos isolados das amostras: Cladosporium, Penicillium, Gliocladium, Trichoderma, Nigrospora, Rhizopus, Aspergillus niger Tiegh. e Aspergillus flavus Link. A cmara foi mantida temperatura de 28C e fotofase de 12 horas. Aps 17 dias de exposio em cmara tropical, foi averiguada ocorrncia de manchas causadas por fungos em todas as amostras. Verificou-se tambm que h uma diferena expressiva no tipo de fungo e na velocidade de crescimento entre os dois tipos de contrafortes utilizados. Chalfoun et al. (2008) analisaram a presena de fungos em resduos do caf (cascas de caf tratadas com cido actico e cido frmico, semi-secas, com soro de leite e melao, com soro de leite fermentado e com melao) com o objetivo de avaliar o potencial toxignico de isolados de Aspergillus, visando a incorporao desses resduos em raes de peixes. No foram isolados fungos de cascas de caf tratadas com cidos, nem com melao. Os autores isolaram A. ochraceus Wilh. (1877), A. niger e leveduras. Nenhum dos isolados de A. niger produziram fluorescncia caracterstica de produo de ocratoxina A e 60% dos isolados de A. ochraceus apresentaram fluorescncia em menor ou maior intensidade quando comparados ao padro de ocratoxina A. Gao et al. (2008) isolaram Aspergillus terreus Thom (1918) M11 a partir do composto contendo celulose na fbrica de Zhengzhou, na China. Neste estudo, esta espcie apresentou alta atividade celuloltica quando cultivada a 45C, pH 3,0 com 80% de umidade e 0,8% de extrato de levedura como fonte de carbono e nitrognio. Estes autores obtiveram em condies timas de produo 581 U de endoglucanases, 243 U de FPase e 128 U de -glucosidase por grama de fonte de carbono. No que se refere biotecnologia ambiental, inmeras pesquisas vm sendo realizadas com o intuito de se obter um produto a partir de um resduo gerado na agroindstria. A possibilidade de usar resduos agroindustriais, como fonte de produo para cogumelos, gera oportunidade de reciclagem, consequentemente, benefcios ao 25

ambiente. Gomes-da-Costa et al. (2008) com a finalidade de verificar o crescimento micelial de dois isolados, de Lentinula edodes (Berk.) Pegler (1976) (Shiitake), 42 e 47, utilizaram como substratos: serragens de Eucalyptus sp. Brutelle (1788), de Grevillea robusta Cunn. ex. Brown e de Melia azedarach Linnaeus; resduo de algodo e folhas de Panicum maximum Jacq. (capim colonio) em diferentes composies e suplementados com farelos de soja e de arroz. Observaram-se quatro padres de comportamento para o isolado 42 e cinco para o 47. As serragens de Eucalyptus sp. e de G. robusta mostraram-se as mais propcias ao crescimento dos dois isolados de L. edodes, confirmando ser essa espcie essencialmente de hbito ligncola. Kumar et al. (2008), isolaram fungos termoflicos de compostagem de palha para seleo e produo de vrias enzimas e verificaram a presena de A. nidulans (Eidam) Winter (1884), Scytalidium thermophilum (Cooney & Emers.) Austwick (1976) e Humicola Traeen (1914). Os autores confirmaram a capacidade de Humicola em apresentar atividade FPase (11,43 U ml1), Aspergillus nidulans em produzir celobiase (134,21 IU ml1) e S. thermophilum produzindo atividade CMCase (30,36 U ml1) e xilansica (236,43 U ml1). Aureobasidium pullulans (De Barry) Arnoud (1918) ER-16 isolado a partir de resduo industrial de laranja em Catanduva, So Paulo, Brasil e o fungo termoflico Thermoascus aurantiacus Miehe (1907) CBMAI-756, isolado de madeira morta em Manaus, Amazonas, Brasil, foram avaliados quanto ao perfil de -glucosidases em diferentes resduos agrcolas e ao comportamento em diferentes concentraes de glicose e etanol (LEITE et al., 2008). Marino e Abreu (2009) verificaram a velocidade de crescimento, o vigor, o perodo de formao e a eficincia biolgica de trs isolados de L. edodes em resposta suplementao do substrato base de serragem de casca de coco com 0, 5, 20, 30 e 40% de farelo de trigo e/ou de arroz como um substrato alternativo. O crescimento micelial e o vigor dos isolados de Shiitake aumentaram com a suplementao em todos os isolados testados. Singh et al. (2009) com o objetivo de avaliar o efeito da temperatura e do potencial hdrico nas interaes do antagonismo fngico, isolaram de palha e resto de trigo N. sphaerica (Sacc.) Mason (1927), Epicoccum nigrum Link (1815), Fusarium oxysporum Schltdl. (1824), Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker (1959), F. equiseti (Corda) Sacc. (1886), Mycelia sterilia, Alternaria sp. Nees ex. Fries (1821), F. nygamai Burgess & Trimboli (1986), Acremonium sp. Link ex. Fries (1821), Trichoderma sp. 26

Pers. ex. Fries (1821), Rhizoctonia solani Kuhn (1858) e F. chlamydosporum Wollenw. & Reinking (1925). Na pesquisa os autores encontraram Alternaria e Fusarium como sendo os gneros mais frequentemente isolados e Trichoderma designado o mais abundante. A. niger MTCC7956 foi isolado a partir de madeira apodrecida na ndia e utilizado no estudo da hidrlise de enzimas celulolticas produzidas a partir de fermentao em estado slido utilizando farelo de trigo como substrato. O melhor tempo para a produo da enzima foi 48 h, durante o qual foram obtidos 50 FPase U/g na atividade contra papel de filtro e menor atividade de (SUKUMARAN, 2009). -glucosidase 5 U/g

2.4. ENZIMAS PRODUZIDAS POR FUNGOS

Os fungos destacam-se na biotecnologia pela capacidade biodegradadora de resduos naturais. Ao que se deve o fato de um grande nmero desses fungos produzirem importantes grupos de enzimas, as hemicelulolticas, as celulolticas e as lignolticas que desempenham um papel fundamental no ciclo do carbono, pela decomposio de resduos vegetais. Alm disso, a aplicao das enzimas em diversos processos do setor produtivo tem merecido destaque nas ltimas dcadas. Isto se deve, ao fato de enzimas atuarem como agentes que melhoram os processos industriais quanto qualidade e eficincia do produto final, bem como aspectos de ordem econmica e ambiental (BON et al., 2008). Todos os microrganismos capazes de decompor hemicelulose, celulose e lignina produzem uma srie de enzimas com diferentes especificidades, que podem atuar em sinergia (BEGUIN; HUBERT, 1994). Enzimas so protenas com atividade cataltica, isto , exercem a funo de acelerar ou mesmo possibilitar reaes entre componentes qumicos. Presentes em todos os sistemas biolgicos so produzidas por todos os organismos vivos e tm a capacidade de atuar fora do meio celular. Constituem o principal alvo da pesquisa em Biotecnologia, no apenas por seu papel crucial nos mecanismos celulares, mas tambm por seu potencial de aplicao na substituio de processos qumicos convencionais (DO CANTO; MENEZES, 1995). O maior empecilho ao uso de enzimas em processos industriais est relacionado ao alto custo desse catalisador (GANDHI, 1997).

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A diversidade fngica uma fonte importante de recursos genticos para o avano da biologia e biotecnologia. Nos nossos dias, conhecem-se cerca de 4.300 enzimas seqenciadas, 300 dessas comercializadas (FERRER, 2004). Os fungos apresentam imensa diversidade gentica e desempenham funes nicas e cruciais na manuteno de ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoqumicos (MYERS, 1996). As vantagens da utilizao de microrganismos na produo de enzimas em substituio as tradicionais fontes animais e vegetais, so o rendimento relativamente alto, eficincia de custos e susceptibilidade manipulao gentica. Atualmente as enzimas de origem microbiana so utilizadas no processamento de alimento, na manufatura de detergentes, nas indstrias txtil e farmacutica, terapia mdica e na biologia molecular (BON et al., 2008). Os fungos filamentosos de maior interesse industrial que atuam na decomposio de substncias celulsicas incluem: Aspergillus (BON et al., 2008), como A. awamori Nakazawa (1915), A. niger, A. oryzae (Ahlb.) Cohn (1884), A. nidulans, Paecilomyces variotii Bainier (1907) (ALMEIDA e SILVA et al., 1995), Penicillium decumbens Thom (1910) (CHEN; JIN, 2006), Trichoderma harzianum Rifai (1969) e T. reesei Simmons (1977) (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004), Candida

guilliermondii (Castell.) Langeron & Guerra (1938) (FELIPE et al., 1997), C. tropicalis (Castell.) Berkhout (1923) (PESSOA JR. et al., 1997), C. langeronii Dietrichson (1954) (NIGAM, 2000) C. shehatae Buckley & Uden (1967), Pichia stipitis Pignal (1967) (SARAOGLU-EKEN; ARSLAN, 2000) e Mucor miehie (BON et al., 2008). Entretanto, a explorao do imenso potencial desses fungos como produtores de uma vasta gama de enzimas extracelulares de aplicao industrial catalases, amilases, celulases, xilanases, peroxidases, invertases, pectinases, queratinases, lpases e proteases, entre outras, somente se tornou possvel com o avano do conhecimento de sua fisiologia, bioqumica e gentica (BON et al., 2008). A maior parte das enzimas hoje utilizadas extrada de organismos mesfilos; portanto suas aplicaes so em geral, restritas, devido limitada estabilidade nas temperaturas extremas (altas e baixas) e condies adversas de reao, como pH muito alterado (cidos e alcalinos) e presena de solventes orgnicos (CARREA; COLOMBO, 2000). As enzimas mesfilas e as extremfilas so estveis e ativas em diferentes temperaturas, no havendo presso evolutiva para que as mesfilas sejam estveis e

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ativas em altas temperaturas e as termfilas em baixas temperaturas (GOMES et al., 2007; S PEREIRA et al., 2004).

2.4.1. Celulases As enzimas conhecidas como celulases hidrolisam a ligao glicosdica entre dois ou mais carbohidratos ou entre um carbohidrato e uma poro no carbohidrato. A classificao das hidrolases -glicosdicas (E.C. 3.2.1.-) conforme a nomenclatura enzimtica da Unidade Internacional de Bioqumica (IUB) feita com base na sua especificidade ao substrato e ocasionalmente no mecanismo molecular. De acordo com esta nomenclatura, o 3 refere-se a hidrolases; 3.2 glicosilases e 3.2.1. glicosidase, isto , enzimas que hidrolisam compostos o-glicosil ou s-glicosil. Uma classificao com base nas similaridades da seqncia de aminocidos do domnio cataltico foi proposta e atualmente as hidrolases glicosdicas so agrupadas em 87 famlias (HENRISSAT, 1991; HENRISSAT; BAIROCH, 1993). As etapas envolvidas na degradao microbiana da celulose ainda no esto totalmente esclarecidas, mas sabe-se que so produzidas como um sistema multienzimtico, compreendendo basicamente trs componentes enzimticos majoritrios que agem sinergicamente na hidrlise da celulose: as endoglucanases (E.C. 3.2.1.4.), as celobiohidrolases (exoglucanases, E.C. 3.2.1.91) e as -glicosidases (celobiases, E.C. 3.2.1.21). De acordo com o modelo de sinergismo endo-exo, essas enzimas cooperam da seguinte maneira: as endoglucanases (EG) clivam ao acaso o polmero de celulose, alterando rapidamente seu grau de polimerizao, produzindo novos stios de ataque para as celobiohidrolases (CBH) as quais agem como exo-enzimas e hidrolisam o polmero nos terminais no redutores, liberando celobiose como produto principal enquanto as -glicosidases que so responsveis pela clivagem de cadeias pequenas, tanto de celooligossacardeos a celobiose, at glicose, que poder ento ser utilizada nas diversas vias metablicas do microrganismo (Figura 3) (BAYER et al., 1998; BON et al., 2008; CAO; TAN, 2002). A maior parte das celulases constituda por dois domnios, que funcionam independentemente: o domnio de ligao ao substrato (DLS), e o domnio cataltico (DC), que abriga o stio ativo (SA). Estes domnios esto ligados um ao outro atravs de uma cadeia polipeptdica flexvel. O stio ativo possui como funo a hidrlise das ligaes glicosdicas da celulose e cada classe de celulase possui uma forma diferente de stio ativo, permitindo a hidrlise de ligaes em regies distintas do substrato. A 29

funo do domnio de ligao ao substrato est associada adsoro, que permite o aumento da concentrao das celulases na superfcie da celulose atravs de interaes no covalentes, envolvendo ligaes de hidrognio, foras eletrostticas e interaes hidrofbicas (PALONEN et al., 2004). Conforme a origem das celulases (bacteriana ou fngica) e dependendo da composio das misturas de celulases, estas se distinguem no seu comportamento e sua agressividade sobre o substrato celulose (BON et al., 2008). Mtodos para determinar a atividade das celulases em celulose slida usam substratos como papel de filtro, celulose microcristalina, Avicel ou mesmo fibras de algodo, eventualmente tratados com cido fosfrico. A formao de acares redutores geralmente monitorada por mtodos espectrofotomtricos, como, por exemplo, o mtodo do cido dinitrossaliclico (DNS) (MILLER, 1959), o mtodo da neocuprona (BITTNER; MCCLEARY, 1963) ou o mtodo de Nelson-Somogyi (SOMOGYI, 1952).

Figura 3. Esquema do modo de ao do complexo celuloltico. Fonte: MEDVE (1997).

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2.4.1.1. Endoglucanases (E.C. 3.2.1.4) As endoglucanases so tambm conhecidas como celulases, endo -1,4 glucanases e carboximetilcelulases. Seu substrato natural a celulose e xiloglicana, apresentando especificidade varivel sobre a carboximetilcelulose (CMC), Avicel (celulose cristalina), -glucana e xilana. Estas enzimas que catalisam a hidrlise interna de ligaes -1,4-D-glucosdicas da celulose. Podem hidrolisar tambm ligaes -1,4 em D-glucanas que contenham ligaes -1,3. O stio ativo das endoglucanases possui uma forma de chave, que possibilita a ao da enzima ao longo da cadeia de celulose e reduz consideravelmente seu grau de polimerizao. As regies de menor organizao estrutural so mais facilmente atacadas, pois possuem cadeias que no esto envolvidas em interaes de hidrognio intermoleculares to fortes quanto as que ocorrem nas regies cristalinas, levando, conseqentemente, a uma maior exposio das ligaes glicosdicas mais internas das cadeias de celulose (GILKES et al., 1991; PALONEN et al., 2004).

2.4.1.2. Exoglucanases (E.C. 3.2.1.91) Conhecida tambm como -1,4- celobiosidase, celobiohidrolase, -1,4 celobiohidrolase ou Avicelase. As exo-1,4--D-glucanases atuam nas extremidades redutoras e no redutoras da cadeia de celulose e celotetraose, liberando majoritariamente celobiose, alm de glucose e celotriose (ZANDON, 2001). Estas enzimas no atuam sobre celuloses solveis por haver um impedimento estereoqumico causado pelos grupos substituintes, seja carboximetlico (CMC) ou hidroxietlico (HEC). As exoglucanases atuam sobre Avicel, produzindo uma reduo lenta e gradual do seu grau de polimerizao. O stio ativo das celobiohidrolases possui forma de tnel atravs da qual a cadeia de celulose penetra e sofre hidrlise de suas ligaes glicosdicas terminais, liberando majoritariamente celobiose (GILKES et al., 1991). 2.4.1.3. -glucosidases (E.C. 3.2.1.21) Tambm denominadas como celobiase, gentobiase e amgdalase, possuem a funo de desdobrar a celobiose gerada pelas endoglucanases e exoglucanases em glucose. Estritamente falando, -glucosidases no so celulases legtimas, uma vez que agem sobre substratos solveis, mas sua contribuio muito importante para a eficincia da hidrlise da celulose pela remoo da celobiose presente no meio de reao, que um potente inibidor competitivo das celobiohidrolases. Apresenta ampla 31

especificidade por -D-glicosdeos, podendo hidrolisar tambm -D-galactosdeos, -Dxilosdeos, -L-arabinosdeos e -D-fucosdeos (BON et al., 2008; GHOSE, 1987; MEDVE, 1997).

2.4.2.1. APLICAO DAS CELULASES

As celulases so enzimas com maior aceitao e aplicao na indstria txtil. So utilizadas no processamento txtil de fibras celulsicas com o objetivo de criar uma superfcie mais lisa, aumentar o brilho, evitar a formao de peloteamento (pilling), desbotar peas confeccionadas tingidas (principalmente de Denim) e obter um aspecto de tecido usado (efeito stone-wash) (BON et al., 2008). Estas enzimas tambm fazem parte de formulaes de detergentes domsticos para aumentar o efeito de detergncia (BHAT, 2000; CAVACO-PAULO, 1998). Estudos recentes usam celulases tambm para a remoo do material celulsico em tecidos de fibras mistas (polister/algodo) para produzir tecidos mais finos (VASCONCELOS; CAVACO-PAULO, 2006). So tambm aplicadas no que diz respeito a bioconverso de biomassa agrcola em produtos com valor comercial. Neste aspecto, tem havido uma ateno crescente na converso de biomassa em etanol, considerando um combustvel ambientalmente adequado e uma alternativa aos combustveis fsseis (LIN; TANAKA, 2006). Podem ser utilizadas ainda como aditivos no preparo de enzimas digestivas, na indstria de alimentos para aumentar o rendimento da extrao de amido, leos vegetais, componentes do ch verde, protena de soja, aromatizantes e do amido da batata doce, e como aditivos de rao animal. Em combinao com pectinases tem contribudo para uma melhor extrao e clarificao de sucos (BHAT; BHAT, 1997; BHAT, 2000). Essas enzimas participam, ainda, dos processos de produo do vinagre de laranja e do gar (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004). Devido ao aumento da presso ambiental sobre as indstrias de papel e txtil, supe-se que as celulases devem desempenhar um papel importante no

desenvolvimento de tecnologias limpas, tanto no processamento do denim, como descolorao do papel visando a reciclagem e tratamentos de guas residuais (GEORGE et al., 2001).

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2.4.2.2. SCREENING E PRODUO DE CELULASES

2.4.2.2.1. Screening do potencial celuloltico

A utilizao do meio slido para selecionar microrganismos produtores de enzimas permite de forma fcil e rpida o screening de fungos produtores de enzimas especficas (HANKIN; ANAGNOSTAKIS, 1975). Vrios autores utilizam a tcnica de plaqueamento para selecionar microrganismos produtores de celulases (KADER; OMAR, 1998; MONTENECOURT; EVELEIGH, 1977; NEIROTTI; AZEVEDO, 1988; RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004). A maioria das tcnicas de plaqueamento para selecionar microrganismos produtores de celulase baseada na capacidade de assimilao do carboidrato (NEIROTTI; AZEVEDO, 1988). Montenecourt e Eveleigh (1977) trabalharam com o mutante QM9414 e a linhagem, selvagem QM6a de Trichoderma reesei e demonstraram a correlao positiva que existe entre a formao de halo de degradao de celulose e a atividade enzimtica dessas linhagens, mostrando assim a validade do uso de tcnicas semiquantitativas para medir a capacidade de degradao de celulose em fungos. Os autores demonstram ainda a eficcia da aplicao de um choque trmico (50C) por 16 horas, o que favorece uma hidrlise mais rpida da celulose, permitindo a seleo de enzimas celulolticas termoestveis. Entretanto, a alta temperatura conduz paralizao do crescimento de T. reesei. Segundo estes, a formao do halo claro de hidrlise deve-se ao efeito combinado do aumento da atividade celuloltica e de uma conseqente inibio do crescimento do fungo, que pode ser atribudo devido liberao de celulases das hifas localizadas nos bordos das colnias por autlise resultante do tratamento trmico. Um mtodo simples de colorao que permite melhor visualizao do halo de degradao de celulose foi proposta por Teather e Wood (1982) utilizando uma soluo de vermelho congo (0,025%). Estes autores ressaltam que a interao do vermelho congo com polissacardeos (-D-glucanas) contendo ligaes (1-4) ou (1-3) do um complexo vermelho intenso, cuja formao evitada pela ao das -glucanases. A partir de meio de cultura que no produz halo de degradao de celulose, anteriormente utilizado, Neirotti e Azevedo (1988) desenvolveram um meio que permite a visualizao de halo e quantificao da capacidade celuloltica de Humicola sp. atravs da medio do dimetro do halo formado. Estes avaliaram a melhor quantidade de citrato de sdio usada (5 ou 10 mM), o emprego de extrato de malte ou de levedura, 33

tempo de incubao, aplicao de choque trmico e propuseram uma modificao no processo de colorao desenvolvida por Teather e Wood em 1982. Para visualizao do halo a utilizao de extrato de malte foi mais eficiente, a concentrao de citrato de sdio mais efetiva para reduzir o tamanho das colnias foi a de 10 mM e quanto ao perodo de incubao que permitisse obter colnias de tamanho adequado para medio do halo, variou entre cinco e sete dias. A aplicao do choque trmico (50C) por 16 horas auxiliou na revelao do halo de degradao da celulose. No processo de colorao proposto por estes autores a visualilizao do halo bem mais evidente, utilizando 10 mL por placa de soluo de vermelho congo (0,025%) em tampo Tris HCl 0,1M (pH 8) e aps 30 minutos, retirada da soluo e lavadas com 6mL de NaCl 0,5M em tampo Tris HCl 0,1M (pH 8). Apesar de estudos demonstrarem o potencial das linhagens de Trichoderma na produo de celulases (GASHE, 1992) e de algumas espcies serem usadas intensivamente para a despoluio ambiental pela capacidade de degradarem resduos e efluentes (BUCHERT et al., 1993), espcies dos gneros Aspergillus e Penicillium tambm tm sido citadas como boas produtoras destas enzimas (CASTILLO et al., 1994; KIM et al., 1997). O gnero Penicillium tem sido constantemente utilizado como fonte de enzimas em vrios setores industriais (CARVALHO et al., 1992; TEIXEIRA, 1994). Nogueira e Cavalcanti (1996) estudaram 48 linhagens de fungos filamentosos isolados de aveia industrializada, quanto capacidade de ao celuloltica. Todas as amostras apresentaram resultados positivos, destacando-se Aspergillus janus var. brevis e Penicillium bilaii por apresentarem maiores nveis enzimticos. As espcies que exibiram menor dimetro da colnia apresentaram alto ndice enzimtico, em relao quelas que mostraram maior dimetro da colnia. Dos dezesseis fungos celulolticos isolados de vrios locais do Sayap-kinabalu Park, Sabah, Malsia, 10, foram testados por Kader e Omar (1998), baseados no dimetro do halo de degradao do meio de celulose aps sete dias de incubao. Os autores verificaram que os isolados de Trichoderma B1 e D2 e Aspergillus D1 e E1 apresentaram valores entre 1,33-1,71 e 1,75-1,85 mm, respectivamente, valores superiores aos encontrados com a amostra controle 1,32 mm. Corabi-Adell et al. (2002), avaliaram aspectos enzimticos de 50 isolados de Trichoderma no Estado de So Paulo. A capacidade de degradao da celulose foi verificada no meio contendo celulose, asparagina e gar (CAA), e como nica fonte de 34

carbono, compararam o uso de celulose microcristalina e carboximetilcelulose (10g/L). Os ensaios realizados utilizando meio com celulose microcristalina no se mostraram adequados para seleo dos isolados, entretanto, as placas com meio contendo carboximetilcelulose demonstraram bons halos de degradao. Lima Filho et al. (2003) realizaram a caracterizao celuloltica de culturas de Colletotrichum associados a doenas de ps-colheita isoladas de caju, manga, mamo, maracuj e banana. Os isolados de maracuj e mamo com 4,89 e 4,46 milmetros (mm) de halo de degradao de celulose respectivamente, diferiram significativamente do isolado de manga 3,00 mm quanto atividade celuloltica. O isolado de banana no mostrou habilidade em degradar o meio de cultura contendo celulose aps cinco dias de inoculao. Possivelmente, um maior perodo fosse necessrio para esse isolado expressar a produo desta enzima. Sanomiya e Nahas (2003) isolaram fungos e bactrias do latossolo vermelho distrfico no Estado de Minas Gerais, com o objetivo de avaliar o efeito da adubao fosfatada, de diferentes culturas, bem como o efeito da calagem sobre o nmero microrganismos com atividade para vrias enzimas. A proporo dos fungos que apresentaram atividade para CM-celulolticos foi de 36,3%, para CMC-celulolticos de 35,9%, para ureolticos de 11,7%, para os proteolticos, 2,3% e para amilolticos de 2,0%. Ao analisar detalhadamente as interaes entre os tratamentos, constatou-se que na ausncia de calagem em solo seco, excetuando-se os CMC-celulolticos, as maiores contagens de amilolticos (1,24-1,45 x 104 UFC g-1), CM-celulolticos (8,24-8,64 x 104 UFC g-1) e ureolticos (1,23-3,88 x 104 UFC g-1) foram obtidas na ausncia de planta. Quando foi feita a calagem, as maiores contagens foram obtidas na ausncia de planta e de adubao (CM-celulolticos, 12,21 x 104 UFC g-1, CMC-celulolticos, 11,45 x 104 UFC g-1 e ureolticos, 4,65 x 104 UFC g-1) ou pela aplicao de superfosfato no solo (proteolticos 2,52 x 104 UFC g-1). Do total de isolados, observou-se maior freqncia de celulolticos que os demais grupos estudados. Os resultados apresentados mostraram uma ocorrncia elevada de isolados com atividades enzimticas combinadas. As maiores porcentagens foram encontradas entre os isolados que apresentam atividades combinadas CM e CMC-celuloltica, o que pode ser justificada considerando que a celulose um dos principais componentes da matria orgnica vegetal incorporada ao solo. Com o objetivo de investigar a atividade da celulase de fungos isolados do solo da Estao Ecolgica de Juria-Itatins, So Paulo, Brasil, Ruegger e Tauk-Tornisielo 35

(2004) isolaram 80 fungos filamentosos avaliando a capacidade de produo de celulases em resposta presena de celulose, como nica fonte de carbono, em meio de cultura slido. Foi utilizada a tcnica de colorao com vermelho congo e determinada a atividades da celulase em papel de filtro (FPase) e em carboximetilcelulose (CMC). Aps cultivo dos fungos em meio sinttico contendo CMC como nica fonte de carbono, observou-se que a incubao das culturas a 50C apresentou duplo efeito na formao da zona de degradao da celulose como citado por Montenecourt e Eveleigh (1977) que foi uma hidrlise mais rpida da celulose e a inibio do crescimento. Os autores constataram que este ltimo efeito foi demonstrado pela no alterao nos valores entre os dimetros das colnias medidos antes e aps o choque trmico. O halo de degradao da CMC foi observado em 36 linhagens, ou seja, 45% dos fungos estudados. Procurando-se comparar essas linhagens, foi estabelecido um ndice enzimtico e, por meio deste, observou-se que algumas colnias com pouco crescimento apresentaram os maiores ndices enzimticos, como P. herquei e T. hamatum I (dimetro da colnia = 2,0 mm, ndice = 6,0), P. miczynskii e P. verruculosum II (dimetro da colnia = 1,0 mm, ndice = 5,0) e P. glabrum II (dimetro da colnia = 3,0 mm, ndice = 5,0). O halo indicador da degradao da CMC no foi observado em 29 linhagens (36%), incluindo 14 do gnero Trichoderma, considerados como bons produtores de celulases. Os fungos foram diferenciados quanto atividade dessas enzimas, pois tais atividades variaram em relao ao tipo de substrato e s metodologias utilizados. Dos fungos estudados, 64 linhagens (80%) apresentaram atividade FPase que variou entre 1,4x10-2 e 2,3x10-2 U, sendo o melhor resultado obtido com Scopulariopsis carbonaria. Entretanto, aps o cultivo em meio de farelo de trigo por 4 dias a 25C, para verificar a atividade CMCase, que foi evidenciada em 78 linhagens (95%), foi obtida a melhor atividade (1,64 U) com o cultivo de T. harzianum (RUEGGER; TAUKTORNISIELO, 2004). Os resultados deste estudo evidenciaram que a produo de celulases depende do tipo de substrato e que o uso de distintos mtodos torna difcil a comparao com os resultados obtidos por diferentes autores. Salienta-se ainda que, os fungos produtores de celulases, na natureza, no ocupam o mesmo nicho ecolgico em cultura pura, onde no existe competio; ao contrrio, interagem com outros organismos celulolticos e com aqueles que degradam vrios polmeros. Essa associao responsvel pela completa

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mineralizao dos substratos celulsicos nos ecossistemas onde estes organismos esto inseridos (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004).

2.4.2.2.2. Produo das enzimas do complexo celuloltico

Ghose em 1987, juntamente com a Comisso de Biotecnologia, International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), devido ao crescente nmero de grupos engajados no estudo emprico da celulase e seus substratos, sentiram a necessidade de um trabalho para formar a base da troca de idias e de comparao de resultados. Ento, aps onze anos de pesquisas, publicaram um importante documento para prescrever os procedimentos normalizados para o ensaio e avaliao quantitativa do sistema enzimtico para esta enzima. Estes autores avaliaram principalmente o sistema celulsico de T. reesei em paralelo a outros fungos e compararam a estudos com bactrias celulolticas e sugeriram que estes organismos apresentam um modo de ao diferente, assim como as condies timas de atividade para pH e temperatura, devendo os mesmos serem adaptados com relao ao tempo, substrato e concentrao das enzimas. Em geral esta normatizao recomenda a utilizao de papel de filtro para atividade celulsica total, carboximetilcelulose para atividade endo-glucanase e celobiose para atividade de -glucosidase, que at os dias atuais so os substratos mais utilizados. Utilizando uma cultura de A. niger A20 em cultivo submerso, a produo de celobiase foi investigada por Abdel-Fattah et al. (1997). Foi verificado que no meio lquido contendo celulose, a produo mxima ocorreu quando o pH foi controlado e mantido em 4,0 durante o processo de fermentao. Lactose (0,2% g/L) e celulose (1,5% g/L) foram as fontes de carbono mais favorveis. Extrato de levedura (0,05% g/L), peptona (0,025% g/L), uria (0,025% g/L) e (NH4)2SO4 (0,07% g/L) foram as mais favorveis fontes nitrogenadas. O fosfato de potssio (KH2PO4) utilizado em uma concentrao de 0,2% (g/L) induziram a produo da enzima com maior rendimento. Foi possvel aumentar o rendimento de 13,8 U mL-1 para 27,5 U mL-1 de celobiase no meio modificado. As enzimas imobilizadas em quitosana com 0,3% (v/v) glutaraldedo e 10% em de poliacrilamida com um 5,0% (p/v) tiveram o nvel mais elevado ligando as atividades. A carga mxima de atividade enzimtica em quitosana foi 1570 U -1 por grama. O valor da constante de Michaelis (Km) da enzima imobilizada foi superior aos

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valores nativos da enzima. A estabilidade trmica foi melhorada com o processo de imobilizao. Ojumu et al. (2003) utilizaram para produo de celulase, bagao, caroo e serragem de milho como substratos, aps moagem e pr-tratamento com soda custica utilizando A. flavus. A partir da fermentao submersa utilizando serragem, foi obtido o melhor resultado, com valor de atividade enzimtica de 0,0743 U/mL, enquanto bagao e caroo de milho 0,0573 U/mL e 0,0502 U/mL respectivamente. Nos resduos utilizados o mximo de atividade enzimtica foi verificada aps 12 horas de cultivo, sugerindo que este tempo o melhor momento em que a enzima pode ser recuperada. As atividades de endoglucanase, exocelobiohidrolase e celobiase foram estudadas por Pereira Jnior et al. (2003), utilizando uma linhagem de Lentinula edodes cultivada em meio lquido contendo carboximetilcelulose (CMC) ou Avicel como nica fonte de carbono. Os autores detectaram as atividades de endoglucanase e exocelobiohidrolase no sobrenadante das culturas crescidas tanto em meios contendo CMC como nos meios contendo Avicel, sendo observada a influncia da concentrao e do tipo de celulose. No foi detectada atividade de celobiase nos sobrenadantes, sendo a mesma detectada somente no extrato micelial. Com a concentrao de 1,7% de Avicel, a linhagem estudada no demonstrou atividade de exocelobiohidrolase. Entretanto, concentrao de 0,5% obteve-se uma atividade de 74 mol de Remazol Brilliant Blue R (RBBR) por mg de protena/min. Quando realizada a substituio de Avicel por CMC a 0,5%, a atividade de exocelobiohidrolase foi reduzida a menos de 50%. Em sobrenadantes obtidos de meio com CMC, a atividade desta enzima foi de apenas 200 UI/mg de protena. O mximo de atividade endoglucansica em sobrenadantes obtidos em meio com Avicel a 0,5% foi em torno de 800 U/mg de protena, aps 96 horas de cultivo, sendo estas condies escolhidas como as melhores para a produo desta enzima. Mucor circinelloides Tiegh. (1875) (NRRL 26519) foi utilizado por Saha (2004) para produo, purificao e estudo das propriedades de endoglucanase (EG). Este fungo quando cultivado em lactose, celobiose e Sigmacell 50, produz todo o complexo da celulase (endoglucanase, celobiohidrolase, -glucosidase) quando hidrolisadas a partir de CMC, Avicel, Solka-floc, Sigmacell 50 e papel de filtro em relao a taxas de 100, 29, 27, 38 e 22%, respectivamente. A EG purificada apresentou atividade especfica de 43,33 U/mg de protena, sendo uma protena monomrica com um peso molecular de 27,000. A melhor temperatura e pH para a ao da enzima foram em 55C 38

e 4,0-6,0, respectivamente. A enzima foi purificada com estabilidade em pH 4,0-7,0 e temperatura de at 60C. O pH 5,0 recomendado para a utilizao de Avicell, SolkaFloc, e Sigmacell 50, e vinculado a enzima foi liberado atravs da alterao do pH para 8,0. A atividade da enzima foi aumentada de 27 5% para 44 14% pela adio de 5mM de MgCl2 e 0,5mm de CoCl2, na mistura da reao, respectivamente. Onsori et al. (2005) realizaram uma seleo com 13 amostras do gnero Aspergillus de colees de culturas e isolados de solo. A seleo foi realizada pela habilidade de crescer em meio contendo carboximetilcelulose como nica fonte de carbono, e tambm pela maior capacidade de atividade de endo--1,4-glucanase. Aspergillus sp. (R4) foi escolhido com produo de halo de 50 mm e para a atividade CMCase apresentou 11,80 U/mg, sendo este isolado indicado como o melhor produtor de endo--1,4-glucanase. Para estudar a produo de CMCase e xilanase, Silva et al. (2005), utilizaram a fermentao em estado slido (SSF) usando diferentes resduos agrcolas (farelo de trigo, bagao de cana, bagao de laranja, sabugo de milho, grama verde, grama seca, serragem de eucalipto e palha de milho) como substratos sem enriquecimento dos meios, para os ensaios de caracterizao da enzima utilizaram uma cultura de Thermoascus aurantiacus Miehe (1907), isolado de solo brasileiro. O estudo das enzimas hemicelulolticas extracelulares mostrou que o fungo T. arantiacus melhor produtor de xilanase do que de celulase. Maiores nveis das enzimas foram obtidos em meios contendo sabugo de milho, grama e palha de milho. Todas as enzimas foram estveis por 24 horas a 28C numa ampla faixa de pH (3,0-9,0) e tambm foram estveis a 60C por 1 h. O pH timo e temperatura tima para xilanase e CMCase foram 5,05,5C e 5,0 e 75C, respectivamente. O microrganismo cresceu muito bem nos resduos de sabugo de milho, grama e palha de milho, sendo estes, indicados para serem aplicados como um meio simples e de baixo custo. Assim, os autores ressaltam que as enzimas estveis secretadas extracelularmente apresentam as caractersticas necessrias para sua aplicao industrial. Castro (2006) estudou a utilizao de uma biomassa lignocelulsica para a produo de celulases por oito fungos filamentosos, bem como a caracterizao das enzimas quanto a propriedades cinticas, fisico-qumicas e catalticas. Aps avaliao preliminar, quatro linhagens (A. niger ATCC16404, P. funiculosum Thom (1910) ATCC11797, T. harzianum Rifai (1969) IOC3844 e T. harzianum IOC4038) foram selecionadas para ensaios mais detalhados, pela destacada habilidade em produzir 39

celulases. Adicionalmente, duas outras linhagens, T. reesei Rut C30 e H. grisea var. thermoidea, foram adotadas como referncia. A concentrao celular de 4,0 x 105 esporos/mL foi a escolhida para o experimento. A produo de celulases pelas melhores linhagens apontou T. harzianum IOC3844 como um rpido e destacado produtor de endoglucanases, atingindo 6358 U/L-1 de atividade em apenas 72 horas de processo. A. niger consolidou-se, conforme preconizado pela literatura, como um potencial produtor de -glicosidases, alcanando 1627,3 U/L-1 de atividade ao final da fermentao. T. harzianum IOC4038 e P. funiculosum ATCC11797 produziram extratos com desejvel balanceamento entre as enzimas componentes do complexo celulsico, tendo esta ltima linhagem atingido valores de produo mais elevados que a primeira. Todas as enzimas apresentaram valores timos de temperatura, em CMC, celobiose e papel de filtro, entre 47 e 61C e revelaram-se celulases cidas, com os melhores valores de pH para atuao variando entre 4,8 e 5,5. No que tange estabilidade trmica durante 23 horas de incubao, os extratos apresentaram propriedades semelhantes s de preparados comerciais, tendo sido altamente estveis a 37C, mostrando perder estabilidade com o aumento da temperatura. Kaur et al. (2006) relataram a produo de celulase em dois fungos termfilos, Melanocarpus sp. MTCC3922 e Scytalidium thermophilum MTCC4520. A palha de arroz induziu mximos nveis de celulase em ambos os fungos. A adio de frutose (1% p/v) para a carboximetilcelulose (CMC) resultou em duas vezes o aumento da atividade de endoglucanase para Melanocarpus sp., no entanto, a adio de etanol (1% v/v) resultou uma atividade oito vezes maior com S. thermophilum. Para avaliar a fermentao em estado slido (FES) e a produo de celulase e hemicelulases, por P. echinulatum Dale (1923) 9A02S1, Camassola e Dillon (2007) realizaram experimentos com diferentes concentraes de bagao de cana pr-tratado (PSCB) e farelo de trigo (FT). As maiores quantidades de atividade utilizando papel filtro (FPA) foram obtidas em misturas de PSCB e FT (32,89 1,90 U gdm-1). A maior atividade de -glucosidase foi 58,95 2,58 U gdm-1, no quarto dia. Para endoglucanases a maior atividade foi 282,36 1,23 U gdm-1 no quarto dia, e para a atividade de xilanases foi de cerca de 10,0 U gdm-1 a partir do segundo ao quarto dia. O potencial de produo de P. echinulatum para FPA, endoglucanase, -glucosidase e xilanase na FES, indicou que FT pode ser parcialmente substitudo por PSCB.

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Duas culturas de Penicillium sp. (PB-316 e CR-313) foram isoladas por Picart et al. (2007) de solos subtropicais por apresentarem boa capacidade em secretar elevado nvel de celulase termostvel em meios suplementados com palha de arroz. Em anlise de gel de eletroforese com poliacrilamida dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE), verificou-se que as linhagens estudadas secretaram vrias enzimas na hidrlise da celulose. Penicillium sp. CR-316 mostrou maior atividade de celulase, com temperatura e pH timo de atividade para carboximetilcelulase a 65C e pH 4.5, respectivamente, aps 3 h de incubao. Dois nveis de designer fatorial fracionrio (FFD) foram analisados por Alam et al. (2008), para determinar os efeitos de seis variveis, substrato (guas residuais domsticas) e concentrao do co-substrato (farinha de trigo), temperatura, pH inicial, tamanho do inculo e agitao sobre a taxa de produo da celulase por T. harzianum em estado lquido. Na anlise estatstica dos resultados experimentais, timas condies de processo foram constatadas para temperatura de 32,5C, concentrao do substrato 0,75% (p/v), concentrao do co-substrato 2,0% (p/v), pH inicial 5,0, tamanho do inculo 2,0% (p/v) e agitao 175 rpm. A anlise de varincia (ANOVA) mostrou um alto coeficiente de determinao (R2) de 0,975. A atividade da celulase foi de 10,2 FPase U/mL no terceiro dia de fermentao, processo que indicou 1,5 vezes o aumento na produo da enzima em comparao a atividade de celulase obtida em dados anteriormente alcanados no projeto do experimento (6,9 FPase U/mL). Em busca de estratgias para melhorar a produo de celulase, Ahamed e Vermette (2008) realizaram ensaios com alta concentrao de celulose para substituir a glicose no meio de fermentao, utilizando para a produo T. reesei. Os experimentos foram conduzidos separadamente com lotes de crescimento utilizando T. reesei cultivado em quatro meios em tanque agitado com capacidade de 7,0 L. Uma mistura de lactose e cido lactobinico foi adicionado no biorreator como indutores para celulase. A utilizao de celulose e extrato de levedura na cultura, induziu uma maior produo da enzima e de massa celular, com um volume de atividade enzimtica de 69,8 U/L-1 h1

, para a atividade filtro de papel 5,02 U/mL-1, para atividade CMCase de 4,2 U/mL-1, e

uma biomassa fngica de 14,7 g/L-1. A concentrao da biomassa com relao a constante de tempo foi relativamente rpida, quando usado como componente extrato de levedura, seguido por um segundo crescimento mais lento devido fase da hidrlise de celulose, que seguem no acrscimo da concentrao de celulase.

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Das et al. (2008) desenvolveram uma nova tecnologia de processamento e seletividade para arroz polons, atravs da utilizao de celulases e xilanases. As enzimas foram produzidas a partir de Aspergillus sp. e Trichoderma sp., respectivamente. Nesta tcnica o arroz embebido em gua a 35C por 24 horas para atingir um nvel de saturao de umidade de 35,5 g/100g, o que leva a um aumento na concentrao do cido gama-aminobutrico para 27 mg/100g de arroz. O tratamento enzimtico foi feito durante 2 horas a 50C. O leo bruto e o teor de fibra bruta marrom do arroz foi reduzido de 16 g/100g, e 20 g/100g, respectivamente, atravs do tratamento enzimtico. P. citrinum (MTCC6489) isolado de solo por Dutta et al. (2008), produtor de alcalinos tolerantes e celulases termostveis foi utilizado para a produo e caracterizao desta enzima. A atividade de endoglucanase e a atividade do papel filtro (FPase) foram estudados usando como substrato farelo de trigo no estado slido e cultura submersa. O teste do zimograma para endoglucanase revelou a presena de duas isoformas diferentes em peso molecular. Um destes de 90 kDa e uma outra de 38 kDa. Endoglucanase parcialmente purificada mostrou na curva dois picos em pH 5,5 e 8,0, respectivamente. Entretanto FPase apresentou apenas um pico timo em pH 6,5. Os autores concluram que a celulase de P. citrinum termostvel. Com o intuito de obter uma comunidade microbiana eficaz e estudar o processo de biodegradao em bagao de cana (SCB), Lv et al. (2008) isolaram microrganismos mesoflicos de materiais lignocelulsicos em decomposio, sendo a amostra EMSD13 selecionada por sua alta eficincia em degradar celulose e suportar altas temperaturas (50C). Mais de 77% do SCB pr-tratado com lcali foi degradado e mais de 83% da celulose contida foi utilizada por EMSD13 dentro de 6 dias. Para compreender o processo de biodegradao extracelular de EMSD13 em SCB-absorvveis, celulases foram analisadas. O pico de atividade (42,0 mU/mL) da celulase extracelular no sobrenadante ocorreu no terceiro dia de incubao. Mekala et al. (2008), utilizaram bagao de cana como substrato para produo de celulase utilizando T. reesei RUTC30, a produo e os parmetros tais como concentrao do inculo, temperatura e tempo de incubao, foram otimizados para o maior rendimento da enzima. Previsivelmente, os resultados mostraram que a produo de celulase foi mais elevada (25,6 FPase unidades por grama substrato seco), quando a

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concentrao do indutor foi de 0,331 mL/gds (Unidades por grama slidos secos), e a temperatura e o tempo de incubao foram 33C e 67 horas, respectivamente. Com o objetivo de avaliar o potencial da utilizao de polpa de laranja para a produo de celulases por T. reesei RUTC30, Oberoi et al. (2008) analisaram diferentes combinaes no experimento. A polpa seca suplementada com farelo de trigo na proporo de 4:1 resultou na maior atividade de celulase contra papel de filtro (FPase) 13,4 U/gds, para atividade endo-1,4--glucanase (CMCase ) e para a atividade glucosidase a maior atividade foi obtida quando a polpa foi suplementada com farelo de trigo na proporo 3:2 utilizando meio Mandel Weber (MW), atingindo valores de 25 e 18 U/gds, respectivamente. No entanto, a polpa suplementada com farelo de trigo em 3:2 utilizando gua como meio resultou em uma proporo de atividades FPase: glucosidase em cerca de 1:1, que considerado como mais adequado para a realizao da eficiente sacarificao em caso de material lignocelulsico. Pericin et al. (2008) avaliaram o potencial da torta de abbora (PuOC) como substrato para a produo de endoglucanase por P. roquefortti utilizando fermentao em estado slido (FES). As comparaes foram feitas para a produo CMCase usando farelo de trigo (FT) e diferentes tortas de resduos industriais como substratos (torta de abbora, torta de soja e torta de girassol). O FT serviu como a melhor fonte de carbono para a sntese CMCase por P. roquefortti apresentando elevada atividade 53,06 U gds-1. Razoveis quantidades de enzima foram produzidas em substrato misto (PuOC + FT) e sobre PuOC como nica fonte de nutrientes, que foram 48,49 U gds-1 e 37,07 U gds-1, respectivamente. Sabendo que a enzima de sntese foi relacionada disponibilidade de umidade, variaes no teor inicial de umidade do substrato foram investigadas. As anlises revelaram que o substrato com umidade inicial de 44,44%, elevou o rendimento da CMCase (36,0 U gds-1) e que o tempo de incubao influencia sobre a produo enzimtica durante FES. A produo de CMCase aumentou progressivamente com o tempo de incubao, obtendo-se atividade mxima aps o quinto dia (59,9 U gds-1 ). Segundo Ribeiro Leite et al. (2008) a -glucosidase purificada de Aureobasidium pullulans ER-16 uma das mais termostveis enzimas relatada, porm de uso invivel para aplicaes industriais. O fungo termoflico Thermoascus aurantiacus CBMAI-756 e mesoflico A. pullulans ER-16 foram cultivados em estado slido para produo de glucosidase sobre diferentes materiais hemicelulsico. Dentre os substratos testados o farelo de trigo foi o mais adequado para produo de -glucosidase para ambos os

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microrganismos. T. aurantiacus exibiu mxima produo enzimtica (7,0 U/ml ou 70,0 U/g) entre 48 e 72 horas de cultivo e A. pullulans com mximo de produo (1,3 U/ml ou 13,0 U/g) em 120 horas. Mximas atividades foram obtidas a 75C, com pH timo em 4,5 e 4,0, para T. aurantiacus e A. pullulans, respectivamente. -glucosidase de A. pullulans apresentou pH mais estvel (4,5-10,0 contra 4,5-8,0) e mais termostvel (90% aps 1 hora em 75C contra 85% aps 1 hora a 70C) do que a enzima termfila de T. aurantiacus. A constante de termoinativao t
(1/2)

a 80C foram 50 e 12,5 min para A.

pullulans e T. aurantiascus, respectivamente. Atravs destes dados os autores confirmaram a elevada termoestabilidade de -glucosidase bruta obtida de A. pullulans. Camassola e Dillon (2009) realizaram um estudo com bagao de cana prtratado (PSCB) com o fungo da podrido branca Pleurotus sajorcaju PS2001, e este substrato, foi posteriormente, a biomassa utilizada na produo de celulases e xilanases pelo fungo P. echinulatum. Apesar das vantagens ambientais oferecidas por este tipo de tratamento prvio, a atividade enzimtica obtida com PSCB foi menor que o do tratamento controle, que foram realizados com bagao de cana no tratados (SCB) e celulose. Para o meio suplementado com PSCB, a mdia de pico de atividades obtidos foram 0,13, 1,0, 0,18 e 0,33 Uml-1 para atividade do papel de filtro, endoglucanase, glucosidases, e xilanases, respectivamente. Para a celulose, valores controle de 0,52, 1,20, 0,20 e 1,46 U ml-1, e para SCB foram obtidos valores de 0,95, 1,60, 0,21 e 1,49 Uml-1, respectivamente. Estes autores consideram que, embora as atividades enzimticas das culturas com bagao de cana pr-tratado tenham sido inferiores aos das culturas sem pr-tratamento, deve-se notar que a produo de enzimas do complexo hemicelulsico e celulsico aps tratamento com Pleurotus outra forma de acrescentar valor a este resduo agrcola. Neurospora crassa foi cultivado em estado slido por Dogaris et al. (2009) para a produo do sistema celuloltico utilizando bagao de sorgo (SB) como substrato e misturas de palha e farelo de trigo. Aps a otimizao, a melhor fonte de nitrognio foi o sulfato de amnio, o pH timo para produo das enzimas ficou entre 4.0 e 5.0 e para a umidade inicial de crescimento 70,5% foi a selecionada. O conjunto dessas variveis proporcionou rendimentos elevados como 492,8, 1,08, 26,7, 297,8 e 0,132 (em U g-1 da fonte de carbono) para endoglucanase, exoglucanase, -glucosidase, xilanase e xilosidase, respectivamente. Clulas de N. crassa foram capazes de assimilar a maioria

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dos acares e de outros nveis limitados de produtos metablicos liberados, durante sacarificao e fermentao simultnea deste valioso substrato em etanol. A fim de demonstrar o potencial de novos compostos para o rastreio de microrganismos celulolticos em meio slido para deteco de glucanase/celulase, Ivanen et al. (2009) verificaram que aps utilizao de 2-(2'-benzotiazolil)-fenil (BTP), celooligossacardeos com grau de polimerizao (DP) 2-4 (BTPG2-4) apresentaram um precipitado fluorescente quando utilizadas trs bactrias e dezoito fungos celulolticos com atividade para celobiohidrolase, -glucosidase e endoglucanase. Na tentativa de reduzir custos na produo do bioetanol, Sukumaran et al. (2009) analisaram a produo de celulase total (FPU) e -glucosidase (BGL) usando biomassa de fonte renovveis e sua aplicao na sacarificao lignocelulsica. Foi utilizado um substrato de baixo custo como o farelo de trigo para a produo da enzima, fungos termotolerantes como T. reesei RUTC30 e A. niger MTCC7956 e fermentao em estado slido, que segundo estes autores tambm produz um produto mais concentrado, o que neste caso muito mais vantajoso. Para a sacarificao lignocelulsica trs diferentes misturas foram estudadas, bagao de cana, palha de arroz e biomassa de guap. Para a produo da enzima o melhor tempo foi o de 48 h. Apreciveis nveis de atividade contra papel de filtro (50 FPase U/g) foram obtidos e menor atividade de glucosidase (5 U/g). Um maior rendimento de acares redutores totais (26,3 g/L) foi obtido a partir de palha de arroz seguido pelo bagao de cana-de-acar (17,79 g/L). A hidrlise enzimtica da palha de arroz foi utilizada como substrato para a produo de etanol por Saccharomyces cerevisiae. A produo de etanol foi de 0,093 g por grama de palha de arroz pr-tratada. O impulso no desenvolvimento de pesquisas para recuperao e purificao de produtos produzidos por clulas microbianas so to ou mais desafiantes que o estudo de produo, pois, constituem complexa etapa do processo, dados os variados fatores que influenciam na qualidade e rendimento destas importantes biomolculas.

2.5. SISTEMAS DE DUAS FASES AQUOSAS (SDFA)

O desenvolvimento de tcnicas e mtodos para a separao e purificao de protenas, organelas celulares e outros produtos biolgicos, tem sido parmetro importante e emergente para o avano da indstria biotecnolgica. Sistemas formados

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por fases lquidas podem ser utilizados em diversos processos industriais como, por exemplo, na extrao lquido-lquido, em que um soluto dissolvido em uma fase se difunde para outra. A extrao lquido-lquido uma alternativa interessante de separao de substncias, desde que reduz etapas do processo combinando passos em uma nica operao (MAZZOLA et al., 2008). Em 1896, Beijerick observou a formao de fases ao misturar gua, gar e gelatina ou amido em determinadas concentraes. Relatou tambm o enriquecimento da fase superior com gelatina e da fase inferior com o gar ou amido solvel. Ostwald e Hertel, em estudos posteriores, verificaram que para variadas fontes de amido diferentes concentraes eram necessrias para a separao de fases. Dobry e Boyer-Kawenoki estudaram a miscibilidade de pares de polmeros solveis em gua ou em solventes orgnicos e a ocorrncia ou no de separao de fases. Mas, somente em 1956 com as pesquisas de Albertsson, teve incio o emprego dos sistemas aquosos bifsicos (SAB) na separao de biomolculas, pois este, veio a descobrir que o polietilenoglicol (PEG), fosfato de potssio e gua, assim como PEG, dextrana e gua formavam sistemas de duas fases (ALBERTSSON, 1960). O avano nas pesquisas que envolvem a rea de bioseparao, tem sido limitado pela dificuldade e complexidade dos processos aplicados, pois, cerca de 50 a 90% do custo de produo est vinculado ao tipo de estratgia empregada. Sendo desta forma, necessrio a aplicao de tcnicas propicias utilizao em larga escala que permitam: eficincia, economia e que atinjam alto grau de recuperao e pureza, mantendo a estabilidade e atividade da molcula (DYR; SUTTNAR, 1997). Em relao s tcnicas tradicionais, uma promissora tcnica de extrao e purificao, que utilizada industrialmente o da partio de biomolculas por sistemas aquosos bifsicos, pois, apresenta rpida separao de fases, alto rendimento, reduzida viscosidade e baixo custo. Adicionalmente o alto contedo de gua em ambas as fases (80-90%) implica em alta biocompatibilidade e baixa tenso interfacial, minimizando a degradao das biomolculas (GUNDUZ; TOLGA, 2004; SALABAT, 2001). Alm de permitir o fcil aumento de escala e reciclagem dos reagentes utilizados nesses sistemas (REH et al., 2002). Os SDFA so formados pela mistura aquosa de dois polmeros hidrfilos, ou de um polmero com determinados sais. Acima de certas concentraes crticas, os

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componentes estabelecem a separao espontnea de fases, onde, um ou outro componente predomina em cada fase (SHANG et al., 2004; TUBIO et al., 2004). Vrios fatores influenciam na transferncia do soluto entre as fases no sistema bifsico aquoso e a escolha de condies adequadas para o processo ainda so estudados, tais como, aqueles envolvidos no prprio sistema, temperatura, pH, concentrao e tipo do polmero, concentrao e tipo do sal, como os fatores inerentes a biomolcula (conformao, carga, massa molar e hidrofobicidade) (PESSOA-JR; KILIKIAN, 2005). Condies timas de recuperao e altos fatores de purificao tm sido obtidos para vrias protenas que foram estudadas. Isto comumente realizado seguindo um procedimento semi-emprico que inclui estudos experimentais dos efeitos das variveis que influenciam o sistema. Como um exemplo tpico tem-se a separao e purificao da protena taumatina, que foi purificada em 20 vezes e recuperao de 90-95% alcanados em uma nica etapa utilizando SDFA (CASCONE et al., 1991). Isto tambm foi realizado para anticorpos monoclonais (NIELSEN; ASENJO, 1991). O crescente interesse por SDFA para a aplicao na separao e purificao de protenas e enzimas tais como: a extrao de pectinase utilizando o sistema PEG 4000 + dextrana (ANTOV, 2004), obteno de albumina de soro bovino (BSA) empregando o sistema PEG + gel dextrana (GUNDUZ; TOLGA, 2004), purificao da xilose redutase por um sistema PEG + sais de fosfato (MAYERHOFF et al., 2004), fosfolipase D (TEOTIA; GUPTA, 2004), proteases (PORTO et al., 2008), purificao de ficoeritrina B (BENAVIDES; RITO-PALOMARES, 2004), lutena (CISNEROS et al., 2004), policetideos (ESMANHOTO; KILIKIAN, 2004), purificao de ricina B (ZHANG et al., 2005) e da toxina alfa de Clostridium perfringens (CAVALCANTI et al., 2008). Os SDFA vm sendo empregados com muito sucesso na recuperao de biomolculas e representam uma etapa essencial em muitos processos industriais, porm a dificuldade nos processos de recuperao consiste significativamente na natureza do produto. Assim, do ponto de vista econmico, esta tecnologia requer o desenvolvimento e a otimizao dos processos de recuperao e purificao de protenas para a indstria biotecnolgica (SEADER; HENLEY, 1998).

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3. OBJETIVOS

3.1 Geral Avaliar fungos isolados de torta de mamona quanto produo e recuperao de celulases.

3.2 Especficos Isolar, purificar e identificar fungos provenientes de torta de mamona; Caracterizar em meio slido as culturas de fungos isoladas quanto capacidade de degradar celulose; Selecionar as culturas com maior potencial de degradao, para produo de celulase; Produzir celulases por fermentao submersa utilizando como substrato a torta de mamona; Determinar a atividade celuloltica e contedo protico; Recuperar a enzima por sistema bifsico aquoso com Polietilenoglicol (PEG)-citrato.

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