AVALIAO DA PRODO DOS COMPOSTOS MAJORITRIOS DA FERMENTAO DE MOSTO DE UVA POR LEVEDURAS ISOLADAS DA REGIO DA SERRA GACHA (RS)

Deigo Rodrigues Marques, Ronaldo Shigueru Sasaki, William Takeshi Mada Reviso Bibliogrfica Resumo A qualidade sensorial do vinho o mais importante fator durante a sua fabricao. O aroma do vinho formado pela presena de compostos volteis que impressionam o sistema olfativo. Diferentes leveduras como as do gnero Saccharomyces, Kloeckera, Candida, Hansenula, Hanseniospora e Pichia entre outras, em conjunto com a Saccharomyces cerevisiae podem iniciar a fermentao do mosto de uva e dar origem ao vinho. Embora as leveduras no-Saccharomyces cerevisiae participem apenas do incio da fermentao, elas exercem grande contribuio para a qualidade do aroma do vinho pela capacidade de produzir steres e lcoois em concentrao superior s leveduras Saccharomyces cerevisiae. Introduo A complexidade do sector vitivincola decorre, desde logo, da multiplicidade de fatores que influenciam a produo e os mercados. Dos fatores naturais (o relevo, o solo, o clima, as variaes anuais, etc.) aos fatores humanos e histrico-culturais (a formao, as tradies e inovaes tcnicas, a adaptao de determinadas castas, os modelos de regulao das atividades econmicas, a evoluo dos gostos, etc.). Por outro lado, o sector vitivincola socialmente complexo, agregando uma pluralidade de agentes, com interesses, representaes e prticas diferenciadas, mais ou menos resistentes ou permeveis s inovaes, desde o pequeno viticultor, que trata da vinha e vende as uvas, at s grandes empresas exportadoras[7]. O sector vitivincola foi sempre um dos sectores agroindustriais mais marcados pela evoluo cientfica e tecnolgica, mas tambm pela tradio, adquirindo esta, por vezes, um carter de distino e prestgio. Nos tempos recentes, tem-se assistido a um forte investimento em projetos cientficos ligados ao vinho, na biotecnologia, na anlise qumica, na enologia, etc., a par da introduo de maquinaria cada vez mais sofisticada para grande parte das operaes de cultivo da vinha (desde a armao dos terrenos plantao e s operaes de tratamento e granjeio), bem como dos sistemas de vinificao (lagares robotizados, cubas de vinificao automatizadas, controlo de temperaturas, etc.)[7]. Sendo um dos produtos agroindustriais que mais precocemente, desde a Antiguidade, foram objeto de comrcio a longa distncia, o vinho tornou-se tambm um dos produtos mais marcados pela concorrncia nos mercados internacionais e por polticas de regulamentao da sua produo, transporte e comercializao. Nos nossos dias, o comrcio vincola dos mais globalizados, envolvendo interesses de grandes empresas transnacionais, com estratgias de gesto e marketing assentes na rapidez e controlo da informao sobre os mercados, campanhas publicitrias agressivas, redes de distribuio internacional, etc[7].

A produo brasileira de vinhos est concentrada no sul do pas. O Rio Grande do Sul o maior e o mais tradicional Estado produtor, com um volume anual variando entre 200 e 300 milhes de litros. Predominam os vinhos de uvas americanas e hbridas, chamados de vinhos comuns, que em 2002 representaram 89,13% do volume total elaborado[3]. A biotecnologia consiste no uso de sistemas celulares para o desenvolvimento de processos e produtos de interesse econmico ou social. Entre os sistemas celulares, os fungos so de grande interesse biotecnolgico. Talvez sejam eles dentre os seres vivos, os que mais tm contribudo com produtos e processos de importncia fundamental para o bem estar da populao[1]. O Brasil tem larga experincia na produo de lcool combustvel. O Programa Nacional do lcool desencadeado no final dos anos 70, decorrente da crise do petrleo, gerou uma srie de tecnologias prprias, tornando o nosso pas lder mundial nesse sentido. No poderia deixar de ocorrer, portanto, o desenvolvimento de processos visando produo de linhagens melhoradas da levedura Saccharomyces cerevisiae, responsvel pela produo de etanol. Linhagens mais produtivas, com caractersticas desejveis para produo de etanol e com monitoramento na indstria por tcnicas de marcao molecular, foram desenvolvidas em vrios laboratrios[1]. A uva a matria-prima utilizada na produo do vinho, uma bebida alcolica fermentada das mais antigas e de consumo mundial. Teoricamente, qualquer fruto ou vegetal que contenha umidade, acar e nutrientes para as leveduras pode ser utilizado como matria-prima para a produo de bebidas alcolicas fermentadas [6]. O bero da Pinot Noir a Borgonha, na Frana, onde utilizada para a elaborao de vinhos tintos de alto conceito. Tambm ocupa lugar de destaque na regio da Champagne, originando, juntamente com a Chardonnay, os famosos vinhos espumantes da regio. uma variedade precoce, de ciclo curto, e por isso muito difundida em vrios pases da Europa setentrional. Foi introduzida no Brasil h mais de setenta anos, permanecendo nas colees ampelogrficas das estaes experimentais. A difuso comercial da Pinot Noir, no Rio Grande do Sul, foi iniciada no final da dcada de 1970, sendo, aqui, utilizada para a elaborao de vinho tinto varietal e para vinhos espumantes[4]. A Chardonnay goza de renome internacional, especialmente pela qualidade dos vinhos que origina na Borgonha, assim como, pelos famosos espumantes elaborados na regio de Champagne, em corte com Pinot Noir. No Brasil tem sido usada para a elaborao de vinho fino varietal e tambm para vinhos espumantes. Variedade de origem francesa, possivelmente da Borgonha, a Chardonnay foi introduzida em So Roque, SP, em 1930, e no Rio Grande do Sul em 1948. A partir do final da dcada de 1970, por interesse do setor vitivincola, esta casta foi trazida de procedncias diversas e difundida na Serra Gacha, tanto pelos rgos de pesquisa como pela iniciativa privada[4]. Materiais e mtodos 1 Leveduras As leveduras Saccharomyces cerevisiae e a Kloeckera apiculata foram isoladas do bago de uva Chardonnay cultivada na regio da Serra Gacha (RS). As vrias colnias isoladas em placa de Petri contendo meio yeast malt (1% de glicose; 2% de gar; 0,5% de peptona; 0,3% malte e 0,3% de extrato de levedura) foram selecionadas com base em sua morfologia e repicadas novamente. Anlises microscpicas verificaram a

pureza do isolado. O isolado foi mantido em meio descrito acima com sucessivos repiques de 15 em 15 dias at a sua identificao. 2 Identificao das leveduras A identificao das duas leveduras foi realizada pela galeria ID 32 C (Biomeriux) segundo PINA & HOGG. Esta galeria padronizada para identificao de leveduras que utiliza mini-testes de assimilao padronizados e uma base de dados experimentais adaptada. A interpretao da leitura da galeria ID 32 C foi realizada pelo modo automtico mini-API (Biomeriux). 3 Avaliao fsico-qumica Os mostos puros Chardonnay e Pinot Noir sofreram a avaliao do contedo de acar, nitrognio amoniacal, SO2 livre e total, acidez voltil e total e valor de pH, bem como da estimativa da quantidade de lcool provvel de ser formada. Os dados da concentrao de acar e lcool foram obtidos pela relao com os valores da densidade calculada pelo densmetro Mustimetre Dujardin-Salleron (385200). O valor de pH foi medido em pHmetro(Metter Toledo 320- Tecnal). A concentrao de acidez voltil foi calculada pelo destilador Gilbertini (Distillatore Eletrnic Enochimic). O valor da concentrao da acidez total foi obtido por titulao de acordo com OUGH & AMERINE. A quantidade de SO2 livre e total foi obtida por uma adaptao do mtodo de RIBEREAU & PEYNAUD. A concentrao de nitrognio amoniacal foi obtida pelo mtodo de OUGH. 4 Condies de fermentao dos mostos Chardonnay e Pinot Noir Mostos de uvas Chardonnay e Pinot Noir, doados pela indstria Chandon do Brasil S/A, situada no Estado do Rio Grande do Sul (RS), foram usados para investigao da produo de aroma por duas leveduras durante uma fermentao de sete dias. A fermentao foi iniciada aps a adio de 1 x 107 clulas/mL (K.apiculata ou S. cerevisiae) em erlenmeyers de 125mL contendo 25mL de mosto. Antes de iniciar a fermentao os mostos foram filtrados em membrana (Millipore) de 0,22m. Os erlenmeyers tampados foram incubados a temperaturas de 20C e 15C, temperaturas as quais so as mais prximas das condies de fermentao para produo industrial de vinho. A cada 24 horas, um frasco, contendo 25mL de mosto fermentado foi filtrado em membrana (Millipore) de 0,22m. O filtrado foi recolhido e o seu pH determinado de acordo com o item 2.3. A concentrao celular, expressa em massa seca (MS), foi quantitativamente determinada atravs de secagem destas membranas a 100C, por 24 horas, e diviso pelo correspondente volume filtrado. As fermentaes foram realizadas em triplicatas. 5 Condies cromatogrficas para anlise dos compostos volteis a) Os compostos volteis foram isolados pelo sistema de Purge and Trap concentrator/DynamicHeadspace (G1900-60500), usando o polmero Tenax. As condies de isolamento e concentrao dos volteis foram: Temperatura da amostra: 30C; Tempo de purga: 15 minutos; velocidade de fluxo do gs de arraste: 30mL/min.; Temperatura de desoro: 180C; Tempo de desoro: 10min. A temperatura da linha de transferncia usada foi de 180C. b) O cromatgrafo gasoso HP-G 1908-60500 (FID) foi equipado com uma coluna capilar HP-Innowax (30m x 0,25mm x 0,25mm), de fase ligada polietilenoglicol. O gs de arraste utilizado foi o Hlio:1mL/min. A programao da temperatura da coluna foi:

35C/5 min., rampa: 3C/min. 140C 180C/5min., temperatura do detector: 250C, temperatura do injetor: 200C. O modo de injeo foi do tipo splitless. c) As anlises de identificao foram realizadas em um cromatgrafo gasoso Shimadzu (EM) QP 5000 (Espectrometria de massas). A programao da temperatura da coluna foi igual seqncia reportada acima, com exceo para o sistema de injeo, o qual foi utilizado o modo split (1:100). A voltagem de ionizao aplicada foi de 70eV e o espectro de massa obtido de uma faixa de varredura de 35-350m/z. A quantificao foi realizada pelo mtodo de padronizao externa usando grficos de padres de volteis correspondentes da Sigma-Aldrich e Merck. As anlises foram realizadas em triplicatas. Resultados e discusso Foram selecionadas leveduras e identificadas de acordo com sistema automtico mini-API ID 32 C as Saccharomycescerevisiae e Kloeckera apiculata. A intervalo de confiana da identificao do gnero dada pelo sistema automtico foi de 99,8% e 99,9% para a Saccharomyces cerevisiaee Kloeckera apiculata, respectivamente. As anlises fsico-qumicas dos mostos foram realizadas com o intuito de verificar se estes estariam com concentraes de acar, nitrognio, acidez, SO2 dentro de limites propcios para iniciar a fermentao. Os dados destas anlises esto apresentados na Tabela 1.

Uma fermentao de 25 a 55 dias necessita de uma concentrao de acar em torno de 150-240g/L e uma concentrao mnima de nitrognio da forma amoniacal em torno de 70-140mg/L. A presena de SO2, bem como sua quantidade, no mosto regula a atividade microbiana e impede o crescimento de alguns microrganismos. A quantidade de 1 a10mg/L de SO2 livre o suficiente para que no ocorra contaminao do mosto por bactrias lcticas durante a fermentao alcolica. O pH do mosto para produo de vinho espumante deve estar em torno de 3. Os mostos utilizados neste trabalho esto em condies propcias para iniciar a fermentao.[6] A variao da massa celular durante a fermentao a 20C dos mostos Chardonnay e Pinot Noir pela Kloeckera apresentou um rpido crescimento nas 72

horas iniciais da fermentao. A sua massa celular alcanou uma concentrao de 12,3mg/L (expressa em massa seca) em 168 horas de fermentao. No mosto Pinot Noir o comportamento da variao da massa celular foi muito similar. O perodo de maior crescimento aconteceu nas 72 horas iniciais da fermentao. Aps este perodo, houve um declnio da velocidade, correspondendo fase estacionria. Em 168 horas de fermentao, a concentrao celular obtida foi de 10,1mg/L

A variao da concentrao celular nos mostos Chardonnay e Pinot Noir fermentados a 20C com a Saccharomyces cerevisia mostrou um rpido crescimento nas 72 horas iniciais da fermentao no mosto Chardonnay, mas aps este perodo o crescimento praticamente estagnou. A concentrao celular de 12,4mg/L (expressa em massa seca) foi alcanada totalmente nas 72 horas iniciais da fermentao. A fermentao no mosto Pinot Noir pela Saccharomyces cerevisiae mostrou ser rpida e brusca nas 48 horas iniciais da fermentao. Aps este perodo o crescimento foi diminuindo at alcanar a fase estacionria, entre 144 e 168 horas de fermentao.

As leveduras do gnero Saccharomyces e Kloeckera atingem sua fase de maior crescimento nas 72 horas iniciais da fermentao.[7] O crescimento celular a 15C mostrou ser um pouco diferente da 20C. As concentraes celulares das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Kloeckera apiculata alcanadas aps 168 horas de fermentao a 15C foram menores e as fases exponenciais de crescimento foram lentas, acontecendo entre 72 e 96 horas de fermentao, assim a 15C, a fermentao mostrou ser mais lenta. As concentraes celulares mximas da levedura Kloeckera apiculata foram equivalentes tanto no mosto Chardonnay como no mosto Pinot Noir.

O isolamento dos volteis pelo sistema automtico Purge and Trap/Concentrator Dynamic Headspace mostrou que a tcnica foi muito eficaz para compostos de baixo ponto de ebulio. Segundo FERREIRA etal. [8] esta tcnica no sensvel para analisar compostos com ponto de ebulio mdio e alto. Por esta tcnica,

foi possvel isolar 22 compostos de aroma presentes nas amostras aps 168 horas de fermentao apresentada na tabela 2. A fermentao a 20C favoreceu a produo de uma maior concentrao dos compostos volteis majoritrios de aroma do que a fermentao realizada a 15C. Nas amostras de mosto de uva fermentado pela Kloeckera apiculata a 15C foram observadas as mais baixas concentraes de etanol em comparao s demais amostras. A fermentao realizada pela cultura pura de Kloeckera apiculata apresentava baixas quantidades de etanol, cerca de 6,5% (v/v). [4]

Concluso A Kloeckera apiculata produziu quantidades significantes de compostos importantes para a qualidade do vinho como o acetato de etila porem produo de etanol foi muito baixa, um ponto negativo para produo de vinho. Embora a produo de etanol pela Saccharomyces cerevisiae tenha sido alta, as produes de acetato de etila e acetato de isoamila foram baixas se comparadas com as amostras de mosto fermentado pela Kloeckera apiculata.

Bibliografia [1] AZEVEDO, J.L. Fungos Gentica e melhoramento de fungos na biotecnologia. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, n.1, p.12-15, 1997. [2] BORM, A. A histria da biotecnologia A cincia que est surpreendendo at os mais otimistas. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, n.34, 2005. [3] CAMARGO, U.A. Tecnologia vincola: novas variedades. X Congresso Brasileiro de Viticultura e Enologia, Bento Gonalves, p.127-128, 2003. [4] GERRA, C.C.; MANDELLI, F.; TONIETTO, J.; ZANUS, M.C.; CAMARGO, U.A. Conhecendo o essencial sobre uvas e vinhos. Bento Gonalves: Embrapa Uva e Vinho, p.22-23 e 25-26, 2009. [5] MAMEDE, M.E.O.; PASTORE, G.M.Avaliao de mosto de uva fermentado. Cinc. Tenol. Aliment., Campinas, v. 27, p.281-284, 2007. [6] MARTINELLI, F.A. 1983. Tecnologia de vinhos e vinagres de frutas. Departamento de Tecnologia Rural da ESALQ/USP. Piracicaba, So Paulo, 130 p. Monteiro, C.L.B. 1984. Tcnicas de avaliao. [7] PEREIRA, G.M. O vinho do Porto: entre o artesanato e a agroindstria. Resvista da Faculdade de Letras, Porto, III srie, v.6, p. 185-191, 2005.