Tcnicas de anlise de protenas

Estrutura secundria da enzima COMT

Fundamento e aplicao das tcnicas de anlise de protenas Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) Hibridao Western Electroforese bidimensional (2D-PAGE) Imunoprecipitao Sistema de dois hbridos em levedura Sistema de phage display Espectrometria de massa

Electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) (1)

A velocidade de migrao em campo elctrico depende da dimenso, forma e carga das molculas. Para a desagregao e desnaturao das protenas utiliza-se SDS, -mercaptoetanol ou DTT (agentes redutores) e calor. O SDS (detergente fortemente aninico) confere s protenas carga negativa.

SDS-PAGE (2)

Colorao do gel com azul de coomassie

Electrotransferncia de protenas

Hibridao Western (Imuno-hibridao) (1)

Em (A) e (B) foram utilizados anticorpos da distrofina diferentes.

A hibridao Western detecta protenas que foram separadas por electroforese em gel de poliacrilamida e transferidas para uma membrana.

Hibridao Western (2)

Esta tcnica permite detectar a presena ou ausncia de uma protena que reage com o anticorpo; determinar a sua dimenso e avaliar os nveis relativos de expresso em diferentes amostras. A dimenso da protena na amostra 5 diferente, talvez devido a modificao ps-traducional.

Electroforese bidimensional (2D-PAGE)

A pH elevado as protenas esto negativamente carregadas. A pH baixo as protenas esto positivamente carregadas.

Protenas bsicas pI intermdio

Protenas acdicas

Gel de focagem isoelctrica

Na anlise de proteomas a matriz de poliacrilamida com um gradiente de pH imobilizado (IPG) para haver maior reprodutibilidade nos resultados.

SDS-PAGE
O ponto isoelctrico (pI) a posico em que a carga da protena neutra relativamente ao pH local.

Poder de resoluo do gel bidimensional

A gama de pH mais estreita aumenta o poder de resoluo das protenas.

As imagens representam prrotenas do fgado de ratinho separadas por 2D-PAGE e coradas com nitrato de prata. No gel em que a gama de pH mais larga (3-12) a maioria das protenas esto concentradas no meio, reflectindo o facto de que a maioria das protenas tm valores de pI na gama 4-7. Uma protena pode ocorrer em diferentes posies num gel 2D, por exemplo como consequncia de diferenas na modificao ps-traducional.

Imunoprecipitao

Protenas radioactivamente marcadas so incubadas com um anticorpo, que forma complexos com a protena (o antignio) contra a qual dirigido. Estes complexos antignio-anticorpo so colhidos em esferas que se ligam ao anticorpo e isolados por centrifugao. As esferas so fervidas para dissociar os complexos, e as protenas recuperadas so analisadas por SDS-PAGE. A protena radioactiva que foi imunoprecipitada detectada por auto-radiografia.

Sistema de dois hbridos em levedura (1)

Fundamento

O sistema de dois hbridos em levedura permite detectar in vivo interaces protena-protena.

Figure 8-51. 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter..

Sistema de dois hbridos em levedura (2)

Fundamento: A protena alvo fundida com o domnio de ligao a DNA que a localiza na regio reguladora de um gene reprter, onde funciona como isco (bait). Quando esta protena alvo se liga a uma outra protena (presa, prey), no ncleo da clula, especificamente construda em fuso com o domnio de activao da transcrio, a sua interaco leva aproximao dos dois mdulos do activador transcricional, o que desencadeia a expresso do gene reprter. O gene reprter, em geral, permite o crescimento em meio selectivo (Ex.: gene His3). Tambm se utiliza como gene reprter lacZ. As protenas de fuso bait e prey so obtidas por tcnicas padro de DNA recombinante. Na maioria dos casos, uma nica protena bait utilizada para pesquisar outras protenas com as quais interage, partindo de um conjunto de protenas prey produzidas por ligao do DNA codificante do domnuio de activao de um activador transcricional a fragmentos de DNA de uma biblioteca de cDNA.

Sistema de dois hbridos em levedura (3)

Procedimento

Sistema de dois hbridos em levedura (4)

Os domnios do factor de transcrio no tm de estar covalentemente ligados, mas devem formar uma protena dimrica. Os factores de transcrio funcionais so detectados pela activao de um gene reprter.

Sistema de dois hbridos em levedura (5)

Os falsos positivos so devidos a: Autoactivao espontnea do gene reprter pelo bait ou pelo prey Interaco no especfica Interaco irrelevante porque ocorre entre protenas encontradas em compartimentos separados. Os falsos negativos so devidos a: Erros de PCR na produo de cDNA Condies no fisiolgicas, uma vez que o teste ocorre no ncleo e as protenas de outros compartimentos podem no adquirir a conformao ou a agregao correcta.

Vectores de clonagem utilizados no sistema de dois hbridos em levedura

Sistema de phage display (1)

O phage display uma forma de clonagem de expresso de genes estranhos em fagos. Os cDNAs so clonados de modo a expressar protenas estranhas na superfcie dos fagos, o que permite o estudo de interaces protena-protena in vitro.

O gene III codifica uma protena secundria da cpside do fago f1. O local de clonagem est situado na regio que corresponde extremidade N-terminal da protena codificada pelo gene III. Uma biblioteca fgica de expresso produzida a seguir transfeco de E. coli.

Sistema de phage display (2)

Os recombinantes com insertos na mesma fase de leitura do gene III originam protenas de fuso em que o componente N-terminal consiste na sequncia da protena estranha.

Sistema de phage display (3)

A purificao de afinidade utilizando um anticorpo especfico de uma das protenas estranhas permite a identificao de sequncias de cDNA que codificam a protena no caracterizada.

Sistema de phage display (4)

As bibliotecas de phage display so utilizadas na triagem de protenas ou pptidos com propriedades farmacolgicas, enzimticas ou antignicas.

A identificao de um pptido que se liga a um ligando pode ter utilizao directa na investigao de um agente teraputico ou fornecer informao acerca da sequncia parcial de uma protena maior de ligao ao ligando.

A era ps-genmica
Genmica o estudo de genomas completos. Genoma a informao gentica total numa clula particular ou organismo. Transcritmica o estudo do transcritoma. Transcritoma a populao de mRNAs expressos numa nica clula ou tipo de clula. Protemica o estudo do proteoma. Proteoma o conjunto completo de protenas codificadas pelo genoma.

Limitaes da genmica
O nmero de genes (ORFs) encontrados no genoma humano muito menor do que o nmero de protenas expressas (splicing alternativo, modificaes ps-traducionais, clivagem proteoltica) e por isso, necessria mais informao acerca das unidades funcionais da clula. O genoma na sua maioria esttico (numa gerao) enquanto o proteoma mais dinmico ciclo celular, desenvolvimento, resposta ao ambiente. Os nveis de mRNA, em geral, no tm correlao com os nveis de expresso proteica (diferente estabilidade dos mRNAs e diferentes eficincias de traduo). A maioria das modificaes ps-traducionais vulgarmente observadas nas protenas no podem ser estudadas ou previstas com rigor a partir do genoma.

Espectrometria de massa
A espectrometria de massa uma tcnica poderosa que permite determinar a massa molecular de protenas/pptidos e a sequncia de aminocidos. Esta informao utilizada para identificar a protena, pesquisando bases de dados de sequncias de nucletidos e de protenas. Tambm utilizada para determinar o tipo e localizao das modificaes ps-traducionais das protenas.

Espectrmetro de massa
A maioria dos espectrmetros de massa possuem:
Uma fonte de ionizao (produz ies molculas carregadas) Um ou mais analisadores de massa (separa os ies) Um detector (conta ies)

Sistema de vcuo Amostras 2-DE Fonte de ionizao Analisador de massa Detector Sistema de recolha de dados

Minimiza colises, interferncias

Espectrometria de massa em tandem

Genetics From Genes to Genomes

Anlise da expresso gnica

Os parmetros importantes na expresso gnica so o material de estudo, a resoluo da expresso e a eficincia (o nmero de genes/protenas que podem ser analisados de uma s vez).

Da protena ao gene e do gene protena (1)

O conhecimento da biologia molecular das clulas torna experimentalmente possvel partir do estudo do gene para a protena e da protena para o gene.
Uma pequena quantidade de protena purificada utilizada para se obter uma sequncia parcial de aminocidos. Esta informao permite identificar o gene correspondente numa biblioteca de DNA. Uma vez clonado o gene, a sequncia codificante da protena pode ser inserida num vector de expresso de modo a produzir grandes quantidades da protena a partir de clulas obtidas por engenharia gentica.

Da protena ao gene e do gene protena (2)

Engenharia de protenas

Alterao da composio de bases e/ou dos codes do gene para melhorar a sua expresso. Introduo de alteraes especficas na sequncia de DNA para melhorar as caractersticas da enzima (aumentar a especificidade pelo substrato). Produo de protenas totalmente novas.