Modelado de la germinacin de esporas de hongos en condiciones de temperatura constante y variable

Abstracto La germinacin de las esporas de Penicillium expansum y Aspergillus niger se control microscpicamente en agar extracto de malta en condiciones isotrmicas que va de 0 a 33 C y de 5 a 41,5 C, respectivamente. Los datos de germinacin obtenidos, expresados como porcentaje de germinacin (% P) en funcin del tiempo, se ajustaron a la ecuacin de Gompertz modificada para la estimacin de los parmetros de la germinacin cintica (tiempo de retraso, (g), y la tasa de germinacin, (g)) , que se modelaron ms en funcin de la temperatura mediante el uso de modelos con el cardenal de inflexin (CMI). El efecto de la temperatura sobre estos parmetros fue similar a la reportada para la cintica de crecimiento del micelio de las cepas analizadas. La germinacin de las esporas tambin se estudi en diversas dinmicas de tiempo-temperatura incluyendo las condiciones de los cambios de temperatura individual o secuencial. La germinacin de las esporas en los cambios de temperatura se previ utilizando la ecuacin de Gompertz modificada en conjunto con los modelos de CMI para (g) y (g) y se basa en el supuesto de que i) un cambio de temperatura no da lugar a ningn adicional (g ) y, por tanto, el retraso total se puede calcular mediante la adicin de las partes relacionadas del tiempo de demora, y ii) despus de un cambio de la temperatura de la tasa de germinacin (g) se adapta instantneamente a la nueva temperatura. La comparacin entre estas previsiones y los datos observados muestran que la germinacin de las esporas es fuertemente afectada por la medida del cambio de temperatura, el porcentaje de esporas germinadas en el momento del cambio y de las especies de hongos. Ms all del inters cientfico en la comprensin de la dinmica de la germinacin de las esporas, los modelos desarrollados en este estudio pueden ser utilizados como herramientas en sistemas eficaces de gestin de calidad para el control de hongos en los alimentos. 1. Introduccin Germinacin de esporas es Una Etapa Esencial en El Desarrollo del Ciclo de Vida de Todos los Hongos filamentosos (d'Enfert, 1997). La germinacin de fungalspore Una es Una Reaccin fisiolgica de Una Clula en Reposo Al Estilo de modificacion de las CONDICIONES Ambientales y CONSTA de dos Fases distinguido (Gervais et al., 1988).El Primer Paso Incluye la conversin de la espora de Descanso, Cuya latencia es Controlada Por La Presencia Internacional de los bloques metablicos, Las Barreras de Penetracin de los Nutrientes, los inhibidores de S Mismo y Bajo Contenido de Agua y los genes defectuosos ([Gervais et al., 1988], [Nielsen, 1992] y [Osherov y mayo de 2001]), en la ONU Activo. Un Perodo de hinchazn gradual del aumento de esporas de Como En El Dimetro y la BIOMASA es la Siguiente. Despues de la ONU tiempo determinado, CUANDO SE Inicia la Segunda Fase, la polaridad S establece el pecado y el pecado Crecimiento tubo germinativo emerge de la espora Ampliada ([d'Enfert, 1997] y [Nielsen, 1992]). El tubo germinativo Si es tan largo al Menos Como El ancho de la Mayor Dimensin de la espora hinchada, EL sporeis considerar Que germinaron (Dantigny et al., 2006). Este tiempo de germinacin puede Servicios definida de Como El Lmite Entre la germinacin y El Crecimiento vegetativo convertir Que El Tubo germinativo en elongacin y ramificacin Una micelio (d'Enfert, 1997). Despues de la Contaminacin de Alimentos Con fungalspores y si las adecuadas CONDICIONES Hijo, la Aparicin de micelio visible DEPENDE del tiempo sporegermination y la TASA de Crecimiento del micelio (Gougouli y Koutsoumanis, 2010). En Situaciones reales, la Contaminacin de Alimentos Con fungalspores ocurre generalmente en las Naciones, Unidas Nmero Muy bajo (Dantigny et al., 2007), y la probabilidad de germinacin Que Su S traducir en la ONU Producto en mal Estado o la Produccin de micotoxinas en El Momento del CONSUMO DEPENDE en Gran Medida en la Palabra la palabra capacidad, de las esporas Contaminantes prrafo germinar, asi de como de Sobre la Cintica de Su germinacin. Por Lo Tanto, COMO SE ha comentado Por Varios Investigadores ([Dantigny et al., 2002], [Gougouli y Koutsoumanis, 2010] y [Samapundo et al., 2007]) El Desarrollo de Modelos Matemticos, Que Hijo capaces de predecir deEl Crecimiento de Hongos sporegerminationand, es de gran Importancia. Un Esfuerzo Importante Para El Desarrollo de Modelos predictivos Para El Crecimiento de deterioro y / u Hongos micotoxignicos S ha Hecho DURANTE La ltima Dcada y Que todavia est en Marcha ([Dantigny et al., 2006], [Dantigny et al., 2007] y [Garca et al., 2009]). En Contraste Con El aumento del Nmero de Estudios Sobre el Crecimiento del micelio radial, los Datos Disponibles Sobre la Cintica de la germinacin de las esporas Hijo limitados. En Los Ultimos Aos, embargo de Pecado, la necesidad de Que la Cintica de modelinggermination ha Sido reconocido Cada Vez Ms ([Dantigny et al., 2006] y [Dantigny et al., 2007]). Los Modelos Ms utilizados Principales Hijo la logstica y los Modelos de Gompertz modificada (Garca et al., 2009), Que fuern construdos principalmente predecir El prrafo de El Crecimiento bacteriano ([Whiting y Call, 1993] y [Zwietering et al., 1990 ]), Mientras Que SLO UNOS Pocos Estudios Han Tratado de desarrollar Nuevos Modelos ([Bosch et al., 1995] y [Gervais et al., 1988]). Modelos Primarios cuantificar El porcentaje de germinacin de esporas de Una Poblacin en FUNCIN del tiempo en CONDICIONES de Estado ESTACIONARIO. Ests Modelos pueden proporcionar Informacin til ACERCA de la Variacin del tiempo de germinacin de esporas Individuales. Ms Cuanto empinada mar de La Curva de la germinacin, Menor es la varianza. Las diferencias en La Pendiente de la Curva de la germinacin en S debe al Hecho de Que Cada espora Por S caracteriza pecado tiempo de germinacin individuales (Dantigny et al., 2006), y podria atribuirse al Estilo de Existencia de los inhibidores de S Mismo Que impiden la germinacin prematura y Rpida de Todos los de Las esporas, al Mismo Tiempo (Barrios-Gonzlez et al., 1989). Por Lo Tanto, El Tiempo de germinacin de la espora no es pecado valor Fijo y Se Puede caracterizar Por Una Mejor Distribucin de probabilidad. Por Otra Parte, heno Datos de Investigacin Que indica Que Mas los estresantes del Medio Ambiente, El alcalde es la Variacin del tiempo de germinacin en S convierte en ([Huang et al., 2010], [Judet et al., 2008] y [Samapundo et al., 2007]). Con El Fin de cuantificar El Impacto de los Factores abiticos Sobre el tiempo de germinacin, los Modelos secundarios pueden utilizados Servicio. Aunque los Datos de numerosos Trabajos de Investigacin demuestran la gran Influencia de las CONDICIONES Ambientales en El Tiempo de germinacin y en Otros parametros cinticos, especialmente la Actividad del Agua y la Temperatura ([Casals et al., 2010], [Dantigny y Nanguy, 2009], [Gervais et al., 1988], [Sautour et al., 2001] y [Schubert et al., 2010]), SOLO UNOS Pocos Estudios Han Tratado de expresar este Con Influencia en Trminos cuantitativos es Decir, los ModelosMatemticos ([Halouat y Debevere, 1997], [Li et al., 2003], [Pardo et al., 2006] y [Schubert et al., 2010]). Todos los Modelos Disponibles en sporegermination Han Sido desarrollados y validados Sobre la Base de Datos de constantconditions. Los Factores Ambientales, el embargo de Pecado, y en especial la Temperatura de almacenamiento, usted puede fluctuar DURANTE la Distribucin, almacenamiento y venta al Por Menor Nacional de Alimentos ([Giannakourou et al., 2001], [Giannakourou et al., 2005] , [Koutsoumanis, 2001], [et al Koutsoumanis., 2010] y [Laguerre et al., 2002]). Si AEE fluctuaciones ningun Hijo tomados en Cuenta DURANTE la Validacin de las Naciones, Unidas Modelo, Su USO En Un Sistema de aseguramiento de la Calidad Puede Llevar la ONU Decisiones equivocadas. De Hecho, El Comportamiento de las CONDICIONES de Temperatura esporas de Hongos en Cambio, sin pesar del Creciente INTERS Cientfico en ESTA direccin, no ha investigado en S. Por Lo Tanto, existe la necesidad de Estudiar y modelingsporegermination en Situaciones reales de COMO CONDICIONES de Temperatura Dinmico ([Dantigny y Nanguy, 2009] y [Garca et al., 2009]). Teniendo en Cuenta Lo anterior, los Objetivos del Presente Estudio fuern: i) Estudiar y modelar El Proceso de germinacin de Penicillium expansum y Aspergillus nigerspores en CONDICIONES de Temperatura Constante, ii) investigar El Efecto de los Cambios de Temperatura Sobre la germinacin de los Hongos Anteriores, y iii) evaluar la Palabra la palabra capacidad, de los Modelos Derivados de predecir la germinacin de fungalspores en la Temperatura Dinmico CONDICIONES.

1.

Materiales y mtodos 2.1. Cepas de hongos y preparacin de los inculos P. expansum (cepa PE-YV1) y A. niger (cepa AN-YV7) examinados en este estudio fueron aislados del medio ambiente de una unidad de produccin de yogur. Los aislamientos anteriores, que se depositan en la coleccin de cepas del Laboratorio de Microbiologa de Alimentos e Higiene de la Universidad Aristteles de Tesalnica, se mantuvieron en agua destilada estril que contiene 0,1% (v / v) un agente humectante (Tween 80, Merck, Darmstadt, Alemania ) a 5 C y se subcultivaron cada dos meses. P. expansum y A. niger se cultivaron a 25 C en agar extracto de malta (MEA, LAB M Limited, Lancashire, Reino Unido) durante 7 das y 5, respectivamente, para obtener cultivos de gran esporulacin. Las esporas fueron suspendidas en agua destilada estril que contiene 0,1% (v / v) de Tween 80 raspando suavemente la superficie del medio con una esptula estril. Despus de filtrar suspensiones de las esporas a travs de cuatro capas de tejido estril mdica (Aseptica, Atenas, Grecia), sus concentraciones finales fueron evaluados utilizando una cmara de recuento Neubauer (Precicolor, HBG, Alemania). Debido al hecho de que fungalspores puede hinchar el momento en que se suspenden en solucin acuosa, cada una suspensin de esporas de cada una de las especies de hongos prueba fue diluido en solucin de Ringer (Laboratorio de M Limited) para obtener un recuento de inculo de aproximadamente 107 esporas / ml , y se utiliza lo ms rpidamente posible. El procedimiento utilizado para la recogida de esporas tiene la ventaja de la evaluacin estandarizada suspensiones de esporas. 2.2. Medio El medio de crecimiento estndar que se utiliza en todos los experimentos se MEA, que se acidifica con un 10% (v / v) de cido lctico (Fluka, Buchs, Alemania) a un pH de 4,2. Medio de autoclave (20 ml) se verti en 90 mm de dimetro placas de Petri estriles de plstico y se utiliza para la inoculacin de inmediato. Las mediciones de la actividad del agua de las muestras de agar inoculado en el momento del tratamiento inicial y final se realiza mediante un medidor de actividad de agua AquaLab (serie Model 3, dispositivos Decagon, Inc., Pullman, WA, EE.UU.). Los valores de actividad de agua para cada tratamiento se mantuvo constante durante el perodo de almacenamiento, siendo 0,997 a 25 C. El pH del agar antes de la inoculacin, se determin a 25 C usando un medidor de pH con un electrodo de vidrio (pH 211 microprocesadores, Hanna Instruments BV, Ijsselstein, los Pases Bajos). 2.3. La germinacin de estudio Porciones (100 l) del inculo (P. expansum o A. niger), que contiene aproximadamente 106spores, fueron chapados en superficie asptica de MEA. Despus de la inoculacin, las placas fueron selladas con parafilm, para evitar la prdida de humedad, y se almacenan en condiciones controladas de almacenamiento isotrmico de alta precisin ( 0,2 C) a baja temperatura incubadoras programables (modelo 153 MIR, Sanyo Electric Co., Ora-Gun, Gunma, Japn), que se fija en 0, 5, 10, 15, 20, 25, 27.5, 30 y 33 C para P. expansum y en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40 y 41,5 C de A. niger. La temperatura durante los experimentos se monitoriz utilizando los registradores de datos electrnicos (cox marcador, Tecnologas de Cox, Belmont NC, EE.UU.) con los sensores internos y externos de control de la temperatura de la incubadora y medio, respectivamente. Los experimentos se llevaron a cabo durante un mximo de 90 das. Para el estudio de la germinacin, a intervalos regulares de tiempo durante el almacenamiento, en funcin de la temperatura de incubacin, tres trozos de agar pequeo (10 x 10 mm) de diferentes placas de Petri, se extrajeron aspticamente con un escalpelo y se transfiere a portaobjetos. Un cubreobjetos fue colocado sobre cada pieza y, a fin de que la germinacin de las esporas individuales a ser examinados, un microscopio z motorizados (Olympus, BX61, Tokio, Japn) fue utilizado, que fue operado en el modo de contraste de fases con objetivo de 40 ( Olympus). Una cmara de alta resolucin del dispositivo (Olympus DP71) fue montado en el microscopio para ajustar las imgenes, que fueron analizados por el software de anlisis de imgenes Image-Pro Plus versin 6.3 (MediaCybernetics Inc., Bethesda, MD, EE.UU.). Las esporas se considera que ha germinado cuando la longitud del tubo germinativo fue mayor o igual que la mayor dimensin de las esporas hinchada (Dantigny et al., 2006). El nmero de esporas por campo microscpico a un promedio de 30 10. En total, ms de 450 esporas (150 esporas por unidad x 3 piezas) se observaron en todos los ensayos, con el nmero total y el nmero de esporas germinadas se cont con regularidad.

2.4. Desarrollo de modelos para el efecto de la temperatura sobre la germinacin de las esporas El porcentaje de esporas germinadas se calcul como P (%) = (esporas Ngerminated / esporas nTotal) x 10. Para cada cepa de hongos y la temperatura de almacenamiento, los datos de P (%) con el tiempo se ajustaron a la ecuacin de Gompertz modificada (Ec. (1)) para la estimacin de los parmetros de la germinacin cintica(g and g): .. 2.5. Validacin de la germinacin en condiciones dinmicas Los datos de germinacin observado en condiciones isotrmicas se utilizaron para disear los experimentos para el control de la germinacin de las esporas bajo condiciones no isotrmicas. Los escenarios de temperatura y tiempo estudiados incluyen cambios bruscos de temperatura individual o secuencial, antes o despus de la aparicin del tubo germinativo. Para estos experimentos, las incubadoras de alta precisin programables (modelo MIR 153) fueron utilizados. La fluctuacin de tiempotemperatura protocolos examinarse en este contexto se registraron electrnicamente usando cox marcador registradores de datos con el control de la temperatura interna y externa de sensores de la incubadora y agar, respectivamente. No se observaron diferencias significativas entre la temperatura de la incubadora y la temperatura media para todos los perfiles de la prueba. 3. Resultados y discusin 3.1. Los experimentos en constanttemperatureconditions En la primera parte del estudio el objetivo fue determinar y modelar la influencia de la temperatura sobre la germinacin de P. expansum y A. nigerspores. Todos los experimentos en esta parte se llevaron a cabo en constanttemperatureconditions. Las curvas de germinacin se generaron sobre la base de las distribuciones de frecuencia acumulada de los tiempos de germinacin de cada aislamiento y el estado examinado y que se ajustaron ms a la ecuacin de Gompertz modificada. Como se muestra en la fig. 1 la ecuacin modificada de Gompertz describe satisfactoriamente el porcentaje de esporas germinadas en el tiempo tanto para los hongos ensayados, con coeficientes de determinacin (r2) que van desde 0,932 hasta 0,999 y 0,915 a 0,995 de P. expansum y A. niger, respectivamente. La capacidad de la ltima ecuacin para describir sporegermination ha sido previamente demostrada por varios hongos ([Abellana et al., 1999], [Huang et al., 2010], [Judet et al., 2008], [Pardo et al. 2004], [Pardo et al., 2006] y [Schubert et al., 2010]). La germinacin g parmetros cinticos y mg de P. expansum y A. niger a las temperaturas de almacenamiento diferentes pruebas se muestran en la Tabla 1. El efecto de la temperatura sobre estos parmetros fue similar a la observada en la cintica de crecimiento del micelio (Gougouli y Koutsoumanis, 2010) con la g y 1/g siguiendo una tendencia parablica. La germinacin ms rpida de P. expansum se observ a temperaturas entre 20 y 27,5 C, mientras que el proceso de germinacin

es muy lenta a 0 C, donde el 1/g mg y fueron 20 veces inferiores a los estimados en la temperatura ptima (Tabla 1 ). A la temperatura mxima ensayada en la que germinationwas observado (30 C), los parmetros g y g eran casi la misma que la observada a 15 C. Una tendencia de la temperatura dependencia similar se obtuvo para los parmetros de nigergermination A., pero con la germinacin ptima se observ a 35 C y temperaturas de prueba mnima y mxima para la germinacin de 10,5 y 41,4 C, respectivamente. Los resultados anteriores estn de acuerdo con estudios anteriores, que informaron el efecto significativo de la temperatura y otros factores abiticos sobre sporegermination por varios hongos incluyendo Trichoderma atroviride (Schubert et al., 2010), amstelodami Eurotium, chevalieri E., E. Herbariorum (Abellana et al., 1999), Monilinia spp. (Casals et al., 2010), Trichoderma viride, Penicillium roqueforti (Gervais et al., 1988), Aspergillus y Penicillium spp. (Marn et al., 1998), as como A. ochracheus (Pardo et al., 2004). Un intento de investigar la relacin entre mg y 1/g mostr una correlacin lineal con la g de productos g siendo relativamente constante para todas las temperaturas ensayadas (Fig. 2). La producto se ha utilizado ampliamente en estudios de cintica bacteriana para caracterizar el estado fisiolgico de las clulas bacterianas ([Baranyi y Roberts, 1994], [Baranyi et al., 1995], [Gougouli et al., 2008], [Koutsoumanis et al., 2006] y [Pin et al., 2002]). En el caso de las bacterias, el significado biolgico de (tasa de crecimiento de la poblacin) es diferente que en la cintica de la germinacin. El g parmetro determina la pendiente de la distribucin de frecuencias acumuladas de los tiempos por ciento de germinacin de las esporas de un solo e indica la tasa de germinacin por ciento en una poblacin de esporas. Datos de la investigacin indican que el aumento de la desviacin estndar de esta distribucin es similar a la disminucin de la pendiente de la distribucin construidas acumulada (Judet et al., 2008). Por lo tanto, la g se relaciona con la variacin de los tiempos sporegermination sola. Una relacin lineal entre mg y muestra 1/g que cuanto mayor sea el tiempo de inicio de la germinacin, mayor ser la distribucin de los tiempos de germinacin se hace. Los valores constantes de la g de productos g observado en este estudio para que las esporas de las condiciones de esporulacin mismo, la edad y el tratamiento, independientemente de la temperatura durante la germinacin, indica que este producto podra ser utilizado como un ndice de potencial del estado fisiolgico de las esporas de los hongos , que caracterizan el tiempo requerido por una poblacin de esporas tanto para iniciar y completar la germinacin. La validez de este ndice, sin embargo, debe ser confirmada con estudios sobre la germinacin de las esporas con diferentes estados fisiolgicos, como la edad diferentes, la esporulacin y la esporulacin post-condiciones o el nivel de re-hidratacin. El efecto de la temperatura sobre los parmetros de la germinacin (mg y g) se model utilizando el CMI propuesto por Rosso et al. (1993). Este modelo ha sido ampliamente utilizado para describir el efecto de factores ambientales sobre la cintica del crecimiento bacteriano y el crecimiento del micelio radial ([Catadores et al., 1997], [Gougouli y Koutsoumanis, 2010], [Panagou et al., 2003], [Sautour et al., 2001] y [Tassou et al., 2007]). Para fungalsporegermination, sin embargo, estudios ms disponible describir el efecto de factores ambientales utilizando modelos polinmicos ([Halouat y Debevere, 1997], [Li et al., 2003], [Pardo et al., 2006] y [Schubert et al. 2010]). A pesar de la popularidad de los modelos polinomiales, asociado con el hecho de que son relativamente fciles de ajustar a los datos experimentales mediante regresin lineal mltiple y permitir que prcticamente ninguno de los parmetros ambientales y sus interacciones para tener en cuenta, tambin tienen propiedades, como la inclusin de los coeficientes de muchos de ellos sin interpretacin biolgica, que limitan su utilidad como secundario modelos de prediccin (Ross y Dalgaard, 2004). Por el contrario, todos los parmetros del modelo de CMI se puede considerar que son biolgicamente interpretable ([Catadores et al., 1997] y [Ratkowsky, 2004]) y proporcionar estimaciones de los valores ptimos, mnimos y mximos de los parmetros ambientales probadas, que no son fciles de determinar experimentalmente (Dantigny, 2004). Las curvas de ajuste de los modelos de CMI a la observada mg y 1/g de P. expansum y A. niger se presentan en la figura. 3. El modelo ajustado y los datos observados para los dos hongos ensayados. La estimacin de los valores de los parmetros cardinales y las estadsticas de los accesorios se presentan en la Tabla 2. Los valores estimados de los parmetros cardinales para ug estaban cerca de los valores respectivos de 1/g (Tabla 2) indicando dependencia de la temperatura similar entre ellos. Esto ha sido reportado en el crecimiento del micelio (Gougouli y Koutsoumanis, 2010). Adems, la temperatura ptima (Topt) para la germinacin fue similar a la de crecimiento del micelio, inform Gougouli y Koutsoumanis (2010) para los aislamientos mismos hongos. Por el contrario, la regin de la germinacin (Tmax - Tmin) result ser ligeramente ms ancho en comparacin con la regin el crecimiento del micelio. Esto se puede atribuir al hecho de que en condiciones cercanas a las fronteras de germinacin de las esporas pueden germinar, pero no son capaces de formar un micelio. Este ltimo fue confirmada en el presente estudio y el estudio de Gougouli y Koutsoumanis (2010).