Msuri pentru protecia muncii i asigurarea securitii n laboratoarele de biochimie..............................................................................................5 Recoltarea sngelui..........................................................................................................7 Condiii de recoltare......................................................................................................7 Recoltarea sngelui capilar............................................................................................

8 Recoltarea sngelui venos.............................................................................................9 Condiiile de conservare a probelor recoltate................................................................9 Obinerea plasmei i a serului......................................................................................10 Prepararea soluiilor procentuale molare, normale..................................................10 Noiunea de pH..............................................................................................................15 Ionizarea apei i produsul ionic al apei...................................................................15 Scara de pH..............................................................................................................16 Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici .................................16 Demonstrarea capacitii de tamponare:..................................................................18 Determinarea colorimetric a pH-ului prin metoda cu soluii tampon........................19 Volumetrie......................................................................................................................20 Principiile analizei volumetrice ..............................................................................20 Clasificarea metodelor volumetrice.........................................................................21 Calcule n analiza volumetric................................................................................22 Tehnica titrrii.........................................................................................................22 Erorile determinrilor volumetrice..........................................................................23 Surse de erori...........................................................................................................23 Acidimetria volumetric..............................................................................................25 Titrri acido-bazice..................................................................................................25 Titrarea unui acid tare cu o baz tare.......................................................................25 Determinarea factorului unei soluii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluii etalon..26 Dozarea unei soluii de NaOH cu soluia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut............27 Dozarea amoniacului prin diferen........................................................................28 Titrarea unui acid slab cu o baz tare......................................................................28 Aplicaie: Dozarea acidului lactic cu o soluie titrat de NaOH.............................29 Titrarea unei baze slabe cu un acid tare...................................................................30 Oxidimetria volumetric..............................................................................................31 Permanganometrie.......................................................................................................32 Stabilirea factorului soluiei de KMnO4 0,1N.........................................................32 Determinri permanganometrice n mediu acid......................................................33 Dozarea acidului oxalic (micrometod)..................................................................33 Dozarea apei oxigenate (macrometod)..................................................................34 Iodometrie....................................................................................................................35 Dozarea substanelor reductoare............................................................................36 Stabilirea factorului soluiei de Na2S2O3 0,01 N...................................................36 Dozarea substanelor oxidante.................................................................................37 Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometod).................................................................37 Dozarea K3[Fe(CN)6] (micrometod).....................................................................37 Complexometria volumetric......................................................................................38 Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometric (metoda Budesinsky)...............................................................................................40 Volumetria prin reacii de precipitare..........................................................................42 Dozarea clorurilor prin metoda Volhard.................................................................43 Identificarea glucidelor.................................................................................................44 Reacii de reducere..................................................................................................44 1

Identificarea dizaharidelor.......................................................................................51 Identificarea polizaharidelor....................................................................................52 Identificarea glucidelor.................................................................................................53 Identificarea aminoacizilor i proteinelor...................................................................54 Reacii de culoare ..................................................................................................54 Reacii de precipitare ale proteinelor...........................................................................58 Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Srensen.........61 Identificarea nucleoproteinelor....................................................................................63 Vitamine.........................................................................................................................64 Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografic................................................64 Dozarea iodometric a acidului ascorbic din urin (metoda Palladin).........................................................................................................66 Enzime............................................................................................................................67 Influena concentraiei substratului asupra vitezei de reacie enzimatic........................................................................................69 Determinarea constantei lui Michaelis pentru ureaz..................................................70 Determinarea activitii catalazei sanguine.................................................................73 Determinarea activitii transaminazelor (metoda colorimetric cu 2,4-dinitrofenilhidrazin)...................................................74 Determinarea activitii fosfatezei alcaline (Metoda Bodansky).....................................................................................................78 Explorarea echilibrului acido-bazic.............................................................................83 Determinarea rapid a rezervei alcaline (bicarbonat actual)...................................84 Metoda Astrup.........................................................................................................85 Ioni anorganici...............................................................................................................85 Determinarea potasiului seric......................................................................................85 Dozarea flamfotometric a potasiului seric.............................................................87 Dozarea calciului i magneziului.................................................................................88 Dozarea calciului.....................................................................................................88 Determinarea cationului calciu n snge..................................................................89 Dozarea calciului prin metoda permanganometric................................................91 Dozarea calciului prin metoda complexonometric................................................92 Dozarea magneziului prin metoda Mann i Yoe.....................................................94 Dozarea ionului de clor din ser prin metoda Schales............................................................................................................97 Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificat)................................................98 Dozarea fosfatului anorganic din ser prin metoda Briggs ( cu deproteinizare)..........................................................................100 Compui organici.........................................................................................................103 Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl.................................................103 Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului.........................................106 Electroforeza proteinelor serice ................................................................................109 Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl.........................................113 Dozarea ureei din ser prin metoda cu ureaz.............................................................115 Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski............................................................116 Dozarea acidului uric din ser.....................................................................................119 Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin...........................................................121 Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecia van den Bergh......................................123 Glucoza......................................................................................................................125 Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetric)..................125

Dozarea glucozei prin metoda enzimatic (glucozoxidaz)..................................130 Teste rapide pentru determinarea glicemiei...........................................................132 Alte tehnici de determinare a glicemiei n laborator.............................................134 Dozarea beta-lipoproteinelor dup Burstein.............................................................135 Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatic....................................137 Dozarea colesterolului total i liber...........................................................................138 Obinerea, purificarea i identificarea lecitinei (glbenu de ou).............................140 Hemoglobina.............................................................................................................143 Dozarea hemoglobinei in snge ( metoda Drabkin)..............................................143 Dozarea hemoglobinei sub form de oxihemoglobin.........................................144 Analiza urinei...............................................................................................................144 Examenul fizic al urinei.............................................................................................145 Examenul chimic al urinei.........................................................................................148 Analiza compuilor patologici din urin...................................................................149 Identificarea proteinelor urinare............................................................................149 Evidenierea puroiului...........................................................................................152 Identificarea glucidelor urinare.............................................................................152 Identificarea corpilor cetonici urinari....................................................................157 Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici................................................159 Identificarea acizilor biliari...................................................................................159 Identificarea pigmenilor biliari urinari.................................................................160 Identificarea urobilinogenului i stercobilinogenului............................................161 Identificarea sngelui.............................................................................................162 Teste rapide de diagnostic din urin..........................................................................163 Test rapid de sarcin..................................................................................................163 Analiza de laborator a urinei.....................................................................................164 Determinri n urina din 24 de ore.............................................................................164 Dozarea clorurilor din urin (metoda Mohr).........................................................164 Dozarea acidului uric din urin.............................................................................165 Dozarea creatininei din urin ................................................................................166 Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal.......................................166 Analiza calculilor urinari...........................................................................................167 Identificarea unor componeni prin reacii specifice:............................................168 Analiza salivei..............................................................................................................169 Identificarea unor componeni ai salivei...................................................................169 Determinarea pH-ului i a capacitii tampon a salivei.........................................171 Analiza sucului gastric................................................................................................172 Determinarea aciditii gastrice.................................................................................172 Analiza lichidului cefalorahidian...............................................................................174 Examenul fizic...........................................................................................................175 Examenul chimic al lichidului cefalorahidian...........................................................175 Analiza scaunului.........................................................................................................176 Metode fizice de analiz folosite n laborator...........................................................178 Fotometria.................................................................................................................178 Spectrofotometru Spekol ......................................................................................180 Spectrofotometrul de absorbie atomic....................................................................182 Spectrofotometrul de absorbie atomic................................................................183 Flamfotometria..........................................................................................................184 Fotometrul cu flacr (flamfotometrul).................................................................184 Poteniometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi............................................186

Msurarea pH-ului cu electrodul de sticl.............................................................186 Valori patologice de laborator care amenin viaa.................................................187 Limitele valorilor normale.........................................................................................187

Msuri pentru protecia muncii i asigurarea securitii n laboratoarele de biochimie

1. ntregul personal i studenii, trebuie s cunoasc i s respecte regulile de protecia muncii i asigurarea securitii, pentru prevenirea accidentelor de munc. 2. Tot personalul care lucreaz n laboratoarele de analize biochimice este obligat s poarte halate curate. 3. Aparatele electrice (centrifug, termostate, frigidere, spectrofotometru etc.) trebuie s aib prizele mpmntate i izolare electric perfect. Fixarea lor n priz se face numai cu mna uscat. 4. nainte de nceperea oricrei lucrri de laborator trebuiesc nsuite tehnic problemele teoretice. 5. Toate reaciile chimice se execut n conformitate cu condiiile prescrise (cantitatea, concentraia, vesela, etc.). 6. Masa de lucru se pstreaz ntr-o ordine i curenie exemplar. 7. Nu se execut nici o operaie n vase murdare. 8. Dup ntrebuinare toate vasele de laborator se spal cu ap de robinet i cu ap distilat. 9. Nu se aglomereaz masa cu vase i aparate inutile, pe mas se pun numai reactivii i vesela necesar pentru lucrarea respectiv. 10. Sticlele cu reactivi s fie ntotdeauna nchise cu dop. Dac se folosesc diferii reactivi trebuie avut grij s nu se schimbe dopurile. Excesul luat dintr-un reactiv nu trebuie turnat napoi n sticl. 11. ncperea unde se prepar acizii minerali, apa de brom, solvenii organici trebuie s fie prevzut cu ni, exhaustor i ventilaie electric. 12. nainte de folosirea unor substane inflamabile (sulfur de carbon, benzin, eter, etc.) se sting toate becurile de gaz. 13. Fiecare laborator trebuie s fie dotat cu extinctor, s se fac instructaj periodic de utilizarea extinctorului i s fie precizat o echip care s intervin n caz de incendiu. 14. Evaporarea solvenilor inflamabili se va face numai pe bi de nisip sau bi de ap electrice, sub nie cu tiraj convenabil.

15. Trebuie s se lucreze cu mare precauie cu metalele alcaline, fosfor, brom, clor, acid azotic, substane toxice i inflamabile. 16. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete prevzute cu filtru de vat. 17. Pipetarea acizilor concentrai i bazelor se face cu pipet cu volum mai mare dect volumul de pipetat i prevzute cu filtru de vat. 18. Bromul se msoar numai sub ni, cu pipete cu bul, prevzute cu o par de cauciuc pentru aspirare. Acidul sulfuric diluat se prepar prin turnarea acidului sulfuric concentrat n vasul cu ap i nu invers. 19. n timpul nclzirii unei eprubete care conine un lichid captul deschis al eprubetei nu se ine spre cel care efectueaz operaia i nici spre vecini. 20. Nu se las substane n vase neetichetate. 21. Substanele toxice se in sub cheie i n borcane sau sticle prevzute cu etichete cu cap de mort. 22. Este strict oprit gustarea reactivilor deoarece majoritatea substanelor chimice folosite sunt toxice sau caustice. 23. Mirosirea substanelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gtul sticlei cu reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conine vapori ai substanelor de la gtul sticlei cu ajutorul palmei n apropierea nasului. 24. Cnd se lucreaz cu substane care n cursul operaiei se pot mprtia sau se pot produce mici explozii, se folosesc ochelari de protecie. 25. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon i azot lichid se depoziteaz, n afara laboratorului. Cnd sunt strict necesare anumitor operaii n laborator ele se ancoreaz cu lan n locuri anume prevzute. 26. Cromatografia i electroforeza se efectueaz n ncperi izolate de restul laboratorului i prevzute cu ventilatoare electrice. 27. n legtur cu lucrarea practic efectuat se noteaz toate observaiile precum i schia instalaiei folosite. 28. Acizii minerali i hidroxizii concentrai, hrtiile i eprubetele sparte nu se arunc n chiuvete. 29. Dup terminarea activitii, se pun toate vasele la loc, se cur masa i se controleaz dac aparatura electric a fost scoas din prize i robinetele de ap i gaz nchise.

30. Fiecare laborator trebuie s fie dotat cu o trus de prim ajutor care s conin medicamente i material sanitar strict necesar (antinevralgice, cardiotonice, antibiotice, antiseptice, calmante, fei, tifon etc.). 31. Este interzis pstrarea alimentelor n frigidere cu produse biologice,. pentru a evita pericolul de infectare. 32. Este necesar ca msurile de protecia muncii, asigurarea securitii, prevenirea toxicitii s fie prelucrate cu fiecare grup de studeni la nceputul activitii anului universitar i reamintite periodic. 33. n cazul unor accidente se va apela la conductorul lucrrii.

Recoltarea sngelui
Analizele chimice ale constituenilor anorganici i organici sanguini se pot realiza pe snge venos, capilar i arterial (foarte rar). Investigaiile comparative pe snge capilar i venos au artat c nu exist diferene dependente de modul de prelevare pentru urmtoarele substane: sodiu, potasiu, clor, calciu, fosfor, colesterol, uree, proteine totale. n schimb pentru glucoz sau gsit valori mai mici n sngele venos fa de cel arterial, pentru piruvat i lactat valori mai mari n sngele venos dect n cel capilar iar pentru amoniac valorile din sngele arterial sunt mai mari dect cele din sngele venos.

Condiii de recoltare
n mod curent, recoltarea sngelui se efectueaz dimineaa, jeun (pe nemncate). Analizndu-se influena micului dejun (mas uoar) asupra concentraiei unor constitueni sanguini, s-a gsit c recoltarea sngelui jeun nu este obligatorie n cazul dozrii urmtoarelor elemente: clor, sodiu, potasiu, calciu, bicarbonat, uree, creatinin, acid uric, proteine totale, colesterol, amilaz, ceruloplasmin, fosfataz alcalin, fosfataz acid, transaminaze, leucinaminopeptidaz, colinesteraz. n principiu, utilizarea sngelui total n cadrul diferitelor investigaii este admis numai n cazul n care concentraia substanei urmrite este aproximativ aceeai n globulele roii i n plasm, aa cum este cazul glucozei i al azotului ureic. Datorit] coninutului diferit n ap al sngelui (81%) i al plasmei sau serului (93%), valorile glucozei din ser sunt cu 12% mai mari ca cele obinute n snge.

Concentraiile medii ale unor componeni organici i anorganici i activitile medii ale unor enzime din plasm i eritrocite sunt redate n tabelul de mai jos.

Component (concentraie) Azot neproteic (mg/100 ml) Creatinin (mg/100 ml) Azot ureic (mg/100 ml) Acid uric (mg/100 ml) Glucoz (mg/100 ml) Colesterol (mg/100 ml) Potasiu (mEq/l) Sodiu (mEq/l) Clor (mEq/l) Calciu (mEq/l) Magneziu (mEq/l) Fosfor anorganic (mEq/l) Bicarbonat (mEq/l)

Eritrocite 44,0 1,8 14,0 2,5 74,0 139,0 100,0 16,0 52,0 0,5 5,5 2,5 19,0

Plasm 25,0 1,1 17,0 4,6 90,0 194,0 4,4 140,0 104,0 5,0 2,2 3,2 26,0

Eritrocite Plasm 1,80 1,60 0,82 0,54 0,82 0,72 22,7 0,11 0,50 0,10 2,5 0,78 0,73

Utilizarea plasmei n locul serului pentru dozrile diferiilor constitueni prezint un singur avantaj: hemoliza mai slab a plasmei fa de hemoliza produs n timpul obinerii serului (recoltare, coagulare, transport). Cu excepia unor enzime (fosfataza acid, lactatdehidrogenaz i aldolaza) care se elibereaz n timpul coagulrii din trombocite, nu se constat diferene ntre concentraia plasmatic i seric a celorlali constitueni.

Recoltarea sngelui capilar

Recoltarea sngelui capilar se face din pulpa degetului, din clci (la nou nscui) sau din lobul urechii (la pacienii n stare de oc), dup urmtoarea tehnic : se spal locul cu eter se usuc, se neap suficient de adnc cu un ac steril; se las sngele s curg spontan pn cnd se formeaz o pictur apre-

ciabil din care se recolteaz cu ajutorul unei micropipete cantitatea de snge necesar; dac sngele nu curge spontan n cantitate suficient, se pot folosi manevre ajuttoare: frecarea degetului n cazul prelevrii din pulp, a gambei n cazul prelevrii din clci sau aplicare de alcool 70 n cazul prelevrii din lobul urechii; dup prelevare se pune pe locul nepturii un tampon steril.

Recoltarea sngelui venos

Recoltarea sngelui venos se efectueaz din venele plicii cotului (la adult i copii mari), din fontanel i venele jugulare (la sugari i copii mici). Recoltarea din venele plicii cotului se face dup urmtoarea tehnic: - se fixeaz garoul deasupra cotului, se dezinfecteaz tegumentul n locul puncionrii cu alcool 70 %; - se puncioneaz vena i se recolteaz sngele prin ac fie direct n eprubet prin scurgere liber, fie prin aspirare n sering ; - dup recoltare se ndeprteaz garoul i se tamponeaz locul puncionat cu un tampon de vata mbibat n alcool. Se folosesc ace i seringi de unic utilizare s-au ace i vase speciale pentru recoltarea sngelui, vasele n care se recolteaz trebuie s fie n perfecta stare de curenie i uscare ntruct urmele de alcool, ap etc. pot produce hemoliza sngelui, iar diferitele impuriti pot falsifica rezultatele dozrilor. Poziia corpului i staza venoas influeneaz rezultatele obinute n cazul determinrii elementelor figurate (eritrocitele, etc.) i a celor cu greutate molecular mare (proteinele totale, fraciunile proteice individuale, colesterolul din complexul lipoproteinelor etc.). De exemplu: valoarea proteinelor totale crete de la 6,63 g/100 ml n poziie de deccubit la 7,65g/100 ml n ortostatism. n cazul determinrii substanelor cu greutate molecular mic, poziia corpului i staza venoas nu afecteaz valoarea rezultatelor excepie, fcnd lactatul, piruvatul i amoniacul.

Condiiile de conservare a probelor recoltate

Probele de snge total recoltat pe heparin se pstreaz la 4 C, iar dozrile trebuie fcute n mai puin de 4 ore de la recoltare. Pstrarea prea ndelungat (chiar la 4C) este contraindicat. Conservarea probelor la temperatura camerei determin perturbri n compoziia electroliilor, enzimelor i diferiilor metabolii. n cazul plasmei sau serului, determinrile metaboliilor i enzimelor trebuie realizate, de asemenea, n decurs de 4 ore de la recoltare, n condiiile pstrrii la temperatura camerei. Fr alterri importante, serul sau plasma pot fi pstrate la 4 C timp de 24 ore. n cazul dozrilor dup 24 ore de la recoltare plasma sau serul trebuie 9

congelat sau liofilizat, form de conservare preferabil adugrii de conservani (amestec timol-fluoru0r: 10 mg fluorur de sodiu + 1 mg timol/ml snge sau streptomicin 1 mg/l0 ml snge).

Obinerea plasmei i a serului

Analizele biochimice se pot efectua pe snge total, plasm sau ser. Plasma sanguin se obine prin centrifugarea sngelui proaspt recoltat pe un anticoagulant (fluorur de sodiu, amestec de oxalai de potasiu i amoniu, heparin etc.); supernatantul este constituit din plasma sanguin, iar sedimentul din elementele figurate. Serul sanguin se obine prin centrifugarea sau decantarea sngelui recoltat fr anticoagulant, dup ce a fost lsat s coaguleze la temperatura camerei timp de 30-60 minute. Serul normal este limpede, de culoare galben pai i se deosebete de plasma sanguin prin faptul c nu mai conine fibrinogen. n condiii fiziologice, aspectul serului poate fi : - opalescent datorit particulelor de grsime provenite dintr-un regim foarte bogat n lipide, caz n care clarificarea se poate obine prin deproteinizare sau extracia lipidelor cu amestec alcool-eter (3/1); - galben-brun datorit substanelor carotenoide provenite din alimentaie excesiv vegetarian ; - de la roz la rou intens datorit prezenei hemoglobinei, rezultat al hemolizei produs prin greeli n tehnica de recoltare a sngelui. n condiii patologice, serul poate prezenta urmtoarele modificri de culoare : - opalescent n nefroza lipoidic; - galben-brun n ictere de diferite etiologii; n contact cu aerul, bilirubina se poate transforma n biliverdin, sngele devenind verzui.

Prepararea soluiilor procentuale molare, normale

O soluie este un amestec omogen de dou sau mai multe substane inseparabile prin mijloace mecanice ca filtrarea sau centrifugarea. La o soluie se disting dou componente: solventul sau componenta care dizolv i solutul(soluii) sau componenta

10

(componentele) care se dizolv. Raportul dintre un solut i solvent se exprim prin concentraia soluiei. Exist mai multe moduri de exprimare a concentraiei unei soluii: a) Concentraia procentual care la rndul ei poate fi de trei feluri: concentraia procentual de mas - grame solut n 100 g soluie, (m/m) De exemplu 100 g soluie 15% (m/m) H2SO4 conine 15 g H2SO4 i 85 g ap. concentraia procentual volumetric - ml solut n 100 ml soluie, (v/v) De exemplu 100 ml soluie 4% (v/v) etanol se prepar completnd 4 ml CH3CH2OH pn la 100 ml cu ap. n acest caz facem abstracie de contracia de volum, fenomen larg ntlnit n prepararea soluiilor procentuale volumetrice. ntr-o expresie restrns acest fenomen poate fi scris astfel: v neglijat. concentraia procentual mixt - grame solut n 100 ml soluie, (m/v) De exemplu 100 ml soluie 0,8% (m/v) NaCl (ser fiziologic) conine n acest volum 0,8 g NaCl b) Concentraia molar (m, M) reprezint numrul de moli de solut aflai ntr-un litru de soluie. c) Concentraia molal, mai rar folosit, se definete prin numrul de moli de solut dizolvai n 1000 g de solvent. d) Concentraia normal reprezint numrul de echivaleni-gram de solut dintrun litru de soluie. Se numete echivalent cantitatea de substan n greutate care ntr-o reacie chimic dat poate nlocui sau lega 8 pri n greutate de oxigen sau 1,008 pri n greutate de hidrogen. Cantitatea de substan n grame, egal numeric cu echivalentul, se numete echivalent-gram. Pentru calcularea echivalentului-gram se ine cont de urmtoarele reguli:
solut

+v

solvent

>v

soluie

. Pentru soluii diluate el poate fi

11

 echivalentul-gram a unui acid este egal cu raportul dintre masa molecular (M) a acidului i numrul de ioni H+ angajai n reacie. De exemplu, ntr-o reacie de neutralizare cu HCl EgHCl =
M HCl = 36,5 g HCl, 1

iar ntr-o reacie n care H3PO4 cedeaz toi cei 3 ioni H+ :

E gH 3 PO 4 =

M H3 PO4 3

98 = 32 ,7 g H3PO4 3

echivalentul-gram a unei baze este dat de masa molecular a sa mprit la numrul ionilor HO- care particip la reacie. Dac toi ionii HO- particip la reacie

echivalentul-gram al bazei se poate calcula mprind masa molecular a acesteia la valena metalului. De exemplu: EgNaOH =
M NaOH = 40 g NaOH 1

E gCa ( OH ) 2 =

M Ca ( OH ) 2 2

74 = 37 g Ca(OH)2 2

n sensul mai larg al bazelor generalizate, echivalentul gram se calculeaz cunoscnd numrul de protoni care sunt legai. pentru sruri, echivalentul-gram este dat de raportul dintre masa molecular i produsul dintre numrul atomilor de metal din molecula de sare i valena acestui metal, sau raportul dintre masa molecular i produsul dintre numrul radicalilor acid i valena acestora. De exemplu: E Fe2 ( SO4 ) 3 = M Fe2 ( SO4 ) 3 23 = 400 = 66,7 g Fe2(SO4)3 6

Ca i n cazul acizilor, bazelor i srurilor, echivalentul-gram a unei substane oxidante sau reductoare se calculeaz pe baza stoicheometriei redox a reaciei la care particip aceasta. n reaciile de oxido-reducere atomii i schimb valena. Echivalentul se definete ca fiind raportul dintre masa molecular a compusului chimic i numrul de electroni cedai sau primii n reacie de atomul (atomii) care se oxideaz sau se reduc. De exemplu, n permanganometrie, n mediu acid ionul de mangan din KMnO 4, accept 5 electroni:
7+ 2KMnO4 + 3H2SO4 = 2+ 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5[O]

Prin urmare, E gKMnO 4 =

M KMnO 4 5

= 31,6 g KMnO4

12

- variaia strii de oxidaie a ionului de mangan din KMnO4 n mediu slab alcalin sau neutru este 3.
7+ 2KMnO4 + H2O = 2KOH +4+ MnO2 + 3[O]

E gKMnO 4 = -

M KMnO4 3

158 = 52 ,7 g KMnO4 3

variaia strii de oxidaie a manganului din KMnO4 n mediu puternic alcalin este 1
+7 +6 2KMnO4 + 2KOH = 2K2MnO4 + H2O + [O]

EgKMnO4 =

MKMnO4
1

= 158g KMnO4

1. Soluii procentuale a) Prepararea unei soluii de NaCl 10 % (m/m) Conform definiiei 100 g soluie NaCl 10 % trebuie s conin 10 g NaCl i 90 g ap. Se cntresc 10 g NaCl la balana tehnic care se introduc ntr-un pahar Berzelius i se adaug 90 ml de H2O distilat. Se omogenizeaz amestecul cu ajutorul unei baghete de sticl. b) Prepararea unei soluii de CH3COOH 15 % (v/v) Conform definiiei 100 ml soluie CH3COOH 15 % trebuie s conin 15 ml CH3COOH glacial i restul H2O distilat. Se msoar ntr-un cilindru gradat 15 ml CH3COOH glacial i se completeaz volumul cu H2O distilat pn la 100 ml. Se omogenizeaz amestecul cu ajutorul unei baghete de sticl. c) Prepararea unei soluii de Na2CO3 5%(m/v) 100 ml soluie Na2CO3 5 % trebuie s conin 5 g Na2CO3 anhidru i H2O distilat. Se cntresc 5 g Na2CO3 anhidru la balana tehnic, se introduc ntr-un cilindru gradat i se completeaz cu H2O distilat pn la 100 ml. Se omogenizeaz amestecul cu ajutorul unei baghete de sticl. n cazul n care se lucreaz cu Na2CO3 . 10 H2O se vor lua n considerare masele moleculare pentru a se determina cantitatea n grame a srii hidratate ce corespunde greutii de sare anhidr.

M Na 2 CO3 anh . = 106

M Na 2 CO3 .10 H2 O = 286

x

106 g Na2CO3 anh. ............... 286 g Na2CO3.10 H2O 5 g Na2CO3 anh. ............... x = 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O 13

Se vor cntri 13,49 g Na2CO3 . 10 H2O la balan i se va proceda n modul descris mai sus. Regula amestecurilor Dintr-o soluie mai concentrat se poate prepara o soluie mai diluat cu ajutorul regulei amestecurilor. De exemplu, avnd la dispoziie o soluie de NaCl 2 % (m/m) s se prepare 20 ml soluie NaCl 0,9 %(m/m). Valorile concentraiilor celor dou soluii, avnd concentraia mai mare, respectiv mai mic dect concentraia soluiei de preparat, se aeaz n colurile de sus ale unui dreptunghi imaginar. Valoarea concentraiei soluiei de preparat, se aeaz la intersecia celor dou diagonale. Valorile numerelor ce reprezint concentraiile se scad pe diagonal (numerele mai mici se scad din cele mai mari). Rezultatele se scriu n colurile de jos ale dreptunghiului. Aceste numere reprezint pri n greutate din soluiile respective (grame, kilograme, etc.). 2 0,9 0,9 pri NaCl 2 % 1,1 pri H2O distilat2 pri NaCl 0,9%(m/m) 0

Deci, se pot amesteca 0,9 pri NaCl 2 % cu 1,1 pri H 2O distilat pentru a rezulta 2 pri soluie de NaCl 0,9%(m/m). Avnd n vedere c soluia NaCl 0,9% (m/m) este diluat putem tolera conversia prilor de greutate, n volume. Adic, 20 ml (soluie) NaCl 0,9 %(m/v) ..........x ............y x = 9 ml NaCl 2 % y = 11 ml H2O distilat Aproximaia fcut este util deoarece este mai uoar msurarea volumetric a soluiilor n loc de cea gravimetric. 2. Soluii molare

14

a) Prepararea unei soluii de H2SO4 0,1 M conin 0,1 moli H2SO4. Deci:

avnd la dispoziie soluie de H2

SO4 20 % (m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiiei, 1000 ml H2SO4 0,1 M

1000 ml H2SO4 0,1 M .................. 9,8 g H2SO4 pur 100 g sol. H2SO4 20 % .............. 20 g H2SO4 pur x g sol. H2SO4 20 % ..9,8 g H2SO4 pur x = 49 g sol. H2SO4 20 %(m/m)
v= m 49 = 43 ,02 1,139

ml sol. H2SO4 20 %(m/m)

n balonul cotat de 1000 ml se introduce o cantitate de H2O distilat, se adaug 43,02 ml soluie H2SO4 20 % i apoi se aduce la cot cu H2O distilat dup rcirea amestecului la temperatura menionat pe balon (20C). Dup ce se fixeaz dopul balonului cotat se omogenizeaz soluia prin agitare energic. 3. Soluii normale Prepararea unei soluii de H2SO4 0,1 N avnd la dispoziie soluie H2SO4 20 % (m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiiei 1000 ml sol. H2SO4 0,1 N conin 0,1 E gH 2 SO 4 . Deci: 1000 ml H2SO4 0,1 N .............. 4,9 g H2SO4 pur 100 g sol. H2SO4 20 % ........... 20 g H2SO4 pur x g sol. H2SO4 20 % .......... 4,9 g H2SO4 pur x = 24,5 g sol. H2SO4 20 %(m/m)
v= m 24 ,5 = 21 ,51 1,139

ml sol. H2SO4 20 %

Noiunea de pH
Ionizarea apei i produsul ionic al apei Dei apa pur este considerat neelectrolit, ea conduce totui curentul electric. Acest lucru se datoreaz faptului c o parte din moleculele ei sunt ionizate. Ionizarea apei poate fi scris conform ecuaiei:

15

H2O + H2O <---------> H3O+ + OHAre loc un transfer de protoni ducnd la un echilibru. Constanta de aciditate a apei va fi:

[ H O ][OH ] K=
+
a

[ H 2O ] 2

La temperatura de 25C apa se afl ionizat n proporie de o molecul la 555 milioane de molecule. De aceea se consider c, prin ionizare, concentraia apei (de la numitor) rmne practic constant i deci poate fi nmulit cu constanta de aciditate. Ka [H2O]2 = Pi = [H3O+] [OH-] Constanta Pi este numit produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliz a apei. Deoarece la temperatura de 25C produsul ionic al apei are valoarea de 10-14 moli2/l2, nseamn c n apa pur la 25C concentraia ionilor de hidroniu, egal cu cea a ionilor de hidroxid, este 10-7moli/l. [H3O]+ = [OH-] = 10-7moli/l Scara de pH n soluii diluate, acizii tari pot fi considerai practic ionizai complet. Astfel, ntr-o soluie apoas 0,1N de HCl (0,1 moli/l) concentraia ionilor de hidroniu este practic egal cu concentraia total a acidului. Este comod s se exprime concentraia ionilor de hidroniu dintr-o soluie apoas n form logaritmic. Se numete exponent al concentraiei ionilor de hidroniu sau pH logaritmul zecimal cu semn schimbat al concentraiei ionilor de hidroniu din soluie (Srensen, 1909): pH = - lg [H3O+] Punctul neutru: O soluie apoas este neutr cnd concentraiile ionilor de hidroniu i ionilor de hidroxid sunt egale, conform ecuaiei: [H3O+] = [OH-] = 10-7moli/l Punctul neutru, n soluii apoase, este la pH = 7. O soluie cu pH < 7 este acid; o soluie cu pH > 7 este bazic. Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici Indicatori de pH (acido-bazici) sunt substane organice colorate (acizi sau baze slabe) care i modific culoarea n funcie de pH. Condiiile pe care trebuie s le 16

ndeplineasc un indicator de pH sunt urmtoarele: schimbarea de culoare s fie reversibil, i s se produc brusc, deci ntr-un interval de pH ct mai mic, s fie solubil n ap, s aib putere de colorare (culoare intens), chiar la concentraii mici; schimbarea de culoare s se produc la adaosul unor concentraii mici de acid sau de baz; s fie stabil n condiiile obinuite de lucru. Dac indicatorul este un acid slab (AH), n soluie apoas are loc reacia protolitic: AH + H2O <> H3O+ + An cazul albastrului de bromtimol, acidul slab AH este galben iar baza conjugat A- este albastr. Prin schimbarea aciditii soluiei indicatorului i schimb culoarea fenomen numit viraj, datorit trecerii lui din stare protonat n cea deprotonat sau invers. Constanta de aciditate al indicatorului va fi:
Ka = [H ] [AH] n forma logaritmic:
+

[A ]

lgKa = lg[H ] + lg sau - lg[H ] = -lgKa + lg

+ +

[A ]

[A ]

Adic:

[AH]

[AH]

-lg[H+] = pH i -lgKa = pKa, deci: pH = pKa + lg sau pH = pKa + lg

[AH] [A-] [albastru] ________ [galben]

Ochiul uman nu poate distinge dect cca. 10% dintr-o culoare n prezena unei alte culori. Dac [A-] = 10[AH], soluia va fi albastr i pH1 = pKa + 1. Dac 10[A-] = [AH], soluia va fi galben i pH2 = pKa - 1. Prin urmare: pH1 - pH2 = pH = 2 Acest interval de pH se numete intervalul de viraj al indicatorului care nseamn intervalul de pH n care are loc schimbarea culorii indicatorului (de la albastru la galben n cazul nostru) odat cu schimbarea pH-ului soluiei. Fiecare indicator are un interval de viraj specific. La valori de pH inferioare intervalului de viraj indicatorul i pstreaz culoarea, iar peste acest interval la fel. Din culoarea soluiei unui indicator se poate aprecia pH-ul soluiei.

17

Indicatorii acido-bazici pot fi simpli, micti i universali. Indicatorii simpli se caracterizeaz printr-un interval de viraj relativ mic (cca 2 uniti de pH). Indicatorii simpli se pot folosi pentru tatonarea pH-ului necunoscut. pH-ul necunoscut se poate estima cu o eroare de un semiinterval de viraj. Indicatorii universali sunt amestecuri de indicatori simpli ale cror intervale de viraj sunt parial suprapuse sau, n cazul cel mai bun, unul n continuarea celuilalt. Indicatorii universali au intervale de viraj mai mari dect ale celor simpli. n comer se gsesc hrtii indicatoare impregnate cu indicatori universali. Prin compararea culorii obinute cu o scar de culori etalon, se poate determina pH-ul unei soluii cu o precizie de aproximativ + 0,5 uniti pH. n tabelul de mai jos apar cteva exemple de indicatori simpli cu caracteristicile lor: Intervalul de Denumirea Metil violet Metil oranj Rou metil Albastru de bromtimol Fenolftalein viraj ( pH) 1,0 - 3,2 3,1 - 4,4 4,4 - 6,2 6,2 - 7,6 8,2 - 10,0

Sub interval de viraj verde rou rou galben incolor

n cadrul intervalului de viraj albastru portocaliu roz verde roz

Peste interval violet galben galben albastru rou-violet

Sistemele tampon: sunt formate dintr-o sare hidrolizabil i acidul slab sau baza slab rezultat prin hidroliz. O soluie care i schimb numai puin pH-ul, la adugarea unei cantiti mici de acid sau baz tare se numete soluie tampon. O caracteristic a unei soluii tampon este capacitatea de tamponare. Capacitatea de tamponare a unei soluii este capacitatea ei de a se opune variaiei de pH la adaosul de acid tare sau baz tare i se exprim prin numrul de echivaleni de acid sau baz care schimb pH-ul unui litru de soluie cu o unitate. Ea se micoreaz prin diluare. Demonstrarea capacitii de tamponare:

18

Reactivi:

Indicator Bogen (amestec de rou metil i albastru de bromtimol, cu intervalul de viraj ntre pH 4,4-7,6) Sol. tampon fosfat pH = 7 Sol.de HCl N/10 Sol. de NaOH N/10

Modul de lucru: n dou pahare Berzelius (1, 1a) se pune ap distilat i se adaug cte 2 ml de indicator. Dac apa este neutr culoarea soluiilor este verde. n alte dou pahare (2, 2a) de aceiai mrime se prepar soluie tampon cu pH = 7, la care se adaug cte 2 ml soluie de indicator obinndu-se tot culoarea verde. Se adaug cte 1 ml HCl N/10 n paharele 1i 2 i se amestec cu bagheta: se observ o puternic variaie a culorii soluiei din paharul 1 ceea ce indic o mare variaie a pH-ului. n paharele 1a i 2a se adaug cte 1 ml NaOH N/10, se amestec cu bagheta i se observ la fel o mare variaie a culorii soluiei din paharul 1a. n paharele 2 i 2a culoarea se schimb foarte puin, deoarece pH-ul s-a modificat foarte puin. n dou pahare Berzelius (1, 1a) se prepar soluie tampon cu pH = 7 i se adaug cte 2 ml indicator. n alte 2 pahare (2, 2a) se prepar soluie tampon cu acelai pH, ns de zece ori mai diluat, adugnd cte 2 ml indicator i n aceste pahare. Se pipeteaz cte 1 ml HCl N/10 n paharele 1 i 2, i cte 1 ml NaOH N/10 n paharele 1a i 2a. Se amestec cu bagheta. n paharele 2 i 2a se observ schimbarea mai pronunat a culorii indicatorului deoarece, soluiile tampon fiind mai diluate, li s-a micorat capacitatea de tamponare.

Determinarea colorimetric a pH-ului prin metoda cu soluii tampon

Principiu: Se adaug soluiei de cercetat un anumit volum dintr-un indicator potrivit i se compar culoarea pe care o capt soluia, cu culoarea produs de aceiai cantitate de indicator adugat unei serii de soluii tampon cu pH-uri cunoscute. pH-ul soluiei de cercetat va fi egal cu pH-ul soluiei de referin cu culoarea identic. Reactivi: - Sol. de CH3COOH N/10

19

- Sol. de CH3COONa N/10 - Sol. de KH2PO4 M/15 - Sol. de Na2HPO4 M/15 - Indicator Bogen (amestec de rou metil i albastru de bromtimol) Modul de lucru: Se prepar n dou serii de eprubete soluii tampon cu pH diferit conform tabelelor: Tampon acetat (Walpole) CH3COOH N/10 CH3COONa N/10 pH ml ml 8,2 1,8 4 6,3 3,7 4,4 4,0 6,0 4,8 2,1 7,9 5,2 1,0 9,0 5,6

Tampon fosfat (Srensen) KH2PO4 M/15 Na2HPO4 M/15 pH ml ml 8,8 1,2 6 7,3 2,7 6,4 5,1 4,9 6,8 2,8 7,2 7,2 1,3 8,7 7,6 0,5 9,5 8,0

n fiecare soluie se adaug cte 0,2 ml indicator Bogen. Eprubetele se agit energic pentru omogenizarea culorii. Culoarea soluiilor va fi diferit n fiecare eprubet n funcie de pH. Se adaug 0,2 ml indicator la 10 ml din soluia de cercetat i se omogenizeaz. Se compar culoarea obinut cu culorile seriei. Dac culoarea soluiei cercetate este identic cu culoarea uneia din soluiile tampon (acetat sau fosfat), pH-ul lor este identic. Dac culoarea se ncadreaz ntre culorile a dou soluii tampon consecutive se consider c pH-ul soluiei cercetate este media aritmetic a valorilor de pH a celor dou soluii tampon.

Volumetrie
Principiile analizei volumetrice Analiza volumetric se bazeaz pe msurarea de volume, operaie ce se execut comod cu vase calibrate (cilindrii gradai, baloane cotate, pipete, biurete). Principiul analizelor volumetrice const n msurarea volumului de reactiv necesar producerii reaciei cantitative cu substana de determinat ce se afl n soluia de analizat. Operaia de adaos a soluiei de reactiv se face n pic- turi, din biuret i se numete titrare.

20

Pot fi urmrite volumetric numai acele reacii care au loc univoc, (fr reacii secundare i cantitativ) i cu vitez foarte mare. Pentru marcarea sfritului reaciei, respectiv a punctului de echivalen, se folosesc fenomene ce pot fi puse n eviden prin observare vizual (schimbri de culoare, apariii de precipitate) sau instrumental (poteniometru, conductometru, spectrofotometru). Pentru observarea vizual a sfritului titrrii n modul cel mai obinuit se folosesc indicatorii, substane care i schimb culoarea n punctul de echivalen. La punctul de echivalen reactanii sunt prezeni n cantiti echivalente, deci n amestecul de reactivi nu se afl n exces nici substana de dozat i nici reactivul titrat. Volumul de reactiv adugat pentru atingerea punctului de echivalen se numete volum de echivalen. Spre a putea stabili concentraia substanei de analizat este necesar ca soluia de reactiv folosit la titrare s fie de concentraie cunoscut, s fie suficient de stabil i s se prepare relativ uor. Metodele volumetrice se caracterizeaz prin rapiditate, n majoritatea cazurilor o determinare volumetric se face n cteva minute. Clasificarea metodelor volumetrice Metodele volumetrice pot fi: a) directe b) indirecte - prin retitrare - prin intermediul unui substituent n cazul metodelor de titrare direct, reacia dintre componentul de determinat i reactivul de titrare este de echivalent la echivalent. Prin retitrare se titreaz excesul unui reactant adugat soluie de analizat (vezi dozarea NH3). n cazul folosirii unui substituent, produsul de reacie titrabil rezultat prin substituie se formeaz n cantitate echivalent cu componentul de determinat (ex. complexometria). n ceea ce privete natura reaciilor care stau la baza metodelor volumetrice, clasificarea acestora este: a.) metode de titrare acido-bazic sau neutralizare b.) metode de titrare redox (permanganometria, iodometria) c.) metode de titrare prin formare de compleci (complexometria) d.) metode de titrare prin formare de precipitat (ex. argentometria)

21

Calcule n analiza volumetric Raportul de concentraie ntre soluia real (aproximativ normal) i cea teoretic (exact normal) se numete factorul soluiei. Factorul exprim numrul de ml de soluie exact normal care echivaleaz cu 1 ml din soluia preparat:
F= Vt Vr

unde: Vt - volumul teoretic (a soluiei exact normale) Vr - volumul real ( a soluiei preparate)

Factorul soluiilor exact normale este 1,000. Ele folosesc ca soluii etalon i cu ajutorul lor se determin factorul soluiilor aproximativ normale. Soluiile mai diluate au un factor subunitar, soluiile mai concentrate au un factor supraunitar. Practic valoarea factorului trebuie s fie ntre 0,8000-1,2000. Pe lng factor concentraia exact a soluiilor se poate exprima i cu ajutorul titrului. Titrul unei soluii reprezint cantitatea de substan exprimat n grame din 1 ml soluie. De exemplu: pentru o soluie de NaOH care conine 4,653 g pe litru titrul are valoarea de 0,004653. Tehnica titrrii Pregtirea instrumentelor pentru titrare Biureta se spal cu ap distilat i apoi se cltete cu soluia de titrare de dou ori. Dup utilizarea mai ndelungat a biuretei este necesar degresarea tubului gradat al acesteia. Aceasta se poate realiza cu amestec cromic sau cu soluie de detergent. Se umple biureta cu soluia de titrare peste gradaia 0, apoi se scoate plnia care a servit pentru introducerea lichidului n biuret i se potrivete la zero nivelul lichidului lsnd s cad ncet lichidul n exces ntr-un vas colector. Dac robinetul se mic greu sau biureta picur, se scoate robinetul, se terge de umezeal i se unge cu un strat subire i uniform de vaselin. Partea inferioar a manonului robinetului se usuc cu ajutorul hrtiei de filtru i apoi se introduce robinetul uns la locul lui. Bulele de aer prezente n biuret pot s cauzeze erori la titrare ceea ce impune ndeprtarea lor. Modul de lucru: La nceputul titrrii dm drumul soluiei din biuret n picturi repezi agitnd n continuu coninutul flaconului Erlenmayer, n care se gsesc, exact msurat, volumul soluiei de titrat plus indicatorul. De obicei se observ o schimbare temporar de culoare 22

a indicatorului n locul unde cad picturi de reactiv n soluie. Spre sfritul titrrii concentraia substanei de dozat scade i la contactul picturilor de reactiv cu soluia de dozat schimbarea temporar a culorii soluiei este mai persistent. n aceast faz viteza de picurare se reduce treptat n aa fel nct dup adugarea ultimei picturi necesare, s fie posibil nchiderea rapid a robinetului. Pictura aderat pe vrful biuretei se introduce n vasul de titrare prin atingerea de peretele interior al acestuia i se amestec cu lichidul de titrat aplecnd vasul n direcia lichidului ce se prelinge pe peretele vasului. Titrarea se consider terminat cnd ultima pictur produce o schimbare slab dar sesizabil i stabil a culorii lichidului. Erorile determinrilor volumetrice n analizele chimice pot interveni dou tipuri de erori: - erori sistematice - erori ntmpltoare Erorile sistematice au valori constante i sunt ntotdeauna pozitive sau negative. Erorile ntmpltoare au valori i semne diferite. Ele se pot elimina prin efectuarea unui mare numr de determinri i prin calcularea mediei aritmetice a volumelor de echivalen cu valori apropiate. Volumele de echivalen ale cror valori sunt exagerat de ndeprtate se exclud Practic se efectueaz titrarea a trei probe paralele efectundu-se media aritmetic ntre volumele de echivalen identice sau cele cu valoare foarte apropiat. Se accept o diferen ntre volumele de echivalen mai mic sau egal cu 0,2 ml. S lum un exemplu. Volumele de echivalen obinute la titrarea a trei probe paralele sunt: V1 = 7 ml; V2 = 7,1 ml; V3 = 7,4 ml. Diferenele V3 - V1 i V3 - V2 sunt mai mari de 0,2 ml, deci V3 se exclude. Volumul mediu ( v ) luat n calcul va fi n acest caz media aritmetic dintre V1 i V2 i are valoarea de 7,05 ml. Dac toate probele au valori foarte diferite rezultatele nu sunt interpretabile iar titrrile trebuie s fie repetate. Surse de erori Eroarea de paralax ( eroarea de citire) intervine la citirea incorect a nivelului soluiei din vasul de msurat. Volumul de soluie ntr-un vas de msurat este egal cu volumul nominal al vasului n cazul n care punctul inferior al meniscului lichidului este tangent la cota de pe vas. Pentru citirea corect a poziiei meniscului ochiul observatorului trebuie s fie pe orizontal ntr-un plan tangent la menisc iar vasul trebuie s aib o poziie vertical.

23

Vorbim despre eroarea de paralax n minus cnd ochiul observatorului este deasupra acestei orizontale, respectiv eroare de paralax n plus, cnd ochiul se gsete sub nivelul orizontului. Pentru evitarea erorii de paralax se folosesc biuretele Schellbach care sunt prevzute cu o dung albastr pe un fond alb. La nivelul meniscului dunga albastr se ntrerupe formnd dou vrfuri ascuite care se ating ntrun punct. Se citete poziia acestui punct de contact. Eroarea de scurgere se datoreaz faptului c soluiile apoase umezesc sticla i, la golirea rapid o parte din lichid ader pe suprafaa biuretei, deci soluia nu se scurge cantitativ n vasul de titrare. Pentru evitarea acestei erori, viteza de scurgere pe parcursul titrrii trebuie s fie mic. Eroarea de picurare n analiza volumetric, soluiei de analizat i se adaug soluia titrat pn cnd ultima pictur produce o schimbare sesizabil i stabil a culorii soluiei. n cele mai multe cazuri acest efect se datoreaz unui exces a soluiei cu care se titreaz. Pentru reducerea acestui exces, ciocul biuretei trebuie s fie ct mai subire pentru ca picturile de titrant s fie ct mai mici. Eroarea de temperatur Vasele de msurat volume, biurete, baloane cotate, pipete sunt etalonate pentru o anumit temperatur (200C). Diferena dintre temperatura de etalonare a vasului i temperatura real a soluiei de msurat determin o diferen de volum, care poart denumirea de eroare de temperatur. Se poate evita aceast eroare prin respectarea temperaturii de etalonare. Diferenele mici de 1-20C sunt, n majoritatea cazurilor, neglijabile. 24

Acidimetria volumetric
Titrri acido-bazice n titrrile de neutralizare, stabilirea volumului de echivalen sau de neutralizare se face cu ajutorul indicatorilor acido-bazici care, cum am artat sunt n form neionizat acizi slabi (AH) sau baze slabe (B). n tabelul de mai jos sunt exemplificai mai muli indicatori acido-bazici cu precizarea naturii lor de acid sau baz. Sunt inclui i civa din indicatorii utilizai la determinarea pH-ului (vezi mai sus). Evident, tria acestor acizi crete ctre cel al crui interval de pH este cel mai mult sub valoarea 7. Pentru prepararea soluiilor de indicatori se folosesc ca solveni apa, dar mai ales alcool apos, cei mai muli n concentraie de 0,1 %. Indicatorul AH = acid; B = baz Albastru de timol (AH) Albastru de bromfenol (AH) Metiloranj (B) Verde de bromcrezol (AH) Rou de metil (AH) Purpur de bromcrezol (AH) Albastru de bromtimol (AH) Rou neutral (B) Rou de crezol (AH) Fenolftalein (AH) Albastru de timol (AH) Timolftalein (AH) Galben de alizarin (AH) Interval de pH 1,2 - 2,8 3,0 - 4,6 3,1 - 4,4 4,0 - 5,6 4,4 - 6,2 5,2 - 6,8 6,2 - 7,6 6,8 - 8,0 7,2 - 8,8 8,0 - 10,0 8,0 - 9,6 9,4 - 10,6 10,0 - 12,0 Culorile limit Acid Alcalin roie galben galben vilet-albastr roie oranj galben albastr roie galben galben purpurie galben albastr roie galben galben roie incolor roie galben albastr incolor albastr galben liliachie

Titrarea unui acid tare cu o baz tare Principiu: n cazul titrrii unui acid tare, de exemplu HCl, cu o baz tare, de exemplu NaOH, la echivalen se formeaz o sare nehidrolizabil, n exemplul dat NaCl i mediul devine perfect neutru. La neutralitate avem:

[ H ] =[ OH ] =10
+

ioni g/l

pHechiv. = 7

[H ]
+

pe parcursul titrrii este egal cu concentraia acidului rmas netitrat.

Dup echivalen

[ OH ]

este egal cu concentraia bazei introdus n exces. Pentru

alegerea indicatorului adecvat, este necesar cunoaterea pH-ului la punctul de echivalen. La un exces (eroare) de 1% reactiv pH-ul soluiei variaz brusc. La titrarea

25

unui acid tare cu o baz tare intervalul de eroare corespunde aproximativ intervalului de pH 4-10, ceea ce nseamn c se poate folosi orice indicator care are un interval de viraj ntre pH 4-10. n figura de mai jos apare curba de titrare a unui acid tare cu o baz tare cu precizarea a doi indicatori ce permit punerea n eviden a punctului de echivalen (P.E.) al reaciei Determinarea factorului unei soluii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluii

etalon Prepararea unei soluii de HCl aproximativ 0,1 N Ne propunem s preparm 1 litru sol. HCl aproximativ 0,1 N avnd la dispoziie o soluie HCl 15% (g/100 g) cu = 1,075 g/cm3. Din definiia concentraiei normale: 1000 ml HCl 0,1 N conin 0,1 Eq HCl = 3,65 g HCl 100 g HCl 15 % .............15 g HCl x g HCl 15 %............. 3,65 g HCl x = 24,33 g HCl 15 % =
m V
2 ,3 4 3

V = 1,075 = 22,6 ml HCl 15 %

ntr-un balon cotat de 1000 ml se introduce o cantitate mic de H2O bidistilat, se adaug 22,6 ml HCl 15 % i se completeaz cu H2O bidistilat pn la cot. Omogenizarea soluiei se realizeaz prin agitarea energic. Stabilirea factorului soluiei de HCl 0,1 N preparat Pentru stabilirea factorului soluiilor se folosesc soluiile etalon, stabile din punct de vedere chimic i cu factor cunoscut (eventual F = 1,000). O astfel de soluie etalon se poate prepara prin cntrirea i dizolvarea n ap a KHCO3, necesar n titrarea de mai jos.

26

Pentru determinarea factorului soluiei de HCl 0,1 N preparat anterior se msoar exact cu ajutorul unei pipete cte 10 ml sol. KHCO3 n 3 pahare Erlenmeyer. Se adaug cte 3 picturi de metiloranj i se titreaz, cele trei probe paralele, pn la virajul indicatorului de la galben la portocaliu. CO2 format n urma reaciei se ndeprteaz prin fierberea probelor 2-3 minute. n cazul n care dup rcirea probelor culoarea a revenit la galben, se continu titrarea pn la portocaliu. Din cele 3 volume de echivalen se face media aritmetic i se obine v HCl . La baza calcului st relaia:

v HCl
FKHCO 3

. FHCl

= VKHCO 3 .

10 x FKHCO de unde FHCl = v cu soluia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut Dozarea unei soluii de NaOH HCl
3

n trei flacoane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml sol. NaOH, se adaug cte 3 picturi de metiloranj i se titreaz cu soluie titrat de HCl 0,1 N pn la virajul indicatorului de la galben la portocaliu. Concentraia procentual mixt a soluiei de NaOH se exprim n g/100 ml i se calculeaz n felul urmtor: - se face media aritmetic a celor trei volume de echivalen i se obine v HCl - conform definiiei concentraiei normale, 1000 ml HCl 1 N conin 1 EgHCl - din ecuaia reaciei chimice NaOH + HCl = NaCl + H2O rezult c 1 EqHCl reacioneaz cu 1 EqNaOH deci: 1000 ml HCl 1 N ............. 40 g NaOH 1000 ml HCl 0,1 N............ 4 g NaOH

v HCl

FHCl ................... x g NaOH

x = 4 v FHCl 1000

- reprezint g NaOH coninute n volumul sol. de NaOH titrate (10 ml).

CNaOH%(m/v) = 10 x, reprezint concentraia procentual mixt a soluiei de NaOH.

27

Dozarea amoniacului prin diferen Principiu: Metoda direct de dozare a amoniacului cu o soluie titrat de HCl 0,1 N, n prezen de metiloranj, este n general evitat datorit pierderilor de amoniac prin desorbie. Este preferat metoda dozrii amoniacului prin diferen. Soluia de amoniac se trateaz cu un volum de soluie titrat de HCl, ce conine un exces de acid i se determin excesul de HCl prin titrare cu o soluie titrat de NaOH n prezen de metiloranj. Reaciile sunt urmtoarele: NH3 + HCl = NH4Cl; Reactivi: NaOH + HCl = NaCl + H2O. - Soluie de HCl 0,1N cu factor cunoscut - Metilorange, soluie alcoolic 0,1% Modul de lucru: n trei flacoane Erlenmeyer se introduc cte 10 ml HCl 0,1 N, 5 ml soluie de NH3, 1-2 picturi de metiloranj i se titreaz excesul de acid cu o soluie titrat de NaOH 0,1 N pn la virajul indicatorului de la rou la portocaliu. Calcul: 1000ml HCl 0,1 N vHCl

................. 1,7 g NH3

FHCl - v NaOH FNaOH ...........x

x = g NH3/ 5 ml vHCl

FHCl - v NaOH FNaOH = volumul teoretic de HCl, obinut pe cale

titrimetric, ce conine cantitatea de HCl care a reacionat cu NH3 din prob; vHCl = 10 ml; v NaOH
0,1 N

= media aritmetic a volumelor de

echivalen obinute la titrarea celor 3 probe paralele. Concentraia soluiei de amoniac se exprim n g/100 ml, adic C NH3 %(m/v) = 20 x Titrarea unui acid slab cu o baz tare Principiu: La titrarea unui acid slab cu o baz tare se formeaz o sare hidrolizabil. De exemplu titrarea acidului lactic cu o soluie titrat procese chimice: de NaOH implic urmtoarele

28

CH3

CH OH

COOH + Na+ + HO -

CH3

CH OH

COO- + Na+ + H2O

H2O

H+ +OH -

H+ +CH3 - CH - COOOH

CH3 - CH - COOH OH

Din ecuaii reiese c anionii acidului slab, rezultai prin ionizarea complet a srii, se combin cu H+ rezultai n urma procesului de disociere a H2O . Astfel descrete, iar

[H ]
+

[ OH ]

>

[H ]
+

ceea ce determin reacia alcalin a soluiei. La punctul

de echivalen soluia are un pH > 7. n general, soluiile apoase ale srurilor acizilor slabi cu baze tari sunt alcaline. Se alege acel indicator al crui interval de viraj conine valoarea pH-ului soluiei srii hidrolizabile. n cazul de fa este folosit indicatorul fenolftalein, al crui interval de viraj este cuprins ntre 8-10 uniti de pH. Aa cum se vede n figura de mai jos, n care acidul slab este CH 3COOH, folosirea unui indicator cu

interval de viraj n mediul acid nu permite punerea n eviden cu precizie punctul de echivalen al reaciei Aplicaie: Dozarea acidului lactic cu o soluie titrat de NaOH Reactivi: - Soluie NaOH 0,1N cu factorul cunoscut - Soluie alcoolic de fenolftalein 0,1% Modul de lucru: n trei flacoane Erlenmayer se msoar cte 10 ml soluie acid lactic, se adaug 3-4 picturi de fenolftalein i se titreaz cele trei probe cu o soluie titrat de NaOH 0,1

29

N, pn la virajul indicatorului de la incolor la roz slab persistent cel puin 20 de secunde . Concentraia acidului lactic se exprim n procente mixte i se calculeaz n felul urmtor: 1000 ml NaOH 0,1 N ............... 9 g acid lactic

v FNaOH ............................ x
x = g/10 ml c% (m/v) = 10 x Titrarea unei baze slabe cu un acid tare Principiu: La titrarea unei baze slabe cu un acid tare se formeaz o sare hidrolizabil, pH-ul n punctul de echivalen fiind mai mic dect 7. n general soluiile apoase ale srurilor acizilor tari cu baze slabe sunt acide. De exemplu titrarea unei soluii de NH3 cu o soluie titrat de HCl implic urmtoarele procese chimice:
NH3 + H2O NH4OH + NH4 + Cl- +H2O

NH4OH + H+ + ClH2O H+ + OHNH4OH

NH+ + OH4

Ionii OH- rezultai n urma procesului de disociere a H2O au tendina de a reaciona cu o parte din ionii de amoniu formai. Astfel

[ OH ]

descrete, iar

[H ]
+

>

[ HO ]

ceea ce determin reacia acid a soluiei. La punctul de echivalen soluia are

un pH < 7. Prin urmare se alege acel indicator al crui interval de viraj conine pH-ul soluiei srii rezultate n urma titrrii (NH4Cl). n acest caz se poate folosi metiloranjul (figura de mai jos).

30

Titrrile acizilor slabi cu baze slabe (i invers), nu produc variaii brute i mari a pH-ului n jurul punctului de echivalen. De aceea ele sunt rar utilizate n titrimetria acido-bazic.

Oxidimetria volumetric
Date generale n oxidimetrie toate reaciile chimice au loc cu transfer de electroni, ele denumindu-se oxido-reduceri sau reacii redox. Dup reactivii utilizai oxidimetria se poate mpri n: a) Permanganometria, care folosete drept component oxidant KMnO4. b) Iodometrie, n care ca reactiv se folosete I2 sau I-, ca oxidant respectiv reductor, dup caz. c) Alte procedee [bromatometrie(KBrO3), cerimetrie (Ce(SO4)2), bicromatometrie (K2Cr2O7), iodatometrie (KIO3)] utilizeaz compuii precizai ntre paranteze ca oxidani. Reaciile redox pot fi utilizate n vederea unor dozri, dac ele ntrunesc anumite condiii: - s fie totale n sensul dorit ( adic s fie cantitative), - s decurg cu vitez mare, pentru ca deteminrile s se efectueze ntr-un timp scurt, - s se poat observa uor punctul de echivalen, care arat sfritul reaciei chimice. Grupa metodelor volumetrice bazate pe reacii redox cuprinde procedee de determinare cantitativ, care se realizeaz prin titrarea substanelor reductoare cu oxidani i a substanelor oxidante cu reductori. Majoritatea reaciilor redox sunt reversibile, al cror echilibru dinamic poate fi deplasat ntr-un sens sau altul n funcie de condiiile de lucru. Ca n oricare alt metod volumetric i n oxidimetrie (titrimetria redox) se urmrete atingerea punctului de echivalen care se poate indica vizual sau instrumental. De exemplu, n permanganometrie, permanganatul de potasiu este o substan colorat ce poate s funcioneze ca indicator, fiindc un mic exces de reactiv produce o schimbare de culoare uor sesizabil. n cazul titrrilor iodometrice, la punctul de echivalen poate s apar un exces de iod molecular sau s dispar acest exces, ceea ce se poate indica cu ajutorul amidonului tiut fiind c amidonul formeaz cu I2 un complex violet intens colorat. 31

Permanganometrie
Principii: Permanganatul de potasiu, KMnO4, este unul dintre oxidanii cei mai folosii, datorit potenialului de oxidare mare al sistemului MnO4-/Mn2+. Oxidarea se poate efectua att n mediu acid ct i n mediu neutru sau alcalin. Puterea oxidant a permanganatului scade mult cu creterea pH-lui soluiei. Reaciile care se petrec n diferite medii sunt cele artate mai nainte la calcularea echivalenilor-gram ai KMnO4. Rescrierea simplificat a lor pune n eviden numrul de electroni acceptai de o molecul de oxidant: - n mediu acid KMnO4 accept 5 electroni/molecul: MnO4- + 8H+ + 5e- <=> Mn 2+ + 4H2O; - n mediu neutru sau aproape neutru se transfer 3 electroni: MnO4-+ 4H+ + 3e- <=> MnO2 + 2H2O - n mediu alcalin, accept un singur electron: MnO4- + e- <=> MnO4 2Permanganatul de potasiu cristalin este de culoare violet, aproape neagr. Lumina, creterea temperaturii, a dilurii, a aciditii sau a alcalinitii soluiei, prezena corpilor strini mai ales n pulbere, accelereaz descompunerea permanganatului. De aceea soluiile de KMnO4 se pstreaz n soluie neutr, n sticle brune (la ntuneric) i la temperatura obinuit. Stabilirea factorului soluiei de KMnO4 0,1N Avnd n vedere instabilitatea KMnO4 este necesar determinarea periodic a factorului soluiei de KMnO4 folosindu-se ca substan etalon acidul oxalic. Reactivi: - Soluie (COOH)2 0,1N cu factor cunoscut - Soluie H2SO4 20% Modul de lucru: n trei baloane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml soluie de acid oxalic 0,1N cu factor cunoscut, se adaug cte 10 ml H2SO4 20%, se nclzete la 70-80C i se titreaz cu KMnO4 0,1N pn la roz slab, persistent cel puin 10 secunde. Factorul soluiei de KmnO4 se calculeaz dup formula: VKMnO4 F KMnO4 = V acid oxalic F acid oxalic unde VKMnO4 este media aritmetic a volumelor de echivalen a celor trei probe paralele. 32

Vacid oxalic Facid oxalic

FKMnO4 =
VKMnO4

Determinri permanganometrice n mediu acid Permanganatul de potasiu n mediu puternic acid (H2SO4 20%), la temperatura de 70-80 C, se reduce la sarea manganoas (MnSO4) punnd n libertate oxigen, conform reaciei cunoscute 2KMnO4 + 3H2SO4 = K2SO4 + 2MnSO4 +3H2O +5[O] Reacia decurge autocatalitic deoarece ionii manganoi (Mn2+ i Mn3+) formai n primul moment catalizeaz reducerea n continuare a permanganatului de potasiu. Decolorarea soluiei se produce datorit faptului c MnSO4 format este incolor n soluii diluate. Soluia acid de permanganat servete n oxidimetrie, pentru dozarea volumetric a acidului oxalic, a apei oxigenate i a altor substane (acidului azotos, etc). Sfritul titrrii se recunoate prin dispariia sau apariia culorii violete determinate n soluie de ionul MnO4-. Dozarea acidului oxalic (micrometod) Principiu: Reacia titrimetric este urmtoarea: 5(COOH)2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +10CO2 +8H2O Reactivi: - Soluie H2SO4 20% - Soluie KMnO4 0,01 N cu factor, FKMnO4, cunoscut Modul de lucru: n trei flacoane Erlenmeyer se msoar cte 1 ml soluie de acid oxalic de dozat. Se adaug cte 1 ml H2SO4, 2 ml ap bidistilat i se nclzete pn la 70-80C. Se titreaz cu KMnO4 0,01N pn cnd soluia rmne colorat n roz slab cel puin 10 secunde. Calcul 1000 ml KMnO4 0,01N reacioneaz cu 0,01 Eq-gram de acid oxalic= 0,45 g acid oxalic V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ c%(m/v) = 100x x g acid oxalic x g (COOH)2 ........................... 1 ml soluie

33

Aceast reacie nu se produce direct: o pictur de soluie de permanganat nu se decoloreaz imediat cnd este adugat ntr-o soluie coninnd exces de acid oxalic i sulfuric. Culoarea roz a soluiei (datorat prezenei ionului MnO4-) persist, disprnd numai dup un anumit interval de timp deoarece reacia redox corespunztoare are o cinetic lent pn la formarea catalizatorului (Mn3+). Apoi ionii Mn3+ se reduc la Mn+2, care este un proces instantaneu. n ultima etap manganul (II) format reacioneaz rapid cu ionul MnO4- (VII), formndu-se Mn (III) foarte reactiv care oxideaz acidul oxalic, finalul titrrii fiind determinat de epuizarea (COOH)2 din prob i apariia unui mic exces de ioni MnO4- care coloreaz persistent soluia de titrat. Secvena de reacii ale procesului autocatalitic este urmtoarea: (1) Mn(VII) + (COOH)2 -------> Mn(III) +CO2 (lent) (2) Mn(III) + (COOH)2 -------> Mn(II) + CO2 (3) Mn(II) + Mn(VII) ---------> Mn(III) (instantaneu) (rapid).

n stadiul iniial viteza reaciei este controlat de etapa lent (1). De ndat ce concentraia ionilor Mn(II) devine apreciabil, reducerea permanganatului poate s se desfoare rapid pe calea procesului (3). Spre finalul titrrii culoarea MnO4- dispare tot mai greu datorit scderii concentraiei acidului oxalic. Reacia este accelerat n final, ca i la nceput, prin nclzire la 70-80C . Dozarea apei oxigenate (macrometod) Principiu: Dozarea se poate face tot prin titrarea direct cu permanganat n soluie de acid sulfuric. Apa oxigenat (peroxid de hidrogen) funcioneaz att ca oxidant, dup reacia:

H2O2+2H++2e- 2H2O; ct i ca reductor, dup reacia: H2O2 2H++O2; n soluie acid permanganatul de potasiu este redus dup reacia: 5H2O2 +2KMnO4 +3 H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 +8H2O +5O2 Modul de lucru: n trei flacoane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml soluie de ap factor, FKMnO4, cunoscut pn cnd soluia rmne colorat n roz slab. oxigenat de dozat. Se adaug cte 10 ml H2SO4 20%. Se titreaz cu soluie de KMnO4 0,1N cu

34

Calcul: 1000 ml KMnO4 0,1N sunt echivaleni cu ...................1,7 g ap oxigenat x g ap oxigenat 10 ml soluie V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g H2O2 c% (m/v) = 10x

Iodometrie
Principiu: Metoda se bazeaz pe sistemul redox: I2 + 2e- <=> 2I- al crui potenial redox standard biochimic este E0 = 0,62 V (pH = 7) n soluii de iodur coninnd ionul I3-, reacia redox i valoarea potenialului redox standard biochimic sunt: I3- + 2e- <=> 3 IE0 = 0,54 V (pH=7) n aceste reacii, iodul molecular este oxidant, iar substanele care au un potenial redox mai mic dect + 0,54V vor fi oxidate de ctre iod i se vor putea determina uor. Un exemplu este reacia cu tiosulfat: I2 + 2S2O32- 2I- +S4O62- (ioni tetrationat) Substanele care au potenial redox mai mare (substanele oxidante), cum este ionul Fe3+, pun n libertate iodul molecular conform reaciei: 2Fe3+ + 2I- 2Fe2+ + I2 Calculul de baz al iodometriei este deci urmtorul: din cantitatea de iod eliberat de un oxidant sau din cantitatea de I2 redus de un reductor se poate calcula cantitatea oxidantului sau reductorului. Sfritul reaciei dintre substana de analizat i iod, n prezen de iodur, este determinat cu ajutorul amidonului, care formeaz un compus colorat intens albastru, de forma [(C6H10O5)4I]4 KI. Sensibilitatea indicatorului este mare, punndu-se n eviden circa 1,5 mg iod la litru de soluie, ( 10-5N) acidulat cu HCl sau H2SO4. Creterea temperaturii soluiei de titrat sau prezena alcoolului metilic sau etilic micoreaz sensibilitatea indicatorului. Tot ca indicator n iodometrie se poate folosi o soluie alcoolic 0,2% de naftol-flavon, care cu iodul d un compus colorat tot n albastru. Acest indicator este ns mult mai sensibil dect amidonul i se poate folosi la titrarea soluiilor mai diluate

35

de iod ( 10-3n) sau la titrarea iodometric a soluiilor colorate, n lumin ultraviolet cnd, la un exces de iod, fluorescena albastr a indicatorului dispare. n acelai mod se folosete i rodamina B, a crei fluorescen roie la lumina ultraviolet dispare n prezena unui mic exces de iod. Dozarea substanelor reductoare Substanele reductoare pot fi dozate n dou feluri: - substana de dozat se titreaz direct cu soluie de iod, - substanei de dozat i se adaug soluie de iod n exces i excesul de iod se titreaz cu o soluie de tiosulfat de sodiu cu factor cunoscut. Sfritul acestor titrri poate fi determinat cu unul din indicatorii prezentai mai sus. Reacia titrimetric este: 2Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6 Stabilirea factorului soluiei de Na2S2O3 0,01 N Principiu: n cazul soluiei etalon de permanganat de potasiu au loc urmtoarele reacii: 10 KI + 2 KMnO4 + 16 HCl = 12 KCl + 2 MnCl2 + 5 I2 + 8 H2O I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6 Reactivi: - Soluie de KMnO4 0,01 N cu factorul FKMnO4 - Soluie de HCl 15% - Soluie de KI 0,5% Modul de lucru: n 3 baloane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml soluie de permanganat 0,01 N, se adaug cte 5 ml soluie de HCl 15% i 10 ml soluie de KI 0,5%. Dup 5 minute de repaus se titreaz cu tiosulfat de sodiu iodul pus n libertate pn la culoarea galben-deschis a soluiei. Se adaug 2 ml soluie de amidon 0,5% i se continu titrarea pn la albastru pal agitnd puternic. O pictur de soluie de tiosulfat n exces decoloreaz complet soluia. Calcul: Se folosete formula VNa2S2O3FNa2S2O3 = VKMnO4FKMnO4

VKMnO FKMnO adic FNa2S2O3 =

4 4

VNa2S2O3

36

Dozarea substanelor oxidante Din soluia de KI oxidanii pun n libertate iod elementar. Cantitatea de iod pus n libertate este echivalent cu cantitatea substanei oxidante adugate. Iodul elementar pus n libertate se dozeaz prin titrare cu tiosulfat de sodiu care reduce iodul la ioni de iodur conform reaciei de mai sus. Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometod) Principiu: Iodul rezultat prin oxidarea ionilor I- de ctre ionii [Fe(CN)6]3- conform reaciei, 2 [Fe(CN)6]3- + 2 I- 2 [Fe(CN)6]4- + I2, este titrat cu tiosulfat de sodiu n prezena amidonului ca indicator. Reacia are loc n mediu slab acid (CH3COOH) ns, fiind reversibil, deplasarea ei spre dreapta se realizeaz prin adaosul de ioni Zn2+ din amestecul CH3COOH ZnSO4. Are loc reacia: 2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4 K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3 K2SO4 Ireversibilitatea acestei reacii se datoreaz insolubilitii srii duble a ferocianurii. Reactivi: - Soluie KI 0,5 % - Soluie CH3COOH - ZnSO4 (3% fiecare) - Soluie Na2S2O3 0,01 N cu factor cunoscut - Soluie amidon 0,5 % Modul de lucru: n 3 baloane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml fericianur de potasiu. Se adaug cte 10 ml soluie de KI i 15 ml CH3COOH - ZnSO4. Dup 5 minute se titreaz cu soluie de tiosulfat de sodiu 0,01N iodul pus n libertate pn la decolorarea aproape complet a soluiei. Se adaug 2 ml soluie de amidon i se continu titrarea pn la dispariia culorii albastre. Calcul: 1000 ml Na2S2O3 0,01N ..3,29 g K3[Fe(CN)6] VFNa2S2O3...........................................x g x g K3[Fe(CN)6].10 ml sol c%(m/v) = 10 x Dozarea K3[Fe(CN)6] (micrometod) Principiu i reactivi: sunt aceeai ca i la macrometod.

37

Modul de lucru: n 3 baloane Erlenmeyer se msoar cte 2 ml ap bidistilat. Se adaug cu ajutorul micropipetei cte 0,10 ml fericianur de potasiu. Se adaug cte 1 ml soluie de KI i 1,5 ml CH3COOH - ZnSO4. Dup 5 minute se titreaz iodul eliberat cu soluie de tiosulfat de sodiu 0,01N n prezena de 0,2 ml amidon pn la dispariia culorii albastre. Calcul: 1000 ml Na2S2O3 0,01N ..3,29 g K3[Fe(CN)6] VFNa2S2O3...........................................x g x g K3[Fe(CN)6].0,1 ml sol c%(m/v) = 1000 x Sistemul I2/I- se gsete n concentraie foarte mic n apa de mare (0,05 mg/l), deoarece iodul este legat n cea mai mare parte sub form organic. Plantele marine extrag iodura din apa de mare. Iodura se regsete n cenua acestor plante. Se mai gsete iodur n cantiti variabile (7-46 g/m3) n apele fosile care nsoesc petrolul i, n concentraii mai mici, n unele ape minerale. Iodul apare, n concentraii foarte mici, n toate vieuitoarele i este indispensabil pentru viaa acestora. La animalele superioare, iodul este concentrat n glanda tiroid ntr-o protein numit tireoglobulin. Lipsa de iod n apa de but, n special n unele regiuni muntoase, determin apariia, la populaia acelor regiuni, a unor maladii ale glandei tiroide (gu).

Complexometria volumetric
Metodele complexometrice servesc la dozarea cationilor prin titrare cu soluia agentului complexant. Prin metodele indirecte se pot doza complexometric i anioni, precum i substanele organice. Din numrul mare de reactivi unul frecvent folosit este complexonul III (EDTA Na2) utilizat spre exemplu pentru titrarea ionilor Ca2+.

38

N CH2 CH2 N

CH2

COOH CH2

CH2 C O O- Na+ +Ca2+ O- Na+ CH2 C CH2 O COOH

CH2 COOCH2 C O Ca O O CH2 CH2 O COOC

2-

+2 Na++2H+

CH2 N

complexon III (etilendiamino-tetraacetatul disodic)

complexonat de calciu

Existena mai multor cicluri pentaatomice imprim moleculei o mare stabilitate. Stabilitatea complexului format este una din condiiile pe care trebuie s o ndeplineasc o reacie care st la baza unei metode complexometrice. Stabilitatea se exprim cantitativ prin constanta de stabilitate KMY. Dac notm cu M ionul de metal i cu Y agentul de complexare, reacia de complexare este urmtoarea:

M +Y

MY

Constanta de stabilitate este exprimat prin relaia:

K MY =

[ M ] [ Y]

[ MY ]

Valoarea constantei de stabilitate depinde de natura complexului i de o serie de ali factori, cum ar fi pH-ul soluiei. Indicatorii folosii n complexometrie sunt indicatorii metalocromici, colorani organici, care formeaz compleci interni cu cationii metalici, de alt culoare dect aceea a indicatorului liber. Indicatorul trebuie s fie ales n aa fel nct stabilitatea complexului format de el cu ionii de metal s fie mai mic dect stabilitatea complexului format agentul de complexare cu ionii metalici. n tabelul de mai jos sunt prezentai principalii indicatori metalocromici, cationii pentru care sunt folosii i logaritmul constantelor de stabilitate ale lor n mediile precizate.

39

Indicator metalcromic Eriocrom negru T

Cationi Cd2+ Co2+ Cu2+ Mg2+ Pb2+

Mediu NaClO4 0,3N NaClO4 0,3N NaClO4 0,3N NaClO4 0,3N KNO3 0,1N NaClO4 0,2N NH4ClO4 0,2N NaClO4 NaNO3 0,2N NaClO4 0,2N KCl 0,2N NaClO4 0,1N KCl 0,1N KCl 0,1N KCl 0,1N

lg KMY 12,74 20,00 21,38 7,00 13,19 12,31 2,68 3,50 3,36 10,01 9,04 14,05 3,92 75,60 11,67 4,32 4,10 15,60 9,30 3,70 4,35

Murexid

Zn2+ Ca2+ Cu2+ Ni2+ Al3+ Cu2+ Fe3+

Acid sulfosalicilic

Ftaleincomplexon Xilenoloranj

Ba, Sr, Ca Be2+ Bi3+ La3+ Pb2+, Zn2+, Hg2+, Sn2+ Ca2+ Al3+ Cu2+ Fe3+ Ni2+ Fe2+ Zn2+

Acid calconcarbonic Cromazurol S

, `- Dipiridil

Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometric (metoda Budesinsky) Principiu : Fosfatul cupric, greu solubil n ap, reacioneaz n mediu neutru cu aminoacizii formnd compleci de tipul chelailor. Un aminoacid monoamino-monocarboxilic 40

complexeaz ionii Cu2+ n raport de 2:1 formnd un complex solubil n ap. Reacia este urmtoarea:
COOH 6 HC NH2 + 3(PO4)2 Cu R COO H 3HC N R H H Cu N R CH +2PO43- +6H+

H OOC

Excesul de fosfat cupric nedizolvat se poate separa prin centrifugare sau filtrare. Prin adugare de HCl la filtrat se elibereaz ionii cuprici din complex conform reaciei: COO HC H N H Cu N H OOC R CH +2HCl COOH Cu2++2 Cl- +2 HC R NH2

R H

Ionii cuprici eliberai se dizolv prin titrare cu complexon III n prezena indicatorului metalocromic piridilazonaftol (PAN). Reacia titrimetric de complexare este urmtoarea: 2N CH2 CH2 N CH2 CH2 COOH C O O- Na+ 2+ - Na+ +Cu O C O COOH Modul de lucru: n trei flacoane Erlenmeyer se pipeteaz cte 5 ml soluie aminoacid, 5 ml suspensie agitat de Cu3(PO4)2, se agit bine i apoi se las 5 minute n repaos. Amestecul se filtreaz i din filtrate se pipeteaz cte 5 ml n trei flacoane Erlenmeyer curate. Se adaug ctre 1 ml soluie HCl, 3 picturi indicator PAN i se titreaz ionii Cu CH2 CH2 N N CH2 COOCH2 C O Cu CH2 CH2 O
O

+2Na++H+

CH2 CH2

O COO-

Reactivi:

soluie complexon III 0,01N cu factor cunoscut soluie HCl 0,01N indicator PAN 0,1 % n soluie etanolic suspensie de Cu3(PO4)2

41

2+

eliberai cu o soluie de complexon III 0,01 M pn la virajul indicatorului de la rou Calcul: Dac se cunoate natura aminoacidului prezent se ia n calcul masa molecular a

violet la galben-verzui.

lui. Dac este vorba de un amestec de aminoacizi

monoamino-monocarboxilici

rezultatul se exprim n mg N -aminic/100 ml sau mmoli N -aminic/l. 1000 ml sol. complexon III 0,01 M ....................0,01

2 14 g N
x

v FComplexon III ................................... ..............................

x = .......g/ 2,5 ml c% (m/v) = 40 x

Volumetria prin reacii de precipitare

Principii: Soluia de reactiv formeaz cu componentul de dozat un precipitat insolubil. Din volumul reactivului folosit pentru precipitarea complet a componentului de dozat se calculeaz cantitatea componentului respectiv. Pot fi utilizate numai acele reacii, la care precipitatul format are compoziie constant, reacia decurge rapid i punctul de echivalen poate fi indicat. Fiecare metod necesit indicator aparte. Dac n cursul titrrii se formeaz precipitat alb sau de culoare deschis, putem folosi un indicator care cu ionul de dozat sau cu excesul reactivului d reacie de culoare sau precipitat colorat. Dintre metodele bazate pe reacii de precipitare cea mai des utilizat este argentometria, n care se ntrebuineaz ca reactiv AgNO3. Azotatul de argint (ionii de Ag+ ) formeaz cu ionii Cl-, Br-, I-, SCN- precipitate practic insolubile. Prepararea unei soluii de AgNO3 0,01N Azotatul de argint chimic pur se deshidrateaz la 210-250C. Dup rcire se cntrete cantitatea necesar (1,6989 g/l) se dizolv i se completeaz cu ap distilat la volumul necesar. Dac nu se msoar exact cantitatea teoretic de AgNO3, soluia va avea factorul:
Cantitatea msurat F AgNO3 = 1,6989

Soluia se pstreaz n sticl brun.

42

Stabilirea factorului soluiei de NH4SCN 0,01 N Principiu: n vederea determinrii, un volum precis de AgNO3 0,01 N (cu factorul cunoscut) se titreaz cu NH4SCN. Are loc reacia: AgNO3 + NH4SCN = AgSCN + NH4NO3 Drept indicator servete alaunul feric. Indicarea sfritului titrrii are loc prin urmtoarea reacie: exces de NH4SCN. Modul de lucru: n trei baloane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml soluie 0,01 N AgNO 3 cu factorul cunoscut. Se adaug 5 ml HNO3 10% i 2 ml alaun feric ca indicator. Se titreaz cu soluia de NH4SCN 0,01 N, agitnd puternic, pn la roz pal persistent. Se calculeaz factorul din relaia: VSCNF SCN = VAgNO3F AgNO3 Dozarea clorurilor prin metoda Volhard Principiu: Dozarea indirect a ionului de clor dup Volhard const n urmtoarele etape. La soluia de analizat, acidulat cu HNO3, se adaug n exces o soluie titrat de AgNO3. Are loc reacia: AgNO3 + Cl = AgCl + NO3 Excesul de azotat de argint se titreaz cu sulfocianur n prezen de Fe3+ ca indicator. AgNO3 + SCN = AgSCN + NO3 Modul de lucru: n 3 baloane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml soluie care conine ionii de Cl, se adaug 20 ml soluie 0,01N de azotat de argint 10 ml acid azotic 10% se aduce la fierbere, se adaug 2 ml alaun feric 20%. Se titreaz cu o soluie 0,01 N de NH4SCN agitnd puternic, pn la roz slab, persistent timp de 5 10 secunde. Calcul: Rezultatul se va exprima n mM/l. Fiind vorba de o titrare prin diferen, raionamentul este identic cu cel din cazul determinrii amoniacului. Fe3+ + 3 SCN- = Fe(SCN)3 Formarea sulfocianurii de fer, substan intens colorat n rou, indic un mic

43

Identificarea glucidelor
Reacii de reducere Reaciile de reducere nu sunt specifice doar glucidele reductoare, ele fiind date i de alte substane neglucidice cu caracter reductor. Caracterul reductor al monozaharidelor i a unor dizaharide este datorat prezenei n molecula lor a funciunii carbonilice, care se poate oxida, reducnd la cald i n mediu alcalin cationii metalelor grele: Cu, Ag, Bi, precum i unele substane organice ca acidul picric, indigoul, etc. 1. Reacia Fehling Principiu: Gruparea carbonil din glucidele reductoare reduce la cald Cu2+ pn la Cu+ din complexul solubil format n mediu alcalin cu sarea Seignette (tartrat dublu de sodiu i potasiu). Se formeaz Cu2O, pulbere de culoare roie-crmizie, conform reaciilor: CuSO4 + 2KOH Cu(OH)2 + K2SO4 C6H12O6 + 2 Cu(OH)2 C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O
acid gluconic

Reactivi:

- Reactivul Fehling se obine n urma amestecrii soluiei I i II n volume egale, operaie ce se desfoar n momentul ntrebuinrii. - Soluia I: CuSO4 35 g/1000 ml soluie - Soluia II: 150 g sare Seignette i 90 g NaOH la 1000 ml soluie - Soluii 2% de glucoz, fructoz, lactoz.

Modul de lucru: Se amestec ntr-o eprubet 1 ml reactiv Fehling I cu 1 ml reactiv Fehling II se adaug 2 ml soluie de glucid i se nclzete pn la fierbere agitnd continuu. n prezena unui glucid reductor se formesaz un precipitat rou-crmiziu de Cu2O. 2. Reacia Benedict Principiu: Glucidele reductoare reduc la cald n mediu alcalin hidroxidul de cupru de culoare albastr n oxid de cupru (I) de culoare roie-crmiziu. Reacia Benedict prezint avantajul c se folosete un singur reactiv, ionul de Cu2+ fiind complexat n soluie de ctre citratul de sodiu. 44

Reactivi:

- Reactivul Benedict: 173 g citrat de sodiu i 100 g Na2CO3 anhidru se dizolv n 800 ml H2O distilat fierbinte, se filtreaz i se aduce volumul la 850 ml. Se dizolv separat 17,3 g CuSO 4 5 H2O n 100 ml H2O distilat, se adaug sub agitare primei soluii i se completeaz volumul soluiei finale la 1000 ml. - Soluii 2% de glucoz, fructoz, lactoz.

Mod de lucru: ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie de glucid i 3 ml reactiv Benedict, se nclzete pn la fierbere agitnd continuu. Apariia unui precipitat rou-crmiziu implic existena n soluie a glucidului reductor. 3. Reacia Tollens Principiu: Glucidele reductoare reduc la cald Ag+, din azotatul de argint amoniacal, la Ag metalic care se depune pe pereii eprubetei sub forma unei oglinzi (oglinda de argint), conform reaciilor: AgNO3 + NaOH AgOH + NaNO3 AgOH + 2 NH3 [Ag(NH3)2]OH C6H12O6 + 2 [Ag(NH3)2]OH C6H12O7 + 2 Ag + 4NH3 + H2O Reactivi: - soluie AgNO3 5% n ap distilat - soluie NH4OH 20% - soluii 2% de glucoz, fructoz, lactoz. Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduc 1 ml AgNO3, se adaug pictur cu pictur soluie de amoniac pn la dizolvarea precipitatului format iniial. Se adaug 1 ml soluie glucidic i se introduce eprubeta ntr-o baie de ap nclzit la fierbere. n cazul existenei unui glucid reductor n soluia glucidic se formeaz oglinda de argint. nclzirea eprubetei se poate face i direct la flacr sub agitare blnd. 4. Reacia Nylander Principiu: Gruparea carbonil din glucidele reductoare reduce azotatul de bismut n bismut metalic de culoare neagr.

45

Reactivi:

- Reactivul Nylander: 20 g azotat bazic de bismut, 40 g sare Seignette i 100g NaOH se dizolv n ap pentru 1000 ml soluie. - Soluii 2% de glucoz, fructoz, lactoz.

Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie glucidic i 1 ml reactiv Nylander, se nclzete pn la fierbere agitnd continuu. n prezena unui glucid reductor n soluie apare un precipitat negru-brun. 5. Reacia Barfoed Principiu: Reacia Barfoed permite diferenierea monozaharidelor reductoare, pentru care reacia este pozitiv, de dizaharidelor reductoare pentru care reacia este negativ. Principiul reaciei const n reducerea n mediu acid a ionilor de Cu2+ la Cu+ din Cu2O, care se depune pe fundul eprubetei sub forma unui precipitat rou-crmiziu. De fapt reacia este potrivit att pentru monozaharide ct i pentru dizaharide reductoare. Diferena const n vitezele de reacie foarte diferite: mari pentru monozaharide; mici pentru dizaharidele reductoare. Reactivi: - Reactivul Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolv n 200 ml H2O distilat, se filtreaz i se adaug 1,8 ml acid acetic glacial. - Soluii 2% de glucoz, fructoz Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie glucidic i 2 ml reactiv Barfoed, se nclzete pn la fierbere agitnd continuu timp de 1-2 minute. Apariia unui inel de precipitat rou-crmiziu la suprafaa soluiei i depunerea de precipitat rou-crmiziu pe fundul eprubetei pune n eviden prezena monozaharidelor. 6. Reacia cu acidul picric Principiu: Glucidele reductoare reduc una din gruprile nitro ale acidului picric (de culoare galben) la grupare amino, cu formare de acid picramic (de culoare brun-roie).

46

Aceast reacie poate servi la dozarea colorimetric a glucidelor reductoare (metoda Crecelius-Seifert). Reactivi: - acid picric 0,5% - glucoz 1% - NaOH 10% Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie de glucoz, 2 ml acid picric i 1 ml NaOH. Se nclzete pn la fierbere, agitnd continuu pn la apariia unei coloraii roii-brune. Reacii de culoare Reaciile de culoare sunt specifice monozaharidelor care sub aciunea acizilor minerali concentrai se deshidrateaz i se transform n furfurol sau n derivai ai lui.
H H CHO 3 H2O O furfurol HO - C - C - OH CH - CHO H2C OO H H pentoz H H HO - H2C 3 H2O O hidroxim - furfurol etil CHO

HO - C - C - OH HO - CH2 - HC CH - CHO O O H H hexoz

Furfurolul i derivaii lui pot reaciona cu fenolii, n urma reaciei rezultnd compui colorai.

47

1. Reacia Molisch Principiu: n prezena acidului sulfuric concentrat, monozaharidele (pentozele, hexozele) se transform n furfurol (hidroximetil furfurol) care reacioneaz cu -naftolul n raportul 1:2 formnd produi de condensare de culoare violet. Aceast reacie o dau la cald toate glucidele deorece, sub aciunea H2SO4 conc. ele hidrolizeaz punnd n libertate monozaharidele.
OH

R O

CHO

H + H H2O OH

OH

R O

CH

OH

Reactivi:

- reactivul Molisch: soluie alcoolic 5% de alfa-naftol - H2SO4 conc. - soluie de glucoz 1%

Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie glucoz 1%, se adaug 1-2 picturi din soluia de alfa-naftol i apoi se toarn cu precauie pe peretele nclinat al eprubetei H2SO4 conc. La suprafaa de contact a celor dou straturi de lichide cu densiti diferite se formeaz un inel violet.

48

2. Reacia Bial Principiu: Reacia Bial servete la identificarea pentozelor, pentru care reacia este pozitiv, fa de hexoze, ea fiind negativ. n prezena acizilor minerali tari, pentozele reacioneaz cu orcina (5-metilrezorcina) formnd produi de condensare de culoare violet sau albastru-verde n funcie de natura acidului folosit. Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcin se dizolv n 200 ml alcool etilic 96% i se adaug 40 picturi sol. FeCl3 10% - HCl conc. - soluie 1% de fructoz, arabinoz, glucoz Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduc 2 ml sol. de pentoz, iar n alt eprubet 2 ml soluie de glucoz. Se adaug n fiecare eprubet 10 picturi reactiv Bial i cte 2 ml HCl conc. Se agit coninutul eprubetelor, se astup cu dopuri de vat i se las ntr-o baie de ap ce fierbe timp de 10 minute. Coninutul eprubetei n care se gsete soluia de pentoz devine albastru-verzui. 3. Reacia Seliwanoff Principiu: Reacia Seliwanoff servete la diferenierea cetozelor de aldoze. Monozaharidele n prezena HCl conc. reacioneaz cu rezorcina (sau ali polifenoli) formnd produii de condensare colorai. Reacia este mai rapid i mai intens n prezena cetozelor, cnd se obin produi colorai n rou dect n prezena aldozelor, cnd se obin produi colorai n roz deschis. Reactivi: - reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcin, 100 ml HCl conc., 200 ml H2O distilat. - soluie de fructoz, glucoz 2% Modul de lucru: ntr-o eprubet se introduce 1 ml soluie fructoz i n alt eprubet 1 ml soluie de glucoz. Se adaug n ambele eprubete cte 2 ml reactiv Seliwanoff i se nclzesc probele pn la fierbere. Dup rcire, coninutul eprubetei cu fructoz se coloreaz n rou, iar a celei cu glucoz n roz slab.

49

Reacia cu fenilhidrazina Reacia este specific glucidelor reductoare i are ca rezultat formarea osazonelor. Osazonele diferitelor glucide se deosebesc ntre ele prin structura cristalin ceea ce determin imagini microscopice diferite, aa cum se vede n figura de mai jos. De asemenea ele se deosebesc prin solubilitate, puncte de topire.

Principiu: Reacia glucidelor reductoare cu fenilhidrazina decurge n dou etape: - la rece, se formeaz fenilhidrazina - la cald, n prezena unui exces de reactiv, se formeaz osazona specific glucidului folosit. Cetonele reacioneaz ca i aldozele. Prin RMN s-a dovedit c osazonele au o structur chelatic ciclic. Reactivi: - fenilhidrazin solid - CH3COONa H2O - acid acetic glacial - soluii 10% de glucoz, lactoz, maltoz Modul de lucru: Se introduc cte 5 ml soluie de glucoz, lactoz i maltoz n cte o eprubet, se adaug 0,5 ml acid acetic glacial, puin fenilhidrazin i o cantitate dubl de acetat de sodiu. Se agit i se introduc eprubetele ntr-o baie de ap la fierbere timp de 1/2 de or. Dup rcire apar cristalele galbene specifice, care se vor examina la microscop, punnd 1-2 picturi din fiecare prob pe o lamel de sticl.

50

H C =O HC - OH R g cid lu re c or du t H C =N - NH - C6 5 H H-C - OH R H C =N - NH - C6H5 C =O R H C =N - NH - C6 5 H C =O R H C =N - NH - C6H5 C =N - NH - C6 5 H R os z a on + H2 N - NH - C6 5 H fe ilh n idra in z

H C =N - NH - C6 5 H H2 O HC - OH R fe ilh n idra on z

+ H2 N - NH - C6 5 H NH3 C6 5 - NH2 H

+ H2N - NH - C6 5 H fe ilh ra in n id z

H2 O

Identificarea dizaharidelor Dizaharidele pot fi reductoare - maltoz, lactoz sau nereductoare - zaharoza. Dup o prealabil hidroliz a legturii glicozidice i cele nereductoare vor da reaciile caracteristice de reducere i culoare ale monozaharidelor.

51

Reactivi:

- reactiv Benedict - reactiv Barfoed - acid clorhidric 10% - hidroxid de sodiu 10% - soluii 2% de zaharoz, lactoz, maltoz

Modul de lucru: Se introduc cte 2 ml soluie maltoz, zaharoz i lactoz n cte o eprubet, se adaug 2 ml reactiv Benedict i se nclzesc soluiile pn la fierbere. Reacia este pozitiv n cazul maltozei i a lactozei care sunt dizaharide reductoare. ntr-o alt eprubet se introduc 2 ml zaharoz, 3 picturi HCl 10% i se aduce soluia la fierbere. Dup rcire se neutralizeaz cu 3 picturi de NaOH 10%, se adaug apoi 2 ml reactiv Benedict i se nclzete din nou la fierbere. Reacia va fi pozitiv pentru c n urma hidrolizei au rezultat dou monozaharide reductoare. Identificarea polizaharidelor Principiu: Polizaharidele cu importan biologic - amidonul, dextrinele, glicogenul formeaz cu iodul la rece combinaii colorate diferit: - amidonul cu iodul - albastru - dextrinele cu iodul - brun-rou clar - glicogenul cu iodul - crmiziu opalescent Aceste combinaii sunt termolabile, la cald culoarea dispare i reapare la rcire ceea ce sugereaz termodisocierea lor. Reactivi: - soluie apoas de iod: se amestec 0,2 g I2 cu 1 g KI i 2 ml ap distilat. Dup dizolvare se completeaz la 100 ml cu ap distilat. - soluii 2% de amidon, dextrine, glicogen Modul de lucru: Se introduc cte 2 ml soluie amidon, dextrin, glicogen n cte o eprubet. Se adaug apoi 1-2 picturi soluie de iod i se observ culorile obinute. Se verific dispariia culorilor prin nclzirea eprubetelor i reapariia lor la rcire.

52

Identificarea glucidelor

1. Reacia cu iod incolor monozaharide dizaharide sol.fr glucid rou-brun clar opalescent dextrine glicogen albastru amidon

2. Reacia Benedict (sau Fehling) pozitiv glucid reductor 3. Reacia Barfoed pozitiv monozaharid 4.Reacia Bial pozitiv pentoze negativ hexoze negativ dizaharid 4".Reacia de formare a osazonelor 4'.Reacia Benedict maltosazona lactosazona pozitiv zaharoza 5. Reacia Selivanov negativ sol.fr glucid 3'.Hidroliz acid negativ glucid nereductor soluie fr glucid

pozitiv fructoz

negativ glucoza

53

Identificarea aminoacizilor i proteinelor

Reacii de culoare Reaciile de culoare nu sunt specifice moleculei proteice ca un tot, ci sunt date de prezena n molecula proteic a unor componente structurale, cum ar fi legturile peptidice n cazul reaciei biuretului sau prezena unor anumii aminoacizi n cazul celorlalte reacii. Reacia biuretului Principiu: Substanele care conin legturi peptidice (ncepnd cu tripeptidele) reacioneaz cu Cu2+ n soluie puternic alcalin dnd o coloraie caracteristic violet, purpurie, datorit formrii unui complex colorat n care ionul Cu2+ este unit prin legturi coordinative cu heteroatomi ai aminoacizilor angajai n legtura peptidic. Aceast reacie se folosete i pentru dozarea substanelor proteice prin metod spectrofometric. Simboliznd cu Ri respectiv Ri+1 radicali ai aminoacizilor legai prin legtura peptidic, aceast legtur se poate reprezenta n felul urmtor:

Cel mai simplu compus care d aceast reacie este biuretul, de unde i numele reaciei. Formula biuretului este:

Reactivi: Mod de lucru:

- Sol. CuSO4 1% - Sol. NaOH 10%

La 1-2 ml soluie de cercetat se adaug un volum egal de NaOH i 3-5 picturi de soluie de CuSO4. Se obine o coloraie albastr - violet, fotometrabil.

54

Reacia ninhidrinei Principiu: Ninhidrina (tricetohidrindenhidrat) reacioneaz cu aminoacizii n soluie apoas, neutr sau slab alcalin i la cald, cu formarea unui compus colorat. Coloraia variaz pentru diverii aminoacizi de la roz, rou la albastru-violet (purpura lui Ruhemann) i este galben pentru prolin, galben-brun pentru hidroxiprolin. Aceast reacie este dat nu numai de aminoacizi, ci i de peptide i proteine. Reacia cu ninhidrin este una din reaciile generale folosite pentru identificarea i dozarea aminoacizilor n special la metoda cromatografic. Reactiv: Mod de lucru: La 2-3 ml soluie de cercetat se adaug 0,5 ml soluie de ninhidrin, se nclzete soluia la fierbere cca 30 secunde, apoi se rcete. Se observ formarea unei coloraii albastru-violet (fiindc se lucreaz cu un amestec de aminoacizi). Reacia xantoproteic Principiu: Aceast reacie este caracteristic aminoacizilor aromatici. Astfel fenilalanina, tirozina, triptofanul dau o coloraie galben la nclzire cu acidul azotic concentrat. Reacia este datorat nitrrii nucleului benzenic, respectiv imidazolic. Se poate da ca exemplu reacia fenilalaninei cu acidul azotic: - Sol. de ninhidrin 0,1% cu adaos de piridin.

Reactivi: Mod de lucru:

- HNO3 conc. - Sol. NaOH 5%

La 1 ml soluie de cercetat se adaug cteva picturi de HNO 3 concentrat. Apare un precipitat alb sau o tulburare. Dup fierberea coninutului 1-2 minute apare o culoare 55

galben. La fierbere precipitatul se poate dizolva parial sau complet. Dac dup rcire soluia se alcalinizeaz, culoarea se intensific, se schimb n galben portocaliu. Apariia petelor galbene pe piele n urma aciunii acidului azotic concentrat se explic tot prin reacia xantoproteic. Reacia Adamkiewicz-Hopkins-Cole (reacia triptofanului) Principiu: Triptofanul (aminoacid care se gsete n aproape toate proteinele) d cu acidul glioxilic (OHC-COOH) o coloraie violet. Se folosete ca reactiv acidul acetic glacial, care conine ca impuritate acid glioxilic. Reacia este specific nucleului indolic, astfel produii obinui prin descompunerea triptofanului (indolul i derivaii si) dau i ei reacia pozitiv. Reactivi: Mod de lucru: La 2 ml soluie de cercetat se adaug 2 ml acid acetic glacial, se amestec i se introduc pe fundul eprubetei 2 ml H2SO4 concentrat. La suprafaa de separaie se formeaz un inel violet. Reacia se folosete n laboratoarele clinice pentru diferenierea meningitei tuberculoase de meningitele de alt etiologie, aceast reacie fiind pozitiv numai din lichidul cefalo-rahidian al pacienilor cu meningit tuberculoas. Meningita este inflamaia membranelor care nvelesc creierul i mduva spinrii. Reacia tioaminoacizilor (reacia cisteinei, cistinei) Principiu: Prin fierberea unei soluii alcaline coninnd tioaminoacizi sau proteine ce conin n molecul aminoacizi cu sulf, sulful se elibereaz ca sulfur de sodiu (Na 2S). Sulfura de sodiu rezultat se trateaz cu acetat de plumb i se formeaz un precipitat negru-brun de sulfur de plumb. Reactivi: Mod de lucru: La 1 ml soluie de cercetat se adaug acelai volum de NaOH 30% i se fierbe 35 minute. Dup fierbere se adaug 1-2 ml soluie de acetat de plumb i se fierbe din nou. Se obine un precipitat sau numai o coloraie brun-neagr. - Sol. de NaOH 30% - Sol. de acetat de plumb 10% - Acid acetic glacial - Acid sulfuric concentrat

56

Reacia Pauli (reacia histidinei i tirozinei) Principiu: Tirozina, histidina i proteinele coninnd aceti aminoacizi, formeaz prin cuplare cu acidul diazobenzensulfonic, un colorant azoic roz care se intensific la rou prin alcalinizare. Sinteza srii de diazoniu are loc prin reacia:

Reacia de cuplare este urmtoarea (se ia n considerare i alcalinizarea):

O-Na+ SO3-Na+ + H2O Sarea de diazoniu + tirozin + NaOH

N=N CH2 I H - C - NH2 I COO-Na+ Reactivi: Colorant azoic

- Sol. de acid sulfanilic 1% n HCl 10% - Sol. de NaNO2 5% - Sol. de Na2CO3 30% sau NaOH 10%

Mod de lucru: Se diazoteaz 1 ml soluie de acid sulfanilic adugnd 1 ml soluie de nitrit de sodiu. Se amestec acidul diazobenzensulfonic obinut cu 1 ml soluie de cercetat i

57

dup neutralizare cu 3-4 ml soluie de Na2CO3 (sau cteva picturi de NaOH) se obine o coloraie roie. Reacia Sakaguchi (reacia argininei) Principiu: Soluiile care conin substane cu radicalul guanidinic n molecul, dau n mediu alcalin n prezena alfa-naftolului i a hipocloritului sau hipobromitului de sodiu combinaii colorate n rou. Reactivi: - Soluie de hipoclorit de sodiu - Soluie alfa-naftol: se dizolv 0,1 g alfa-naftol n aprox. 25 ml alcool etilic i se dilueaz cu ap la 100 ml. - Soluie de NaOH 10% Mod de lucru: Se ia ntr-o eprubet 1 ml soluie proteic diluat i se alcalinizeaz cu 1 ml soluie NaOH 10%. Se adaug 1 ml soluie alfa-naftol i soluia de hipoclorit de sodiu pictur cu pictur pn la apariia unei culori viinii. Culoarea dispare la cald.

Reacii de precipitare ale proteinelor

Principiu: Proteinele sunt precipitate de acizi minerali (H2SO4, HNO3, HCl) sau organici (acid tricloracetic, tanic, ferocianic, sulfosalicilic), soluii concentrate de sruri (sulfat de sodiu, sulfat de amoniu, etc.), alcooli (metanol, etanol, etc.), aceton, ioni de metale grele (sruri de argint, mercur, cupru, plumb), nclzire. Precipitarea poate fi reversibil sau ireversibil. Precipitarea salin Principiu: Proteinele sunt macromolecule hidratate n soluie apoas. Dac srurile metalelor uoare sau de amoniu (sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, clorur de sodiu, sulfat de magneziu) adugate soluiilor proteice ating o anumit concentraie, deshidrateaz particulele proteice, care precipit. Precipitatul de protein obinut prin precipitare salin poate fi redizolvat prin micorarea concentraiei srii (prin dializ, diluare), deci este o precipitare reversibil.

58

Deoarece proteinele precipit la concentraii diferite de sruri, precipitarea salin (salting-out) poate fi folosit i pentru fracionarea proteinelor. Astfel globulinele precipit n soluii semisaturate de sulfat de amoniu, iar albuminele numai n soluii saturate de sulfat de amoniu. Reactivi: - Sol. de protein (ser sanguin uman, bovin sau cabalin) - Sol. saturat de (NH4)2SO4 - (NH4)2SO4 solid - NaCl solid - MgSO4 solid - Acid acetic glacial Mod de lucru: ntr-o eprubet se toarn 3 ml soluie de protein. Se adaug acelai volum de soluie saturat de sulfat de amoniu. Astfel obinem o soluie semisaturat de (NH4)2SO4. Dup cteva minute precipit globulinele. Precipitatul se separ prin filtrare. Filtratul conine albuminele. Se pune n filtrat sulfat de amoniu solid pn la saturare (cnd noi cantiti de sare nu se mai solv). n aceast soluie vor precipita albuminele. n dou eprubete se toarn cte 3 ml soluie de protein. ntr-una din eprubete se adaug NaCl, n cealalt MgSO4, pn la saturare. Dup cteva minute n ambele eprubete precipit globulinele. Precipitatul se filtreaz. Filtratul conine albuminele deoarece srurile adugate nu precipit albuminele n soluie neutr. Filtratul se aciduleaz cu cteva picturi de acid acetic glacial. n aceast soluie slab acid precipit albuminele. Precipitarea cu ionii metalelor grele Principiu: Proteinele cu srurile metalelor grele (plumb, cupru, mercur, argint, etc.) formeaz combinaii greu solubile. Precipitarea se produce deja la concentraii mici de sruri i precipitatul obinut n acest caz nu se mai dizolv dup micorarea concentraiei srii prin diluare sau dializ, deci este o precipitare ireversibil. Reactivi: - Sol. de HgCl2 10% - Sol. de CuSO4 10% - Sol. de Pb(CH3COO)2 10% - Sol. de AgNO3 5%

59

Mod de lucru: n 4 eprubete se toarn cte 1 ml soluie de protein. n fiecare eprubet se adaug pictur cu pictur soluie din fiecare reactiv. n toate eprubetele se formeaz precipitate. Acetatul de plumb i sulfatul de cupru nu trebuiesc adugate n exces, deoarece precipitatul format se solv n exces de reactiv (salting-in). Precipitarea cu acizii minerali Reactivi: - HNO3 conc. - HCl conc. - H2SO4 conc. Mod de lucru: n 3 eprubete se toarn cte 1 ml de acid azotic, clorhidric respectiv sulfuric. n fiecare eprubet se stratific cu precauie cte 1 ml din soluia de protein. La suprafaa de separare dintre cele dou soluii se obin precipitate albe sub form de disc (inel). Apoi eprubetele se agit. Precipitatele formate se dizolv n exces de acid clorhidric i sulfuric, dar nu i n exces de acid azotic. Precipitarea proteinelor cu acid azotic concentrat servete pentru punerea n eviden a proteinelor din urin patologic. Precipitarea cu acizi organici Acidul tricloracetic i acidul sulfosalicilic sunt reactivii specifici pentru precipitarea proteinelor. Acidul tricloracetic este foarte adecvat pentru deproteinizarea lichidelor biologice (de ex. ser sanguin), deoarece precipit numai proteinele din soluie, nu i produii de degradare ai acestora. Se mai folosete ca precipitant amestecul de acid picric cu acid citric (reactiv Esbach), util n determinarea cantitativ a proteinelor. Reactivi: - Sol. de acid sulfosalicilic 20% - Sol. de acid tricloracetic 10% - Sol. de acid picric 1,2% Mod de lucru: ntr-o eprubet la 1-2 ml soluie de protein se adaug cteva picturi de reactiv. Se formeaz un precipitat abundent.

60

Precipitarea prin nclzire Principiu: Proteinele la nclzire coaguleaz. Coagularea este cea mai rapid la punctul izoelectric. n mediu puternic acid sau bazic proteinele nu coaguleaz la nclzire, deoarece sarcina electric le confer o mai mare stabilitate n stare dizolvat. Reactivi: - Sol. de CH3COOH 1% - Sol. de CH3COOH 10% - Sol. de NaOH 10% - NaCl crist. Mod de lucru: n 5 eprubete se toarn cte 1-2 ml soluie de protein. Se adaug reactivi conform tabelului. Nr. eprubetei Adaos 1. . 2. . 3. . 4. . cristale) 5. .

2-3 pic. acid acetic 1% 10-15 pic. acid acetic 10% 10-15 pic. acid acetic 10% + NaCl (cteva 10-15 pic. NaOH 10%

Aceste eprubete se supun nclzirii i se observ apariia precipitatelor. Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Srensen Principiu: Aminoacizii au o structur amfiionic. Din aceast cauz soluiile lor, datorit capacitii de tamponare, micoreaz saltul de pH la adaosul de acid sau baz sare. n consecin aminoacizii nu pot fi titrai prin metode acidimetrice sau alcalimetrice curente. Adugndu-se soluiei de aminoacid un exces de formaldehid, se blocheaz gruparea amoniu. Rezult o baz Schiff, care se comport ca un acid slab (carboxilic). Aciditatea gruprii carboxilice se titreaz cu NaOH, n prezena fenolftaleinei ca indicator. R - CH - COO + H2C = O I + NH3 61
-

R - CH - COO + H2O + H I N = CH2

Baz Schiff R - CH - COO + H + NaOH I N = CH2 Reactivi:

+

R - CH - COO Na + H2O I N = CH2

- Sol. de NaOH N/10 cu factorul FNaOH - Fenolftalein 0,1% n soluie alcoolic - Formaldehid (substana este foarte reactiv, se autooxideaz, deci conine i acid formic ca impuritate. Prezena acestui acid ar da eroare la titrare. Din acest considerent formaldehida este alcalinizat cu NaOH n prezen de fenolftalein pn la virajul indicatorului).

Mod de lucru: n 3 baloane Erlenmeyer se msoar cte 10,0 ml soluie prob de aminoacid (pH 6). Trebuie adus i aceast soluie la pH = 9, de aceea se pun cte 3 picturi de fenolftalein i se adaug pictur cu pictur sol. de NaOH pn la apariia culorii roz. Acest volum de NaOH folosit nu se ia n considerare la calcul. n fiecare balon se adaug cte 2 ml soluie de formaldehid, sub aciunea creia soluia devine acid (pH 3). Astfel dispare culoarea roz, soluia devenind incolor. Fiecare soluie se titreaz cu soluie de NaOH pn la virajul indicatorului. Variaiile de pH sunt reprezentate pe urmtoarea schem: pH 14

9 6 3 0 Alcalinizare +CH2O Titrare cu NaOH

62

Calcul: ntruct se lucreaz cu un aminoacid oarecare monoamino-monocarboxilic sau cu un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici, nu putem folosi greutatea molecular la calcul. Din acest considerent rezultatul se exprim n mg % azot alfaaminic sau n mmoli N aminic/l. Dac volumul mediu de titrare a probelor se noteaz cu Vm, calculul este urmtorul: 1 ml NaOH 0,1 N . . . . . . . . . . . .1,4 mg N aminic Vm FNaOH . . . . . . . . . . . . . . X mg . . . . . . 10 ml prob Y mg . . . . . .100 ml prob 100 Y = 10 X mg N % = 14 X mmoli N aminic/l.

Identificarea nucleoproteinelor
Principiu: Scheletul structural al acizilor nucleici este construit din baze azotate, pentoze i acid fosforic. Prin hidroliz acid aceste aceste subuniti se elibereaz i pot fi puse n eviden Reactivi: - Sol de H2SO4 5% - Sol. de NH3 10% - HNO3 conc. - Sol. de molibdat de amoniu - Sol. amoniacal de AgNO3 - Reactiv Bial - HCl conc. Modul de lucru: a) Hidroliza: ntr-un balon cu fund rotund se introduc 5-10 g drojdie de bere, la care se adaug 40 ml H2SO4 5%. Se astup balonul cu un dop prevzut cu un refrigerent ascendent i se fierbe 60-90 minute. O parte din hidrolizat se filtreaz i se mparte n 3 eprubete n care se identific prile componente ale acizilor nucleici. b) Identificarea pentozelor: n prima eprubet se adaug 10 picturi reactiv Bial i 2 ml HCl conc. Se agit coninutul eprubetei se astup cu un dop de vat i se las pe

63

o baie de ap ce fierbe timp de 10 minute. Coninutul eprubetei se coloreaz n albastru verde. c) Identificarea H3PO4: In a doua eprubet se adaug soluie de NH 3 pn la reacia slab alcalin, apoi cteva picturi de HNO3 conc., 1 ml soluie de molibdat de amoniu. La nclzire se obine un precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu. d) Identificarea nucleobazelor: n a treia eprubet se adaug soluie de NH3 pn la reacia alcalin, se filtreaz i se adaug cca. 1 ml soluiei amoniacal de AgNO3. Dup ctva timp se formeaz un precipitat floconos galben-brun de sruri ale bazelor purinice. Identificarea bazelor purinice din hidrolizat se poate face i cu ajutorul reaciei murexidului. Murexidul este un colorant provenit din produsul de oxidare cu HNO3 conc. a bazelor purinice i amoniac. Modul de lucru: 1-2 picturi din soluia de analizat se usuc pe o plac de porelan pe baie de ap. Cu baghet se adaug o pictur de HNO3 conc. Dup evaporare se atinge cu o baghet nmuiat n amoniac. Apare o coloraie roie care se schimb spre albastru violaceu cnd se adaug o pictur de NaOH.

Vitamine
Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografic
Principiu: Cromatografia este o metod fizico-chimic de separare a componenilor unui amestec, care utilizeaz fenomenele ce au loc la interfaa a dou faze. Ea poate fi folosit n scopuri analitice sau preparative. Pe suprafaa dintre dou faze dintre care una este staionar (faza solid sau lichid adsorbit pe un material poros) i una mobil (solvent lichid sau gaz) pot avea loc fenomene de adsorbie, schimb de ioni sau partiie ntre dou faze lichide nemiscibile. Faza staionar la cromatografia n strat subire este constituit dintr-un strat de silicagel sau oxid de aluminiu n stare dispers depus pe o lam de sticl. Developarea se face cu un solvent apolar (benzen, toluen, petrol) sau un amestec de solveni apolari. Dac substanele cromatografiate sunt incolore, decelarea petelor (spoturilor) formate pe placa cromatografic se face cu ajutorul unor reactivi care dau reacii de culoare cu substanele amintite. 64

Identificarea componenilor se poate face: - prin decuparea spoturilor i analiza lor ulterioar prin metode chimice sau fizice. - prin aplicarea simultan pe plac a substanelor etalon, spotul format de o anumit substan cunoscut se va gsi dup developare la aceeai distan de punctul de start ca i acela dat de componentul identic din amestec. - prin determinarea valorii (raportul dintre distana parcurs de spot i de frontul solventului n acelai interval de timp) Rf este caracteristic pentru fiecare substan n condiii de lucru standardizate. Modul de lucru: a) Pregtirea plcii cromatografice Se prepar prin agitarea silicagelului n alcool etilic (2 g silicagel, 6 ml alcool) o suspensie care se toarn pe suprafaa unei plci de sticl. Prin micarea plcii se ntinde ct mai uniform suspensia i se continu micarea plcii pn cnd prin evaporarea alcoolului mobilitatea suspensiei scade i suspensia rmne nemicat. Dup uscarea complet a plcii laturile longitudinale se terg pe o lime de 0,5 cm. b) Aplicarea amestecului de analizat La o distan de 1 cm de la unul din capetele plcii, cu ajutorul unei capilare se aplic soluia de cercetat precum i soluiile etalon din vitamine urmrite. Diametrul maxim admis al probelor aplicate este cca. 5 mm. Cantitatea minim de vitamin aplicat este aproximativ 3 g. c) Developarea Plcile se introduc ntr-un vas cu toluen cu captul pe care s-au aplicat soluiile, aezat n solvent. Placa n timpul developrii are o poziie nclinat la 20-30 fa de orizontal. Solventul migreaz prin capilaritate de-a lungul stratului de adsorbant. Pentru a mpiedica evaporarea, cromatografia se face ntr-o atmosfer saturat cu vaporii solventului, adic vasul este ermetic nchis. d) Localizarea petelor Dup uscarea plcilor, componentele migrate sunt evideniate cu ajutorul unui strat subire de H2SO4 98% turnat pe plac cu ajutorul unei pipete n aceeai parte n care au fost aplicate probele. Poziia plcii trebuie s asigure deplasarea acid sulfuric n sensul n care s-a fcut developarea. Vitaminele liposolubile n contact cu acid sulfuric

65

se coloreaz astfel: vitamina A albastru-violet, - carotenul albastru, vitamina D2 galben-portocaliu, vitaminele E, K1, K2, K3 brun.

Dozarea iodometric a acidului ascorbic din urin (metoda Palladin)

Principiu: Acidul ascorbic este oxidat n mediu acid de I2 la acid dehidroascorbic

O C HO HO C C HC HO CH CH 2OH HO O +I2

O C O O C C HC CH CH 2OH O + 2HI

Iodul necesar oxidrii rezult din interaciunea KIO3 cu KI n mediu acid. Dup oxidarea complet a vitaminei C iodul n exces d o culoare albastr n prezena amidonului. Reactivi: - soluie HCl 2%; - soluie KI 0,1N; - soluie KIO3 0,004N; - soluie amidon 0,5%. Modul de lucru: Se cntrete 1 g din produsul vegetal de analizat (ace de brad, fructe de mcee, etc.) i se tritureaz cu o soluie de HCl 2% i 5g nisip de cuar splat prealabil cu HCl. Triturarea ncepe cu o mic cantitate de HCl. Dup aceea masa omogen se pune ntr-un vas de 50ml, se spal mojarul cu acid clorhidric 2% i dup introducerea soluiei de splare n vasul cotat, se aduce la semn cu HCl 2%. Lichidul se las s se limpezeasc, decanteaz i se filtreaz prin vat. Primii 10ml se arunc. Cnd se lucreaz cu urin se iau 10ml urin n vasul gradat, se aduce la cot cu HCl 2%, se amestec i se filtreaz.

66

10 ml din filtrat se pun ntr-un flacon conic, se adaug 30ml ap distilat, 5ml soluie de iodur de potasiu i 5ml HCl 2%. Se titreaz cu o soluie de iodat de potasiu 0,004N folosind ca indicator amidon. Culoarea albastr trebuie s se menin 30 secunde. Calculul: se efectueaz innd cont de faptul c 1ml soluie KIO3 la 100g produs analizat sau la cantitatea de urin eliminat in 24 ore. Valori normale 50-150 mol/zi (10-30mg/zi). Variaiile lor nu sunt concludente din punct de vedere clinic. De aceea se folosete proba ncrcrii cu acid ascorbic. Se administreaz intravenos 1000mg acid ascorbic i dup ce se colecteaz urin timp de 5 ore, adugnd la fiecare fraciune de urin cte 10% acid acetic glacial. n mod normal se elimin in 5 ore cel puin 400mg acid ascorbic. O eliminare mai sczut pledeaz pentru hipovitaminoz sau avitaminoz C. 0,004N corespunde la 0,352mg acid ascorbic (M. acid ascorbic =176). Rezultatul se raporteaz

Enzime
Introducere Enzimele, biocatalizatori proteici, sunt produse de materia vie i prezena lor este necesar pentru desfurarea reaciilor chimice n toate sistemele biologice. Enzimele au i nsuiri ale catalizatorilor utilizai n reaciile chimice din lumea nevie. Ele sunt ns superioare acestor catalizatori n mai multe privine: a) Asigur reaciilor chimice pe care le catalizeaz viteze cu cteva ordine de mrime mai mari, b) Reaciile pe care le catalizeaz au loc n condiii blnde: temperatur sub 50C, presiune atmosferic, pH n jurul valorii 7, for ionic moderat. Comparativ, catalizatorii chimici acioneaz la temperaturi ridicate, presiuni mari i valori extreme de pH; c) Au specificitate foarte mare ceea ce asigur ca n reaciile pe care le catalizeaz s nu participe dect substraturile pentru care enzimele sunt specifice. Multe enzime au i nsuiri nentlnite la catalizatorii chimici cum sunt: a) Activitatea lor poate fi reglat (mrit sau micorat) de anumii efectori; b) Catalizeaz reacii endergonice imposibile d.p.d.v. termodinamic prin transferul energiei libere necesare de la reacii exergonice.

67

Cinetica enzimatic studiaz viteza reaciilor catalizate de enzime n funcie de concentraia substratului [S], de concentraia enzimei [E] i de influenele unor factori fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, cofactori, etc. Concepia unanim admis n enzimologie c formarea din substrat a produsului de reacie implic existena complexului enzim-substrat (ES), redat prin ecuaia: K1 K3 E + S ES ------> E + P, K2 a fost statuat n primul rnd innd cont de alura dependenei vitezei reaciilor catalizate de enzime de concentraia de substrat (Leonor Michaelis i Maud Menten, 1913). Din punct de vedere al localizrii enzimele se clasific n: Enzimele secretate cu rol activ n plasm, ca de exemplu: a) enzimele plasmatice funcionale, produse n special n ficat (ceruloplasmina) b) enzimele coagulrii, lipoproteinlipaza (LPL), lecitin-colesterol-aciltransferaza (LCAT). Nivelul lor plasmatic scade cu lezarea celulelor productoare. Enzimele secreto-excretate, provenind din glandele exocrine i pancreas. Ele sunt excretate i acioneaz la nivelul tubului digestiv, de exemplu amilaza, lipaza, tripsina. Activitile lor cresc n plasm prin lezarea celulelor de origine sau prin prezena unui obstacol la nivelul cilor excretorii precum i prin creterea permeabilitii membranei celulelor secretorii; Enzimele celulare cu loc de aciune n celulele din care provin, a cror activitate plasmatic crete prin lezarea celulelor de origine. Exemple sunt glutamic-oxalacetic transaminaza (GOT), glutamic-piruvic transaminaza (GPT), lactat dehidrogenaza (LDH), fosfataza alcalin i acid, creatin kinaza (CK), etc. Concentraia majoritiilor enzimelor celulare este constant n timp. Fac excepie enzimele inductibile/represibile i enzimele plasmatice funcionale intracelular cum ar fi CK (creatin kinaza), GOT, LDH, GPT, GDH (glutamat dehidrogenaza), GT ( -glutamil-transaminaza), SDH (sorbitoldehidrogenaza), OTC (ornitin transcarbamilaza) fosfatazele acid i alcalin, ale cror concentraii cresc sau scad n anumite stri patologice (leziuni de esut).

68

Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astzi n msur hotrtoare la cunoaterea cauzelor a numeroase boli, diagnosticul i urmrirea evoluiei acestora, elaborarea pe baze tiinifice a medicamentelor.

Influena concentraiei substratului asupra vitezei de reacie enzimatic

Concentraia substraturilor celor mai multe enzime variaz destul de mult n funcia de starea metabolic a esutului i de ali factori. Dependena vitezei de reacie de concentraia substratului constituie aspectul cel mai important al cineticii enzimatice. Una din principalele mrimi ale cineticii enzimatice este activitatea enzimatic. Pentru exprimarea activitii enzimatice se folosesc n prezent mai multe sisteme de uniti ceea ce ngreuneaz interpretarea rezultatelor. Uniunea Internaional de Biochimie recomand exprimarea activitii enzimelor n mod unitar, n uniti internaionale (UI sau U). Unitatea internaional de activitate enzimatic reprezint cantitatea de enzim care transform un mol de substrat ntr-un minut, la 25 C, n condiii optime (concentraia maximal a substratului, fora ionic a tamponului, pH optim). 1UI = 1 mol substrat /min. Conform SI unitatea de msur a activitii enzimatice este katalul. 1 katal = 1 mol substrat / sec Se folosesc subunitile ( m, , n, p) katalului. n determinrile pe lichide biologice se raporteaz activitatea enzimei la 1000 ml (vezi tabelul limitele valorilor normale. Se folosete de asemenea exprimarea i n miliuniti internaionale pe mililitru (mU/ml) ceea ce de fapt nu modific valorile numerice respective. Chiar i atunci cnd se utilizeaz UI, apar diferene ale valorilor limitelor normale, datorit varietii metodelor folosite pentru determinri. Principiu: Pentru o cantitate dat de enzim, viteza,v, a reaciei enzimatice crete odat cu creterea concentraiei substratului [S], pn cnd ntreaga cantitate de enzim se satureaz cu substrat. Se atinge astfel viteza maxim,vmax, care nu va fi depit chiar dac n continuare concentraia substratului va crete, n cazul n care substratul n exces nu 69

inhib propria enzim. Acest principiu este descris de ecuaia Michaelis-Menten (pentru deducere vezi cursurile de biochimie):
v = vmax

KM + [S]

[S]

unde KM, constanta lui Michaelis.

Reprezentarea grafic a lui v n funcie de [S] (temperatura, pH-ul i [E] fiind constante) este o curb cu alur hiperbolic. Din analiza curbei reiese c v crete liniar cu creterea [S] numai pentru valori mici ale acesteia, apoi creterea se face tot mai lent pentru ca la concentaii mari de substrat, viteza reaciei s rmn constant. Fiecare enzim se caracterizeaz prin valorile particulare KM i vmax ale lor.

Determinarea constantei lui Michaelis pentru ureaz

Principiu: n determinarea experimental se va folosi ca substrat ureea i ca enzim ureaza din boabe de soia. Ureaza catalizeaz urmtoarea reacie:

O=C

NH 2 NH 2

+ H2O

ureaz

CO2 + 2NH 3

Viteza de reacie este proporional cu cantitatea de amoniac eliberat n unitatea de timp (1min). Aceasta se determin prin titrare cu o soluie de HCl cu factor cunoscut. HCl + NH3 ---------> NH4Cl Cunoscnd concentraiile substratului din probe care se consider constante pe parcursul fazei de incubaie i calculnd vitezele de reacie, exprimate n moli uree transformai ntr-un minut, pe baza datelor titrimetrice se face reprezentarea grafic (v, [S]) din care se poate calcula KM pentru ureaz. Reactivi: Soluie de uree 0,1 M - Soluie de uree 1,0 M Soluie de ureaz: fie o soluie de enzim cristalizat, fie o suspensie de fin de soia. Se pstreaz n frigider. Soluie de tampon fosfat 0,1 M, pH=7 Soluie de CuSO4 5%

70

Indicator rou de metil 0,1% n soluie alcoolic

Modul de lucru: Conform tabelului se prepar o serie de 6 probe introducndu-se n toate aceeai cantitate de enzim i soluii de concentraii cresctoare ale substratului. n tabel vor fi consemnate pe baza datelor experimentale (titrimetrice) i a efecturii calculelor, valorile ai , m i vi (i=1,6). n proba martor se inactiveaz enzima, nainte de a se introduce substratul, adugnd 5 picturi soluie CuSO4 5%. Reaciile chimice (n cazul probelor 1-6), declanate n momentul amestecrii enzimelor cu substratul, sunt lsate s se desfoare timp de 25 min., apoi sunt ntrerupte prin adaosul inhibitorului, adic a cte 5 picturi soluie CuSO4. Se msoar n fiecare prob cantitatea de NH 3 format, prin titrarea cu soluie de HCl n prezena indicatorului rou metil (3 picturi) care vireaz de la galben la rou. Culoarea galben dat de indicator, naintea virajului, se datoreaz amestecului coloristic cu culoarea albastr dat de ionii Cu2+ hidratai. Calculul: 1mol HCl........................................1 mol NH3..................1/2moli uree 1000 ml HCl N/20............................................. ........._____1_____moli uree 2.20 (ai-m) ml..............................................................................xi____________ xi = (ai-m)25 moli uree transformai n 25 minute vi = (ai-m)25/25 = ai-m moli uree/ 1 min. Reprezentarea grafic Pe un sistem rectangular de axe de coordonate trasat pe hrtie milimetric se aplic pe ordonat o scar a valorilor vitezelor de reacie. Pe abscis se trec concentraiile molare ale ureei din cele ase probe menionate n tabel. Se reprezint grafic punctele (vi, [S]). Curba hiperbolic se traseaz printre punctele experimentale. Poriunea dreapt, paralel cu abscisa (corespunztoare saturrii E cu S), se prelungete pn la intersecia cu ordonata, intersecia corespunznd valorii vmax. La valoarea vmax/2, se duce o dreapt paralel cu abscisa pn la intersecia cu curba i de la aceast intersecie se duce o dreapt paralel cu ordonata pn la intersecia cu abscisa. Acest 71

punct corespunde valorii KM (concentraia de substrat corespunztoare semi-vitezei maxime). Ea este ntr-o prim aproximaie constanta de disociere a complexului enzim-substrat (ureaz-uree). Deci, se stabilesc (1) vmax, (2) vmax/2 i (3) KM.

72

Interpretarea rezultatelor Valorile mari ale KM corespund unei legturi slabe ntre E i S iar valorile mici ale KM corespund unei legturi puternice ntre E i S. Valorile lui KM pentru diverse enzime sunt cuprinse ntre 10-1- 10-6 moli/litru. n cazul ureazei, KM 10-2 moli/litru ceea ce plaseaz aceast enzim n rndul celor cu afinitate (constant de stabilitate a complexului E-S) mic fa de substrat.

Determinarea activitii catalazei sanguine

Principiu: Catalaza din snge este o oxidoreductaz foarte activ, care descompune apa oxigenat, n ap i oxigen molecular: 2 H2O2 2 H2O + O2 Activitatea ei se determin prin dozarea apei oxigenate rmas nedescompus ntr-un sistem cu concentraia iniial a H2O2 cunoscut. Este o metod indirect: catalaza dintr-un microlitru de snge acioneaz asupra unei cantiti determinate de ap oxigenat; excesul de ap oxigenat se dozeaz prin titrare cu KMnO 4 n mediu acid; din diferen se calculeaz numrul catalazic.
+7 +2 2 KMnO4 + 5 H-1O2 + 3 H2SO4 2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H20 + 5 O2 O 2 +7 5e +2 Mn + Mn

x2 x5

-2

O O2
1 (v/v) 2% 20% N/10 cu factorul FKMnO4 cunoscut

- 2e 2

Reactivi:

- Snge diluat - Soluie de H2O2 - Soluie de H2SO4 - Soluie de KMnO4

Mod de lucru: n patru flacoane Erlenmeyer se pipeteaz: Proba 1 Proba 2 Martor 1 Martor 2 Ap distilat (ml) 2 2 2 2 Snge diluat (ml) 1 1 1 1 se fierbe i se rcete Ap oxigenat (ml) 2 2 2 2 Repaus 30 la temperatura camerei Acid sulfuric (ml) 5 5 5 5 Titrare cu KMnO4 pn la roz slab stabil (ml) b1 b2 a1 a2 Media =b1 +b2 / 2 = bm Media =a1 +a2 / 2 = am 73

Calculul: Volumul mediu de titrare pentru probe (bm) este mai mic dect cel pentru martori (am) deoarece catalaza descompune o parte din apa oxigenat din probe. 1ml KMnO4 N/10----------------------------------------------------------1,7 mg H2O2 (am-bm)FKMnO4 --------------------------------------------------------------x x = (am-bm)FKMnO4 1,7 mg H2O2 descompuse de catalaza din 1 ml snge diluat 1/1000 (1 l snge integral). Aceast valoare se numete numr catalazic. Interpretarea rezultatelor Valorile normale ale numrul catalazic (cifre catalazice) sunt cuprinse nte 14-18. Acatalazemia este o deficien nnscut, a catalazei din eritrocite i alte esuturi, avnd ca principal simptom gangrena cavitii bucale. Dac se face concomitent i hemograma, se poate calcula i Indicele catalazic = (am-bm)FKMnO4 1,7 / nr. globule roii (n milioane). Indicele catalazic este cel care are valoare de diagnostic. Este sczut n cancer, anemie, caexie i n 80 % din afeciunilor hepatice.

Determinarea activitii transaminazelor (metoda colorimetric cu 2,4-dinitrofenilhidrazin)

Principiu: Transaminazele catalizeaz reacia de transfer a gruprii amino de la un alfaaminoacid la un alfa-cetoacid. Transaminazele cu cea mai mare importan clinic sunt: glutamic-oxalacetic-transaminaza (GOT, aspartat aminotransferaza-AST) i glutamicpiruvic-transaminaza (GPT, alanin aminotransferaza-ALT). Acestea catalizeaz urmtoarele procese reversibile: oxaloacetat glutam at GOT (AST) aspartat cetoglutarat piruvat GPT (ALT) alanin

74

GOT este o enzim localizat n proporie de 60% n citoplasm i 40% n mitocondrii, n special n muchiul scheletic, miocard i ficat. n reacia catalizat de GOT se folosete ca substrat amestecul aspartat- -cetoglutarat din care rezult oxalacetat i glutamat. Oxalacetatul se decarboxileaz spontan trecnd n piruvat. Piruvat rezult i din reacia catalizat de GPT avnd ca substrat amestecul alanina- -cetoglutarat Piruvatul rezultat din aceste reacii reacioneaz cu 2,4-dinitrofenil-hidrazina n mediu alcalin dnd dinitro-fenil-hidrazona corespunztoare de culoare roie, care se determin fotometric:

Datorit faptului c i ceilali alfa-cetoacizi prezeni (alfa-cetoglutarat) formeaz fenil-hidrazone, cu absorbii la diferite lungimi de und, se msoar extincia dinitrofenil-hidrazonei piruvatului la lungimea de und de 520 nm unde fenil-hidrazona alfacetoglutaratului absoarbe slab. Intensitatea coloraiei produse este proporional cu intensitatea activitii enzimei. Activitatea transaminazelor se calculeaz n funcie de cantitatea de acid piruvic care se formeaz ntr-un minut. Reactivi: - Substrat GOT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,039 g alfacetoglutarat de sodiu (sau 0,030 g acid alfa-cetoglutaric) i 1,57 g aspartat de sodiu (sau 1,32 g acid aspartic) se dizolv n aproximativ 80 ml ap bidistilat. Se ajusteaz cu NaOH 0,4N pH-ul soluiei la 7,4 apoi se completeaz volumul la 100 ml cu ap bidistilat. - Substrat GPT: 1,50 g K2HPO4, 0,20 g KH2PO4, 0,030 g acid alfacetoglutaric (sau 0,039 g alfa-cetoglutarat de sodiu) i 1,78 g alanin se dizolv n aproximativ 80 ml ap bidistilat, se aduce pH-ul la 7,4 cu NaOH 0,4N, apoi se completeaz la 100 ml cu ap bidistilat. - Soluie de 2,4-dinitro-fenil-hidrazin 1 mM n HCl 2M: se dizolv 19,8 mg dinitro-fenil-hidrazin n 10 ml HCl (d = 1,19 g/cm3) i se completeaz la 100 ml cu ap bidistilat.

75

- Soluie standard de piruvat de sodiu 2 mM: se dizolv n 100 ml ap bidistilat 22 mg piruvat de sodiu (1 ml soluie conine 2 moli piruvat). Se adaug 0,3 ml cloroform pentru conservare. - Soluie NaOH 0,4N Modul de lucru: Att pentru GOT ct i pentru GPT se pregtesc cte trei eprubete: prob (P), standard (S) i blanc (B). GOT P S B Sol.substrat GOT (ml) 0,5 0,5 0,5 Sol.substrat GPT (ml) Se incubeaz 5 minute la 37C Ser (ml) 0,1 Sol.standard PIR (ml) 0,1 60 minute Se incubeaz la 37C Sol.2,4-dinitrofenilhidrazin (ml) 0,5 0,5 0,5 Ser (ml) 0,1 Sol.NaOH 0,4 N (ml) 5,0 5,0 5,0 GPT S 0,5 0,1 30 minute 0,5 5,0

P 0,5 0,1 0,5 5,0

B 0,5 0,5 0,1 5,0

Se omogenizeaz coninutul eprubetelor i dup 5 minute se citete extincia probelor (EP) i a standardului (ES) fa de blanc, la 520 nm, n cuva de 1 cm. Calcul: tiind c soluia standard conine 0,2 moli piruvat /0,1 ml se calculeaz cantitatea de piruvat rezultat din reacia pentru fiecare enzim i se exprim activitatea enzimatic n moli piruvat format/min./1000 ml ser (n condiiile de lucru) i se noteaz cu X: Pentru GOT: X=(EP/EB) 0,2 (1/60) (1/0,1) 1 000 moli piruvat Pentru GPT: X=(EP/EB) 0,2 (1/30) 1 000 moli piruvat Activitatea enzimatic real nu este dat direct de valoarea obinut colorimetric, deoarece hidrazona colorat se formeaz i cu alfa-cetoglutarat din substrat, iar pe de alt parte, condiiile nu sunt cele optime (37C n loc de 25C i prezena alfacetoglutaratului care formeaz hidrazon). S-au calculat tabele de corecie prin 76

comparaie cu datele obinute cu metoda de referin, care exprim activitatea enzimatic real, msurnd spectrofotometric n UV transformarea NADH + H in NAD+, n prezena enzimelor indicatoare: malat-dehidrogenaza (MDH) n amestec cu GOT i lactat-dehidrogenaza (LDH) n amestec cu GPT. Reaciile enzimatice sunt urmtoarele:
GOT +

alfa-cetoglutarat + L-aspartat --------------> L-glutamat + oxalacetat

MDH

oxalacetat + NADH + H+ ----------------> L-malat + NAD+

GPT

alfa-cetoglutarat + L-alanina --------------> L-glutamat + piruvat

LDH

piruvat + NADH + H+ ----------------> L-lactat + NAD+ Din tabelul de corecie se citete activitatea enzimatic real (determinat prin metoda enzimatic) exprimat n Uniti Internaionale (UI = moli/min./l, 25C) care corespunde valorilor X calculate. UI GOT 2 3 5 6 7 9 11 13 15 17 19 20 21 UI GOT 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41,44 47 51 55 UI GOT 60 UI GOT

X 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 23 24

GPT 1 2 2,5 3 4 4,5 5 6 7 7,5 8 8,5 9

X 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44,46 48 50 52

GPT 9,5 10 11 12 13 14 15 16 17 18,19 20 21 22

X 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78

GPT 23 24 25 26 27 29 30 31 33 34 35 36 37

X 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 100 102

GPT 38 39 40 42 44 46 48 50 52 54 56 60

Observaii: 1. Dac activitatea enzimatic depete 60 UI se va repeta determinarea cu incubaie scurt: 20 de minute pentru GOT si 10 minute pentru GPT. Rezultatele obinute se vor nmuli cu 3. Este de preferat ca n locul scurtrii timpului de incubaie s se

77

fac diluii ale serului 1:5, 1:10, 1:20 n ap distilat i se reia cu fiecare diluie tehnica de lucru de la nceput. La calcul se ine seama de diluie. 2. Sticlria utilizat trebuie s fie perfect curat, splat n final cu mult ap distilat, deoarece urme de detergeni pot inhiba considerabil activitatea enzimatic. Interpretarea valorilor obinute Valori normale: GOT: Aduli: 2-20 UI. Copii sub 3 luni: pn la 40 UI GPT: Aduli: 2-16,5 UI. Copii pn la 5 ani: 0,2-13 UI Valori patologice: n cazul leziunilor celulare mai uoare crete activitatea GPT, ea fiind o enzim citoplasmatic, iar n cazul leziunilor mai grave crete i activitatea GOT (GOT este prezent i n microsomi) GOT : - creteri marcate ( 10-100 ori ) n: infarct miocardic, hepatit viral acut, necroza toxic a ficatului - creteri moderate n: hepatite cronice, icter mecanic, mononucleoza infecioas, anemii hemolitice, boli ale musculaturii striate GPT: - creteri marcate ( ~ 100 ori ) n: hepatita viral acut, necroza toxic a ficatului - creteri moderate n: hepatite cronice, ciroz, mononucleoza infecioas, hepatita de staz cardiac. Raportul de Ritis: GOT/GPT ~ 1,2-1,3. n leziunile inflamatorii ale ficatului acest raport scade datorit creterii mai mari ale activitii GPT. n leziunile necrotice raportul crete datorit creterii mai marcate a activitii GOT.

Determinarea activitii fosfatezei alcaline (Metoda Bodansky)

Fosfatazele sunt un grup de enzime cu rol important n metabolism, capabile s hidrolizeze esterii fosforici, elibernd acid ortofosforic. n snge ntlnim n special un grup de fosfomonoesteraze care acioneaz diferit, n funcie de pH-ul mediului i de prezena unor efectori (ionul de Mg2+). Cele mai importante enzime din grupa fosfomonoesterazelor sanguine sunt: fosfataz alcalin fosfataz acid - acioneaz la pH 8,4 - 9,1 - acioneaz la pH 5,1 - 6,0

78

Fosfatazele alcaline sunt foarte rspndite n corpul animal. Cele mai bogate surse sunt: epiteliul intestinal, prile n cretere ale oaselor, rinichi, glandele mamare, leucocite. Principiu: Sub aciunea catalitic a fosfatazei alcaline serice glicerolfosfatul de sodiu este hidrolizat eliberndu-se fosfat monosodic. CH2 CH CH2 OH O OH P O-Na+ OH O +HOH CH2 CH CH2 OH OH OH +NaH2PO4

Activitatea enzimei se determin doznd cantitatea de ioni fosfat eliberat, printro metod colorimetric. Ionul fosfat reacioneaz cu acidul molibdenic rezultnd un complex fosfomolibdenic care este redus de sulfitul de sodiu i hidrochinon la albastru de molibden, care este alctuit dintr-un amestec de oxizi de molibden n stri de oxidare diferite. HPO42- +12 MoO42- + 23 H+ + 3 NH4+ (NH4)3PMo12O40 + 12H2O Oxizii de molibden sunt att de fin dispersai nct intensitatea culorii obinute este proporional cu cantitatea de molibden din fosfomolibdat, deci cu cantitatea de fosfor din prob. Deci global, procesul respect legea Lambert Beer n ce privete concentraia fosforului. Reactivi: - soluie de substrat de glicerolfosfat de sodiu pH -9,6, 0,5g glicerolfosfat de sodiu la care se adaug 0,425 g veronal sodic, totul se dizolv n cca 50 ml de ap, n balon cotat de 100 de ml Se adaug 2,2 ml NaOH 0,1 N. Se completeaz la 100 ml cu ap distilat i se ajusteaz la pH 9,6 - NaOH N/10 - Hidrochinon 1% - Sulfit de sodiu 20% - Acid tricloracetic 10% - Molibdat de amoniu 2,5% - Soluie etalon de fosfat: KH2PO4 p.a. se usuc cteva zile n exicator. Se cntresc 4,3866 g, se dizolv n puin ap i cu ap, se aduce la semn la

79

balon cotat de 1000 ml, se adaug cteva picturi de cloroform drept conservant. Aceast soluie conine 1 mg de fosfor / 1 ml. Curba de etalonare Pentru realizarea curbei de etalonare, se dilueaz de 50 de ori soluia etalon, astfel 1ml soluie conine 20 g fosfor. Se msoar ntr-o serie de eprubete 0,5; 1; 2; 3; 4 i 5 ml din aceast soluie standard. La fiecare prob se adaug cte 2 ml acid tricloracetic 20% i ap pn la 10 ml. Dup amestecare, din acest amestec se msoar cte 5 ml ntr-o alta eprubet, dup care se adaug 2 ml molibdat de amoniu 2,5%, 1 ml hidrochinon i 2 ml sulfit de sodiu. Dup 5 minute se citete exticia i se reprezint grafic lund pe ordonat extincia la = 610 nm n cuv de 1 cm, iar pe abscis cantitatea de fosfor n g (adic 5, 10, 20, 30, 40, 50 g) Modul de lucru: n dou eprubete se msoar cte 5 ml substrat (pH = 9,6). Prima eprubet se menine timp de 5 minute la 37 C dup care se introduce 1 ml ser i se las astupat jumtate de or la 37 C. n eprubeta a doua se msoar 1 ml ser i deoarece acesta constituie martorul, se introduc 4 ml acid tricloracetic 10% pentru inactivarea enzimei. Dup incubarea de o jumtate de or, prima eprubet se trateaz cu 4 ml acid tricloacetic 10%. Att proba ct i martorul se agit energic 1-2 minute i se filtreaz, iar din filtrat se iau cte 5 ml n dou pahare Erlenmeyer i se dozeaz cantitatea de fosfat anorganic dup cum urmeaz. Se adaug n fiecare pahar, n ordine, 1 ml molibdat de amoniu, 1 ml sulfit de sodiu, 1 ml hidrochinon i 2 ml ap bidistilat. Dup 20 de minute de repaus se citete extincia probei fa de martor la = Calcul: Se face pe baza curbei de etalonare. Rezultatul se exprima n uniti Bodansky (UB). O unitate Bodansky este activitatea fosfatazic pentru care 1 mg fosfor este eliberat ntr-o or la 37 C i pH = 9,6 de 100 ml ser din substratul de glicerolfosfat. Valori normale: Aduli: Copii: Sugari: face nmulind cu factorul de conversie 8,3. 2 - 4 U.B. / 100 ml ser 2 - 8 U.B. / 100 ml ser 3 10 U.B. / 100 ml ser 610 nm.

Transformarea unitilor Bodansky, n uniti internaionale (mU/ml sau UI/l) se

80

Modificrile patologice apar n dou mari categorii de afeciuni: osoase i hepatobiliare. Astfel crete mult n boli n care exist o activitate crescut a osteoblastelor: Boala Paget (osteodistrofie deforment), hipoparatiroidismul primar i secundar, rahitism infantil, osteomalacie, metastaze osoase ale unor tumori maligne, icter prin obstrucie (dozarea fosfatazei constituind n acest caz un mijloc biochimic de diagnostic diferenial al icterelor). O cretere fiziologic se observ n sngele matern aproximativ n trimestrul trei al sarcinii i atinge maximumul n timpul travaliului. La ft, concentraia seric a fosfatazei crete, dar este sub valoarea matern i se nsoete de fixarea ionilor Ca 2+ i
3 PO 4 . Concentraia mai mare n sngele matern se explic printr-o trecere

transplacentar de la ft la mam. Scderea fosfatazei alcaline apare n ciroz hepatic, hepatit cronic. Fosfataza acid are valori normale cuprinse n intervalul 4,5 13,5 UI/l (enzim total) i 0,05 3,6 UI/l (fraciunea prostatic). Valorile cresc n carcinomul de prostat (cu metastaze osoase), boala Gaucher, prostatit acut i cronic, necroz hepatic datorat hepatitelor acute i cornice.

Determinarea activitii amilazei serice prin metoda Wohlgemuth.

Prin aciunea amilazei salivare ( -amilaza) asupra amidonului, n cavitatea bucal, se rup legturile 1,4-glicozidice. Cum legturile 1,6 ca i cele 1,4 din vecintatea ramificaiilor, nu pot fi desfcute de ctre -amilaz, produii de digestie a amidonului vor fi, pe lng maltoz, fragmente oligozaharidice de dimensiuni variabile - dextrine limit. Dextrinele limit sunt hidrolizate ulterior, sub aciunea unei hidrolaze, amilo-1,6-glucozidaza, la maltoz care, n intestin este hidrolizat la glucoz de maltaz. Activitatea amilazic a intestinului se datoreaz trecerii amilazelor pancreatice i salivare n snge. pH-ul optim al amilazei salivare este aproape de neutralitate, cofactorul fiind ionul Cl-. Prin adugarea de iod, amidonul rmas dup reacia enzimatic d un compus de adiie iod-amidon, de culoare albastr a crei intensitate este proporional cu concentraia amidonului rmas dup incubaie i invers proporional cu activitatea

81

enzimatic. Coloraia roie care poate s apar n soluiile cu amidonul parial hidrolizat se datoreaz complexelor iod-dextrine. Principiu: Se determin cantitatea minim de amilaz seric necesar pentru a hidroliza complet 2 mg amidon, n 30 minute la 38 C. Reactivi: Modul de lucru: Se iau 8 eprubete care se numeroteaz de la 1 la 8. n fiecare se introduce cte un ml soluie NaCl 0,9%. n prima eprubet se adaug 1 ml ser. Pipeta se spal de 3 ori prin aspirare n amestecul din prima eprubet i cu aceeai pipet se trece 1 ml din amestec n a doua eprubet. Din nou se spal pipeta prin aspirare n a doua eprubet i se trece 1 ml n a treia. Operaia se repet pn la ultima eprubet din care se arunc 1 ml din amestec. n acest mod se obine urmtoarea serie de diluii succesive ale serului: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, adic 1/2n unde n este numrul de ordine al eprubetei. Se adaug apoi n fiecare eprubet cte 2 ml soluie amidon. Se agit i se aeaz n baie de ap la 38C. Dup 30 de minute se scot, se rcesc repede la un curent de ap, apoi n fiecare se introduc cte 1-2 picturi de soluie de iod. Se agit i se observ culoarea format. Culoarea galben indic lipsa amidonului, cea roie arat prezena produilor intermediari de hidroliz (dextrine), iar cea albastr semnaleaz prezena amidonului nehidrolizat. Se noteaz ultima eprubet n care amidonul a fost hidrolizat. Cu aceast metod nu se poate face diferen ntre amilaza salivar i cea pancreatic. Exist, ns, metode electroforetice pentru a diferenia cele dou izoenzime: migrarea electroforetic a amilazei salivare este mai rapid dect a celei pancreatice. Calcul: Rezultatul se exprim n uniti Wohlgemuth (UW). Unitatea amilazic Wohlgemuth reprezint cantitatea de enzim necesar pentru a hidroliza un mg amidon n 30 minute la 38C. Pentru calcul se consider ultima diluie n care nu apare culoarea albastr. Rezultatul n uniti Wohlgemuth se obine nmulind diluia cu 2. De exemplu, dac coloraia albastr apare n eprubeta a 5-a nseamn c amidonul a fost hidrolizat pn la Soluie de NaCl 0,9% Soluie de amidon 0,1% Soluie de KI3 N/10

82

a 4-a eprubet. Calculm diluia acestei eprubete care este 1/16 fa de serul iniial. Dac: 1/16 ml ser hidrolizeaz 2ml sol. amidon 0,1% atunci, 1 ml ser hidrolizeaz x ml sol. amidon 0,1% sau x mg amidon. 12 x = = 32 UW 1/16 Interpretarea valorilor obinute: Valori fiziologice: Valori patologice: n snge: 8-32 U.W. n urin : 8-64 U.W. - activitatea amilazic sczut apare n afeciunile - activitatea amilazic crescut apare n afeciuni ale ficatului, vezicii biliare, n alterri ale funciei renale, afeciuni ale glandei salivare (parotidit acut, sialadenit), sarcin extrauterin, fiindc cantiti mici de amilaz exist n trompele uterine, infarct intestinal. Valoarea diagnostic a amilazemiei se coreleaz cu tulburrile digestive, pancreatita acut, parotidita epidemic. Observaii: 1. Amilaza seric este stabil timp de o sptmn dac serul se ine la frigider sau congelator. 2. Saliva conine de 1000 ori mai mult amilaz dect serul de aceea este necesar ca pipetrile s se fac cu atenie evitndu-se scurgerea salivei n pipet. 3. Eprubetele vor fi bine splate cu ap distilat, de asemenea i pipetele, nlturnduse urmele de detergent care ar putea influena reacia enzimatic. pancreatice, gastrice i duodenale.

Explorarea echilibrului acido-bazic

Modificrile echilibrului acido-bazic a lichidelor din organismul viu, duc la acidoz sau alcaloz. pH-ul sngelui este cuprins n intervalul 7,35-7,45. n mod normal, raportul echivalenilor de HCO3- i H2CO3 este de 20/1, de exemplu 24 mEq bicarbonat i 1,2 mEq acid carbonic. n locul raportului [HCO3-]/[H2CO3], un raport mai practic este [HCO3-]/pCO2 unde pCO2 este presiunea parial a CO2 din snge. Scderea acestui raport duce la acidoz, iar creterea lui la alcaloz. Dac scade numrtorul, este vorba de acidoz respiratorie (reducerea eliminrii prin expiraie a

83

CO2) sau metabolic. Creterea raportului datorit creterii numrtorului indic o alcaloz metabolic. Scderea raportului [HCO3-]/pCO2 datorat creterii pCO2 produce acidoz respiratorie. Creterea raportului determinat de scderea pCO2 produce alcaloz respiratorie. n funcie de modificrile pH-lui se realizeaz acidoza sau alcaloza compensat sau decompensat. Cnd pH-ul nu este modificat este vorba de acidoz sau alcaloz compensat. Cnd pH-ul scade sub 7,35 este vorba de acidoz decompensat, iar cnd pH-ul crete peste 7,45 se poate vorbi de alcaloz decompensat. Valori ale pH-ului sngelui sub 6,9 sau peste 7,9 sunt incompatibile cu viaa. Cele mai importante sisteme tampon care funcioneaz permanent n organism sunt: sistemul bicarbonat/acid carbonic, sistemul fosfailor (HPO42-/H2PO4-), sistemul proteinelor si sistemul hemoglobinei (deprotonat/protonat). Determinarea rapid a rezervei alcaline (bicarbonat actual) Principiu: Bicarbonaii din ser sunt descompui cu acid azotic, cu degajare de CO2, iar excesul de acid azotic se titreaz n prezen de rou de fenol cu soluie de hidroxid de sodiu. Reactivi: soluie acid azotic 0,1 N cu factorul FHNO3 soluie rou de fenol 0,04% n alcool etilic de 60%; soluie de hidroxid de sodiu 0,1 N cu factorul FNaOH Modul de lucru: La 1 ml ser nehemolizat se adaug 1 ml soluie acid azotic 0,1N i 4 picturi soluie rou de fenol 0,04%. Se agit timp de 2 minute pentru ndeprtarea dioxidului de carbon. Se microtitreaz cu v ml soluie de hidroxid de sodiu 0,1N pn la primul viraj portocaliu. Calcul: 1 ml NaOH 0,1N ..................................................0,1mEq HCO 3 FHNO 3 v FNaOH ................................................... x mEq HCO 3 x = rezerva alcalin dintr-un ml ser.

84

Obsevaie: Factorul soluiei de HNO3 0,1N se determin prin titrare cu soluia de NaOH 0,1N cu factor cunoscut, folosind rou de fenol ca indicator. Metoda Astrup Spre deosebire de msurtorile de bicarbonai i de pH efectuate n plasm, metoda Astrup ine cont i de rolul tamponului de hemoglobin i de intervenia anhidrazei carbonice din eritrocite. Metoda se bazeaz pe relaia invers proporional dintre pCO2 i valorile de pH din snge. Este o micrometod n care se utilizeaz un electrod capilar de sticl pentru msurarea pH-ului (dozarea poteniometric a pH-ului cu electrod de sticl, pag.183). Determinrile se fac din snge capilar. Se msoar trei valori de pH (n condiii anaerobe, n condiii de pCO2 sczut i pCO2 crescut). Cu ajutorul acestor trei valori se pot calcula factorii principali ai echilibrului acido-bazic dintr-o nomogram.

Ioni anorganici
Determinarea potasiului seric
Potasiul este un important cation intracelular pentru organism. n celul, parial, el este slab legat cu proteinele i cu ionul fosfat. n tulburrile metabolice celulare nsoite de o scdere a potenialului energetic (diabet zaharat, acidoze, hipertiroidism etc.) celula pierde din acest motiv i potasiul care este ulterior eliminat. Cation principal n fluidul intracelular, K+ este implicat n funcia nervoas i muscular, n funcionarea Na+/K+-ATP-azei. n timpul contraciei musculare, potasiul din spaiul intracelular trece n cel extracelular, iar n locul lui n celul intr sodiul. Supradozarea cu ioni K+ determin scderea (oprirea) activitii cardiace, ulcerul intestinului subire. Necesarul zilnic de potasiu este de 1,875-5,625 g /kilocorp Sursele: vegetale, fructe (nuci, banane, mere, struguri, portocale) boabe de cereale semine de floarea soarelui, carne slab. Principiu: Hexanitrocobaltiatul ( ) trisodic (Reactiv Konninck) formeaz cu ionul K+ ) dipotasicn soluii neutre, un precipitat galben cristalin de hexanitrocobaltiat (

85

monosodic. Gruprile nitro din compus se oxideaz n mediu acid cu KMnO4 n exces. Excesul de KMnO4 se titreaz iodometric cu tiosulfat de sodiu. Na3[Co(NO2)6] + 2 KCl-------------> NaK2[Co(NO2)6] + 2NaCl 5 NaNO2 + 2 KMnO4 + 3 H2SO4 ----> 5 NaNO3 + 2 MnSO4 + K2SO4 +3 H2O 2 KMnO4 + 10 K + 8 H2SO4 ------------> 5
2 2

+ 2 MnSO4 + 6 K2SO4 +8 H2O

+ 2 Na2S2O3 --------------------------------> Na2S4O6 + 2 Na ) trisodic). Prepararea

Reactivi: - Reactiv Konninck (hexanitrocobaltat ( reactivului Konninck: -

Soluia A: Se dizolv 1,25 g Co(NO3)3 n 2,5 ml H2O. Dup dizolvare se adaug 0,0625 ml CH3COOH glacial. Soluia B: Se dizolv 56 g NaNO2 n 9 ml H2O bidistilat, prin nclzire. Soluia A se amestec cu soluia B. Pentru ndeprtarea vaporilor nitroi se trece prin soluie un curent de aer timp de 60 minute (tromp de vid). Se las n repaus 2 ore dup care se filtreaz. Dac culoarea se nchide din nou se trece din nou un curent de aer. - Alcool etilic 70 - Soluie fosfat disodic 5% - H2SO4 20% - KMnO4 0,01N - K 10% - Amidon 1% - Na2S2O3 0,05N Modul de lucru: ntr-o eprubet de centrifug se msoar: - 1 ml reactiv Konninck (Sol.A + B), apoi 1 ml ser. Se agit i se las n repaos 20 minute. Eprubeta se supune centrifugrii la 2000 rpm timp de 10 minute. Dup decantarea lichidului supernatant, precipitatul sedimentat se spal cu 5 ml etanol iar dispersia etanolic se supune din nou centrifugrii i decantrii Precipitatul rmas se dizolv cu 5 ml fosfat disodic, prin fierbere 5 minute. Soluia se golete ntr-un flacon Erlenmeyer de 100 ml iar eprubeta se spal n flacon cu 1 ml H2SO4 20%. n tabel apar cantitile de reactivi care se introduc n flaconul Erlenmeyer cu prob i n unul cu martor.

86

H2O bidistilat (ml) H2SO4 20% (ml) KMnO4 0,01N (ml) K 10% (ml) Amidon 1% (ml)

Prob Precipitat dizolvat 1 20 Repaus 20 minute (ml) 3 2

Martor 5 2 20 3 2

Proba i martorul se titreaz cu Na2S2O3 0,05N pn la dispariia culorii albastre determinate de prezena I2. Calcul: 1 ml Na2S2O3 0,05N corespunde la 0,065 5 mg K mg K% = (v1 - v2) 5 0,065 100; unde v1 = nr. ml Na2S2O3 folosii la titrarea martorului i v2 = nr. ml Na2S2O3 folosii la titrarea probei Valori normale: 13-21 mg/100 ml ser; 3,3-5,4 mmol/l Variaii patologice: - Hiperpotasemii: arsuri intense, hemoragii, infarct

miocardic, sindroame maligne, pancreatite acute hemoragice, necroze viscerale, insuficien suprarenal acut sau cronic, sindrom hemolitic, nefrit acut sau cronic. - Hipopotasemii: diaree, vomismente, nefropatii tubulare, acidoze diabetice, com diabetic, administrare prelungit de diuretice, hipercorticism suprarenal, boala Cushing, tumor suprarenal, tratament cortizonic. Deficiena de potasiu apare dup rniri sau terapie cu diuretice. Deficiena de potasiu determin slbirea tonusului muscular, paralizii, confuzii mentale. Dozarea flamfotometric a potasiului seric n ultimul timp, metodele chimice de determinare ale potasiului au fost nlocuite prin analiza flamfotometric. Factorii care au favorizat utilizarea flamfotometriei ca metod uzual n laboratoarele clinice pentru determinarea n lichidele biologice a metalelor alcaline (Na+ i K+) i metalelor alcalino-pmntoase (Ca2+ i Mg2+), au fost: simplitatea metodei, rapiditatea metodei, consumul minim de substane, limita de eroare (2-3%) apropiat de limita de eroare din determinrile chimice.

87

Principiu: Serul nehemolizat se dilueaz cu ap bidistilat, apoi se pulverizeaz ntr-un dispozitiv special cu ajutorul unui curent de gaz purttor. Aerosolii formai n urma pulverizrii se amestec cu unul din amestecurile de gaze: metan-aer, propan-aer sau acetilen-aer care arde ntr-un arztor special (Brenner), dnd natere la spectre caracteristice. Liniile spectrale ale potasiului pot fi selecionate cu ajutorul unui filtru. Lumina flcrii este proiectat cu ajutorul unei oglinzi concave, prin filtrul de selecie, pe o celul fotoelectric, ceea ce produce un fotocurent, care se poate msura cu ajutorul unui galvanometru. Intensitatea fluxului luminos este proporional cu concentraia ionilor K+ din ser. Alte detalii privind aceast analiz instrumental sunt cuprinse n capitolul privind unele aparate de analiz fizic de la sfritul ndrumtorului.

Dozarea calciului i magneziului

Dozarea calciului Rolul calciului n organism Calciu este cel mai abundent mineral din organismul uman. Un adult de 70 kg conine n esuturi aproximativ 1,2 kg calciu. Aportul zilnic necesar de calciu este 1 gram, din care se absorb doar 10-20%. Calcemia (concentraia plasmatica a calciului) normal este 9-11 mg%, 4,5-5,5 mEq/l sau 2,25 -2,75 mmol/l. Calciul ndeplinete n organism un rol plastic participnd prin combinaiile sale insolubile la structura scheletului osos a crui principal component mineral este hidroxiapatita, 3Ca3(PO4)2Ca(OH)2 i un rol dinamic sub form de ioni Ca2+ prezeni n fluidele, cum ar fi plasma sau urin, sub forma a trei fraciuni: 1. Calciu legat de proteine (proteinate de calciu) aproximativ 1 mmol/l. Aceast form depinde de concentraia relativ a proteinelor i calciului din plasm. Pe baza acestei dependene se poate aprecia fraciunea de calciu ionizat, cunoscnd calciul total din ser sau plasm i nivelul proteinei din ser sau plasm. Tehnica const n folosirea nomogramei MacLean i Hastings, cunoscnd cei doi parametri amintii anterior se citete direct valoarea calciului ionizat de pe nomogram.

88

2. Calciul legat de molecule mici (compleci de calciu sau chelai) acizi organici, numit i calciu complexat dializabil. Acesta poate strbate membranele semipermeabile (celofan) spre deosebire de calciul legat de proteine. 3. Calciul liber, forma biologic activ ce intervine n coagularea sngelui n activarea enzimelor (proteaze), n buna funcionare a inimii, muchilor i nervilor. Determinarea cationului calciu n snge Calciul este cationul prezent predominant n spaiul extracelular. n laboratoarele de analize clinice, calciul din snge se poate doza prin diferite metode. Metodele fizice folosite sunt: fotometria de flacr, spectroscopie de absorbie atomic, folosirea electrozilor ion-selectivi. Metodele chimice folosite sunt precipitarea calciului sub form de oxalat i apoi dozarea oxalatului de calciu format cu ajutorul permanganatului de potasiu i metoda complexonometric. Metodele optice sunt descrise n principiu la sfritul ndrumtorului. Metodele poteniometrice cu electrod pentru Ca2+ utilizeaz un milivolmetru cu impedan de intrare mare similar cu pH-metrului electrodului de sticl utilizeaz electrodul selectiv pentru ionii de Ca2+. Metodele chimice (volumetrice) sau fizice cu excitare (flamfotometrie, spectroscopie de absorbie atomic) permit determinarea concentraiei totale a calciului. Singurele metode care pot determina calciul ionizabil (singurul care este biologic activ) sunt metodele nernstiene, adic cele care folosesc electrozi selectivi. Toi electrozii selectivi au ca particularitate o parte care este numit n mod curent membran. Aceast membran confer selectivitatea electrodului. Membranele sunt de mai multe tipuri: membrane de sticl (pentru msurarea pH-ului), membrane solide (pentru msurare concentraiei F-, CN-) i membrane lichide (pentru msurarea Ca2+, Mg2+). Electrodul membran-lichid pentru Ca2+ este constituit din urmtoarele componente principale: -Un fir de argint metalic acoperit cu clorur de argint, scufundat ntr-o soluie de CaCl2 -Un rezervor central n care se afl CaCl2 i firul de argint -O membran poroas millipor de PVC care joac rolul unui suport inert, impregnat cu o soluie organic compus din sarea de calciu a acidului didecilfosforic dizolvat ntr-un solvent nemiscibil cu apa (de exemplu: di n octil fenil fosfat). 89 care n locul

Ionul de calciu este comun att soluiei apoase (soluie a crei concentraie vrem s-o determinm) ct i soluiei organice cu care este impregnat membrana millipor. n aceast soluie organic se va reine ionul de calciu de ctre un contraion (ion cu semn opus), n cazul de fa didecil fosfatul, care fiind insolubil n ap nu poate prsi soluia organic. ntre cele dou soluii (apoas i organic) apare o diferen de potenial nernstian (respect legea lui Nernst). Diferena de potenial este msurat cu ajutorul instrumentului, care este gradat direct n uniti de concentraie a ionilor de Ca2+ (pCa). Concentraia ionilor de calciu, poate fi apreciata i indirect folosindu-se nomograme. Sunt dou tipuri de nomograme utilizate n acest scop. Nomograma MacLean-Hastings cu ajutorul creia se poate deduce concentraia calciului ionizat, cunoscnd calciu total din ser sau plasm i concentraia total a proteinelor din ser sau plasm. Cea de a doua nomogram utilizabil pentru deducerea concentraiei Ca2+, se bazeaz pe faptul c ionizarea ionilor de calciu variaz linear n funcie de pH-ul serului sau plasmei. Acest tip de extrapolare se poate face numai ntre limitele variaiei pH-ului fiziologic (6,8 - 7,8), pentru c numai n aceast plaj de pH variaia este linear (vezi figura de mai jos).

90

n diagrama pH-Ca2+ liber prezentat, ordonata (concentraia ionilor de Ca2+) este divizat nelinear. Cunoscnd valorile pCa i pH (msurate cu electrozii selectivi corespunztori) se poate stabili natura tulburrii de care sufer pacientul (hiper/hipoparatiroidism primar, acidoz/alcaloz acut, etc.). Dozarea calciului prin metoda permanganometric Principiu Se precipit ionul de calciu sub form de oxalat de calciu. Precipitatul format se dizolv n acid sulfuric, iar acidul oxalic eliberat se va titra cu o soluie de permanganat de potasiu, pn la apariia unei coloraii slab roz. CaCl2 + (COONH4)2 (COO)2Ca + 2NH4Cl (COO)2Ca + H2SO4 (COOH)2+ CaSO4 5(COOH)2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O Reactivi: - soluie de oxalat de amoniu 4% (soluie saturat) - soluie de hidroxid de amoniu 2% - soluie de acid sulfuric 1N - soluie de permanganat de potasiu 0,01 N cu factorul FKMnO4 Modul de lucru: Se pipeteaz 1 ml ser, 1 ml soluie saturat de oxalat de amoniu i 2 ml de ap bidistilat ntr-o eprubet de centrifug. Se amestec prin agitare i se las minim 30 de minute n repaus. Se centrifugheaz timp de 10 minute la 4000 turaii pe minut. Supernatantul se ndeprteaz printr-o singur rsturnare a eprubetei i peste precipitat se adaug 4 ml din soluia de hidroxid de amoniu 2%, se agit, apoi se centrifugheaz. Se ndeprteaz supernatantul cum s-a artat mai sus i se mai face o splare cu soluia de hidroxid de amoniu, se centrifugheaz i se elimin supernatantul. Peste precipitatul astfel splat se adaug 2 ml acid sulfuric 1N i se ajut dizolvarea prin nclzire pe o baie de ap la 60-70C. Se recomand ca temperatura s nu depeasc 70C pentru a se evita descompunerea acidului oxalic. Se titreaz cu soluia de permanganat de potasiu la cald pn la apariia unei coloraii roz palid care trebuie s persiste minimum un minut. n paralel se face i o prob martor. Tot ntr-o eprubet de centrifug, se introduc 2 ml acid sulfuric 1 N, se nclzete pe o baie de ap la 70C i se titreaz cu soluia de permanganat de potasiu la cald pn la apariia unei coloraii roz palid care trebuie s persiste minimum un minut. 91

Calcul: 1 ml soluie KMnO4 0,01 N conine 0,01 miliechivaleni de KMnO4. Stoichiometric 0,01 miliechivaleni de KMnO4 vor reaciona cu 0,01 miliechivaleni de Ca ceea ce reprezint 0,2 mg de calciu. x = (a-b) F KMnO4 0,20 (mg Ca /1ml ser) x100 = mg Ca /100 ml ser sau (a-b) F KMnO4 5 (mmol Ca /l) n care: a = numr de ml soluie KMnO4 0,01 N utilizai la titrarea probei de analizat iar b = numr de ml soluie KMnO4 0,01 N utilizai la titrarea martorului. Valori normale: ser 9-11 mg / 100 ml la aduli sau 2,2-2,8 mmol / l 7-14 mg / 100 ml la copii sau 1,8-3,5mol / l Valori sczute: - hipofuncie paratiroidian - avitaminoz sau hipovitaminoz D - uremie La valori de sub 1,7 mmol / l (6,8 mg%) apar fenomene de tetanie. Valori crescute: - hiperfuncie paratiroidian - neoplazii osoase (osteosarcom, mielom multiplu, unele leucemii) - hipervitaminoz D - deshidratare Dozarea calciului prin metoda complexonometric Eliminarea calciului n urin este n funcie de coninutul de calciu din alimente i de rata de absorbie digestiv. Principiu: Ionii de calciu din urin n mediu puternic alcalin se vor titra cu EDTANa 2, adic complexon III (sarea de sodiu a acidului etilendiaminotetraacetic) n prezena murexidului (purpurat de amoniu) ca indicator. Indicatorul va fixa ionii de calciu (culoarea soluiei va fi roz) care prin titrare vor fi apoi complexai cu EDTA. Indicatorul eliberat va colora soluia n violet. Murexidul, indicator metalocromic (pentru calciu i 92

ali cationi) are gradul de ionizare n funcie de pH-ul mediului. Reaciile prin care ionii Ca2+ sunt complexai de indicator i de complexon sunt: Ca2+ + Ind3- CaIndroz Ca2+ + Y4- CaY2complexonul deprotonat Reacia titrimetric care produce virajul indicatorului este: CaInd- + Y4- CaY2- + Ind3violet Reactivi: - soluie complexon III 0,001 N . - soluie de NaOH 9 N - soluie indicator murexid 0,1% Modul de lucru: Se folosete urin proaspt, fr conservani. Se pregtesc dou pahare Erlenmeyer de cte 100 ml i se pipeteaz n fiecare urmtoarele: Exprimarea Urin Ap bidistilat Soluie de NaOH 9 N Indicator murexid Culoare Se titreaz cu EDTA 0,01N pn la violet cantitilor ml ml ml pic. Proba 2 50 0,2 1 roz A ml Martor 52 0,2 1 roz-violaceu B ml

Se execut o prob i un martor, martorul se titreaz dac este necesar pn la culoarea violet stabil, pentru a se lua n calcul i urmele de calciu din reactivi. Calcul: n calcularea rezultatelor se are n vedere c complexul din 1 ml soluie complexeaz 0,2 mg Ca2+: 1ml EDTA 0,01N-----------------------------------------------0,2 mg Ca (A-B)FEDTA------------------------------------------------------x x= (A-B) FEDTA0,2 mg Ca / 2ml Considernd c urina de 24 ore are volumul de 1500 ml: g Ca n urina de 24 de ore = (A-B) FEDTA0,2 1500 / 2 1000

93

g Ca n urina de 24 de ore = (A-B) FEDTA0,15

Valori normale: - sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore sau 0,25 - 3,5 mmol/24 ore intoxicaii cu vitamina D, hipercalciurie ideopatic. Valori sczute apar n spasmofilie, tetanie infantil, osteomalacie, rahitism, hipopara-tiroidism. Dozarea magneziului prin metoda Mann i Yoe Un adult de 70 kg conine aproximativ 24 g de magneziu, care este distribuit inegal n organism, avnd o concentraie mai mare n esuturile cu activitate metabolic mai intens, cum ar fi creierul, inima, ficatul, rinichii, tiroida. Totui scheletul conine 60% din magneziu. Muchii scheletici i miocardul conine 35%, iar 1% se gsete n compartimentul extra-celular, din acesta aproximativ dou treimi fiind sub form ionizat, restul fiind legat de albumine. Principalele organe implicate n metabolismul Mg sunt intestinul i rinichii. Magneziul are un rol cheie n numeroase funcii mediate enzimatic, fiind implicat n formarea de substrate enzimatice (ATP Mg, GTP Mg) precum i n activarea direct a enzimelor. Funciile membranare care sunt influenate de magneziu includ conducerea impulsului nervos i modularea activitii canalelor de calciu. Principiu: Colorantul Mann i Joe (1- azo - 2 hidroxi 3- (2,4 dimetil carboxamilido) naftalin 1 (2 - hidroxibenzen) 4 sulfonat de sodiu) este albastru. n mediu alcoolic, la pH 9-10, acesta formeaz cu Mg2+ (n cantiti de ordinul microgramelor) un complex de culoare roie, iar intensitatea coloraiei este proporional cu concentraia cationului. Materiale necesare: - spectrofotometru - micropipete de 20 l (0,02ml) - copii i aduli 0,1 - 0,2 g/24 ore sau 2,5 - 5,0 mmol/24 ore

Valori crescute apar n boala Recklinghausen, osteoporoze, dup fracturi,

94

Reactivi:

- Reactivul Mann i Yoe: se dizolv 8 mg colorant n 75 ml alcool absolut (eventual prin fierbere cu reflux) i dup dizolvare se aduce la 100 ml cu alcool absolut. - Soluie tampon (pH 9-10): 20 g tetraborat de sodiu cristalizat cu 10 molecule de ap, se dizolv la cald n 500 ml ap bidistilat, apoi se completeaz cu ap bidistilat la 1000 ml. - Soluie standard de Mg2+ 2 mg/ 100ml: se dizolv 203 mg MgSO4 cristalizat cu 7 molecule de ap n 500 ml ap bidistilat, se adaug 1 ml cloroform (conservant), apoi se completeaz la 1000 ml cu ap bidistilat - Soluie acid percloric 0,33 N: se dizolv 2,85 ml HClO4 70% n 100 ml ap distilat

Modul de lucru: Se pregtesc n trei eprubete urmtoarele mixturi: Soluie tampon (ml) Ser (ml) Standard de Mg2+ (ml) Ap bidistilat (ml) Reactiv Mann i Yoe (ml) Prob 1,0 0,02 Se amestec bine 1,0 Blanc 1,0 0,02 1,0 Standard 1,0 0,02 1,0

Se agit bine mixturile i dup 15-30 de minute se citete exticia probei i a standardului fa de blanc n cuva de 1cm la = Calcul: Ep/Es x 2 = mg Mg% Valori normale nou nscui: aduli: Modificri patologice n practica medical deficitul de magneziu este ntlnit relativ frecvent, dar el nu este ntotdeauna identificat deoarece are expresie medical mai puin specific comparativ cu carena altor elemente (exemplu ferul) i apare ntr-un context complex n asociere cu alte afeciuni care pot domina tabloul. Deficitul de magneziu apare n urmtoarele cazuri: 95 1,6 - 2,3 mg% sau 1,32 -1,90 mEq/l sau 0,66-0,95 mmol/l 1,6 - 2,4 mg% sau 1,56-2,38 mEq/l sau 0,8-1,2 mmol/l Ep/Es x 1,64 = mEq/l 505 nm.

Aport deficitar, alimentaie parenteral, cure drastice de slbire, alcoolismul cronic, vrsturi datorate alimentaiei dezechilibrate, hipersudoraie, eliminarea crescut a magneziului prin urin (etanolul antreneaz diureza osmotic). Afeciunile care evolueaz cu malabsorbie, rezeciile intestinale, enteropatiile acute sau cronice, diarea, steatoreea, terapia cu diuretice, provoac de asemenea depleia de magneziu. n practica pediatric, deficitul poate aprea din urmtoarele cauze: disgravidia - srcire a organismului matern cu repercusiuni asupra capitalului de magneziu al nou nscutului, creterea rapid a copilului n primele luni, lapte matern srac n magneziu, tulburri gastrointestinale la aceast vrst. Terapia cu calciu i vitamina D n doze mari favorizeaz pierderile urinare de magneziu. n diabetul zaharat apare hipomagnezemia datorit pierderilor urinare de magneziu antrenate de diureza osmotic. Stresul fizic i psihic favorizeaz depleia de magneziu. Manifestri clinice ale deficitului de magneziu (hipomagnezemie) sunt polimorfe i nespecifice. Ele pot fi: insomnie, anxietate, depresie , cefalee, slbiciune muscular, crampe, parestezii, hiperreflexe, dificulti de nghiire, senzaie de constricie toracic, tulburri de adaptare a vederii. Suprancrcare de magneziu se constat la nou nscuii ai cror mame au fost tratate cu sulfat de magneziu n contextul eclampsiei de sarcin. n insuficiena renal, n special concomitent cu medicaia pe baz de Mg2+ (antacizi, laxative), se produce hipermagnezemie. Simptomele hipermagnezemiei sunt: hipotensiune, greuri, vrsturi, bradicardie, hiporeflex osteotendinos, hipotonie muscular.

96

Dozarea ionului de clor din ser prin metoda Schales

Principiu: Ionul Cl-, principal anion al plasmei sanguine, n mediu acid se titreaz cu Hg(NO3)2 formnd HgCl2, molecul nedisociat. Se folosete ca indicator difenilcarbazona care formeaz un compus de culoare violet cu ionii Hg2+ n exces. Nu este necesar deproteinizarea, cu excepia serurilor puternic icterice. Reactivi: - Soluie de azotat mercuric 0,01 N - Soluie indicator de difenilcarbazon 0,01 M - Soluie H2SO4 2/3 N - Soluie standard de clorur de potasiu 0,1 N Modul de lucru: n dou flacoane Erlenmeyer de 25 ml se pipeteaz: Ap distilat ml Ser ml Standard KCl ml H2SO4 2/3 N Indicator difenilcarbazon Prob 1,0 0,1 1 pic. 2 pic. Standard 1,0 0,1 1 pic. 2 pic.

Ambele probe se titreaz pn la aceiai culoare violet cu Hg(NO 3)2 0,01 N. Se noteaz volumul n ml folosit la titrarea probei (v1) i cel folosit la titrarea standardului (v2). Calcul: 1 ml Hg(NO3)2 0,01 N corespunde la______________________________0,355 mg Clv1 / v2 ________________________________________________________ x x = mg Cl-/0,1 ml ser = v1 / v2 0,355 mg Cl- / 100 ml ser = v1 / v2 355 mEq Cl- / l = v1 / v2 100

97

Observaii:

n cazul serurilor puternic icterice se efectueaz deproteinizarea.

Dup deproteinizare, culoarea indicatorului la viraj tinde spre albastru, pe cnd la ser neproteinizat spre violet. Valori normale pentru aduli: 340 390 mg clor/100 ml ser 96 110 mEq clor/ litru de ser Valori sczute pn la 250 mg/100 ml ser se ntlnesc n insuficien corticosuprarenal (boala Addison), n diaree sau vrsturi prelungite, cnd organismul pierde pe lng ap i o cantitate apreciabil de NaCl. Valori crescute se ntlnesc n stri de sete, n hiperfuncia corticosuprarenal i n insuficiena renal.

Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificat)

Principiu: Se trateaz serul sanguin cu acid clorhidric cnd se elibereaz Fe3+ din legtura sa cu proteinele (transferina). Se precipit proteinele serice cu acid tricloracetic, dup filtrare Fe3+ din filtrat este redus cu hidrochinon la Fe2+. Ionii de Fe2+ formeaz cu ortofenantrolina i, mai specific, cu , -dipiridil, un complex colorat n rou. Intensitatea coloraiei roii va fi proporional cu concentraia ferului din prob.

Reactivi:

- Soluie HCl 1N; - Soluie CCl3COOH 20%;

98

Soluie hidrochinon 2%; ortofenantrolin, iar pentru dizolvare se aciduleaz iniial cu 2-3 picturi de HCl concentrat)

- Soluie ortofenantrolin clorhidric 1% (se poate utiliza i

Soluie semisaturat de CH3COONa. Se dilueaz extemporaneu o soluie saturat (la temperatura camerei cu ap bidistilat) n proporie de 1:1

- Soluie standard concentrat de fer 10 mg%: 0,0497 g FeSO4 7H2O, ad 100 ml cu ap bidistilat sau 0,0702 g Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O, ad 100 ml cu ap bidistilat. Standardul concentrat se pstreaz la frigider. Se dilueaz extemporaneu 1 ml la 100 ml cu ap bidistilat obinndu-se un standard de lucru de 100 g Fe % cu stabilitate limitat la 1-2 luni. Modul de lucru: n trei eprubete se pipeteaz conform tabelului: Prob (ml) 1 2 Standard (ml) 1 2 Blanc (ml) 1 2 -

sol. HCl 1 N ser (nehemolizat) ap bidistilat sol. standard de fier (100 g %) acid tricloracetic 20% filtrat sol. hidrochinon 2% sol. o-fenantrolin 1% sol. acetat de sodiu

Agitare, 10 min. repaus 2 2 10 min. repaus, filtrare i apoi n eprubete 2 2 0,2 0,2 0,1 0,1 2 2

2 2 0,2 0,1 2

Fiecare eprubet se agit i dup 5 minute se citete extincia probei (Ep) i a standardului (Es) fa de blanc, n cuva de 1 cm, la = 510 nm. Calcul: Sideremia se calculeaz cu urmtoarea formul: Fe g% = Ep/EsCst = Ep/Es100 (Cst = concentraia standardului de fer = 100 g%)

99

Valori normale:

- femei: 80-130 g% (14,3-23,3 moli/l) - brbai: 90-160 g% (16,1-28,6 moli/l)

Valori crescute: creterea reabsorbiei (absena blocadei mucoasei), depozitarea excesiv a ferului n organism (hemosideroz, hemocromatoz), tratament cu fer n exces, etc. Valori sczute: scderea aportului (diet inadecvat, regim finos-lactat), scderea absorbiei (rezecii de stomac/intestin, diaree cronic, sindrom de malabsorbie), aclorhidrie, pierderi mari de snge. Proteina plasmatic transportoare de fer este transferina (siderofilina) sintetizat n ficat. Capacitatea total de fixare a ferului (CTFFe) corespunde cantitii totale de siderofilin i se exprim n g Fe/100 ml plasm. Valorile normale ale CTFFe se ncadreaz ntre 250-420 g% Fe. n deficitul de transferin sunt sczute att sideremia ct i, evident, CTFFE. n anemia feripriv sideremia este mult sczut, n timp ce CTFFe este mult crescut, cauza fiind utilizarea ferului plasmatic pentru producia de hemoglobin. La rndul ei producia accelerat de hemoglobin poate fi cauzat de pierderile cronice de snge, sarcini repetate, hemoragii puternice.

Dozarea fosfatului anorganic din ser prin metoda Briggs ( cu deproteinizare)

n serul sanguin i alte lichide biologice fosforul se gsete sub trei forme: 1. Combinat n proteine (a) sau acizi nucleici (b) ca: (a) fosfoproteine ( cazeina din lapte, vitelina din glbenuul de ou) (b) nucleoproteine (mediul intracelular animal, etc.). 2. Sub form acidosolubil, adic neprecitabil cu acid tricloracetic: a. fosfor anorganic ( acid ortofosforic (H3PO4), H2PO4-, HPO42-, Me4P2O7), b. nucleotide, c. esteri fosforici ai glucidelor, d. acid fosfogliceric, e. acid fosfopiruvic, f. acid creatinfosforic, g. acizi trifosforici 3. Fosfolipide: lecitine, cefaline, sfingomieline etc. Fosfaii anorganici ndeplinesc unele roluri n lichidele i esuturile biologice: a) Sistemul tampon al fosfailor (H2PO4-/ HPO42-). n organismul uman mediul intern are bazicitatea uor crescut peste neutralitate, pH = 7,35 -7,45. Meninerea constant a pH-ului n mediu intern este realizat, alturi de alte sisteme tampon, prin 100

sistemul tampon al fosfailor. Acest sistem poate fi alctuit din dou sruri: fosfat monoacid (Na2HPO4 sau K2HPO4) - care constituie componenta bazic a sistemului - i fosfatul diacid (NaH2PO4 sau KH2PO4) care este componenta acid. De fapt, componentele funcionale n cursul tamponrii sunt anionii acestor sruri: HPO 42- i H2PO4-. La pH-ul normal (7,4), concentraia anionului HPO42- este aproximativ de 5 ori mai mare dect cea a anionului H2PO4-. Componenta bazic, HPO42-, tamponeaz aciditatea mediului prin reacia: HPO42- + H+ ---------> H2PO4Componenta acid, H2PO4-, elibereaz protoni care neutralizeaz ionii OH- ai bazelor: H2PO4- + OH- ------------> H2O + HPO42Dup cum se observ, produii rezultai n ambele cazuri sunt componentele sistemului tampon. Sistemul tampon al fosfailor este operant n special n hematii, dar i n celulele tubulilor renali. b) n snge exist un raport aproximativ invers proporional ntre ionii fosfat i calciu. La nivel renal, hormonul paratiroidian crete reabsorbia calciului i inhib reabsorbia ionilor fosfat (aciune fosfaturic). Efectele la nivelul oaselor i rinichilor, ale hormonului cresc calcemia, fr o cretere echivalent a concentraiei fosfatului, mpiedicndu-se astfel atingerea unor concentraii critice la care aceti ioni s formeze fosfat tricalcic insolubil. De fapt concentraiile serice ale acestor ioni depesc pragul de solubilitate al fosfatului tricalcic. Totui, coninutul n proteine i ali metabolii din ser previne precipitarea srii tricalcice. Principiu: Se precipit proteinele cu acid tricloracetic i se separ prin filtrare. n filtratul acidulat fosfatul anorganic, mpreun cu molibdatul de amoniu, formeaz fosfomolibdatul de amoniu ( un complex de culoare galben): 12 (NH4)2MoO4 + H3PO4 + 21H+-----> (NH4)3PO4 12MoO3 + 21NH4+ (galben) HPO42- + 12MoO42- + 3NH4+ +23H+ (NH4)3[P(Mo3O10)4].6H2O + 6H2O

+12H2O

101

Aceasta este redus la albastru de molibden (un amestec de oxizi de molibden, (MoO2)2.MoO4, fin dispersai n ap) de ctre hidrochinon i apoi sulfit de sodiu. Intensitatea culorii albastre este proporional cu concentraia complexului, deci cu cantitatea de fosfat anorganic din prob, adic culoarea produs de oxizii de molibden este fotometrabil (se supune legii Lambert-Beer). Aparatur: - Spectrofotometru Spekol. Reactivi: - Acid tricloracetic 20% - Soluie de molibdat de amoniu n mediu acid obinut prin dizolvarea a 25g molibdat de amoniu n 300ml H2O la care se adaug 75ml H2SO4 concentrat iar apoi se completeaz la 500ml cu ap. - Soluie de hidrochinon 1% acidulat cu o pictur de H2SO4 concentrat. - Soluie sulfit de sodiu 20% care se mprospteaz la fiecare serie de determinri. - Soluie standard stoc de fosfat (2 mgP/ml) preparat folosind ca substan etalon KH2PO4. - Soluie standard de lucru (20 gP/ml) obinut prin diluarea soluiei stoc de fosfat. Curba de calibrare 1 n baloane Erlenmeyer se msoar: Sol. Standard de lucru de P (1ml=20 gP), ml Acid tricloracetic 20%, ml Ap bidistilat, ml Din acest amestec se msoar n baloane Erlenmeyer: Molibdat de amoniu, ml Sulfit de sodiu 20%, ml Hidrochinon 1%, ml Ap bidistilat, ml 0,5 2 7,5 5 1 1 1 2 2 1 2 7 5 1 1 1 2 3 3 2 5 5 1 1 1 2 4 5 2 3 5 1 1 1 2

Se omogenizeaz coninutul baloanelor i dup 30 min. se citete extincia fa de blanc la =600 nm. Modul de lucru: Se prepar o prob i un blanc n conformitate cu tabelul de mai jos: 102

Ser, ml Ap bidistilat, ml Acid triloracetic 20%, ml Filtrare n eprubete Din filtrat, ml Molibdat de amoniu, ml Sulfit de sodiu 20%, ml Hidrochinon 1%, ml Ap bidistilat, ml

Proba n baloane Erlenmeyer se msoar: 2 4 4 Agitare energic i repaus 10 min + n baloane Erlenmeyer se msoar: 5 1 1 1 2

Blanc 5 1 1 1 2

Se omogenizeaz coninutul baloanelor i dup 30 min se citete extincia probei fa de blanc la = curba de etalonare. Valori normale: - aduli:2,5-4,5 mg/100 ml ser (0,8-1,5 mmol/l) - copii: 4-6 mg/100 ml ser (1,3-1,9 mmol/l) Variaii patologice: Valori sczute: Hipofosfatemii apar n hiperparatiroidism, rahitism, osteomalacie. Valori crescute: Hiperfosfatemii i cronice. apar n hipoparatiroidism, acromegalie, hipervitaminoz D, tubulopatii renale, insuficiene renale acute 600 nm.

Determinarea fosfatemiei se face raportnd extincia probei citit fa de blanc la

Compui organici
Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl
Principiu: Dozarea azotului din materiale biologice se face dup metoda pus la punct de ctre Kjeldahl n 1883. Componentele organice azotate din ser se transform prin mineralizare n sruri de amoniu care n aparatul Wagner-Parnas elibereaz amoniac.

103

Amoniacul este captat ntr-o soluie de H2SO4 n exces iar excesul de H2SO4 se titreaz cu o soluie de NaOH n prezena indicatorului Groak. Reactivi: - H2SO4 conc. - Amestec catalizator CuSO4 . 5 H2O i K2SO4 (1:3), (m:m) - H2O2 3 %; - NaOH 30 %; - H2SO4 N/100; - NaOH N/100; - Indicator Groak: la 100 ml sol. alcoolic saturat de rou metil se adaug 4 ml sol. de albastru de metilen 1 %; Dozarea decurge n trei faze: mineralizarea, antrenarea cu vapori i titrarea Mineralizarea pentru distrugerea materiei organice se face cu H2SO4 conc., la temperatur ridicat i n prezena ionilor de cupru: 2 N + 3 C + 3H2SO4 2 NH3 + 3 CO2 + 3 SO2 Sulfatul de potasiu ridic temperatura de fierbere la 350-4000 C iar ionii de cupru, din sulfatul de cupru, au rolul de a cataliza reacia. n cazul mineralizrii NH 3 reacioneaz cu H2SO4 prezent, transformndu-se n sulfat de amoniu, conform reaciei: 2 NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 naintea antrenrii cu vapori, NH3 se elibereaz din sulfatul de amoniu cu NaOH concentrat: (NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O i se antreneaz cu vapori n aparatul Wagner-Parnas, ntr-un volum cunoscut de H2SO4 N/100. Excesul de H2SO4 N/100 se titreaz cu NaOH N/100 n prezen de indicator Groak. Aparatur: Aparatul Wagner-Parnas este alctuit din balonul A (generator de vapori) n care se formeaz vaporii de ap, care prin vasul B (deflegmator) trec n balonul de antrenare C antrennd de aici amoniacul. Aburii sunt condensai n refrigerentul descendent D, iar soluia apoas de amoniac se colecteaz n flaconul Erlenmayer E care conine soluia de H2SO4 N/100. Modul de lucru: 1) Mineralizarea : ntr-un balon Kjeldahl de mineralizare se introduc 1 ml H 2O distilat, 0,1 ml ser, 2 ml H2SO4 conc., un vrf de spatul amestec catalizator i 2-3 picturi soluie de

104

H2O2. Mineralizarea are loc pe flacr mic sub ni. Dup 10 minute balonul Kjeldahl se rcete la temperatura camerei fiind lsat n repaos sub ni (atenie, eman vapori corozivi de H2SO4 !).

2) Splarea aparatului Wagner-Parnas: naintea acestei distilri aparatul Wagner-Parnas, cu reziduuri de la antrenarea precedent se spal. Pentru aceasta se procedeaz n felul urmtor: Se nlocuiete flaconul E cu un pahar Berzelius care conine ap distilat. Se spal plnia F cu H2O distilat, apoi se nchide din nou robinetul ei. Prin rcirea i condensarea vaporilor de ap presiunea din aparat scade sub cea atmosferic i astfel coninutul vasului de distilare C este aspirat n vasul B, din care apa se ndeprteaz prin robinetul H n paharul Berzelius. Se rcete balonul A cu ajutorul unei crpe ude pn cnd apa distilat din pahar este aspirat pn n vasul B de unde se ndeprteaz prin robinetul H iar dup terminarea splrii se deschide robinetul de siguran G i se poate pregti distilarea. 3) Antrenarea NH3 cu vapori de ap. ntr-un flacon Erlenmeyer (E) de 100 ml se pipeteaz 20 ml H2SO4 N/100, se adaug 2-3 picturi de indicator Groak i flaconul se aeaz sub refrigerentul D n aa fel nct captul acestuia s fie introdus n soluie. Coninutul mineralizat al balonului Kjeldahl se dilueaz cu precauie cu 2 ml H2O distilat i se introduce prin plnia F n vasul de distilare C. Balonul Kjeldahl se spal de 3 ori cu civa ml de apa distilat iar aceasta se colecteaz tot n plnia F.

105

Se adaug prin plnia F 20 ml NaOH 30%. Se nchide robinetul plniei F, se introduce flacra sub balonul A i apoi se nchide robinetul de siguran G se ateapt pn cnd vaporii antrenatori ajung la nivelul refrigerentului D, toate robinetele fiind nchise. Distilarea se face 3 minute, din acest moment, mai precis, dup ce prima pictur de condens cade pe tubul refrigerentului descendet D. n acest timp amoniacul trece cantitativ n flaconul E. Dup terminarea distilrii se coboar flaconul n care s-a colectat condensul i se las s mai picure cteva picturi. Cu ajutorul unei pisete se spal captul refrigerentului D n acest flacon. Numai dup aceasta se scoate becul de gaz de sub balonul A. Dup aceasta se poate trece la splarea aparatului prin procedeul descris mai sus. Coninutul flaconului Erlenmayer E se supune titrrii. 4) Titrarea Excesul de H2SO4 N/100 din flaconul Erlenmeyer se titreaz cu NaOH N/100 n prezena indicatorului Groak. Calcul : 1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N

a FH2 SO4 b FNaOH ................... x

x = ( a FH2 SO4 b FNaOH ) a = 20 ml H2SO4 N/100 b = volumul de NaOH N/100 consumat la titrare.

0,14 mg N/0,1 ml sol.

Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului

Principiu: Proteinele reacioneaz cu ionii de cupru n soluie alcalin formnd un complex proteic de culoare violet. Avantajul const n faptul c se folosete un singur reactiv n care hidroxidul de cupru este meninut n soluie sub form de complex format cu tartratul dublu de sodiu i potasiu, stabilizat cu iodur de potasiu. Reacia de complexare

106

cu ionii Cu2+ este dat de compui care conin n molecula lor cel puin dou legturi peptidice. Cel mai simplu compus care d aceast reacie este biuretul, compus care ia natere prin nclzirea ureei. NH2 t0 NH2 NH3 O O C C biuret O HN C C O H N (- ) N H Cu H N (- ) N H O 2NH + 2 Na + NH2 NH NH2 Cu 4 SO NaOH

2O

C
C O

Aparatura: Spectrofotometru sau fotometru cu filtre Reactivi: - Soluia A: 4,5 g tartrat de sodiu i potasiu se dizolv n 40 ml NaOH 0,2 N. Se adaug sub agitare 1,5 g CuSO 4.5 H2O dizolvat n 10 ml H2O, apoi 0,5 g KI i se completeaz cu NaOH 0,2 N pn la 100 ml. Se conserv n sticl brun timp nelimitat. - Soluia B: se dizolv 5 g KI n 1000 ml de NaOH 0,2 N. Se conserv n sticl brun timp nelimitat. - Soluia de lucru: se dilueaz 1 volum soluie A cu 4 volume soluie B. Se poate utiliza o sptmn, pstrndu-se n sticl brun. - NaCl 0,9 %. Modul de lucru: Se lucreaz n 2 eprubete conform tabelului: Sol. de lucru NaCl 0,9% Ser ml ml ml Proba 5,0 0,1 Blanc 5,0 0,1 -

107

Se omogenizeaz coninutul eprubetelor i dup 30 de minute se msoar extincia probei (E) fa de blanc, la = 546 nm, folosind cuva de 1 cm. Calcul: c (g/100ml) =

V E E 5,1 F = 1% E 1cm V P 2,77 0,1

1% E 18,4 = g proteine/100 ml ser; VF -volumul final; VP -volumul serului; E 1cm -coeficientul de

extincie procentual Valori normale: 6,5 - 8,2 g/100 ml Valori crescute se ntlnesc n: deshidratri acute produse de vrsturi, diaree, diabet, diabet insipid, poliurie; Hiperproteinemii apar i n: mielom multiplu macroglobulinemia Waldenstrm, boala Osler, boala Besnier-Boeck-Schaumann, anemie pernicioas, infecii acute i cronice Valori sczute: se ntlnesc n: afeciuni hepatice, ciroze hepatice, intoxicaii cu benzen, CCl4; Proteinemia scade i n stri de oc produse de arsuri, hemoragii; Hipoproteinemii se ntlnesc n: afeciuni renale, tumori maligne, inaniie. Hiperproteinemie relativ apare n deshidratri acute produse de vrsturi, diaree, poliurie care apare la pacienii cu diabet insipid i diabet zaharat. n cazurile enumerate nu crete de fapt cantitatea de proteine circulante ci crete doar concentraia lor din cauza pierderii de lichid din organism. Hiperproteinemie absolut apare n boli inflamatorii cronice (tuberculoz pulmonar, lupus eritematos sistemic, sarcoidoz). n mielomul multiplu (plasmocitom) se produce proliferarea canceroas a unei clone de plasmocite productoare de imunoglobuline al cror nivel crete n snge. Macroglobulinemia Waldenstrm este un limfom malign cu hipergamaglobulinemie. Apare hiperproteinemie i n unele forme de leucemie. Hipoproteinemie relativ apare n cadrul dilurii sngelui circulant prin administrare de perfuzii sau prin ingerare excesiv de lichide. Hipoproteinemie absolut apare n deficitul genetic de anticorpi sau albumin, afeciuni hepatice grave (ciroz cu evoluie spre insuficien hepatic, intoxicaii cu benzen, CCl4) n care este compromis funcia hepatic de sintez a proteinelor.

108

Pacienii cu tumori maligne prezint hipoproteinemie datorit catabolismului proteic accentuat. n inaniie i sindrom de malabsorbie apare caren de proteine datorit aportului insuficient, sau datorit tulburrii de absorbiei intestinal. Se pot pierde cantiti nsemnate de proteine n sindromul nefrotic (prin filtrul renal lezat trec numeroase molecule de protein i se elimin prin urin), sau poate avea loc pierdere de proteine pe cale intestinal (enterocolit). Hipoproteinemie mai apare n arsuri extinse, hemoragii, ascit (lichid bogat n proteine aprut n cavitatea abdominal n cadrul insuficienei hepatice).

Electroforeza proteinelor serice

Principiu: Electroforeza se bazeaz pe proprietatea particulelor ncrcate electric de a migra spre polul pozitiv sau negativ sub aciunea tensiunii electrice. n funcie de pH proteinele se comport ca anioni i vor migra spre anod (+), sau ca i cationi i vor migra spre catod (-). n cursul electroforezei componenii amestecului de analizat se vor separa datorit vitezelor de deplasare diferite. n funcie de mediul n care are loc migrarea exist dou tipuri de electroforez: electroforeza n faz liber i electroforeza zonal. n cazul electroforezei n faz liber migrarea are loc n faz lichid. Electroforeza zonal folosete o faz solid sau un gel de amidon, agar, agaroz etc. pentru migrare. Electroforeza zonal este tipul cel mai folosit n laborator.

109

Aparate i materiale: - Surs de curent continuu: redresor (0-500 V, 0-50 mA) - Camer de electroforez confecionat din material plastic care conine dou cuve prevzute cu electrozi de platin, i o punte mobil pe care se vor pune lamele cu probele de analizat. n camera de electroforez nchis cu un capac se realizeaz echilibrul lichid (tampon)-vapori de ap.

Schema aparatului de elecroforez. a) plcu de sticl acoperit cu gel de agaroz; b) suport; c) benzi de hrtie de filtru; d) soluie tampon; e) electrozi. Reactivi: Soluie tampon: tampon Tris-barbital [tris-hidroximetilaminometan 7,2 g/l; acid dietilbarbituric (veronal) 1,82 g/l; dietilbarbiturat de sodiu (medinal) 10,2 g/l; etiltiosalicilat de mercur (conservant) 0,02 g/l], pH = 8,6 Gel de agaroz: se prepar o soluie de agaroz 1% n soluia tampon, prin nclzire la fierbere, care se toarn pe plcue de sticl degresate anterior cu alcool. Gelurile se pot pstra n frigider 2-3 zile n cutii umede de plastic. Soluie de fixare: se amestec 90 ml metanol cu 20 ml acid i cu 90 ml ap bidistilat. Compoziia ei este acetic glacial -

metanol 45% i acid acetic 10%. Colorant: rou de Ponceau 0,1% n soluie de acid tricloracetic 10%. Modul de lucru:

110

a.) n camera umed se introduc n cele dou cuve laterale volume egale de soluie tampon, msurate cu cilindrul gradat. Aceste dou compartimente nu comunic ntre ele, deoarece numai n felul acesta curentul electric trece numai prin gel. b.) Se scoate lama de sticl cu gel din cutia de plastic. Se aeaz o band de hrtie de filtru pe o zon a gelului unde urmeaz s fie depus proba. Dup umectare se ndeprteaz imediat hrtia de filtru i se pune n locul ei o matri pentru probe. Matria trebuie s adere la gel. Cu o sering cu Hamilton se introduce 1 l de ser n anul creat de matri i se ateapt 5 minute pentru absorbia serului n gel. Dup 5 minute se ndeprteaz excesul de ser cu o band de hrtie de filtru. Se scoate matria i se pune lama pe puntea care se afl n mijlocul camerei de electroforez. La extremitile lamelor se aplic dou hrtii de filtru Whatman mbibate cu soluie tampon. Aceste hrtii de filtru sunt ndoite la capete astfel nct cu un capt s acopere aproximativ 1/2 cm din lungimea lamei (gelului), iar cellalt capt s fac legtura cu soluia tampon din cuvele cu electrozi. c.) Se nchide etan aparatul, se conecteaz cuvele la redresor i se las probele la migrat 1 h la 170 V. d.) Dup migrare se scot lamele din camera de electroforez i se introduc 10 minute n soluia de fixare, aflat ntr-o cutie Petri. e.) Colorarea se face prin mbibare timp de 5 minute ntr-o soluie de colorant aflat ntr-o cutie Petri. Excesul de colorant de pe plcue se ndeprteaz prin splare cu ap distilat. f.) Uscarea se poate face la termostat sau la temperatura camerei. Gelul uscat va avea consistena unui film. g.) Determinarea cantitativ a fraciunilor proteice se face cu ajutorul unui densitometru optic. Acesta traseaz automat curba de extincie (reflexie optic), care prezint attea maxime cte fraciuni sunt. Aparatul calculeaz valorile procentuale ale fraciunilor proteice. n cazul serului normal, prin electroforeza n gel de agaroz, rezult urmtoarele 6 fraciuni:

Fraciunea Albumine 1 - Globuline 2 - Globuline

Valoarea procentual 50-59 3-5 7-9

g/100ml 3,50-4,20 0,25-0,40 0,50-0,65

111

 1 + 2Globuline - Globuline

11-14 16-20

0,80-1,02 1,10-1,40

Interpretarea valorilor fraciunilor proteice. 1. Hiperalbuminemiile apar n puine stri patologice, mai importante fiind leucozele limfatice cronice. 2. Hiperglobulinemie global (, , ) se ntlnete n cazul tumorilor maligne, bolilor infecioase acute sau cronice, afeciunilor hepatice cronice, nefropatiilor cronice. 3. Hiperalfaglobulinemia asociat sau nu cu hiperbetaglobulinemia se ntlnete n inflamaii acute (reumatism poliarticular acut, boli infecioase acute, infarct miocardic), sindrom nefrotic (cresc ndeosebi 2 globulinele), tumorile maligne, poliartrita reumatoid. 4. Hiperbetaglobulinemia izolat se ntlnete n plasmocitom, hepatite acute virotice sau toxice, diabet zaharat, sindrom nefrotic, icter obstructiv prelungit. 5. Hiperalfa i hipergamaglobulinemia sunt ntlnite n inflamaiile acute i cronice, n tumori maligne. 6. Hipergamaglobulinemie izolat se ntlnete imunologic cum sunt: boli infecioase acute sau cronice: hepatit virotic, mononucleoz infecioas; limfogranulomatoz benign, tuberculoz, sifilis, stafilococi, streptococi endocardit bacterian subacut; colagenaze: poliartrit reumatoid, lupusul eritematos diseminat, sclerodermie; afeciuni hepatice: hepatite cronice, ciroze; afeciuni neoplazice de sistem: boala Hodkin, leucemii. 7. Hipogamaglobulinemia se ntlnete n : agamaglobulinemie i hipogamaglobulinemie congenital; afeciuni digestive: inflamaia mucoasei digestive, neoplasm digestiv; sindrom nefrotic; insuficien cardiac; arsuri ntinse; eczeme generalizate. 112 n afeciunile cu implicaie

figur

sunt

prezentate

proteinogramele

obinute

prin

citirea

electroforegramelor la densitometru optic, n cteva cazuri patologice precum i n cazul normal. a) Normal (vezi tabelul de mai sus), b) Inflamaie acut, c) Inflamaie cronic, d) Sindrom nefrotic, e) Enteropatie exudativ, f) Ciroz hepatic, g) Mielom multiplu, h) Hipogamaglobulinemie.

Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl

Principiu: Azotul neproteic reprezint azotul din substanele ce rmn n soluie dup deproteinizarea serului (uree, acid uric, creatin, creatinin, aminoacizi, amoniac, etc.). Dintre acestea azotul ureic reprezint mai mult de 50 %. Diferena dintre azotul total neproteic i azotul ureic se numete azot rezidual. Dup precipitarea i ndeprtarea proteinelor coninutul de azot neproteic se determin dup acelai principiu ca i n cazul dozrii azotului total din ser prin metoda Kjeldahl. Aparatur: Reactivi: Aparatul Wagner-Parnas. - Fosfowolframat de sodiu 10 % - H2SO4 0,58 N - H2SO4 conc.

113

- Amestec catalizator CuSO4.5H2O i K2SO4 (1:3) - H2O2 3 % - NaOH 30 % - H2SO4 N/100 cu factorul FH2SO4 - NaOH N/100 cu factorul FNaOH - Indicator Groak Modul de lucru: 1) Deproteinizarea serului: ntr-un flacon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml H2O bidistilat, 2 ml soluie de fosfowolframat de sodiu i 2 ml H2SO4 0,58 N. Se agit energic i dup 10 minute proba se filtreaz. 2) Mineralizarea : ntr-un balon Kjeldahl se introduc 2 ml filtrat, 2 ml H2SO4 conc., 2-3 picturi soluie de H2O2 i un vrf de spatul de amestec catalizator. Mineralizarea are loc pe flacr mic sub ni. Dup 10 minute balonul Kjeldahl se rcete la temperatura camerei. 3) Splarea aparatului Wagner-Parnas: se face ca mai sus. 4) Antrenarea NH3 cu vapori de ap : Se efectueaz dup modul descris la dozarea azotului total, cu excepia faptului c amoniacul pus n libertate se va capta n 10 ml H2SO4 N/100. 5) Titrarea: Excesul de H2SO4 se titreaz cu o soluie de NaOH N/100 n prezena indicatorului Groak. Calcul : 1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N

a FH2 SO4 b FNaOH ..................

x = ( a FH2 SO4 b FNaOH ) a = 10 ml H2SO4 N/100

0,14 mg N/0,4 ml ser

b = volumul NaOH N/100 consumat la titrare Rezultatul se exprim n mg N neprot./100 ml ser. Avnd n vedere c 50% din azotul neproteic este reprezentat de azotul ureic, interpretarea ese aceeai cu cea de la uree. Valori normale : 20 - 40 mg N neprot./ 100 ml ser Valori crescute: se ntlnesc n afeciuni renale ca insuficiena renal cronic sau n obstrucii ale cilor urinare. Aceste valori se mai ntlnesc n arsuri, hemoragii digestive, boala Addison.

114

Dozarea ureei din ser prin metoda cu ureaz

Principiu: Ureea din ser este hidrolizat sub aciunea unei enzime specifice, ureaza, i se descompune n amoniac i dioxid de carbon. Amoniacul eliberat este determinat apoi pe baza reaciei pe care o d cu fenolul i hipocloritul de sodiu n mediu alcalin. (Reacia Berthelot).
-

ClO +

OH + NH 3

Cl

parachinoncloroimina format astfel, reacioneaz cu o alt molecul de fenol pentru a forma indofenol care dezvolt n mediu alcalin o intens culoare albastr. Reacia este catalizat de nitroprusiatul de sodiu. O Reactivi: - ureaz tamponat: se dizolv 1 g EDTA n 80 ml ap bidistilat i se ajusteaz, pH-ul la 6,5 cu NaOH diluat. Se adaug apoi 150 mg ureaz i se completeaz volumul la 100 ml cu ap bidistilat. Se agit bine i se psreaz ntr-un vas de plastic. - soluie etalon de uree: 40 mg uree pur, uscat n prealabil n exicator, se dizolv n ap bidistilat aducndu-se la 100 ml. - reactiv fenolic. Se dizolv 25 g fenol chimic pur n 400 ml ap bidistilat. Separat se dizolv 125 mg nitroprusiat de sodiu n 50 ml ap distilat. Se amestec cele dou soluii i se aduce volumul la 500 m1. - reactiv hipoclorit. ntr-un balon de 500 ml se dizolv 12,5 g NaOH n 400 ml apa bidistilat. Se adaug apoi un volum de hipoclorit comercial coninnd 1,10 g hipoclorit de sodiu (de regul 20 ml soluie). Se aduce volumul la 500 ml. Modul de lucru: Se pipeteaz 0,2 ml suspensie ureaz ntr-o serie de eprubete. Se adaug apoi cu o pipet cte 0,02 ml ser n probele de analizat, 0,02 ml ap distilat pentru proba oarb i 0,02 ml soluie de uree 40 mg% pentru proba standard. Se incubeaz eprubetele la 37C pe baia de apa timp de 15 minute. Se scot eprubetele de la incubat i se adaug 1 115 N O
-

ml reactiv fenolic, se agit uor i se adaug 1 ml reactiv hipoclorit alcalin. Se incubeaz din nou la 37C timp de 15 minute pentru dezvoltarea culorii. Se scot din baie eprubetele i se dilueaz prin adugarea a 10 ml ap distilat. Se amestec continuu eprubetele i se citete extincia la 630 nm fat de proba oarb. Calcul: uree mg% = (E probei / E standardului ) 40

Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski

Principiu:

Ureea este descompus n mediu alcalin cu ajutorul soluiei de

hipobromit de sodiu rezultnd azot molecular, dioxid de carbon i ap. Soluia de hipobromit de sodiu se prepar din Br2 i NaOH . Br2 + 2NaOH NaOBr + H2O O C NH2 + 3NaOBr NH2 N2 + CO2 + 3 NaBr + 2 H2O

Dioxidul de carbon este fixat de ctre NaOH, aflat n exces n soluia de hipobromit de sodiu, sub form de Na2CO3 conform reaciei: CO2 + 2NaOH Na2CO3 + H2O Azotul molecular degajat este msurat volumetric n aparatul Kowarski.

116

Aparatur : Aparatul Kowarski are forma unui tub n form de "U". Ramura stng (A) este prevzut n partea superioar cu un robinet (a) i este gradat att deasupra ct i dedesubtul robinetului. Ramura dreapt (B) nu este gradat i are n partea inferioar un robinet (b) cu trei ci n form de T. De aici se ramific i tubul de scurgere (C). Pe robinetul cu trei ci (b) direcia cii verticale a T-ului este evideniat de obicei ca o umfltur sau adncitur (semn). Prin rsucirea acestui robinet se obin trei poziii n funcie de poziia umflturii robinetului: 1) semnul n spate : comunic A cu B. 2) semnul n jos : comunic A cu C. 3) semnul n sus : comunic B cu C. 4) semnul n fa : comunic A i B cu C 117

Reactivi:

- Acid tricloracetic 10 %. - Soluie Kowarski : 350 g NaCl i 150 g K 2SO4 se dizolv la fierbere n 1000 ml H2O, se rcete i se filtreaz. - Soluie NaOBr : se prepar proaspt, adugnd sub ni, sub agitare, 12 picturi de brom la 6 ml NaOH 33 %. Se pstreaz la ghea cel mult o sptmn.

Modul de lucru: Deproteinizarea serului: ntr-un flacon Erlenmayer se pipeteaz 2,5 ml ser i 2,5 ml acid tricloracetic 10 %. Se agit i dup 10 minute se filtreaz. Manipularea aparatului : Se umple aparatul cu soluie Kowarski. Pentru aceasta se stabilete legtura ntre ramurile A i B, se deschide robinetul "a" i se toarn soluia Kowarski n aparat prin ramura B pn cnd lichidul depete nivelul robinetului "a" cu 1-2 ml. Dac rmne aer n aparat, el se ndeprteaz prin tubul de scurgere C (semnul n jos), apoi se completeaz lichidul pn la nivel. Se nchide robinetul "a", se ndeprteaz cu o pipet lichidul de deasupra i se usuc cu o fie de hrtie de filtru. Robinetul "b" se aeaz cu semnul n jos. n ramura A se toarn aproximativ 3,5 ml filtrat. Se las s ptrund n aparat, prin deschiderea robinetului "a", exact 2,5 ml filtrat. Excesul de soluie Kowarski se va scurge prin tubul C. Se ndeprteaz cu o pipet restul filtratului, se spal cu H2O distilat i se usuc din nou cu hrtie de filtru. Se introduc apoi, prin ramura A, 6 ml soluie de NaOBr. Se las s intre n aparat cca. 5 ml. Degajarea azotului ncepe imediat mpingnd n jos soluia Kowarski care se scurge prin tubul C. Dup 10 minute se aduce la nivelul ramurei A soluia din ramura B, lsnd s curg din ramura B lichidul n exces (semnul n sus). Apoi se stabilete comunicarea ntre ramurile A i B (semnul n spate). n acest fel azotul din aparat va avea aceiai presiune cu cea a mediului nconjurtor. Se citete volumul azotului degajat (vN2) precum i temperatura i presiunea atmosferic. Dup dozare aparatul Kowarski se golete i se spal cu ap distilat pentru a evita blocarea robinetelor. Calcul:

v N 2 F 100 = mg uree/100 ml ser v N 2 - volumul de azot degajat

F - factor de conversie din ml N2 n mg uree

118

Se de mai sus. Barometru 710 720 725 730 735 740 745 750 755 760 765 770 10 C 1,91 1,94 1,95 1,97 1,98 1,99 2,01 2,02 2,04 2,05 2,06 2,08

caut n tabelul Kowarski factorul F care corespunde temperaturii i

presiunii barometrice din timpul determinrii. Aceast valoare se introduce n formula

12 C 1,90 1,92 1,93 1,94 1,96 1,97 1,99 2,00 2,02 2,03 2,05 2,06

14 C 1,88 1,91 1,92 1,93 1,94 1,96 1,98 1,99 2,00 2,01 2,03 2,04

16 C 1,86 1,89 1,90 1,91 1,93 1,94 1,96 1,97 1,98 2,00 2,01 2,02

18 C 1,84 1,87 1,89 1,90 1,91 1,92 1,94 1,95 1,96 1,98 1,99 2,00

20 C 1,83 1,85 1,87 1,88 1,89 1,90 1,92 1,93 1,95 1,96 1,97 1,98

22 C 1,81 1,84 1,85 1,87 1,88 1,89 1,91 1,92 1,93 1,95 1,96 1,97

24 C 1,80 1,82 1,83 1,85 1,86 1,87 1,89 1,90 1,92 1,93 1,94 1,95

25 C 1,79 1,80 1,82 1,83 1,84 1,86 1,87 1,88 1,90 1,91 1,92 1,93

Valori normale : 21 - 54 mg uree/100 ml ser sau 3,5 9,0 mmoli/l Valori crescute : Patologic creterea ureei poate fi de origine renal sau extrarenal. Cauze de origine renal: insuficien renal acut sau cronic; (eliminare sczut), glomerulonefrit acut sau cronic, nefroangioscleroz benign sau malign, tuberculoz renal, tumori renale, rinichi polichistic, calculoz. Cauze de origine extrarenl: stri de exsicoz i oc provocate de hemoragii, arsuri, traumatisme; Valori sczute : - insuficien hepatic grav (ciroz)(sintez sczut)

Dozarea acidului uric din ser

Principiu: Acidul uric (catabolitul final al nucleotidelor purinice) reduce n mediu alcalin reactivul fosfowolframic pn la un produs de culoare albastr. Intensitatea culorii este proporional cu concentraia acidului uric n proba de analizat. Reactivi: - Acid tricloracetic 20% - Reactiv fosfowolframic: ntr-un balon de 1000 ml prevzut cu refrigerent cu reflux, se introduc 50 g wolframat de sodiu, 40

119

ml H3PO4 85% (d = 1,71 g/cm3) i 350 ml ap bidistilat. Se fierbe lent aproximativ 6 ore. Se rcete balonul i coninutul su se trece cantitativ ntr-un balon cotat de 500 ml. Se aduce la semn cu ap bidistilat. Dac reactivul este verde se adaug 1-2 picturi de brom i se fierbe cteva minute fr refrigerent pentru ndeprtarea excesului de brom. Reactivul are culoarea galben-verde deschis, pstrat n sticl brun, el nu se altereaz. Reacia este urmtoarea: 12 Na2WO4 + 9 H3PO4 = P(W2O7)6H7 + 8 Na3PO4 + 10 H2O - Na2CO3 crist 22% - Soluie stoc de acid uric: se introduc n aproximativ 60 ml ap bidistilat cald (60C) 100 mg acid uric, 200 mg fosfat disodic, 100 mg fosfat monosodic i se agit pn la dizolvare complet. Dup rcire se completeaz la 100 ml cu ap bidistilat ntr-un balon cotat. Soluia stoc, nchis ermetic prin parafinare (dup adugare de 3-4 picturi de cloroform) se poate pstra 4-5 luni la temperatura de +4C. - Soluia standard de acid uric se prepar prin diluarea soluiei stoc: 1 ml se aduce la 100 cu ap bidistilat. Modul de lucru: a) Deproteinizarea serului: ntr-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml ap bidistilat si 2 ml acid tricloracetic 20%. Se agit puternic i dup 10 minute se filtreaz. b) Reducerea reactivului fosfowolframic se realizeaz efectund urmtoarele amestecuri n eprubete care apoi se agit energic:

Filtrat, ml Sol. standard, ml Ap distilat, ml Na2CO3 22%, ml Reactiv fosfowolframic, ml

Prob 2,0 0,9 0,1

Standard 2,0 0,9 0,1

Blanc 2,0 0,9 0,1

Se las eprubetele n repaus 10 minute la temperatura camerei, apoi se msoar extincia probei i a standardului fa de blanc la =610 nm n cuva de 1 cm.

120

Observaie: n cazul c proba prezint opalescen, ea se centrifugheaz nainte de msurarea estinciei. Calcul: concentraia standardului = 1 mg% 2 ml filtrat corespunde la 0,5 ml ser ( diluia serului= 2/0,5 = 4) Ep/Es x 1 x 4 = mg acid uric/100 ml ser iar Valori normale: Valori crescute: mg % x 60 = moli/l 2-8 mg acid uric/100 ml ser ( 119 - 476 moli/l ) fiziologic: dup efort fizic accentuat sau dup ingestia unor cantiti crescute de alimente bogate n acizi nucleici (ficat, testicule). patologic: a) hiperuricemie primar (biosintez crescut sau eliminare renal sczut) b) hiperuricemie secundar, destrucie celular accentuat n tumori maligne, anemie hemolitic, pneumonie sever etc.; eliminare renal sczut (insuficien respiratorie) Hiperuricemia de durat determin acumularea acidului uric n organism i apariia gutei. Valori sczute: mai rar ntlnite, apar n urma administrrii unor medicamente, defecte enzimatice (xantinurie ereditar), afeciuni hepatice grave. renal, acidoz metabolic si

Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin

Principiu: Creatinina reacioneaz cu acidul picric (galben) n mediu alcalin dnd natere unui produs a crui coloraie poate fi de la orange la rou aprins. Intensitatea coloraiei roii este proporional cu concentraia creatininei din prob. Coloraia se datoreaz formrii unor tautomeri colorai ai creatininei, unul din ei fiind stabilizat prin complexare de un mezomer al acidului picric (reacia Jaff).

121

Complex rou portocaliu de titrat de creatinin Reactivi: - Wolframat de sodiu 10%. - H2SO4 2/3N. - Soluie saturat de acid picric. - NaOH 10%. - Soluie picrat alcalin; se prepar nainte de utilizare prin amestecarea unui volum de soluie de acid picric cu 2 volume NaOH 10% - Soluie stoc de creatinin: se dizolv n HCl 0,1N 100 mg creatinin pur sau 160,2 mg clorur de zinc creatinin i se aduce volumul la 100 ml cu HCl 0,1N - Soluia standard de creatinin se obine dilundu-se 1 ml din soluia standard stoc la 100 ml cu ap bidistilat. Aceast soluie coninnd 0,01 mg creatinin/ml trebuie rennoit sptmnal. Modul de lucru: ntr-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml de ser i 6 ml acid picric saturat i se agit energic. Se introduce balonul pentru 15-20 secunde ntr-o baie de ap fierbinte. Dup rcire se filtreaz ntr-o eprubet iar din filtrat se msoar 5 ml. Se adaug 0,25 ml soluie de NaOH 10% se agit i peste 15 minute se citete extincia probei (Ep) fa de martor la = 530 nm. Martorul este soluia de picrat alcalin, creia n loc de ser i s-au adugat 2 ml ap bidistilat. n paralel se efectueaz aceleai operaii, n locul serului folosindu-se soluie standard de creatinin. Extincia obinut este Es. Calcul: Ep/Es = mg creatinin/100ml ser. Valori normale: 0,6-1,8 mg/100ml ser sau 53-159 moli/l. Variaii fiziologice: nivelul seric al creatininei sufer doar foarte mici variaii n condiii fiziologice. El poate crete n condiiile unei diete foarte bogate n proteine. Clearance-ul endogen de creatinin (fr aport exogen de creatinin) este un indicator al filtrrii glomerulare la subiecii normali.

122

Valori patologice crescute: se ntlnesc n insuficien renal cronic (este ultima substan azotat care crete n snge n aceste condiii, ca i n condiiile fiziologice), distrofia muscular progresiv, eclampsie, acromegalie.

Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecia van den Bergh

Principiu: Bilirubina reacioneaz cu diazo-reactivul Ehrlich (acid sulfanilic diazotat) i formeaz azopigmeni, care au culoare roie n mediu slab acid sau neutru (reacia van den Bergh). Azopigmentul A este un fragment de bilirubin cuplat cu sarea de diazoniu a acidului sulfanilic iar azopigmentul B este un fragment de bilirubin conjugat cuplat cu aceiai sare de diazoniu. Intensitatea coloraiei este proporional cu concentraia bilirubinei din ser.

R: radical de acid glutaric + Bilirubina + 2N N CH3 CH=CH2 CH3 CH2 CH2 COOH(R) SO3 O 2 N H CH N H N=N SO3H

Ionul de diazoniu

Azopigmnet A (B)

Reactivi: - Soluie HCl 1N; - Soluie de cofein-benzoat-acetat: se cntresc i se amestec 20 g cofein pur, 30 g benzoat de sodiu, 50 g acetat de sodiu. Se adaug 400 ml ap bidistilat i se dizolv nclzind uor. Dup rcire se filtreaz. - Reactiv diazo: Sol.A: se msoar 0,5 g acid sulfanilic ntr-un balon cotat de 500 ml, se adaug 125 ml HCl 1N i se completeaz pn la semn cu ap bidistilat Sol.B: NaNO2 0,5% nainte de ntrebuinare se amestec 10 ml soluie A cu 0,3 ml soluie B. - NaCl 0,9% Bilirubina neconjugat (bilirubina indirect) n stare liber nu este hidrosolubil, este meninut n soluie apoas prin legarea sa strns pe albumin. Aceast bilirubin nu reacioneaz direct cu reactivul diazo ci doar n prezen de acceleratori (alcooli

123

inferiori, cofein, etc.), care o elibereaz din legtura cu albumina i o menin n soluie. Nu se filtreaz la nivel glomerular, deci n mod normal nu apare n urin. Bilirubina conjugat (bilirubina direct) hidrosolubil reacioneaz direct cu reactivul diazo. Se filtreaz la nivel glomerular i apare n urin. Se dozeaz paralel bilirubina total (direct + indirect) si bilirubina direct. Modul de lucru: Se lucreaz n trei eprubete dup tabelul de mai jos: reactiv Ehrlich sol. de cofein NaCl 0,9% ser ml ml ml ml Bilirubina total 0,5 3,5 1,0 Bilirubina direct 0,5 3,5 1,0 Blanc 4,0 1,0

Dup amestecarea reactivilor se agit energic eprubetele iar dup 5 minute se citesc extinciile la = 530 nm, n cuva de 1 cm fa de blanc. Calcul: Rezultatul se calculeaz cu ajutorul coeficientului de extincie specific procentual (a) al azopigmentului la = 530 nm:
1g% 1mg%

a = E1cm = 943, de unde

E1cm = 0,943

Volumul final (Vf ) = 5,0 ml; volumul probei (Vp) = 1,0 ml; diluia probei = Vf/Vp = 5 Ep = extincia citit Concentraia bilirubinei (bilirubinemia) se calculeaz cu formulele:
1m g% mg bilirubin/100 ml ser = E p/E 1cm 5sauE p 5,3

moli bilirubin/l ser = Ep x 91 tiind c Mbilirubin = 584 Se calculeaz separat valoarea bilirubinemiei totale i a celei directe iar diferena ntre aceste dou valori reprezint bilirubinemia indirect.

124

Valori normale: Circa 1 mg% (cca.17 moli/l) bilirubin total, din care bilirubina direct cca. 0,25 mg% (4,3 moli/l). Valori crescute: Bilirubina se va infiltra determinnd apariia unei coloraii glbui a scleroticelor i a tegumentelor (icter) la valori de peste 3 mg% (51 moli/l). Hiperbilirubinemiile pot fi cauzate de:

- creterea vitezei de formare a bilirubinei n urma degradrii excesive

a hemoglobinei (hemoliz) n icterul hemolitic;

- scderea

capacitii

de

conjugare

ficatului

cauzeaz

hiperbilirubinemia indirect (10-40mg%) la homozigoi (sindromul Crigler-Najjar de tip I);

- scderea capacitii de eliminare a bilirubinei de ctre ficat (boala

Gilbert);

- perturbarea eliminrii prin bil a bilirubinei n urma blocrii cilor

biliare (calculi, tumori cum ar fi neoplasmul de cap de pancreas) n icterul mecanic;

- deficitul intrahepatic de eliminare activ a bilirubinei conjugate de la

nivelul microsomilor hepatici n canaliculele biliare (sindrom DubinJohnson) determin hiperbilirubinemie direct (2-10 mg%);

- icterul neonatal, datorat imaturitii sistemelor de epurare a

bilirubinei la nou nscut cnd bilirubinemia este crescut (4-5 mg%) temporar (1-2 zile) dup care revine la normal.

Glucoza
Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetric) Glucoza este repartizat n mod inegal i variabil ntre plasm i eritrocite, de aceea dozarea ei se face din sngele total, recoltat pe florur de sodiu. Aceasta previne coagularea sngelui i inhib glicoliza. Principiu: Glucoza prezent n filtratul de snge (deproteinizat), reduce cantitativ fericianura de potasiu n ferocianur de potasiu.

125

K3[Fe(CN)6] + glucoz

K4[Fe(CN)6] + acid gluconic

Excesul de fericianur elibereaz iodul din iodura de potasiu n mediu acid.

2 K3[Fe(CN)6] + 2 KI

CH COOH 3

2 K4[Fe(CN)6] + I2

Aceast reacie fiind reversibil, deplasarea ei spre dreapta se realizeaz prin precipitarea ferocianurii sub form de sare dubl de zinc i de potasiu. Acelai rol are i asigurarea mediului acid (CH3COOH).

2 K4[Fe(CN)6] + 3 ZnSO4

K2Zn3[Fe(CN)6] + 3 K2SO4

Iodul pus n libertate se titreaz cu tiosulfat de sodiu, n prezena amidonului ca indicator.

126

127

2 Na2S2O3 + I2 Reactivi: - NaOH N/10

Na2S4O6 + 2 NaI

- ZnSO4 0,45 % (se pstreaz aproximativ trei sptmni) - K3[Fe(CN)6] N/200 (ntr-un balon cotat de 1000 ml se msoar 1,65 g fericianur de potasiu pur, 10,6 g carbonat de sodiu pur anhidru i ap distilat pn la semn) - ZnSO4 - NaCl (se msoar 100 g sulfat de zinc, 500 g clorur de sodiu i ap distilat pn la 1600 ml) - KI 2,5 % - CH3COOH 3 % (3 ml acid acetic glacial, H2O distilat pn la 100 ml) - Reactivul KI ZnSO4 NaCl: 5 ml KI 2,5% + 20 ml sol. ZnSO4 NaCl - Amidon 1% - KIO3 N/200 F KIO3= 1,000 - Na2S2O3 N/200 (factorul soluiei se verific prin titrare cu soluia de KIO3 N/200) Modul de lucru: Se lucreaz cu 4 eprubete, din care primele dou vor fi pentru probe, celelalte dou pentru blancul reactivilor.

128

Deproteinizarea: n fiecare eprubet se msoar1 ml NaOH N/10 + 5 ml ZnSO 4 0,45 %. Se formeaz un precipitat gelatinos de hidroxid de zinc care servete la deproteinizarea prin adsorbie a proteinelor coagulate ale sngelui. Se adaug apoi numai n primele dou eprubete, pentru probe cte 0,1 ml snge. n continuare nu exist nici o deosebire ntre prelucrarea probelor i a blancului. Dup agitare se pun toate eprubetele pe un stativ, se introduc ntr-o baie de ap clocotind i se fierb 5 minute. Dup fierbere se filtreaz coninutul eprubetelor prin filtrele pregtite n prealabil, n tuburi Hagedorn (sau baloane Erlenmeyer de 50 ml). Pentru a evita pierderi de glucoz se spal eprubetele, de 2 ori cu cte 3 ml ap distilat fiart trecnd i aceast ap distilat prin filtru. Reducerea fericianurii: Se adaug la filtratul din fiecare balon cte 2 ml fericianur de potasiu N/200 (msurai foarte exact). Se agit uor i se introduc baloanele pentru 15 minute ntr-o baie de ap n fierbere. Dup rcirea baloanelor ntrun curent de ap, se introduc cte: - 2 ml din reactivul KI - ZnSO4 - NaCl. - 2 ml acid acetic 3 % - 2 picturi amidon 1 %. Se titreaz soluiile din tuburile Hagedorn (baloane Erlenmeyer) cu tiosulfat de sodiu N/200 pn la dispariia culorii albastre. Calcul: Calculul se face cu ajutorul unui tabel care d echivalena dintre numrul de ml de tiosulfat folosit la titrare i concentraia glucozei n mg/100 ml. Se ia media probelor paralele i cifra obinut se nmulete cu factorul tiosulfatului. Se procedeaz la fel i n cazul blancurilor, care ne ofer o msur a impuritilor reductoare din reactivi. Se caut n tabelul dat concentraiile de glucoz corespunztoare. Din "glicemia" probei se scade "glicemia" blancului. Diferena obinut exprim concentraia de glucoz n mg/100 ml de snge analizat.

TABEL Relaia dintre ml de Na2S2O3 N/200 consumat la titrare i glicemia n mg % Na2S2O3 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09

129

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9

385 355 331 310 290 270 251 232 213 195 177 159 141 124 106 88 70 52 34 17

382 352 329 308 288 268 249 230 211 193 175 157 139 122 105 86 68 50 32 15

379 350 327 306 286 266 247 228 209 191 173 155 138 120 102 84 66 48 31 14

376 348 325 304 284 264 245 226 208 190 172 154 136 119 101 83 65 47 29 12

373 345 323 302 282 262 243 224 206 188 170 152 134 117 99 81 63 45 27 10

370 343 321 300 280 260 241 222 204 186 168 150 132 115 97 79 61 43 25 8

367 341 318 298 278 259 240 221 202 184 166 148 131 113 95 77 59 41 24 7

364 338 316 296 276 257 239 219 200 182 164 146 129 111 93 75 57 39 22 5

361 336 314 294 274 255 236 217 199 181 163 145 127 110 92 74 56 38 20 3

358 333 312 292 272 253 234 215 197 179 161 143 125 108 90 72 54 36 19 2

Exemplu: media volumelor soluiei de tiosulfat ntrebuinat pentru titrare celor 2 probe s o presupunem 1,53. Aceasta se nmulete cu factorul pe care l presupunem 0,9660. 1,53 0,9660 = 1,47798 1,48 ml tiosulfat N/200 Media probelor n alb (blancuri) s fie 1,85 care se nmulete cu factorul, adic, 1,85 0,9660 = 1,7871 1,79 ml tiosulfat N/200. La 1,48 ml tiosulfat corespund n tabel 92 mg glucoz/100 ml, iar la 1,79 ml, 36 mg %. Rezultatul este dat de diferena: 92 - 36 = 56 mg/100 ml. Mmoli/l = (mg/100 ml) 10/180 = (mg/100 ml) 0,055; (M glucoz = 180) n condiiile de mai sus, mmoli/l = 56 x 0,055 = 3,08. Valoarea obinut indic hipoglicemie. Valori normale: 4,4 - 6,6 mmoli/l (80 - 120 mg %) Dozarea glucozei prin metoda enzimatic (glucozoxidaz) Principiu: Glucoza, sub aciunea glucozoxidazei, se transform n acid gluconic. H2O2 rezultat va fi descompus de peroxidaz, n urma reaciei la care particip i indicatorul Trinder (fenol i 4-aminoantipirin), rezultnd un produs de condensare colorat n rou 130

cu absorbie maxim la = 505 nm. Extincia este direct proporional cu concentraia glucozei. Reaciile care stau la baza metodei sunt urmtoarele:

glucozoxidaz Glucoz + O2 + H2O acid gluconic + H2O2 peroxidaz 2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Chinonimin + 4 H2O (rou)

Reactivi: 1). Reactiv 1 conine: tampon TRIS-Cl sau Srensen 90 mmoli/l i fenol 0,3 mmoli/l (pH = 7,5 ). 2). Reactiv 2 conine: glucozoxidaz 10000 U/l, peroxidaz 1000 U/l i 4-aminoantipirin 2,6 mmoli/l 3). Reactiv 3 conine: standard de glucoz 5,56 mmoli/l (1g/l sau 100 mg %) Probe: ser nehemolizat, plasm heparinat, snge deproteinizat, LCR (lichid cefalorahidian). Modul de lucru: Se amestec coninutul unei sticlue de reactiv 2 cu coninutul unei sticlue de reactiv 1, obinnd astfel reactivul de lucru. Stabilitatea soluiei la 20 - 25 oC este 2 sptmni, iar la 2 - 8oC este de o lun. Se prepar urmtoarele soluii: Blanc 10 l 1 ml Standard 10 l 1 ml Prob 10 l 1 ml

H2O distilat Standard Prob Reactiv de lucru

Se agit coninutul eprubetelor i se incubeaz timp de 10 minute la 37 oC sau 30 minute la temperatura camerei (20 - 25 oC). Se msoar extincia probei fa de blanc la 505 nm (490 - 550 nm). Culoarea format este stabil 30 minute. Calcul: E prob

131

Cprob = E standard

Cstandard

Cstandard este 5,56 mmoli/l, sau 100 mg %, n funcie de unitile de msur folosite la exprimarea concentraiei glucozei din soluia standard. Linearitate: Extincia este direct proporional cu concentraia glucozei pn la 22,22 mmoli/l (sau 400 mg %). Dac concentraia glucozei depete aceast valoare, se dilueaz proba cu ser fiziologic i se repet determinarea. La calcularea rezultatului se ia n considerare diluia. Valori normale: ser, plasm: 3,9 - 5,8 mmoli/l (70,2 104,45 mg %) LCR: 2,8 - 3,9 mmoli/l (50,4 70,2 mg %)

Teste rapide pentru determinarea glicemiei n practica medical curent se folosesc tot mai des glucometrele (aparate mici, asemntoare cu un calculator de buzunar), care determin glicemia prin metod enzimatic specific pentru glucoz. Determinarea se face cu ajutorul unor stripsuri (kituri, benzi de hrtie impregnate cu reactivi). Mod de utilizare: Efectum pregtirile pentru prelevarea sngelui din pulpa degetului, apoi pornim aparatul, care ncepe numrtoarea invers. nepm un deget i punem o pictur de snge pe strips. Peste un minut, la semnalul sonor al aparatului, nlturm prin tamponare cu hrtie excesul de snge de pe banda cu reactivi. Introducem kitul n aparat i, la unele tipuri, apsm butonul de msurare. Peste cteva momente apare pe ecran valoarea glicemiei n unitatea de msur folosit de aparatul respectiv. Avantajele metodei: - Este o metod rapid, precis i specific pentru glucoz - Se poate folosi n dispensare medicale i la domiciliu, fiind foarte util n monitorizarea glicemiei la bolnavii diabetici - Unele aparate au i memorie n care sunt pstrate ultimele valori ale glicemiei - Necesit o cantitate foarte mic de snge (o pictur). Valori normale: 70 - 110 mg % (3,89 - 6,11 mmoli/l) Valorile obinute la determinarea glicemiei depind de metoda folosit.

132

n snge, alturi de glucoz, sunt i alte substane reductoare (glutation, acid ascorbic, acid uric, cistein). Din acest motiv valorile glicemiei obinute prin metode chimice, care se bazeaz pe proprietatea reductoare a glucozei (metoda HagedornJensen, colorimetrie cu reactiv arseno-molibdenic) sunt mai ridicate dect cele obinute prin metoda enzimatic specific cu glucozoxidaz. Metoda colorimetric cu o-toluidin d rezultate mai apropiate de valorile obinute prin metoda enzimatic. Interpretarea medical a valorilor glicemiei Valori crescute: Hiperglicemia trectoare poate fi de origine alimentar sau n legtur cu stri emoionale. Postprandial glicemia crete uor, n cazul consumului excesiv de glucide chiar pn la instalarea unei glicozurii. Hiperglicemia de durat este caracteristic n primul rnd pentru diabetul zaharat (diabetes mellitus). n formele de diabet asimptomatic (diabet chimic) glicemia este adesea normal i tulburrile metabolice (insuficienta de insulin) pot fi stabilite numai prin proba de ncrcare cu glucoz (proba hiperglicemiei provocate). Proba numit test oral de toleran pentru glucoz (TOTG) const din administrarea oral la pacient a unei cantiti de aproximativ 70 g glucoz (1 g/kg corp). Se urmrete din jumtate n jumtate de or variaia glicemiei fa de valoarea iniial msurat pe nemncate (vezi schema). n cazuri fiziologice, creterea maxim a glicemiei dup ncrcare nu depete valoarea de 8,8 mmoli/l (160 mg %) n prima or, iar dup 2 ore revine sub 6,6 mmoli/l (120 mg %), i atinge nivelul iniial la cca. 3 ore .

n cazurile uoare de diabet, cnd glicemia nu depete valoarea de 180 mg % (10 mmoli/l), glicozuria este absent. n cazuri de gravitate medie valoarea glicemiei este de 200-300 mg %, iar n cazuri grave poate crete pn la 39 mmoli/l (702 mg %) 133

sau mai mult, fiind nsoit de glicozurie masiv. Evidenierea accidental a glicozuriei este uneori semnul care atrage atenia asupra unui diabet asimptomatic. Sarcina este o stare care scade tolerana la glucoz i produce diabet gestaional la aproximativ 3 % din gravide, uneori cu repercusiuni grave asupra ftului. Monitorizarea glicemiei i glicozuriei este foarte important n aceste cazuri pentru stabilirea dozelor de insulin. Informaii suplimentare asupra valorilor retroactive ale glicemiei ne furnizeaz nivelul hemoglobinei glicozilate. Valorile crescute ale acesteia se coreleaz bine cu nivele mari de glicemie pe perioade lungi. Creteri ale glicemiei apar n diferite disfuncii endocrine cum ar fi hipersecreia de adrenalin, glucagon, ACTH (hormon adrenocorticotrop), STH (hormon somatotrop), cortizol - hormonii enumerai avnd aciune antagonist cu cea a insulinei. Ei stimuleaz adenilat ciclaza cu formare de AMP ciclic, care intensific glicogenoliza i gluconeogeneza. Persoanele care sunt tratate timp ndelungat cu corticosteroizi (astm bronic, poliartrit reumatoid) pot dezvolta aa numitul diabet steroid. Hormonii tiroidieni (T3, T4) au aciune hiperglicemiant prin creterea absorbiei glucidelor la nivel intestinal, stimularea gluconeogenezei i a secreiei de adrenalin. Valori sczute ale glicemiei survin n primul rnd dup administrarea de doze excesive de insulin. La valori sub 40 mg % apar simptome hipoglicemice manifestate prin stri convulsive n urma deficienei de aport glucidic la nivelul celulelor cerebrale. Hipoglicemie apare i n cazul insulinomului (adenomul insulelor Langerhans), tumor care secret cantiti mari de insulin. Disfuncii endocrine cum ar fi insuficiena hipofizar, tiroidian, corticosuprarenal precum i afeciunile hepatice grave i tulburri de absorbie pot induce stri hipoglicemice. O uoar i trectoare hipoglicemie poate s fie de origine alimentar. Alte tehnici de determinare a glicemiei n laborator Metoda cu o-toluidin Principiu: Glucoza, n mediu de acid acetic, formeaz la cald cu o-toluidin un produs colorat n verde, care se fotometreaz.

134

Metoda Nelson-Somogyi Principiu: Glucoza reduce la cald soluia bazic a complexului cupri-tartric. Ionii cuproi formai reduc n mediu acid ionul complex arsenomolibdenic cu formarea de substane de culoare albastr fotometrabil. Metoda enzimatic cu hexokinaz i glucozo-6-fosfat dehidrogenaz Principiu: hexokinaz Glucoz + ATP G-6-P DH Glucozo-6-fosfat + NADP+ cunoscut, i se calculeaz glicemia. Gluconat-6-P + NADPH + H+ Glucozo-6-fosfat + ADP

Se msoar extincia n UV a probei i a soluiei standard cu concentraie

Dozarea beta-lipoproteinelor dup Burstein

Principiu: Beta-lipoproteinele din ser sunt precipitate selectiv de heparinatul de calciu n soluie de clorur de calciu cu for ionic joas. Se msoar turbiditatea soluiei i se exprim n uniti arbitrare. Reactivi: - Clorur de calciu 0,025 M - Sol. heparin 0,2% Modul de lucru: Se pipeteaz n dou erubete, proba (P) i blanc (B), urmtoarele soluii: Clorur de calciu H2O bidistilat Sol. de heparin Ser ml ml ml ml P 5,0 0,1 0,1 B 5,0 0,1 0,1

Se agit i se las n repaus 5 minute la temperatura camerei. Apoi se msoar extincia probei (EP) i a blancului (EB), fa de H2O bidistilat la = 6 45 nm n cuva

135

de 1 cm. Turbiditatea serului depinde de numrul de chilomicroni i de coninutul n grsimi neutre. Din aceast cauz serul trebuie s provin din snge recoltat pe nemncate. Determinarea trebuie s se fac n ziua recoltrii sngelui. Calcul: Rezultatele sunt exprimate direct n uniti de extincie: 1) Turbiditatea serului: E = EB Vfinal/Vser = EB 52 2) Coninutul n beta lipoproteine: E = (EP - EB) 52 Valori normale: 1) Turbiditatea serului: 0-0,1 U. extincie 2) Beta-lipoproteine: 4,0-10,0 U. extincie Fracionarea electroforetic a lipoproteinelor n gel de agaroz produce urmtoarele fraciuni care sunt n urmtoarea coresponden aproximativ cu fraciunile separabile n cmp centrifugal: chilomicronii corespunztori alfa2 lipoproteinelor i care rmn pe linia de start, beta-lipoproteinele care corespund LDL, pre-beta lipoproteinele care corespund VLDL i alfa1-lipoproteinele care corespund HDL. Tipurile de dislipidemie: Pe baza modificrilor cantitative ale fraciunilor lipoproteice i ale coninutului acestora n colesterol, fosfolipide i trigliceride, Fredrickson a stabilit 5 fenotipuri de dislipidemie: Tipul I.: chilomicronemie i hiper-VLDL, cu creterea trigliceridelor i cu ser lactescent datorate deficitului de lipoproteinlipaz sau de apoCII. Se mai numete hipertrigliceridemie familial. Tipul II.a: creterea colesterolului i a LDL, cu ser clar datorat deficitului n receptori apoB100. Se mai numete hipercolesterolemie familial. Tipul II.b: creterea concomitent a colesterolului i a trigliceridelor, ser clar, sau opalescent. Cresc concomitent LDL i VLDL. Se mai numete hiperlipidemie combinat familial. Tipul III.: anomalie ereditar rar ntlnit (boala "betei late") cu cretera concomitent a colesterolului i a trigliceridelor, ser lactescent. Se datoreaz deficitului de clarificare hepatic a IDL i chilomicronilor remaneni. Este cauzat de lipsa de apoE i de lipoproteinlipaz hepatic. Tipul IV.: creterea trigliceridelor endogene (VLDL), ser clar sau opalescent.

136

Tipul V.: creterea chilomicronilor endogeni i exogeni, a colesterolului, cu LDL i VLDL crescute, HDL sczute, ser opalescent sau uneori lactescent.

Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatic

Principiu: Kit-ul enzimatic conine urmtoarele enzime care catalizeaz reaciile indicate mai jos: Colesterol esteraza catalizeaz reacia de hidroliz a esterilor de colesterol rezultnd colesterol liber i acizi grai:
colesterol-esteaz

esteri de colesterol + H2O <-----------------> colesterol + acizi grai n prezena colesterol oxidazei colesterolul sufer o reacie de oxidare cu formarea a 4- colestenonei i a apei oxigenate:
colesterol-oxidaz

colesterol + O2 --------------> 4- colestenona + H2O2 Sub aciunea peroxidazei apa oxigenat reacioneaz cu fenolul i 4-amino antipirina formnd un compus chinonic de culoarea roie, fotometrabil:
peroxidaz

2 H2O2 + fenol + 4-amino-antipirin ----------------> compus chinonic + 4H2O Reactivi: Reactivul pentru colesterol conine n soluie tampon: colesterol esteraza, colesterol oxidaza, peroxidaza, fenol, 4-amino-antipirin. Mod de lucru: Se pregtesc 3 eprubete n care se pipeteaz: P 2 ml 20 l S 2 ml 20 l B 2 ml 20 l -

Reactiv pt. colesterol H2O bidistilat Sol. standard de colesterol (200 mg%) Ser

Se agit i se incubeaz 5 minute la 37C. Apoi se citete extincia probei (P) i a standardului (S) fa de blanc (B) la = 500 nm n cuva de 1 cm. Calcul: mg colesterol/100 ml ser = Ep/Es 200 Valori normale: 150-250 mg% 137

Dozarea colesterolului total i liber

Principiu: Colesterolul liber din ser se extrage cu etanol i apoi se precipit cu digitonin. Diferena dintre colesterolul total i colesterolul liber reprezint colesterolul esterificat. Reactivi: - Soluie de clorur feric: se prepar din 2,5g FeCl 3. 6H2O n urma adugrii a 100ml H3PO4 85%. - Reactivul de culoare: 4ml soluie de clorur feric se dizolv n 50ml H2SO4 concentrat. - Soluie de digitonin 1%: se dizolv 1g digitonin n 50ml etanol 95% i se aduce la 100ml cu ap bidistilat. Se pstreaz la ntuneric max. timp de 6 luni. - Standard de colesterol (0,2%): se dizolv 2000mg colesterol pur n 100ml acid acetic glacial i se dilueaz de 10 ori (1ml n 10ml) cu acid acetic glacial. Observaii: 1. Eprubetele i pipetele trebuie s fie perfect curate i uscate, reacia fiind influenat de urmele de ap. 2. Puritatea acidului sulfuric i a acidului acetic este o condiie indispensabil pentru dozare. n particular, acidul acetic nu trebuie s conin acid glioxilic. Pentru ndeprtarea acidului glioxilic, eventual prezent, se recomand distilarea acidului acetic n prezena anhidridei cromice. Dozarea colesterolului total Modul de lucru: Proba: ntr-o eprubet de centrifug se introduc 6ml acid acetic glacial i 0,1ml ser. Se agit. Se adaug 4ml reactiv de culoare i se agit bine. Se citete extincia probei dup 10 min. de ateptare la = 550 nm n cuva de 1 cm fa de blanc (prepararea acestuia apare mai jos). Rezult extincia Ep. Soluia standard: ntr-o eprubet de centrifug se introduc 6ml acid acetic glacial i 0,1ml standard de colesterol. Se agit. Se adaug 4ml reactiv de culoare i se agit bine. Se citete extincia standardului la = Rezult extincia Es. Blanc: ntr-o eprubet de centrifug se introduc 6ml acid acetic glacial i 0,1ml ap bidistilat. Se agit. Se adaug 4ml reactiv de culoare i se agit bine. 550 nm n cuva de 1 cm fa de blanc.

138

Calcul: mg% colesterol total = (EP/ES) x conc. standard Dozarea colesterolului liber Se pipeteaz n eprubete de centrifug o prob P, un standard S i un blanc B. Ser Standard de colesterol Ap bidistilat Aceton-95% etanol (1:1,v/v) Sol. digitonin ml ml ml ml ml P 0,1 1 1 S 0,1 1 B 0,1 1

Se amestec, se las n repaus 10min i apoi se centrifugheaz (la 3000 rpm, 5min). Se arunc supernatantul. Se usuc precipitatul timp de 5 min. n curent de N2. Resuspendarea rezidiului se face cu 4 ml aceton, apoi se agit cu Vortexul. Se centrifugheaz, se decanteaz (cu grij) supernatantul, se usuc precipitatul timp de 5min. Precipitat CH3COOH glacial ml + 6 + 6 6

Se agit, se adaug 4ml reactiv de culoare i se agit energic cu Vortexul. Dup 10 minute de repaus se citete extincia probei la = fa de blanc. Blancul const doar din 6 ml CH3COOH glacial. Calcul: mg% colesterol liber = (EP/ES) x conc.standard mg%colesterol esterificat = mg% colesterol total - mg% colesterol liber Valori normale: 60-80% din colesterol total. Prin urmare, raportul colesterol esterificat/colesterol total se ncadreaz n mod normal n intervalul 0,60-0,80. Variaii fiziologice: Colesterolemia este strns corelat cu lipidemia i prezint, n mare, aceleai variaii fiziologice. Valoarea nivelului colesterolului seric la natere este sczut, ncepe s creasc n cteva ore sau zile i variaz n funcie de vrst, sex, ras, alimentaie, echilibru neuro-endocrin, profesie. Exist diferene ale colesterolemiei n funcie de sex i de vrst. De exemplu: la brbai valoarea medie este de 250mg/100ml la vrsta de 50 de ani, dup care scade uor; la femei valorile cresc odat cu vrsta atingnd valoarea maxim de 280 mg/100ml n jurul vrstei de 50 ani, dup care scad uor. Cea mai mare parte a colesterolului seric este de origine endogen, aportul de colesterol exogen influennd n mic msur colesterolemia. 550 nm n cuva de 1 cm

139

Variaii patologice: Acest raport este sczut n afeciuni hepatice grave (com hepatic). Raportul dintre colesterolul esterificat/colesterolul total permite diferenierea i diagnosticul icterelor i este: normal n icterele obstructive moderat sczut n icterele catarale sczut n icterele parenchimatoase grave.

Valori crescute (hipercolesterolemii) se ntlnesc n: hipercolesterolemie esenial, hiperlipemie esenial, hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom nefrotic (nefroze lipoidice), ateroscleroz, intoxicaii cu fosfor, CCl4, alcool, morfin, icter obstructiv (calea de excreie a colesterolului fiind cea biliar), pancreatite, alcoolism. Valori sczute (hipocolesterolemii) se ntlnesc n: afeciuni genetice ca: analfalipo proteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia; hepatite acute, hepatite cronice i ciroze decompensate (numai colesterolul esterificat), hipertiroidism; infecii bacteriene: pneumonie, tuberculoz, difterie, lepr; hemopatii severe: leucemii.

Obinerea, purificarea i identificarea lecitinei (glbenu de ou)

Obinerea lecitinei purificat Reactivi: 1 glbenu de ou 75 ml acetona (reactiv) 75 ml cloroform (reactiv) Modul de lucru: Se separ ntr-un mojar glbenuul de ou n aa fel nct s nu se amestece cu albuul. Se adaug peste glbenu amestecnd 25 ml aceton. Solventul deshidrateaz glbenuul i dizolv grsimile cu excepia lecitinei. Dup ce a rmas n repaus cteva minute acetona se decanteaz sau se filtreaz. Se repet operaia de trei ori, ultima cantitate de aceton adugat nu se mai las n contact cu materialul din mojar i este rapid decantat. Reziduul obinut se ntinde pe o hrtie de filtru. Pudra obinut dup uscare se trece ntr-un balon Erlenmeyer i se agit cu 25 ml amestec cloroform i alcool metilic ( 2:1). Se filtreaz lichidul. Pudra rmas pe hrtia de filtru este reluat cu aceiai cantitate de amestec cloroform-alcool, repetndu-se operaia anterioar. Se obine astfel o soluie cloroformic-alcoolic de lecitin. Pentru obinerea substanei

140

pure filtratul se concentreaz prin nclzirea amestecului la 63C. Produsul obinut n urma extraciei cu solveni organici se prezint ca o mas galben de consisten moale care poate fi uscat prin evaporare n vid. Purificarea lecitinei se face prin cromatografie pe coloan de celuloz pentru ndeprtarea impuritilor azotate nelipidice, urmat de cromatografia pe alumin, care reine cefalinele, i apoi pe coloan de Silicagel, echilibrat cu soluia CHCl 3-CH3OH (2:1; v:v), pentru separarea lizofosfatidelor i sfingolipidelor. Caracterizarea fizico - chimic a lecitinei Lecitina formeaz o mas alb-glbuie, higroscopic, alterabil, se brunific dup pstrare. Este solubil n eter, cloroform, uleiuri, alcool concentrat. ( 1p. lecitina: 20 p. alcool concentrat; 1p. lecitin; 9,8p. eter de petrol). Identificarea lecitinei Identificarea lecitinei se face astfel: - adugarea 2 ml de acid sulfuric concentrat la 2 ml de soluie de molibdat de amoniu 0,1% care conine cteva picturi de soluie eteric de lecitin, la nclzire determin formarea unei zone de separaie colorat n albastru; - o soluie alcoolic de lecitin la care se adaug o soluie alcoolic de aloxan se coloreaz n roz, apoi n rou i n final formeaz un precipitat de culoare roie. - dac se adaug cu precauie la 2 ml de acid sulfuric concentrat, 2 ml alcool coninnd urme de lecitin i 4 picturi de soluie alcoolic 0,01% de benzaldehid, furfurol sau vanilin, apare la suprafaa de separare a lichidelor o coloraie roie-brun. Hidroliza lecitinei i observarea microscopica a cristalelor de colina Lecitinele prin hidroliz se descompun ntr-o molecul de glicerol, 2 molecule de acid gras, o molecula de acid fosforic i o molecul de colin. Reactivi: - soluie de hidroxid de sodiu 10% - soluie de acid acetic 10% - soluie de iod 5% ( 1 g iod, + 2 g KI, + 20 ml ap) - hrtie de turnesol Modul de lucru: Lecitina obinut din glbenuul de ou se trece ntr-un pahar Erlenmeyer, se trateaz cu 20 ml NaOH 10%. Se fierbe 10 min. Lichidul obinut se neutralizeaz n prezena hrtiei de turnesol cu acid acetic. Se adaug apoi n exces o pictur de acid. Se rcete, se filtreaz. Pe o lam de sticl se ia o pictur din soluia obinut, se 141

adaug o pictur de iod, se acoper cu lamela. Se observ apariia cristalelor de periodur de colin (cristale Florence).

Imaginea la microscopul optic a cristalelor de colin (desen). Stabilitatea lecitinei Stabilitatea lecitinei include determinarea indicelui de aciditate, a indicelui de peroxid, i a indicelui de iod. 1. Determinarea indicelui de aciditate (Ia): Prin indice de aciditate se nelege numrul de miligrame de hidroxid de potasiu necesare pentru neutralizarea acizilor grai liberi coninui ntr-un gram de lecitin Modul de lucru: 5 g lecitin se dizolv n 50 ml amestec preparat n pri egale din alcool i eter neutralizat n prezena fenolftaleinei ca indicator (0,1g fenolftalein dizolvate n 100 ml alcool din care se folosesc 3 picturi) i se titreaz cu KOH 0,1 N pn la coloraie roz care trebuie s persiste minimum 30 de secunde. Ia = 5,61 v / G unde v = ml KOH 0,1 N folosii la titrare i G = grame substan luat n lucru 2. Determinarea indicelui de peroxid (Ip): Indicele de peroxid reprezint numrul de miliechivaleni oxigen activ din 1000 g lipid (lecitin), respectiv numrul de mililitri de tiosulfat de sodiu 0,01 N oxidai de iodul eliberat din acidul iodhidric prin aciunea peroxizilor din 1g lipid. Modul de lucru: 5 g lecitin (G) se dizolv ntr-un flacon cu dop rodat ntr-un amestec de 18 ml acid acetic i 12 ml cloroform. Se adaug o soluie proaspt preparat dintr-un gram de iodur de potasiu i un ml ap i se agit puternic. Dup un minut se adaug 30 ml ap,

142

2 ml soluie de amidon 0,1% i se titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,01 N (v 2). n paralel se efectueaz titrarea unui martor fr lecitin (v1). Ip = 10 ( v2 - v1 )/ G 3. Determinarea indicelui de iod: Indicele de iod reprezint numrul de grame de iod fixat de 100g lipid nesaturat. Modul de lucru: Intr-un flacon cu dop rodat de 300 ml se ntroduc 0,15 g de lecitin (G) i se dizolv n 20 ml de cloroform, se adaug 25 ml soluie monobromur de iod 0,2N, se nchide flaconul i se las la ntuneric 30 min, agitnd din 5 n 5 minute. Se adauga 15 ml iodur de potasiu 10% ,10 ml ap i se titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,1N (v1) pn la decolorare adugnd 2 ml soluie de amidon spre sfritul titrrii. Se face o prob martor cu aceleai cantiti de reactivi n aceleai condiii, fr lecitin, care se titreaz (v2). Indice de iod = (v1 - v2) 1,269 / G

Hemoglobina
Dozarea hemoglobinei in snge ( metoda Drabkin) Principiu: Fericianura de potasiu oxideaz Fe2+ din hemoglobina la Fe3+. Astfel hemoglobina se transform n methemoglobin. Methemoglobina n prezena cianurii de potasiu trece n cianmethemoglobin, derivat de hemoglobin stabil, fotometrabil la = 540 nm. Materiale: - pipet de hemoglobin de 0,02 ml. Reactiv Drabkin: - 50 mg KCN, 1 g NaHCO3 i 200 mg fericianur de potasiu se dizolv n ap bidistilat i se aduce volumul la 1000 ml cu ap bidistilat. Atenie! Reactivul Drabkin este extrem de toxic. Modul de lucru: n dou eprubete se pipeteaz cte 5 ml de reactiv Drabkin. n una din eprubete se pipeteaz cu o micropipet 0,02 ml soluie standard de hemoglobin (preparat comercial), iar n cealalt se pipeteaz 0,02 ml snge n prealabil agitat pentru

143

resuspendarea celulelor sanguine. Se omogenizeaz eprubetele prin agitare, apoi dup 20 de minute se citete extincia probei de analizat i a probei standard fa de ap distilat la = Calcul: g hemoglobin/100 ml snge=Ep/Es x Cst (Cst = concentraia standardului n g%) Observaie: Metoda cu cianmethemoglobin detecteaz toate formele de hemoglobin i permite determinri foarte precise. Dozarea hemoglobinei sub form de oxihemoglobin Principiu: n prezen de amoniac globulele roii se hemolizeaz i hemoglobina se transform n oxihemoglobin care prezint un maxim de absorbie la = 540 nm. Reactivi i materiale: - soluie de amoniac 0,1% - pipet de hemoglobin de 0,02 ml Modul de lucru: ntr-o eprubet se msoar 5 ml de soluie de amoniac. n acesta se introduc cu pipeta de hemoglobin 0,02 ml de snge n prealabil agitat. Dup agitare se citete extincia probei fa de ap distilat la = 540 nm n cuva de 1 cm.Rezultatul se raporteaz la o curb de calibrare obinut cu diluii dintr-o prob de concentrat de eritrocite cu concentraia hemoglobinei cunoscut. Valori normale: femei: 14-17 g/100 ml snge brbai: 15-20 g/100 ml snge Dozarea hemoglobinei din sngele total prezint importan pentru diagnosticul unor forme de anemii. Observaie: Ca metod de referin (pentru obinerea unei curbe de calibrare n absena unui standard de hemoglobin) se poate folosi metoda bazat pe dozarea ferului eritrocitar. 540 nm n cuv de 1 cm.

Analiza urinei
Urina este un produs de filtrare, reabsorbie i excreie, reprezentnd exercitarea funciei renale. Este un lichid biologic uor accesibil, care d multe informaii utile n diagnostic. 144

Urina "de diminea" servete la determinri calitative (albumin, glucoz, pH, aceton i sediment urinar). Se golete vezica de urina acumulat n timpul nopii i se colecteaz urina proaspt de diminea, care este mai concentrat. Urina de 24 ore se folosete la determinrile cantitative. Este necesar s se msoare volumul diurn de urin fiindc rezultatele dozrilor se raporteaz la acest volum. Se golete vezica de urina "de diminea" i se ncepe la or fix recoltarea urinii n intervalul de 24 de ore. Pentru prevenirea contaminrii probelor de urin cu microorganisme se recomand efectuarea analizelor n cel mult 2-3 ore de la recoltare. Pstrarea nealterat se poate realiza la rece (+4oC) sau prin tratare cu substane conservante, de preferat cu timol (0,1 g la 100 ml de urin). Nu se recomand folosirea de cloroform, fenol, formol fiindc acestea falsific rezultatele obinute.

Examenul fizic al urinei

Volumul. Cantitatea de urin emis n 24 ore depinde de ingestia de lichide, de pierderile de ap (piele, intestin, plmni) i de cantitatea de substane excretate prin urin. Volumul se msoar cu cilindrul gradat. Valori normale: 1500 - 2000 ml/24 ore (brbai); 1000 - 1500 ml/24 ore (femei). Valori patologice: - sub 200 ml/24 ore (anurie) - ntre 200-800 ml/24 ore (oligurie) - peste 2000 ml/24 ore (poliurie) Oligo-anuria este semnul cel mai important al insuficienei renale acute. Cauzele acesteia se pot clasifica n trei grupe: Cauze prerenale: hipovolemie (diaree sever, stare de oc cu prbuirea presiunii arteriale), insuficien cardiac stng - n aceste cazuri nu se realizeaz presiunea hidrostatic necesar funciei de filtrare a rinichiului. Cauze renale: boli inflamatorii ale rinichiului (glomerulonefrit acut), necroz tubular acut (ischemic, toxic), boli autoimune cu afectare renal.

145

Cauze postrenale: obstrucia mecanic a cilor urinare (calculi, malformaii). Se formeaz urin, dar nu se poate elimina.

Poliuria se ntlnete n: diabet zaharat, diabet insipid (se constat o poliurie extrem de 5-20 l/24 ore, cauza fiind lipsa secreiei de hormon antidiuretic-ADH; poliuria este nsoit de polidipsie, adic consumul excesiv de lichide), alcoolism cronic (inhibarea secreiei de ADH), hiperparatiroidism (se elimin cantiti mari de calciu prin urin care antreneaz eliminarea unui volum mare de lichid), insuficien renal cronic (capacitatea de concentrare a rinichilor este alterat). Alte noiuni patologice legate de distribuia volumului urinar sunt: Polakiurie: miciuni dese cu eliminarea unor cantiti mici de urin (apare n cistit, hipertrofie de prostat, tumori ale vezicii urinare). Deseori este nsoit de disurie (durere sau senzaie de arsur la emisia de urin). Nicturie: urinare nocturn (diabet insipid, insuficien cardiac dreapt semnaleaz evoluia spre decompensare). Aspectul. n condiii fiziologice urina proaspt este limpede i transparent. Urina tulbure n momentul emisiei poate fi datorat coninutului excesiv de sruri (urai, fosfai, carbonai), mucusului, puroiului, celulelor epiteliale, grsimilor sau microbilor. Dac ntr-o urin clar n momentul eliminrii dup un timp se formeaz un depozit n form de nor, el se datoreaz unui proces de descuamare epitelial a cilor urinare. Acest depozit nu are nici o valoare diagnostic. Situaiile patologice se difereniaz n felul urmtor: a). Dispariia tulburrii prin nclzire indic prezena urailor, oxalailor i a acidului uric. b). Dispariia tulburrii care a devenit mai abundent n urma nclzirii, prin adugare de acid acetic 10 % indic prezena fosfailor i carbonailor (dac se produce efervescen). c). Dac tulburarea apare la cald i se intensific prin adugare de acid acetic, urina conine albumin. d). Dispariia tulburrii numai la adaus de HCl 12,5 % dup nclzire prealabil, indic prezena oxalatului de calciu. e). Din urina tulbure, chiar n momentul emisiei, puroiul, hematiile sau celulele epiteliale se pot ndeprta prin centrifugare.

146

f). Dispariia tulburrii dup adugarea unui amestec de etanol-eter (1:1; v:v) indic prezena grsimilor. Culoarea. Urina normal are culoare galben-deschis pn la galben-aurie. Urina din timpul nopii fiind mai concentrat, are o culoare mai nchis. Culoarea urinii poate fi modificat de diferite substane pe care le conine. Substane endogene: sngele imprim urinii culoare roie, brun sau maronie; porfirinele dau o culoare roie sau brun-rocat; pigmenii biliari confer culoare galben verzuie; alcaptonul (compus aprut n urin datorit dereglrii catabolizrii Phe i Tyr) d n contact cu aerul o culoare brun-neagr. Substane exogene: albastrul de metilen coloreaz urina n verde-albstrui; piramidonul n rou-crmiziu; fenolul i d o coloraie brun. Mirosul. Mirosul urinii proaspete se datoreaz acizilor volatili din compoziia sa. n urinile concentrate mirosul este mai accentuat. n cazurile de acidoz apare un miros de fructe sau cloroform. Urinile infectate au un miros amoniacal datorit descompunerii ureei de ctre ureaza bacterian. Mirosul fecaloid al urinii poate atrage atenia asupra existenei unei fistule (comunicare patologic ntre tubul digestiv i urinar). Miros fecaloid apare i n infeciile cu Escherichia coli (E. coli este o component a florei intestinale saprofite, dar poate cauza frecvent infecii urinare). Densitatea. Greutatea specific sau densitatea urinii se msoar cu un densimetru special numit urodensimetru, format dintr-un tub de sticl care se termin la partea inferioar printr-un rezervor cu mercur. n partea superioar se afl o tij pe care este nscris scara gradat pentru intervalul 1,000 - 1,040 g/cm 3 la 15
o

C, fiind anexat i o scal termometric, pentru c densitatea urinii variaz n

funcie de temperatur. Densitatea depinde de substanele dizolvate: srurile n general i ureea la indivizi sntoi; glucoza i albumina n cazurile patologice. Densitatea este de obicei invers proporional cu diluia urinii i direct proporional cu intensitatea culorii. Excepie face diabetul zaharat, cnd, cu toate c volumul urinar este mare, ceea ce ar determina o diluie mare, densitatea este mare datorit prezenei glucozei. Modul de lucru: Urina de 24 ore se amestec pentru omogenizare, apoi se toarn ntr-un cilindru gradat, evitndu-se formarea spumei. Se introduce urodensimetrul care trebuie s 147

pluteasc fr a atinge pereii cilindrului. Se citete diviziunea care este tangent la meniscul inferior al suprafeei urinii. Valoarea citit trebuie corectat prin mrire cu 0,001 pentru fiecare depire cu 3oC respectiv prin micorare cu 0,001 pentru fiecare scdere cu 3oC sub 15oC. Cnd urina conine cantiti mari de proteine, peste 7 g%, se vor scdea cte 0,03 pentru fiecare gram de protein n plus. Valori: 1,015 - 1,025 g/cm3, putndu-se modifica fiziologic la valori extreme de 1,001 - 1,035 g/cm3 n funcie de aportul sporit sau de eliminarea abundent de lichide. Scderea densitii urinare se ntlnete n diabet insipid (se elimin o cantitate mare de urin foarte diluat), insuficien renal cronic (datorit incapacitii de concentrare a rinichiului). Creterea densitii urinare apare n diabetul zaharat, nefroz (boal renal n care se elimin o cantitate mare de proteine prin urin).

Examenul chimic al urinei

pH-ul urinei. Valoarea pH-ului urinei normale depinde de diet. O alimentaie bogat n proteine produce aciditate urinar, pe cnd un regim vegetarian determin alcalinizarea urinei. Aciditatea urinei provine din acizi organici (uric, hipuric, citric, acetic, oxalic) i din srurile acide (fosfai primari de Na+, K+, NH4+). Regimul carnat determin o cretere a aciditii urinei datorit eliminrii crescute de acid uric, urai i fosfai acizi. Un regim alimentar vegetarian determin o alcalinizare a urinei prin excesul de sruri minerale i organice. Msurarea pH-ului se face prin folosirea benzilor de hrtie indicator universal sau cu pH-metrul. Modul de lucru: Se introduce n urina proaspt, pentru cteva secunde, o bucat de hrtie indicator. Se stabilete valoarea pH-ului dup 30 de secunde comparnd culoarea hrtiei cu cea a scalei de culori care nsoete fiecare pachet de hrtie indicator. Prin metoda poteniometric (cu pH-metrul), dup calibrarea aparatului cu soluii standard de pH, se introduc cei doi electrozi (de pH i de referin) ntr-un volum adecvat de urin a crei temperatur se cunoate i se citete valoarea pH-ului. Valorile: pH-ul urinei este slab acid, cu variaii n jurul valorii de 6 (4,8 - 7,4) la un individ cu alimentaie mixt. Urini puternic acide se produc n cursul proceselor maligne datorit distrugerii crescute de proteine, n febr, diaree abundent i acidoz metabolic. pH puternic alcalin se constat n infecii urinare (prin fermentare

148

microbian) i n alcaloz metabolic. pH-ul se msoar din urina proaspt emis, deoarece n timp se produce contaminarea produsului cu bacterii, care determin schimbarea reaciei n sensul alcalinizrii urinei.

Analiza compuilor patologici din urin

Identificarea proteinelor urinare Urina normal conine doar urme de proteine (albumine i globuline provenite din plasm), n cantitate de 20-40 mg%o, care nu se pot decela prin tehnici uzuale. Proteinurii apar n stri patologice cum ar fi: - afeciuni renale: filtrul renal lezat nu mai poate reine moleculele proteice i acestea ajung n urin n cantitate mare. Proteinuria poate fi selectiv (numai albuminurie) de exemplu n glomerulonefrite, sau neselectiv n cazuri mai grave (albuminurie i globulinurie) cum ar fi glomerulonefrozele. n afar de bolile inflamatorii renale enumerate, leziuni ale nefronului pot apare i n intoxicaii sau n rinichiul de oc. Proteinuria este pus n eviden i n leziuni mai grave ale filtrului glomerular, caz n care se pune n eviden chiar hematuria. - afeciuni postrenale: leziuni ale mucoasei cilor urinare (litiaz, inflamaie, tumori, etc). n aceste cazuri proteinuria se asociaz obligatoriu cu hematurie (apariia sngelui n urin). - afeciuni prerenale: stri febrile, boli cardiace, ictere, leucemie, apariia n urin a proteinelor Bence-Jones (provenite din imunoglobuline patologice) n mielomul multiplu (plasmocitom). Datorit hiperproteinemiei (creterea cantitii proteinelor n snge), se satureaz capacitatea maxim de transport a celulelor mucoasei tubulare renale, i proteinele care nu s-au reabsorbit se elimin prin urin. n mod fiziologic, n cursul efortului fizic are loc o cretere a proteinuriei care poate atinge de 5 ori valoarea normal. Cantitatea de proteine eliminat variaz n timpul zilei, de aceea trebuie s se fac analiza pe urina de 24 ore (valori normale: 3040 mg/1500 ml). Procedeul cu acid acetic la cald Principiu: Proteinele precipit prin nclzirea i acidularea urinei mbogite cu sruri de sodiu.

149

Reactivi: Mod de lucru:

- Acid acetic 10% - NaCl cristale

n 10 ml de urin filtrat se adaug cteva cristale de NaCl i se nclzete eprubeta n flacr pentru aducerea la fierbere doar a prii superioare a coloanei de lichid. Se adaug cteva picturi din soluia de acid acetic. Apariia unui precipitat persistent indic prezena albuminei. Aprecieri semicantitative asupra cantitii de albumin: - opalescen, urmat de sedimentare la cteva minute . . . . cca 10 mg% - precipitare i sedimentare imediat . . . . . . . . . . . . . . . . . . cca 50 mg% nlimea coloanei de precipitat raportat la nlimea coloanei de urin dup staionarea amestecului timp de 30 secunde: - 1 : 4 . . . . . . . . . . . . cca 250 mg% - 1 : 3 . . . . . . . . . . . . cca 500 mg% - 1 : 2 . . . . . . . . . . . . cca 1000 mg% Proba cu acid sulfosalicilic la rece Principiu: Proteinele sunt precipitate n mediu de acid sulfosalicilic. Reactiv: Sol. acid sulfosalicilic 20% Mod de lucru: La 5 ml urin filtrat se adaug 10-15 picturi din soluia de acid sulfosalicilic. Se agit i se apreciaz reacia innd eprubeta pe un fond negru. Rezultatele posibile sunt: - urina rmne limpede . . . . . . . albumin absent - uoar opalescen . . . . . . . . cca 15 mg% albumin - opalescen apreciabil . . . . . cca 20 mg% albumin - floculare abundent . . . . . . . . > 20 mg% albumin Reacii fals pozitive se observ n terapia diabetului cu antidiabetice orale (tolbutamid), dup administrare de antibiotice din familia cefalosporinelor, etc. Reacia cu acid azotic (proba Heller) Reactiv: Acid azotic concentrat Mod de lucru:

150

n cca. 1-2 ml acid azotic concentrat se las s se preling pe peretele eprubetei 1-2 ml urin. Apariia unui precipitat sub form de inel la zona de contact dintre cel dou soluii indic prezena proteinelor. Reacii fals pozitive pot fi date de urina conservat cu timol sau care conine uree i urai n cantitate mare. Mucoproteinele secretate de mucoasa cilor urinare pot da numai o tulbureal care nu este delimitat sub form de inel. Proba cu acid tricloracetic Reactiv: Acid tricloracetic 15% Mod de lucru: La 5 ml urin se adaug 1 ml acid tricloracetic. Formarea unui precipitat alb floconos arat prezena proteinelor. Evidenierea proteinelor Bence-Jones (termosolubile) Principiu: n urina slab acid proteinele Bence-Jones precipit ntre 45-55 oC i se redizolv n apropiere de 100 oC. Reactiv: Tampon acetat 2 N (pH=4,9) Mod de lucru: Se lucreaz din urinele la care am obinut rezultat pozitiv la reaciile de precipitare a proteinelor. ntr-o eprubet se pun 4 ml de urin, se adaug 1 ml tampon acetat i se incubeaz n baie de ap la 56 oC pn la apariia unui precipitat. Apoi se introduce eprubeta n ap la fierbere timp de 3 minute. Descreterea cantitii de precipitat, clarificarea tulburrii, confirm prezena proteinelor Bence-Jones. Prin rcire la 56 oC reapare precipitatul iniial. Proteinele Bence-Jones sunt lanurile uoare ale imunoglobulinelor. Ele apar n 60% din cazurile cu mielom multiplu (multiplicarea canceroas a unei clone de plasmocite care produce imunoglobuline) i ocazional n alte boli care afecteaz mduva osoas: leucemii, osteosarcoame (tumori canceroase ale esutului osos), metastaze osoase, unele disproteinemii. Test rapid pentru detectarea proteinelor urinare Principiu: Hrtia reactiv impregnat cu albastru de tetra-bromfenol este colorat n galben deschis n mediu acid (pH 3). n prezena proteinelor urinare, culoarea vireaz spre verde, verde-albstrui, albastru sau violet, nuana depinznd de tipul de protein i de concentraia acesteia n urin. 151

Mod de lucru: Se nmoaie captul benzii n urina de analizat. Dup 2 minute se apreciaz prezena proteinelor urinare prin compararea culorii obinute cu o scal de etalonare. Cantitativ urmele de proteine corespund la aproximativ 5-20 mg% de albumin. Testul are valoare orientativ. Evidenierea puroiului Proba Donn Principiu: Cu ajutorul NaOH se lezeaz membrana leucocitar din care astfel se elibereaz mucin, care mrete vscozitatea urinei i mpiedic ridicarea imediat a bulelor de aer. Reactiv: Sol. NaOH 20% Mod de lucru: Se iau ntr-o eprubet 5 ml urin, se adaug cteva picturi de NaOH 20%, se astup eprubeta i se rstoarn brusc, apoi se readuce n poziia iniial. Apariia unor bule de aer n lichid, care rmn mai mult timp n suspensie i se ridic ncet la suprafa denot prezena puroiului. n cazul n care bulele de aer se ridic rapid, testul este negativ. Dac toate bulele de are se ridic ncet la suprafa rezultatul se noteaz cu +. n cazul n care bulele mici rmn pe fundul eprubetei, rezultatul este ++. Dac nici bulele mai mari nu se ridic datorit prezenei unei cantiti mari de mucin, proba se noteaz cu +++. Interpretare: Puroiul este constituit din leucocite degenerate care apar n urin n urma proceselor inflamatorii ale tractului urinar (pielonefrit, cistit, uretrit). Probe fals pozitive pot apare n albuminurie masiv, datorit prezenei polizaharidelor, a mucinei, etc. Testele pozitive trebuie ntotdeauna verificate prin examenul microscopic al sedimentului urinar. Identificarea glucidelor urinare n mod normal, urina nu conine dect cantiti mici de glucide. n mod patologic ns, glucoza poate aprea n cantiti apreciabile, prezena ei n urin fiind denumit glicozurie i este caracteristic diabetului zaharat. n anumite stri patologice particulare, urina mai poate conine n afar de glucoz i alte glucide: fructoz, galactoz, lactoz, maltoz i pentoze.

152

Fiziologic poate apare glicozurie dup ingerarea unor cantiti mari de glucide. De asemenea, luzele i 40% din gravidele n a doua jumtate a sarcinii prezint lactozurie. Evidenierea glucidelor urinare se face pe baza proprietii reductoare a acestora fa de srurile unor metale (Cu, Bi). Pe lng glucide, n urin pot exista i alte substane reductoare care pot da rezultate fals pozitive (cantiti mari de creatinin, acid ascorbic, acid uric, fenoli, etc.). Unele medicamente eliminate prin urin cum ar fi penicilina, streptomicina, dextranul pot reduce srurile metalice. Din acest considerent, naintea cercetrii calitative a diferitelor tipuri de glucide urinare, se efectueaz operaia de defecare - adic nlturarea substanelor reductoare neglucidice din urin. Defecarea urinii Defecarea urinii se efectueaz cu reactivul Courtonne, care se prepar n felul urmtor: se dizolv 100 g acetat de plumb n ap distilat, se neutralizeaz cu acid acetic glacial (control cu hrtie indicator), se filtreaz ntr-un balon cotat de 1000 ml i se completeaz cu ap distilat pn la semn. Mod de lucru: Se iau ntr-un cilindru 45 ml urin i 5 ml reactiv Courtonne, se amestec cu o baghet, se las s se depun precipitatul i se filtreaz. Majoritatea reaciilor de reducere nu sunt considerate suficient de specifice pentru a fi utilizate pentru depistarea glicozuriei. Mai specifice sunt reaciile Nylander i Benedict, ultima avnd avantajul de a da indicaii orientative asupra cantitii de substan reductoare din urin. O metod specific de evideniere a glucozei este metoda cu glucozoxidaz. Reacia Nylander Principiu: Glucidele reductoare reduc n mediu bazic ionii de Bi3+ la Bi metalic. Reactivi: 20 g azotat de bismut, 40 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu i potasiu) i 100 g NaOH se dizolv n ap pn la 1000 ml soluie. Mod de lucru: ntr-o eprubet, la 5 ml urin se adaug 1 ml reactiv Nylander i se nclzete la flacr timp de 4 minute. n prezena glucozei apare un precipitat brun pn la negru. Reacii fals pozitive pot exista n proteinurie masiv, cnd apare un precipitat brun de sulfur de bismut 153

datorit reaciilor de reducere date de unele grupri funcionale ale radicalilor aminoacizilor. Reacia Benedict (semicantitativ) Principiu: Gruparea carbonil din glucidele reductoare reduce la cald Cu2+ din reactivul Benedict la Cu+ (meninerea n soluie a Cu2+ se face prin complexare cu citrat de sodiu). n urma reaciei se formeaz Cu2O de culoare roie-crmizie. Reacia este pozitiv pentru toate glucidele reductoare. Reactivul Benedict are compoziia prezentat la pag. ?? Mod de lucru: Se pun ntr-o eprubet 0,5 ml urin i 5 ml reactiv Benedict. Se amestec i se pune ntr-o baie de ap la fierbere timp de 5 minute. Se rcete la temperatura camerei i se interpreteaz rezultatul astfel: Culoare albastru albastru-verzui verde brun-verzui galben rou-crmiziu Reacia Barfoed Principiu: Reacia de reducere a Cu2+ la Cu+ din Cu2O n mediu slab acid este pozitiv numai n prezena monozaharidelor i ea servete la identificarea acestora n prezena dizaharidelor reductoare (lactoz, maltoz), pentru care aceast reacie este negativ n condiiile de lucru. n mediu slab acid viteza reducerii Cu2+ Cu+ este mult mai mic dect n mediu alcalin (se formeaz un precipitat rou-crmiziu), totui mecanismul reaciei Barfoed nc nu este pe deplin cunoscut. Reactiv: Reactiv Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolv n 200 ml ap distilat, se filtreaz i se adaug 1,8 ml acid acetic glacial. Mod de lucru: Se pun ntr-o eprubet 2 ml urin i 2 ml reactiv Barfoed. Se amestec i se nclzete eprubeta la fierbere timp de 5 minute. Pozitivitatea acestei reacii, adic Rezultat urme + ++ +++ ++++ Substane reductoare g absente urme cca 0,5 cca 1,0 cca 1,5 cca 2,0

154

apariia pulberii roii de Cu2O la suprafaa i la fundul eprubetei, indic existena monozaharidelor reductoare. Reacia Whlk Se folosete tot n scopul diferenierii glucozei de lactoz. Principiu: Urina care conine lactoz, nclzit la 60 oC n prezena NH3 i KOH, se coloreaz n rou. Reactivi: Mod de lucru: ntr-o eprubet, la 5 ml urin, se adaug 3 ml soluie NH3 i 5 pic. soluie KOH. Eprubeta se agit i se introduce n baie de ap la 60 oC, 30 minute. Prezena lactozei determin apariia coloraiei roii. Galactoza produce culoare galben deschis, iar glucoza n concentraii ridicate d o coloraie brun. Interpretare: Lactozuria este un fenomen inofensiv care poate apare n ultimele luni de sarcin sau la nceputul alptrii. Reacia Seliwanoff Se folosete pentru identificarea fructozei urinare. Principiu: Monozaharidele n prezena acidului clorhidric concentrat reacioneaz cu rezorcina (sau ali polifenoli) formnd produi de condensare colorai. Reacia este mai rapid i intens n prezena cetozelor, cnd se obin produi colorai n rou. n prezena aldozelor, n aceleai condiii, coloraia este slab roz. Aceast reacie servete la diferenierea aldozelor de cetoze. Reactivi: - Reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcin i 100 ml acid clorhidric concentrat se dizolv n ap distilat pn la 200 ml. - Soluie fructoz 1% Mod de lucru: - Sol. NH3 25% - Sol. KOH 20%

155

Se pun ntr-o eprubet 0,5 ml urin i 5 ml reactiv Selivanoff. n paralel se execut doi martori, unul cu 0,5 ml urin normal i cellalt cu 0,5 ml urin normal care conine fructoz 1%. Se aduc la fierbere cele trei eprubete. Prezena fructozei este indicat de apariia unei coloraii rou intens. Prin rcire se poate depune un precipitat rou care se dizolv n alcool. Interpretare: Fructozuria esenial este o boal ereditar rar datorat blocrii conversiei normale a fructozei n glucoz n ficat (deficit de fructokinaz). Se poate produce o fructozurie alimentar n diabet i n unele boli hepatice. Reacia Bial Se folosete pentru identificarea pentozelor urinare. Principiu: n mediu puternic acid pentozele dau reacie de culoare cu orcina (metilrezorcina). Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcin se dizolv n 200 ml alcool etilic 96% i se adaug 40 picturi sol. FeCl3 10% - HCl conc. - soluie 1% de fructoz, arabinoz, glucoz Mod de lucru: Se iau ntr-o eprubet 5 ml reactiv Bial i 0,5 ml urin. Se execut n paralel doi martori, unul cu urin normal i altul cu o urin normal la care se adaug 1 ml soluie de pentoze 0,1% (arabinoz sau xiloz). Se aduc la fierbere cele trei eprubete, apoi se las n repaus 15-20 minute. Pentozele dau culoare verde, sau dac sunt prezente n cantiti mari, un precipitat de culoare verzuie. Culoarea poate fi extras prin agitare n alcool amilic. Interpretare: Pentozuria alimentar apare dup un consum substanial de fructe bogate n pentoze. Pentozele sunt adesea excretate n urina diabeticilor. Pentozuria esenial (n care se elimin xiluloza) este o boal ereditar rar n care apar cantiti considerabile de L-xiluloz n urin datorit deficitului de reductaz care convertete pentoza n xilitol.

156

Reacia cu fenilhidrazina n laboratorul clinic formarea glucosazonei i a lactosazonei este utilizat ca test pentru diferenierea glucozei de lactoz n urina femeilor gravide. Reactivi: - Soluie fenilhidrazin n acid acetic glacial 10%; - Soluie acetat de sodiu 25%; - Acid acetic glacial; - Reactiv Patein: se dizolv 200 g acetat de mercur n 600 ml ap distilat, se alcalinizeaz (indicator hrtie de turnesol) cu soluie de hidroxid de sodiu 10%. Se trece ntr-un balon cotat de 1000 ml i se completeaz cu ap distilat la semn. Reactivul nu se altereaz. Mod de lucru: ntr-o eprubet se pipeteaz 1 ml soluie fenilhidrazin, 1 ml acid acetic glacial i 1 ml soluie acetat de sodiu 25%, apoi se adaug 10 ml urin defecat cu reactiv Patein. Prin defecare se elimin celelalte substane reductoare pe care le-ar putea conine urina trecnd n filtrat numai glucidele. Se filtreaz i eprubeta cu filtrat se ine o or n baia de ap la fierbere, apoi se filtreaz imediat la cald ntr-o alt eprubet care se las s se rceasc. n prezena glucozei (n cantitate mai mare de 4 g%o) se obine glucosazon insolubil la cald care rmne pe al doilea filtru i care examinat la microscop, se prezint sub form de ace galbene aurii dispuse n snopi (vezi pag. 49). Fructosazona are aspect asemntor. Dac urina conine i lactoz sau maltoz, osazonele acestora se vor cristaliza n ultima eprubet, la rece. Cristalele de lactosazon apar la microscop sub form de rozete, iar cele de maltosazon au form de lame aproape rectangulare unite prin una din extremiti.

Identificarea corpilor cetonici urinari Corpii cetonici (acetona, acidul acetoacetic i acidul -hidroxibutiric) sunt implicai n metabolismul lipidic. n condiii patologice de dereglare a catabolismului acizilor grai se excret prin urin n special acidul -hidroxibutiric i acidul acetoacetic, ultimul fiind convertit n aceton prin decarboxilare dac urina este pstrat la temperatura camerei.

157

Reacia Legal Servete la identificarea acetonei. n scop diagnostic este suficient identificarea acesteia, fiindc acetona, acidul acetoacetic i -hidroxibutiratul sunt ntotdeauna prezeni mpreun. Reactivi: - Sol. nitroprusiat de Na 10% (proaspt) - Acid acetic glacial - NaOH 10% Mod de lucru: Se iau ntr-o eprubet 3 ml urin, se adaug 5 picturi de soluie de nitroprusiat de Na 10% i 2-3 pic. de NaOH 10% pn la reacie alcalin. Apariia unei culori roii sau portocalii se datoreaz acetonei sau creatininei urinare. Se adaug apoi 1-2 ml acid acetic glacial. Dispariia culorii indic absena acetonei, iar intensificarea culorii cu virare spre rou-violet indic prezena acetonei. Intensitatea culorii variaz n raport direct cu concentraia corpilor cetonici din urin. Reacia poate fi dat i de unele medicamente (salicilai - de ex. aspirina). Diferenierea se face fierbnd n prealabil cteva minute urina, operaie prin care acetona se ndeprteaz. O reacie pozitiv iniial, care nu mai apare dup fierberea unei alte probe din urina respectiv, indic prezena acetonei. Reacia Lieben Principiu: n reacia dintre aceton i iod n mediu alcalin, ia natere iodoformul care poate fi recunoscut prin miros. H3C - CO - CH3 + 3I2 + 3NaOH CH3 - CO - CI3 + 3NaI + 3H2O

CH3 - CO - CI3 + NaOH tri-iod-acetona Reactivi: Mod de lucru:

CH3 - COONa + CHI3 iodoform

- Sol. de iod - iodur de potasiu 0,1 N - Sol. NaOH 10%

158

ntr-o eprubet se iau 5 ml urin, se adaug 1-2 ml NaOH 10% i 1-2 ml iod 0,1 N. Apariia unui precipitat galben i a mirosului de iodoform indic prezena acetonei. Interpretare: Corpii cetonici apar n urin n diabetul zaharat netratat (datorit lipsei de insulin, celulele nu pot internaliza glucoza din snge. Acizii grai vor fi principala surs de energie, ceea ce intensific exagerat cetogeneza hepatic. Ficatul export mari cantiti de corpii cetonici care sunt folosii n scop energetic de esuturile extrahepatice). Acetonurie apare n toate cazurile n care aportul de glucide sau utilizarea lor este deficitar: nfometare, regim alimentar dezechilibrat (bogat n lipide i proteine, srac n glucide), diaree, vrsturi (accentuate de sarcin), malabsorbie intestinal, boli metabolice. Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici Corpii cetonici se pot evidenia cu pulbere reactiv sau cu tablete "Acetotest" sau baghete "Ketostix" care conin nitroprusiat de sodiu i substane alcalinizante, care se coloreaz n rou n cazul reaciei pozitive. Aceste teste rapide se bazeaz pe reacia Legal clasic. Cu ajutorul lor putem detecta corpii cetonici chiar n concentraii de 0,5-1 mmol/l, prin apariia culorii roii la 15 secunde de la contactul urinei cu bagheta cu reactivi. Identificarea acizilor biliari Eliminarea acizilor biliari n urin se mai numete colalurie. Apare n special n caz de icter mecanic (din cauze obstruciei tubului coledoc, srurile acizilor biliari nu mai sunt excretate n bil. Datorit presiunii ele trec n curentul sanguin i se elimin n urin). Colaluria mai apare n ictere date de hepatit, cnd celula hepatic bolnav nu mai poate excreta acizii biliari. Proba Hay Principiu: Srurile acizilor biliari scad tensiunea superficial a urinei permind sedimentarea florii de sulf. Reactiv: Sulf sublimat (floare de sulf). Mod de lucru: Se presar floarea de sulf pe suprafaa urinei pus ntr-o eprubet. Dac urina conine acizi biliari, sulful sedimenteaz n 5 minute. n absena acizilor biliari sulful plutete cteva ore.

159

Reacia Pettenkoffer Principiu: Acidul sulfuric transform glucidele n derivai furfurolici care se condenseaz cu acizii biliari dnd produi colorai. Reactivi: Mod de lucru: ntr-o eprubet se iau 1 ml ap distilat, 1-2 ml urin, 5-6 picturi zaharoz 10% i se agit. Se adaug cu grij, prelingndu-se pe peretele eprubetei inut ntr-o poziie nclinat, 1-2 ml acid sulfuric. Apariia unui inel rou-violet la limita de separaie a reactivului cu proba indic prezena acizilor biliari. n paralel se execut o prob martor n aceleai condiii, nlocuind urina cu ap. Inelul obinut are o nuan brun crmizie. Identificarea pigmenilor biliari urinari Pigmenii biliari sunt derivai pirolici care provin din catabolismul hemului. Principalii reprezentani sunt biliverdina, bilirubina, urobilinogenul, urobilina, stercobilinogenul, stercobilina. Urobilinogenul i stercobilinogenul, rezultai prin reducerea bilirubinei, sunt compui incolori, care n contact cu aerul se oxideaz parial, trecnd n urobilin, respectiv stercobilin, care sunt compui colorai. Identificarea bilirubinei Dup cantitatea de bilirubin eliminat, culoarea urinei variaz ntre galben i brun-nchis, cu nuan verzuie. Bilirubina eliminat n urin, fiind instabil, reaciile de identificare trebuiesc fcute n timp ct mai scurt de la emisie. Bilirubina fiind fotosensibil, urina trebuie conservat la ntuneric. Urina normal conine doar urme de bilirubin, care nu d reacia de identificare pozitiv. Creterea eliminrii urinare a bilirubinei apare, ca i n cazul acizilor biliari, n icterele prin obstrucia cilor biliare i n icterele prin hepatit. Proba Popper Principiu: Oxidarea bilirubinei n biliverdin (de culoare verde) cu ajutorul iodului. - Acid sulfuric concentrat - Zaharoz 10%

160

Reactivi: - Reactiv Popper: Se amestec 525 ml ap distilat, 125 ml alcool 95o, 3,5 ml tinctur de iod 10% i se adaug 12 g KI i 27 g NaCl. Mod de lucru: Se pun 5 ml urin ntr-o eprubet. Se adaug cu precauie, cu o pipet, 2 ml reactiv, astfel ca cele dou lichide s nu se amestece. Reactivul fiind mai dens, se introduce la fundul eprubetei. n prezena bilirubinei apare un inel verde la suprafaa de contact dintre coloanele celor dou lichide. Reacii fals pozitive: dup consum de antipirin (analgetic) i piramidon. Testele rapide de determinare a bilirubinei din urin au la baz reacia de condensare a bilirubinei cu un alt compus n mediu puternic acid, cu apariia unei coloraii maronii de intensitate diferit. Reacia complet necesit 20 de minute. Identificarea urobilinogenului i stercobilinogenului Urobilinoizii sunt derivaii hidrogenai ai bilirubinei: urobilinogenul, stercobilinogenul, urobilina i stercobilina. Reducerea bilirubinei se produce n intestin sub influena bacteriilor. O parte din urobilinoizi este reabsorbit i ajunge din nou la ficat prin vena port (circuitul hepatoenterohepatic al pigmenilor biliari). Cea mai mare parte este metabolizat, n timp ce 35-140 mg sunt excretate n urina de 24 de ore.

Identificarea urobilinoizilor urinari Reacia Ehrlich Principiu: n prezena p-dimetilaminobenzaldehidei n mediu puternic acid, urobilinogenul i stercobilinogenul dau o coloraie roie intens prin formarea unui compus chinoid. Reactivi: - Reactiv Ehrlich: se dizolv 2 g p-dimetilaminobenzaldehid n 100 ml HCl 20%. - Cloroform Mod de lucru: La 3 ml de urin se adaug 2-3 picturi reactiv Ehrlich. Se las n repaus un minut. Apariia unei coloraii roii intense la temperatura ambiant denot o eliminare crescut de urobilinogen. Colorantul se poate extrage n cloroform. Porfobilinogenul intermediar al sintezei hemului, care apare n urin n porfiria intermitent acut, d o coloraie asemntoare. El nu este ns solubil n cloroform. Dac dup agitare cu

161

cloroform

acesta

rmne

incolor,

reacia

pozitiv

se

datorete

prezenei

porfobilinogenului. Observaie: Urina de analizat trebuie s fie rece. n urina cald indolul eliberat n condiiile de reacie poate da i el culoare roie cu reactivul Ehrlich. Sulfamidele dau o coloraie galben care poate masca reacia bilinogenilor. Interpretare: Eliminarea crescut a urobilinoizilor apare n urmtoarele situaii: 1). Hemoliz exagerat: funcia hepatic este n general intact, dar posibilitile de glucuronoconjugare ale ficatului sunt depite. 2). Tulburarea funciei hepatice: ictere hepatocelulare, hepatite, ciroz sau intoxicaii chimice cu cloroform i n special cu tetraclorur de carbon. 3). Icter prin obstrucie, n stadiile precoce, de obstrucie incomplet. Identificarea sngelui n urin apare fie hemoglobina liber (hemoglobinurie), fie hematii (hematurie). Diferenierea se poate face numai prin examenul microscopic al sedimentului urinar, i anume n primul caz n sediment nu se observ hematii. Se folosete urina proaspt fiindc majoritatea testelor se bazeaz pe aciunea pseudoperoxidazic a hemoglobinei: leucoderivatul unui colorant (benzidina, fenolftalein redus n mediu alcalin, etc.) este oxidat cu ap oxigenat, n prezena hemoglobinei, n colorantul respectiv. ntruct leucocitele dau o reacie peroxidazic adevrat (enzimatic) este necesar s se fiarb urina cteva minute, dup acidularea prealabil cu acid acetic. Reacia cu benzidin Reactivi: - Sol. benzidin: 5 g benzidin se dizolv n 50 ml acid acetic glacial i se completeaz cu ap distilat la 1000 ml. - Ap oxigenat 3% Mod de lucru: Se iau 3 ml urin, 2-3 pic. sol. benzidin i 2 ml ap oxigenat 3%. Se agit, reacia pozitiv prezint o culoare albastr. Ordinea de adugare a reactivilor este esenial. Interpretare: Hematuria macroscopic (vizibil cu ochiul liber) apare n caz de: calculi renali, tumori renale sau ale cilor urinare (cancerul renal deseori are ca prim manifestare

162

hematuria), tuberculoz urogenital, traumatisme, chisturi renale, diatez hemoragic (sngerri multiple, n diferite esuturi), cistit hemoragic. Hematuria microscopic, deseori renal apare n caz de: calculi ureterali care produc leziuni ale mucoasei, pielonefrit, nefrit interstiial, n colagenoze (boli autoimune cu frecvent afectare renal), de nsoire n boli infecioase, efort fizic, glomerulonefrit (lezarea grav a filtrului glomerular face posibil traversarea lui de ctre hematii) .

Teste rapide de diagnostic din urin

Stripsurile pentru analiza urinei sunt plci de celuloid care conin mai multe benzi de hrtie impregnate cu reactivi. Parametri cei mai importani care se analizeaz sunt: densitatea, pH-ul, bilirubina, urobilinogenul, proteinele, glucoza, corpii cetonici, leucocitele, nitriii i sngele. Stripsul se introduce n proba de urin pentru cteva secunde, timp n care au loc reaciile corespunztoare. Culoarea se compar cu o scal de culori care arat aproximativ cantitatea de substane coninute, pH-ul, etc, sau se introduce stripsul ntr-un aparat special care citete rezultatele.

Test rapid de sarcin

Se bazeaz pe determinarea hormonului coriogonadotrop uman (hCG). Dac acesta se gsete n urin n cantitate mare (peste 800 U/l), testul este pozitiv, iar la valori sub 500 U/l testul este negativ. Principiul de determinare se bazeaz pe latexaglutinare, hemaglutinare, sau o metod imunoenzimatic, n funcie de testul folosit. La metoda de latexaglutinare elementele de latex ale plcii de reacie a kitului sunt acoperite cu hCG. Antiserul folosit conine anticorpi monoclonali specifici pentru beta-hCG. n caz pozitiv (dac este sarcin) hCG din urin n concentraie de peste 800 U/l se leag de anticorpii monoclonali ai antiserului, mpiedicnd astfel aglutinarea elementelor de latex acoperite cu anticorpi. n caz negativ, dac nivelul hCG n urin este sub 500 U/l, atunci hCG de pe suprafaa elementelor de latex se poate lega de anticorpii monoclonali cu locusurile de legare libere, astfel se produce aglutinarea. n cadrul metodei imunoenzimatice n prima etap se adaug ntr-o eprubet proba de urin la anticorpul anti-hCG legat de o enzim, apoi acest amestec este pus pe o plac de reacie. Dac proba conine hCG, acesta se leag de anticorpul monoclonal i complexul se leag de un alt anticorp (anti-hCG) legat de placa de reacie. n a doua

163

etap se adaug un substrat care este transformat de ctre enzima din complex ntr-un compus colorat. Aceast reacie este foarte sensibil, fiind pozitiv peste valoarea de 25 U/l hCG.

Analiza de laborator a urinei

Analiza de rutina evideniaz: Aspect: clar. Cilindri: abseni, eventual prezena cilindrilor hialini. Culoare: galben pai. Cristale: prezente. Celule epiteliale: absente. Miros: uor aromatic. pH: 4,5-8,0. Densitate: 1,025-1,030g/cm3. Glucide: absente. Hematii: 2-3/cmp vizual. Leucocite: 0-4/cmp vizual. Proba de concentrare pune n eviden: Densitatea: 1,025-1,032g/cm3. Osmolaritatea: > 800 mOsm/kg ap Proba de diluie pune n eviden: Densitatea: < 1,003. Osmolaritatea: < 100 mOsm/kg ap.

Determinri n urina din 24 de ore.

Dozarea clorurilor din urin (metoda Mohr) Principiu. Azotatul de argint precipit cantitativ ionul clor din urin sub form de clorur de argint, iar excesul de azotat de argint d cu cromatul de potasiu folosit ca indicator, cromat de argint de culoare roie, care indic sfritul reaciei. NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 K2CrO4 + 2AgNO3 Ag2CrO4 + 2KNO3 Reactivi: - soluie de acid acetic 10% ; - carbonat de calciu pulbere ; - soluie cromat de potasiu10%; - soluie azotat de argint 0,1N. Modul de lucru: ntr-un vas Erlenmeyer se pipeteaz 10 ml urin de analizat, se adaug 5 picturi din soluia de acid acetic 10% pentru a dizolva precipitatul de fosfai neutri care ar mpiedica observarea sfritului reaciei i 1 g de carbonat de calciu pulbere pentru neutralizarea complet a amestecului deoarece cromatul de argint care se formeaz i care indic sfritul reaciei este solubil n mediu acid. 164

La acest amestec se mai adaug 50 ml de ap distilat i 5-6 picturi din soluia de cromat de potasiu. Se titreaz cu soluia de azotat de argint 0,1 N pn la apariia unei coloraii rou-crmiziu a precipitatului. Calcularea rezultatelor 1 ml AgNO3 0,1 N corespunde la 0,00585 g NaCl g/l NaCl = n x 0,00585 x 100 n = ml soluie AgNO3, 0,l N folosii la titrare. Variaii patologice Rezultatul se poate raporta la cantitatea de urin emis n 24 de ore. n mod normal urina din 24 de ore conine 9-12 g NaCl. - valori crescute: regim hiperclorurat, insuficien suprarenal, nefropatii tubulare sau interstiiale: - valori sczute: retenii tisulare, nefrite, transpiraii excesive, vom, maladii cardiace, diet fr sare. Persoana la care se face analiza clorurilor n urin nu trebuie ca naintea analizei s consume bromuri sau ioduri, deoarece i acestea precipit cu azotatul de argint i rezultatele nu vor fi concludente. Analiza chimic a urinei evideniaz: - Amilaz: 10-80 UI/or - 17 cetosteroizi: - Clearance de creatinin: - brbai: 6-21 mg/24 ore - femei: 4-17 mg/24 ore - brbai (20 ani): 90 ml/min/1,73 m2 - femei (20 ani): 84 ml/min/1,73 m2 - Proteine: < 150 mg/24 ore. Acid uric: 250-750 mg/24 ore. Glucozoxidaz: negativ. Corpi cetonici: negativ - Calciu: - brbai: < 275 mg/24 ore - femei: < 250 mg/24 ore - Fosfat: < 1000 mg/24 ore. Sodiu: 30-290 mEq/24 ore. Clor: 110-250 mEq/24 ore Dozarea acidului uric din urin Recoltarea urinii de 24 ore se face ntr-un recipient de sticl cu 10 ml NaOH 5% pentru a preveni precipitarea urailor. Modul de lucru: n loc de 2 ml filtrat se lucreaz cu 2 ml urin diluat 1:100. 165

Calcul: Ep/Es x 100 x 15 = mg acid uric/1500 ml urin (pe 24 de ore) Valori normale: 0,25 - 1,00 g acid uric eliminat/24 h Valori crescute: n gut (dup puseuri), tumori maligne Valori sczute: n gut (nainte si n cursul puseurilor), boli renale Dozarea creatininei din urin Principiu i reactivii: acelai ca pentru ser Modul de lucru: Se dilueaz urina de 50 ori. Din aceast soluie se pipeteaz 1,5 ml, se adaug 4,5 ml acid picric saturat i se introduce vasul pentru 15-20 secunde n baie de ap fierbinte. Dac soluia rmne limpede, dup rcire se scot 5 ml de prob la care se adaug 0,25 ml NaOH 10%. Dup 15 minute se citete extincia probei fa de martor la 530 nm. Martorul va conine 2 ml de ap bidistilat, 6 ml acid picric saturat i 0,25 ml NaOH 10%. n paralel se execut aceleai operaii folosind n locul urinei diluate o soluie standard de creatinin de concentraie cS = 10 g/ml pentru care se obine extincia Es. Calcul:
mgcreatinin = E urin 1 cS 50 ES 1000

Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal

Pornind de la faptul c constituenii urinii provin din snge, cunoscnd cantitatea lor n snge i n urin, putem calcula volumul de snge epurat de aceste substane. Pentru orice substan din snge, care se elimin n urin, putem scrie formula: m p = mu unde: mp = cantitatea absolut a substanei dintr-un volum de plasm care va fi epurat de aceea substan. mu = cantitatea absolut a substanei ajunse prin epurare n urin. mp = Vp cp/100. mu = Vu cu/100. Vp cp = Vu cu cp, cu = concentraiile plasmatic i urinar a substanei. Vu = volumul de urin eliminat n ml/min. Vp = C (clearance = coeficient de epurare) = acel volum virtual de plasm care este epurat ntr-un minut de aceast substan (ml/min) pe cale renal. Deci

166

coeficientul de epurare este exprimat prin raportul dintre debitul urinar al unei substane pe minut i concentraia sa n plasm: cu C = ---- Vu cp La nivelul nefronului au loc 3 procese importante: filtrarea glomerular, reabsorbia tubular i secreia tubular. Clearance-ul este egal cu volumul filtrrii glomerulare pe minut n cazul substanelor care se filtreaz liber, adic nu sunt reabsorbite i secretate la nivel tubular, nu se transform, nu se depoziteaz, nu influeneaz funcia renal, nu sunt toxice. Astfel de substane pot fi endogene (creatinin) i exogene (inulin, manitol-polizaharide cu mas molecular mare etc.). Astfel determinarea clearance-ului de creatinin endogen permite explorarea filtrrii glomerulare. Clearance-ul de creatinin endogen este egal cu 120 ml/min pentru o suprafa corporal medie de 1,7 m2 i o greutate medie de 70 kg. Fiecare substan din plasm are un coeficient de epurare indiferent de concentraia sa n urin. Majoritatea constituenilor obinuii ai urinei au un coeficient de epurare mai mic de 120 ml/min, datorit reabsorbiei tubulare pariale sau totale (de ex. Cglucoz = 0). O alt categorie de substane au un clearance superior filtratului glomerular, deoarece ele ajung n urina final i printr-un proces de secreie tubular. Determinarea clearance-ului de creatinin permite deci explorarea capacitii de filtrare glomerular. Calcul: Calculul clearence-lui de creatinin (C) se poate face cu urmtoarea formul C = Eurin/Eser 50 1500/24 60 unde: Eurin i Eser sunt extinciile optice citite pentru probele de urin, respectiv ser n metodele de dozare descrise la pag. 121. Valori normale: 80-120 ml/min

Analiza calculilor urinari

Calculii urinari se formeaz prin precipitarea unor substane organice i anorganice des ntlnite n sedimentul urinar: oxalat de calciu, acid uric, urai, fosfai de calciu i magneziu, xantina, colesterolul. Acestea se depun sub form de straturi

167

alternante n jurul unui nucleu sau sunt amestecate intim. Calculi omogeni se ntlnesc rar. Identificarea unor componeni prin reacii specifice: 1) CO32-: Pulberea de calcul urinar se dizolv cu efervescen n soluie de HCl 2N la cald. 2) PO43-: ntr-o eprubet se introduce un vrf de cuit de pulbere de calcul, se adaug cteva picturi de HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) i 1-2 ml soluie de molibdat de amoniu 5%. Se nclzete i se las n repaus. Apariia unei coloraii sau precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu indic prezena fosfatului. 3) (COO)22-: ntr-o eprubet se introduc un vrf de cuit de pulbere de calcul, 1 ml H2SO4 5% i 2 picturi KMnO4 1%o. Se nclzete eprubeta. Dac oxalatul este prezent, va reduce KMnO4 producnd decolorarea soluiei. 4) Cistin: ntr-o eprubet se introduc un vrf de cuit de pulbere, 1 ml soluie de NaOH 10% i 2-3 picturi soluie de Pb(CH3COO)2 saturat. Eprubeta se nclzete la fierbere 1-2 minute. Prezena cistinei duce la formarea PbS (precipitat negru). 5) Urat (reacia murexidului): ntr-o capsul de porelan se introduce un vrf de cuit de pulbere care apoi se umecteaz cu 2-3 picturi HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml) i se evapor pe flacr la sec. Apariia unei culori roii indic formarea acidului purpuric prin oxidarea acidului uric de ctre HNO3. Adugnd o pictur de soluie NH3 25% i o pictur soluie NaOH 10% apare o culoare violet datorit murexidului (purpurat de amoniu). 6) Xantina: Se face reacia cu HNO3 concentrat ca i n cazul evidenierii uratului. Prezena xantinei determin un reziduu galben care nu-i schimb culoarea la adugarea soluiei de NaOH. Adugnd soluie de NH3 culoarea vireaz spre rou. 7) Colesterolul: (reacia Liebermann-Burchardt): ntr-o eprubet se introduc 1 vrf de cuit de pulbere, 1 ml cloroform, 4 picturi H2SO4 concentrat (d = 1,92 g/ml) i 2 picturi anhidrid acetic. Prezena colesterolului determin formarea dicolestendienei de culoare ce variaz de la roz la verde, extractibil n cloroform. Calculii urinari apar n litiaza urinar cu urmtoarea frecven relativ: Oxalat de Ca 34,2%. Oxalat de Ca + fosfat de Ca 26,2%. Acid uric 18,8%. Fosfat de Ca 9,7%. Oxalat de Ca + acid uric 4,5%. Fosfat amoniaco-magnezian 2,2%. Carbonat de Ca 2,2%. Cistin 1,7%. 168

Analiza salivei
Identificarea unor componeni ai salivei

Saliva reprezint produsul de secreie al glandelor salivare. Este un lichid incolor, transparent, insipid, avnd densitatea ntre 1,002-1,006g/cm3 i pH n jur de 6,8 n momentul secreiei, devenind mai alcalin n timpul masticaiei.Volumul salivar mediu zilnic este de aproximativ 800 ml. Compoziia salivei difer n funcie de urmtorii factori: perioada de zi n care se face recoltarea; nainte sau dup mese; alimentele consumate; igiena bucal; stimulul aplicat la recoltare. Compoziia chimic a salivei este urmtoare: ap: 99,4% substane anorganice 0,2%: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, Cl-, SCN-, PO42substane organice 0,4%: proteine, enzime salivare (amilaz, lizozim), mucine (glicoproteine), micromolecule azotate (uree, creatin, etc.), micromolecule neazotate (acid lactic, acid citric). Reactivi: - CH3COOH 5%. - NaOH 5%. - Reactivul biuret - Soluia A: 4,5 g tartrat de sodiu i potasiu se dizolv n 40 ml NaOH 0,2 N. Se adaug sub agitare 1,5 g CuSO45H2O dizolvat n 10 ml ap, apoi se adaug 0,5 g KI i se completeaz cu NaOH 0,2 N pn la 100 ml. Se conserv n sticl brun timp nelimitat. - Soluia B: se dizolv 5 g KI n 1000 ml de NaOH 0,2 N. Se conserv timp nelimitat, n sticla brun. - Soluia de lucru: se dizolv 1 volum soluie A cu 4 volume soluie B. Se poate utiliza o sptmn, pstrndu-se n sticl brun. - HCl 5%. - Na2CO3 20%. - Reactivul Benedict ( 173 g citrat de sodiu i 100 g carbonat de sodiu anhidru se dizolv n 800 ml ap distilat fierbinte, se filtreaz i se aduce volumul la 850 ml. Se dizolv apoi separat 17,3 g sulfat de cupru cristalizat n 100 ml

169

ap distilat, se adaug sub agitare n prima soluie i se completeaz volumul soluiei finale la 1000 ml. - HNO3 5%. - AgNO3 5%. - HNO3 concentrat. - (NH4)2MoO4 5%. - BaCl2 5%. - (COO NH4)2 5%. - FeCl3 5% Identificarea mucinei: Mucinele au ca grupare prostetic compui din clasa glucidelor ce deriv de la aminozaharuri. a) Precipitarea mucinei: la 5 ml saliv se adaug 1 ml acid acetic 5%. Mucina precipit, se filtreaz. Filtratul se pstreaz pentru identificarea altor componeni, iar din precipitat se pune n eviden partea proteic i cea glucidica a mucinei. b) Identificarea prii proteice: o parte a precipitatului se dizolv n 1 ml NaOH 5% i se adaug 1 ml din reactivul biuret. Datorit componentei proteice se formeaz complexul de culoare violet. c) Identificarea prii glucidice: partea ce rmne din precipitat se fierbe cteva minute n 5 ml HCl 5%. Se rcete, se alcalinizeaz cu Na 2CO3 20% i se efectueaz reacia Benedict. Reacia va fi pozitiv datorit apariiei glucidelor reductoare n urma hidrolizei prii glucidice. Identificarea Cl-: La poriunea de filtrat de saliv (lipsit de mucin) se adaug HNO3 5% AgNO3 5%. Formarea unui precipitat alb de clorur de argint indica prezena ionilor ClIdentificarea PO43-: Filtratul de saliv se aciduleaz cu HNO3 conc., se adaug cteva picturi de molibdat de amoniu 5% i se nclzete. Prezena ionilor de PO43este indicat prin apariia unui percipitat galben sau o coloraie galben. Identificarea SO42-: Se aciduleaz filtratul de saliv cu HCl 5% i se aduga BaCl2 5%. n prezena ionilor SO42- apare un precipitat alb de sulfat de bariu. Identificarea Ca2+: Se adaug la filtratul de saliv oxalat de amoniu 5%. n prezena ionului de Ca2+ apare un precipitat alb de oxalat de calciu.

170

Identificarea SCN-: La filtratul de saliv se adaug 1-2 picturi de HCl 5% i 12 picturi FeCl3 5%. n prezena ionilor de SCN- se formeaz Fe(SCN)3 de culoare roie. La fumtori, n general, concentraia ionului SCN- este mai mare ca la nefumtori. Determinarea pH-ului i a capacitii tampon a salivei Determinarea pH-ului: Se face cu hrtie de indicator universal sau mai exact prin metoda electrometric. n mod normal, pH-ul salivei (saliv proaspt) este de 6,5-7,0 deci neutru. Scderea pH-ului salivei (pn la valori slab acide 6,0), ca i creterea (pn la valori slab bazice 7,9) poate aprea n anumite stri fiziologice - scderi n timpul nopii - scderi dup mese - scderi la gravide ct i n unele stri patologice - tulburri sanguine acido-bazice - leziuni ale cavitii bucale n timpul pstrrii salivei recoltate, pH-ul iniial neutru devine alcalin, din cauza pierderii de CO2. Determinarea capacitii tampon: Principiu: Saliva dispune de un important efect tampon exercitat de urmtoarele sisteme tampon: dicarbonat, fosfat i protein (mucin) Capacitatea sistemelor tampon se exprim prin numrul de echivaleni de acid sau baz care schimb pH-ul unui litru de soluie tampon cu o unitate. n scopuri practice capacitatea poate fi exprimat i prin numrul mililitrilor de acid sau baz de concentraie cunoscut, tamponate de un anumit volum de soluie tampon. Reactivi: - HCl 0,01 N; - NaOH 0,01 N; - Metilorange (soluie de indicator) 0,1%; - Fenolftalein (soluie de indicator) 0,1% n alcool.

Modul de lucru: 6 ml saliv se dilueaz cu 14 ml ap distilat. Saliva diluat se mparte n dou probe de cte 10 ml. ntr-una din probe se pune 3 picturi de metilorange, iar n cealalt 3 picturi de fenolftalein. Cu ajutorul microbiuretei se adaug primei probe HCl N/100

171

iar celei de-a doua prob NaOH N/100, pn la virajul indicatorilor. Se noteaz volumul de HCl N/100 i de NaOH N/100 consumate. Aceste volume se nmulesc cu factorii soluiilor respective i se raporteaz la 1000 ml saliv.

Analiza sucului gastric

Determinarea aciditii gastrice
Sucul gastric provine din secreia unui mare i variat numr de celule ale mucoasei gastrice. Zona glandelor fundice elaboreaz secreia primar acid (secreie parietal) care este de fapt o soluie apoas de acid clorhidric. Zona antropiloric elaboreaz secreia primar alcalin (secreia neparietal), care este un amestec de proteine, mucus, ioni de sodiu, potasiu, calciu, clorur i bicarbonat. Secreia alcalin are rolul de a reduce aciditatea gastric prin neutralizare i diluie. Sucul gastric rezult deci din amestecul celor dou secreii parietale i neparietale din care rezult lichidul intens acidulat (pH = 1-2). Principiu: n laborator se determin aciditatea total, liber i legat. Aciditatea liber reprezint concentraia ionilor de hidroniu provenii din acidul clorhidric liber. Aciditatea legat reprezint concentraia ionilor de hidroniu legai de proteine, fosfai acizi, acizi carboxilici i alte substane. Aciditatea total este dat de nsumarea celor dou aciditi (liber i legat) i se poate defini ca fiind suma ionilor de hidroniu titrabili cu NaOH 0,1 N.

Sucul gastric filtrat se titreaz cu NaOH 0,1 N n prezen de indicator Tpfer. 172

Figura red curba de titrare (variaia pH-ului n funcie de NaOH 0,1N adugat) n cazul unui suc gastric normal. Indicatorul Tpfer este un indicator universal preparat din pdietilaminoazobenzen i fenolftalein. n tabel este prezentat virajul indicatorului Tpfer n funcie de pH (vezi curba de titrare de mai sus). Indicator Tpfer p-dimetilaminoazobenzen fenolftalein Reactivi: pH 0 - 2,9 2,9 - 4,1 4,1 - 14 0-8 8 - 10 10 - 14 Culoarea rou portocaliu galben incolor roz rou

- Indicatorul Tpfer : p-dimetilaminoazobenzen 0,25 g fenolftalein alcool etilic 96%. - Sol. NaOH 0,1 N cu factorul FNaOH 2g 100 ml

Modul de lucru: n trei flacoane Erlenmeyer de 100 ml se msoar cte 10 ml suc gastric i se adaug 1-2 picturi de indicator Tpfer. Soluia se titreaz cu NaOH 0,1 N pn la portocaliu i se noteaz cantitatea de NaOH 0,1 N folosit. Aceast cantitate reprezint volumul folosit pentru dozarea aciditii libere i se noteaz cu v. Se continu titrarea trecnd prin culoarea galben pn la apariia culorii roii. Totalul mililitrilor de NaOH 0,1 N consumai de la nceputul titrrii se noteaz cu v' i vor fi luai n considerare pentru calculul aciditii totale. Calcul: Rezultatul se exprim n uniti clinice (UC, numrul de ml de NaOH 0,1 N folosii la titrarea a 100 ml suc gastric).

FNaOH 10 UC aciditatea total = v' FNaOH 10 UC

aciditatea liber = v Valoarea aciditii legat se obine fcnd diferena dintre aciditatea total i cea liber. Valori normale: aciditatea liber = 30 UC; aciditatea total = 50 UC. Valori patologice: Valori crescute: Hiperaciditate se ntlnete n stri de stres (stimulul simpatic induce creterea secreiei de HCl n mucoasa gastric), n gastrite hiperacide, ulcer

173

gastric i duodenal. n tumori pancreatice secretoare de gastrin (gastrinoame), se produc ulceraii multiple datorit hiperstimulrii secreiei de HCl de ctre gastrin (sindromul Zollinger-Ellison). Valori sczute: Hipoaciditatea apare n unele tipuri de gastrit. Aclorhidria, lipsa total de HCl se datoreaz atrofiei mucoasei gastrice sau proliferrii ei tumorale (celulele canceroase i pierd funciile fiziologice). O stare i mai grav este aclorhidria histamino-refractar, cnd nici la stimulare cu histamin nu se secret HCl. n afar de HCl, celulele parietale ale mucoasei gastrice mai secret i o glicoprotein numit factor extrinsec care leag vitamina B12 i o transport la celulele intestinale pentru a se absorbi. n cazul atrofiei mucoasei sau proliferrii ei canceroase, nu se secret acest factor intrinsec i apare anemia pernicioas (prin deficitul de absorbie a vitaminei B12).

Analiza lichidului cefalorahidian

Componentele lichidului cefalorahidian (LCR) provin din plasm prin difuzie liber i printr-un proces de secreie. Aceasta se observ comparnd compoziia chimic a lichidului cefalorahidian cu aceea a plasmei: Componente sodiu potasiu calciu magneziu ClHCO3HPO42SO42proteine uree acid uric glucide reductoare bilirubin acizi organici LCR (mg%) 325 10 5 3 449 40 2 0,5 30 24 0,5-2,6 72 0,2 urme Plasm (mg%) 325 20 10 3 360 60 1 1 7000 30 4 90 0,8 urme

Recoltarea lichidului cefalorahidian se face prin puncie lombar, suboccipital sau ventricular, n eprubete perfect curate i sterilizate. Dup recoltare, n primul rnd se efectueaz examenul microbiologic i citologic, iar restul probei se folosete pentru examenele fizice i chimice.

174

Examenul fizic
Culoarea: LCR normal este incolor i limpede. n unele afeciuni este colorat n galben, roz sau verzui. Aceast culoare se datoreaz prezenei bilirubinei sau biliverdinei i este indiciul unei hemoragii la nivelul sistemului nervos central. LCR poate fi colorat n rou datorit sngelui care poate proveni fie n mod accidental datorit unei puncii greit efectuate, fie datorit unei afeciuni. Transparena: n mod normal, LCR este transparent. n unele afeciuni poate fi opalescent datorit prezenei n cantitate mare a leucocitelor, albuminei sau microorganismelor. LCR este tulbure n meningitele purulente. Un aspect particular l prezint n cazul meningitei tuberculoase cnd probele vor forma o pelicul de fibrin la suprafa. Densitatea: Densitatea normal a LCR este foarte apropiat de aceea a apei: 1,006-1,008 g/cm3. Densitatea crete n unele afeciuni patologice. Ea se determin cu areometre speciale de dimensiuni mici.

Examenul chimic al lichidului cefalorahidian

Examenul chimic se face numai pe un LCR centrifugat. Cele mai frecvente determinri care se efectueaz pe lichidul cefalorahidian i care prezint interes pentru diagnostic sunt: determinarea proteinelor, a glucozei, a clorurilor, al ureei, a permeabilitii fa de nitrai (aceast reacie este utilizat pentru decelarea unei permeabiliti menigiene alterate). Dintre aceste metode vom descrie doar o metod de determinare orientativ a hipo- i hiperglicorahiei. Cercetarea hipo- i hiperglicorahiei: Principiu: Alegnd n mod convenabil diluiile LCR i ale reactivului Fehling se poate obine o reducere uoar sau nul a reactivului. La aceste diluii LCR cu concentraii sczute, normale i crescute de glucoz se comport diferit.

Modul de lucru: n dou eprubete (I pentru cercetarea hipoglicorahiei i II pentru cercetarea hiperglicorahiei) se msoar:

175

L.C.R. ml H2O dist. ml Reactiv Fehling ml Fierbere 5 minute n baie de ap

I 2,0 0,2

II 0,6 2,0 1,0

Interpretarea: - I i II negativ (albastru) - hipoglicorahie - I negativ (albastru) i II pozitiv (rou) - normoglicorahie - I i II pozitiv (rou) - hiperglicorahie Dozarea glucozei din LCR se poate efectua prin metoda enzimatic cu glucozo-oxidaz. Valorile fiziologice ale glicorahiei: 55-70 mg/100 ml, sunt valoari cuprinse ntre jumtate i 2/3 din glicemie. Acest raport, n cazuri normale, rmne constant, iar variaiile glicorahiei sunt aceleai cu ale glicemiei. Valori patologice: Valori crescute numai pentru glicorahie se ntlnesc n tumori, encefalite, abcese cerebrale. Glicorahia scade mult n meningita tuberculoas.

Analiza scaunului
Identificarea sngelui din scaun (Proba Gregersen) Reactivi: acid acetic glacial; Mod de lucru: Se zdrobete o bucat din scaunul de analizat cu puin ap, se adaug acid acetic glacial (raport 2:1) i se agit cu cantitate egal de eter ntr-o plnie de agitare. Dup scurgerea fazei apoase (inferioare) se lucreaz mai departe cu faza eteric (superioar): se adaug cteva picturi de soluie de H2O2 la 2 ml soluie de benzidin i n aceast soluie punem o cantitate din extractul obinut. n caz pozitiv proba se va colora n verde. Identificarea se poate efectua i fr etapa de extracie eteric. Se toarn un amestec de soluie de benzidin n acid acetic glacial cu ap oxigenat peste scaunul de analizat. Lichidul care se scurge de pe prob este verde n caz de prezen a sngelui. eter etilic; H2O2 10%. soluie de benzidin 2% n acid acetic glacial.

176

Aceast analiz se efectueaz dup trei zile de regim strict: pacientul trebuie s evite carnea i alimentele bogate n clorofil, deoarece aceast prob este pozitiv i n cazul prezenei mioglobinei i clorofilei. Exist i un test specific care identific doar hemoglobina uman din scaun prin latexaglutinare. Acest test imunologic nu necesit diet special. Patologie: Sngele apare n scaun cel mai frecvent datorit lezrii hemoroizilor n timpul defecrii. Tumorile colonului (benigne i maligne) pot determina o sngerare de obicei ocult (invizibil cu ochiul liber), care se poate decela cu aceast prob. Uneori chiar sngerrile gastrice se pot exterioriza pe cale fecal prin snge proaspt (cnd tranzitul intestinal este accelerat sngele nu are timp s fie digerat), dar cel mai frecvent n caz de hemoragie digestiv superioar apare melena (scaun negru, ca pcura). Semnele de malabsorbie/maldigestie n scaun Evidenierea glucidelor din scaun - n scaun pot apare glucide reductoare (glucoz, fructoz, lactoz) detectabile cu reaciile Benedict, Barfoed, etc. (v. cap. Analiza glucidelor). Aceste glucide sunt eliminate prin scaune diareice n caz de malabsorbie glucidic. - Se pot detecta i polizaharidele nedigerate din materiile fecale. Mod de lucru: Se adaug cteva picturi de soluie Lugol (cu coninut de iod) la scaunul proaspt eliminat. Amidonul nedigerat d o coloraie albastr cu iodul, iar n caz de digestie incomplet compuii intermediari de degradare (dextrinele) dau o coloraie roie. Patologie: n cazul secreiei deficitare de amilaz pancreatic apar amidonul i dextrinele n materiile fecale. Evidenierea lipidelor din scaun n condiii normale materiile fecale conin o cantitate foarte mic de lipide. Dac crete aceast cantitate (steatoree), scaunul capt un luciu caracteristic i, prin amestecarea fecalelor cu ap, apar pete de grsime pe suprafaa apei. Mod de lucru: Scaunul proaspt eliminat se coloreaz cu Sudan III (rou Sudan). Cu acest colorant se pot evidenia lipidele nedigerate, deoarece trigliceridele i esterii colesterolului se coloreaz n rou.

177

Patologie: n scaun apar lipide nedigerate n secreia insuficient de lipaz pancreatic i n deficitul de acizi biliari datorat obstruciei cailor biliare sau incapacitii hepatice de secreie a acestora, stri care au consecin malabsorbia lipidic. Evidenierea proteinelor din scaun Mod de lucru: Se examineaz la microscop preparatul nativ (fr coloraie) al probei de scaun. Se pot recunoate uor mai ales fibrele musculare nedigerate, care arat deficitul digestiei proteice. Patologie: Maldigestia proteic este datorat secreiei insuficiente de proteaze pancreatice.

Metode fizice de analiz folosite n laborator

Fotometria
Principiu: Fotometria se bazeaz pe excitarea luminoas a electronilor moleculelor substanei. Dup lungimea de und, exprimat n nanometri (nm) sau n ngstrmi (), spectrul undelor electromagnetice folosite n fotometrie se mparte n 3 regiuni: - ultraviolet - vizibil - infrarou 200 - 450 nm, 400 - 800 nm, 800 - 20000 nm,

Metoda spectrofotometric de analiz se bazeaz pe determinarea extinciei unui strat de soluie colorat cu grosimea de 1 cm, la diferite lungimi de und Pentru obinerea radiaiilor de diferite lungimi de und spectrofotometrele conin trei tipuri de monocromaoare: prisme, reele de difracie sau filtre. Lungimile de und corespunztoare diferitelor culori sunt redate n tabelul de mai jos:

178

Culoarea Violet Albastru Verde Galben Portocaliu Rou

Domeniul lungimilor de und 400 - 450 nm 450 - 500 nm 500 - 570 nm 570 - 590 nm 590 - 620 nm 620 - 760 nm

Efectuarea analizelor prin metoda colorimetric prezint avantajul c necesit cantiti mici de substan i un timp relativ redus n comparaie cu analizele chimice. Legea Bouguer-Lambert-Beer, lege fundamental a colorimetriei n condiii similare, straturile de substan colorat de aceeai grosime absorb aceeai cantitate de lumin incident, absorbie ce se exprim matematic prin ecuaia:
I = I 0 e K l

n care I este intensitatea fluxului luminos dup trecerea prin soluie; I0 - intensitatea fluxului luminos incident; e - baza logaritmilor naturali; l - grosimea stratului; K coeficient de absorbie optic. Dac se ia ca baz zecimal de logaritmare, rezult ecuaia: I = I0 10 kl Din aceast ecuaie, n care coeficientul k reprezint coeficientul de extincie, rezult c: a. Raportul ntre intensitatea luminii care a trecut prin stratul de soluie i intensitatea luminii incidente nu depinde de intensitatea absolut a luminii incidente. b. Cnd grosimea stratului de soluie se mrete n progresie aritmetic, intensitatea luminii care trece prin aceasta descrete n progresie geometric. c. Coeficientul de extincie k, depinde numai de natura substanei dizolvate i lungimea de und a luminii incidente i este valabil numai pentru lumin monocromatic. Aceast lege a fost stabilit de ctre P.Bouguer i I.Lambert. Beer a stabilit c, coeficientul de extincie k este liniar proporional cu concentraia substanei absorbante, adic : k= C n care C este concentraia substanei colorate iar este un coeficient care nu depinde de concentraie. Legea lui Beer stabilete dependena absorbiei luminii de ctre stratul cu grosime constant de concentraia substanei colorante. Din ultimele dou ecuaii rezult ecuaia legii fundamentale a colorimetriei legea Bouguer-Lambert-Beer: 179

I = I0 10

Cl

Raportul dintre intensitatea luminii, I, care a trecut printr-o soluie i intensitatea luminii incidente, I0, poart denumirea de transparen sau transmisie i se noteaz cu litera T: T = I/I0 = 10
Cl

Valoarea T pentru un strat de 1 cm grosime se numete coeficient de transmisie. Logaritmul mrimii inverse transmisiei se numete extincie, E, sau densitate optic, D.O.: E = D.O. = lg 1/T = lg I0/I = concentraia substanei colorate din soluie. Spectrofotometru Spekol Spectrofotometrul Spekol const dintr-un monocromator, care este o reea de difracie, un fotoelement i echipamentul de msurarea fotocurentului (amplificator + galvanometru). Lumina emis de sursa (1) dup colimare cade pe reeaua de difracie optic reflectant (2) i formeaz spectrul de difracie care, n planul fantei de ieire (3), se poate plimba cu ajutorul dispozitivului micrometric (4), gradat n nm ce corespund lungimii de und a luminii emergente. Aceasta trece prin cuva (5, 5') ce conine lichidul de msurat i cade pe fotoelementul (6). Fotocurentul obinut este amplificat de amplificatorul (7) i este indicat de instrumentul (8). Calea luminii monocromatice se poate deschide sau nchide cu ajutorul obturatorului (9). Cuvele cu soluia de compensare i cea de msurat se pot introduce alternativ n calea luminii cu ajutorul port-cuvei glisante (10). Punctul 0 i sensibilitatea amplificatorului se regleaz cu butoanele 0 i 100. Aparatul se alimenteaz de la reea prin transformatorul (11). Cl Din aceast ecuaie rezult c extincia E este liniar proporional cu

180

Schema de principiu al unui spectrofotometru

Spectrofotometru Spekol ndreptar pentru folosirea aparatului 1) 2) 3) 4) 5) 6) Se verific dac maneta obturatorului (9) se gsete n poziia 0. Aparatul se conecteaz la reea cu ajutorul ntreruptorului (12). Se ateapt Se alege lungimea de und prevzut n metod prin rotirea tamburului Se aeaz cuvele n glisorul (10). Cuva cu proba martor se va muta n dreptul fantei. Acul galvanometrului se aduce n poziia 0 pe scara inferioar cu ajutorul

aproximativ 10 min. pn la prima citire. micrometrului (4).

butonului 0. Pentru a evita eroarea de paralax, capul se aduce n poziia n care acul i imaginea lui n oglinda instrumentului se suprapun.

181

7) 8) 9)

Obturatorul se va aduce n poziia I (deschis). Indicatorul galvanometrului se Cu ajutorul butonului 100 acul galvanometrului se potrivete la diviziunea Se nchide fanta (obturatorul n poziia 0). Acul indicator trebuie s revin la

va mica spre dreapta. 100 a scrii inferioare. poziia 0. n caz contrar se repet operaiile de la punctul 6-9. 10) Se va muta proba n faa fantei i se deschide obturatorul. 11) Se citete extincia (E) pe scara superioar. Se apreciaz i fraciunile de diviziune. 12) Se nchide obturatorul. Recomandri: Fotoelementul i pierde din sensibilitate dac este expus luminii timp ndelungat. De aceea timpul de iluminare a fotoelementului va fi redus la minimul posibil. Pentru a evita spargerea cuvelor se va lucra cu ele exclusiv deasupra mesei, la mic nlime. Suprafeele optice ale cuvelor trebuie s fie perfect curate, de aceea se va evita atingerea pereilor transpareni. Umplerea cuvei se va face innd cuva nclinat la aproximativ 45 i turnnd lichidul pn la circa 2/3 din nlime. Cuva se va goli prin rsturnare brusc n poziia cu gura n jos i pstrnd aceast poziie se va aeza pe o hrtie de filtru curat. Dup folosirea cuvelor se spal cu ap distilat i se aeaz cu gura n jos pe o hrtie curat.

Spectrofotometrul de absorbie atomic

Principiu: O parte din atomii speciei ce urmeaz a fi analizai sunt excitai n fllacr la un nivel energetic superior emind apoi prin revenirea la nivelul iniial o radiaie corespunztoare liniei de rezonan. Dar majoritatea atomilor rmn n starea fundamental. n spectroscopia de absorbie atomic se trece prin flacr o radiaie avnd frecvena liniei de rezonan. Atomii rmai n starea fundamental absorb 182

aceast radiaie (pe care ar emite-o dac ar fi excitai) i absorbia este proporional cu concentraia atomilor n flacr i grosimea stratului strbtut de radiaia monocromatic. Spectrofotometrul de absorbie atomic Spectrofotometrul de absorbie atomic se compune din: 1. Sursa de radiaie care emite linia de rezonan a elementului de determinat. Emisia lmpii este modulat pentru ca detectorul s nregistreze doar lumina emis de lamp nu i cea emis din flacr (de ctre atomii excitai). Se folosesc n general lmpi de, descrcare cu catod tubular. Catodul trebuie s fie fcut din elementul pe care vrem s-l determinm. Sunt i lmpi care au catozi fcui din aliaje astfel c pot fi folosite pentru determinarea tuturor elementelor din care este fcut aliajul. 2. Atomizorul are rolul de a trece elementul de analizat sub form de atomi. Se folosesc atomizoare de flacr sau cu cuptor de grafit. a) Atomizoarele de flacr sunt alimentate cu amestecuri de gaze cum ar fi: aer-acetilen; aer-hidrogen; aer-propan; N2O-acetilen etc. Proba de analizat este introdus n atomizor prin aspirare i pulverizare. b) Atomizorul cu cuptor de grafit este nclzit cu curent electric dup un program reglabil. Pentru a feri cuptorul (tubul de grafit), de ardere se folosesc gaze de protecie. n general, ca gaz de protecie se folosete argonul sau azotul. La aparatele dotate cu atomizor cu cuptor de grafit se pot analiza probe lichide sau solide. Probele lichide se introduc cu ajutorul unor seringi iar probele solide cu ajutorul unor pensete. 3. Monocromatorul izoleaz linia de rezonan i o focalizeaz asupra detectorului. 4. Fotomultiplicatorul detecteaz i amplific intensitatea luminii care cade asupra sa. Practic, aparatul este ajustat la extincia zero cnd o soluie martor este vaporizat n prob i lumina lmpii ajunge la fotomultiplicator. Cnd se introduc soluii coninnd specii absorbante o parte din lumin este absorbit i rezult o diminuare a intensitii luminii ce ajunge la fotomultiplicator. Se determin extinciile obinute cu soluii standard ale elementului de analizat cu care se construiete o curb de etalonare a aparatului. Se introduc apoi probele de analizat prelucrate n mod corespunztor iar din compararea extinciilor probelor cu curba de etalonare se calculeaz concentraia elementului de analizat.

183

Flamfotometria
Fotometrul cu flacr (flamfotometrul) Principiu: Soluia de analizat este pulverizat automat ntr-un dispozitiv, numit pulverizator i se introduce sub form de aerosoli in flacra unui arztor special (Brenner). Soluia, sub form de aerosoli, ajuns n flacr sufer diferite transformri: apa n care este dizolvat sarea se evapor, componentele dizolvate sunt excitate de temperatura ridicat a flcrii, rentoarcerea electronilor din starea excitat pe un nivel energetic inferior elibereaz energia absorbit sub form de lumin cu lungime de und caracteristic elementelor chimice ai crui atomi sunt excitai. Prin excitarea n flacr a acestui amestec complex iau natere diferite spectre de emisie. Radiaia emis este focalizat pe o celul fotoelectric, dup ce au trecut prin filtre optice de selecie. Ia natere astfel un fotocurent care se msoar cu ajutorul unui galvanometru. n cazul determinrii unui anumit element (sodiu, potasiu, calciu etc.), intensitatea fotocurentului este proporional cu concentraia elementului respectiv din soluie. Pulverizatorul pulverizeaz automat n picturi foarte fine soluia de analizat. El este confecionat din sticl, cuar sau material plastic. Pulverizarea se realizeaz n felul urmtor: gazul purttor comprimat, care iese cu vitez mare n apropierea tubului cu soluie, antreneaz soluia de analizat i o pulverizeaz n particule foarte fine. Soluia pulverizat ajunge in flacra arztorului, unde se vaporizeaz iar ionii absorbii se excit. Pentru ca analiza s se desfoare n condiii optime este necesar meninerea unei presiuni constante att pentru aer ct i pentru gazul de ardere. Reglarea presiunii se realizeaz cu ajutorul unor reductoare de presiune i se msoar cu manometrul. Gazul purttor poate fi aerul sau oxigenul.

184

n figura de mai sus apar principalele componente ale unui flamfotometru. Arztorul este dispozitivul cu flacr n care substana de analizat se vaporizeaz i se excit, emannd radialii luminoase. Pentru ntreinerea flcrii, care se aprinde automat, se utilizeaz diferite amestecuri de gaze n funcie de temperatura necesar pentru excitarea substanei de analizat. Amestec de gaze Gaz de iluminat aer Propan aer Hidrogen aer Acetilen aer Hidrogen oxigen Propan oxigen Acetilen oxigen Temperatura flcrii msurat n C 1700 1840 1925 2000 2045 2125 2397 2550 2660 2850 (calculat) 3100 3137

n tabelul de mai sus sunt redate cteva amestecuri de gaze folosite n flamfotometrie precum i temperaura flcrii acestora. n funcie de potenialul de ionizare al elementului care urmeaz a fi determinat se alege i temperatura dorit i deci gazul combustibil capabil s o realizeze. Pentru a fi activai, sodiul i potasiul necesit o temperatur relativ joas cum ar fi cea a amestecului: propan-aer (1925C), iar calciul i magneziul o temperatur mult mai ridicat (flacr de acetilen-oxigen). Determinarea cantitativ a elementelor din soluia de analizat se face dup mai multe metode: metoda curbei de calibrare, metoda soluiilor limitative, metoda adaosurilor, etc.

185

Soluiile de analizat i standardele respective (soluiile etalon) trebuie s posede, pe ct posibil, aceleai proprieti fizice, n aa fel nct condiiile de pulverizare sa fie identice.

Poteniometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi

Msurarea pH-ului cu electrodul de sticl Metoda necesit un pH-metru i doi electrozi: unul selectiv pentru ionii de hidroniu - electrodul de sticl i unul de referin. Acesta din urm este un electrod metalic de spea a II-a n contact cu o soluie saturat a anionului srii metalice, Ag/AgCl/KClsat. sau, n cazul celui de calomel, Hg/Hg2Cl2/KClsat. Electrodul de sticl este confecionat din sticl special care se comport ca o membran permeabil pentru ionii de hidroniu. Acest electrod n form de balona sferic este umplut cu o soluie tampon cu pH dat care nu-i schimb compoziia (pH-ul) n timpul msurtorilor. El se cufund n soluia prob cu pH necunoscut. Diferena de potenial dintre aceste soluii este dat de relaia lui Nernst. Rescris n termeni de pH aceast relaie devine:
RT E = ( pHelectrod pHprob ) 2,303 F

Aceast diferen de potenial este, cum se vede, ntr-o relaie linear cu pH-ul soluiei probei, deoarece pHelectrod = constant. Ea se poate msura cu pH-metrul. Acesta este un milivoltmetru cu impedan de intrare mare, datorit rezistenei electrice mari a electrodului de sticl, cu scal de pH, numit pH-metru. Pentru msurarea pH-ului unei soluii necunoscute este necesar n prealabil calibrarea pH-metrului cu ajutorul a dou soluii tampon cu pH cunoscut. Avantajele pe care le prezint metoda poteniometric fa de cea colorimetric sunt:

- exactitate mare, 0,01 n cazul pH-metrelor obinuite ca de exemplu

cel de tip MV-84, sau chiar 0,001 n cazul pH-metrelor performante ca de exemplu cel de tip Radiometer-Copenhagen.

- pot fi analizate soluii colorate, vscoase, cu proprieti redox - timp de msurare foarte scurt (1-2 minute)

186

Schema de principiu al unui pH metru

Valori patologice de laborator care amenin viaa

Na seric K seric Ca seric Cl seric HCO3- seric pH PCO2 PO2 Glicemie Hematocrit Indice de protrombin sub 120 mmol/l sub 3 mmol/l sub 1 mmol/l sub 80 mmol/l sub 10 mmol/l sub 7,00 sub 20 mmHg sub 40 mmHg sub 2,5 mmol/l sub 20% (pierdere acut) sub 20% peste 160 mmol/l peste 8 mmol/l peste 4 mmol/l peste 120 mmol/l peste 40 mmol/l peste 7,7 peste 80 mmHg peste 400 mmHg peste 56 mmol/l

Limitele valorilor normale

St snge total Pl plasm Se ser 187 U - urin SG suc gastric FBG - fibrinogen

L LCR Acid uric Se Brbai Femei

GC greutate corporal 4,3 8 mg/100 ml (256 476 mol/ l) 2,3 6 mg/100 ml (137 357 mol/ l) 2 - 8 mg/100 ml (119 476 mol/ l) 400 1000 mg/ 24 ore (2,4 6 mmol/24 h) 0,5 2,6 mg/100 m (29 155 mol/ l ) 35 55 mg N /l (3,5 5,5 mg N/100 ml) 0,5 g/24 ore 50 80 g/100 ml (29 47 mol/l) 0,3 1,2 g/24 ore (17,6 71 mmol/24 ore) total cca. 1mg/100ml (17 mol/l); direct cca. 0,25 mg/100ml (4,3 mol/l) 7 14 mg/100ml (1,8 - 3,5 mmol/l; 3,57 mEq/l) 9 11 mg/100ml (2,2 - 2,8 mmol/l; 4,5-5,5 mEq/l) 0,01 - 0,14 g/24 ore (0,25 - 3,5 mmol/24 ore) 0,10 - 0,14 g/24 ore (2,5 - 3,5 mmol/24 ore) 0,10 - 0,40 g/24 ore (2,5 - 10,0 mmol/24 ore) 4 6 mg/100ml (1 - 1,5 mmol/l) 280 320 mg/100ml (79 90 mmol/l) 340 390 mg/100ml (96 110mmol/l) 410 460 mg/100ml (115 130mmol/l) 600 900 mg/100ml (169 254mmol/l) 300 530 mg/100ml (85 149mmol/l) total 150 250 mg/100ml (3,9 - 6,5 mmol/l) esterificat 60 80% din colesterolul total sau colesterol esterificat / colesterol total = 0,6 - 0,8 0,8 - 1,8 mg/100ml (71 159 mol/l) 0,6 - 0,9 mg/100ml (53 80 mol/l) 0,6 1,8 mg/100 ml (53 - 159 mol/l) 26 mg/kg GC (230 mol/kg GC) 22 mg/kg GC (190 mol/kg GC) 90 160 g/ 100ml (16,1 28,6 mol/l) 80 130 g/ 100ml (14,3 23,3 mol/l) 3 10 UB/100 ml (25 83 UI/l) 2 8 UB/100 ml (16,6 66,4 UI/l) 2 4 UB/100 ml (16,6 33,2 UI/l) 4,5 13,5 UI/l

Aminoacizi Amoniac Bilirubina Calciu (total)

U L Se U Se U Se Se U L St Se L U SG Se Se Brbai Femei Brbai Femei Brbai Femei Sugari Copii Aduli Copii Aduli Sugari Copii Aduli

Clor

Colesterol Creatinin

U Fer Fosfataz alcalin Se Se

Fosfataz acid total prostatic Glucoz

Se 0,05 3,6 UI/l 80 120 mg/100ml (4,4- 6,6 mmol/l) 70 100 mg/100ml (3,9- 5,5 mmol/l)

St

Iodometric o-toluidin

188

Se Pl L U Se

Glocoz- 70 104 mg/100ml (3,9 - 5,8 mmol/l) oxidaz 50 - 70 mg/100ml (2,8 3,9 mmol/l) <30 mg/100ml (<1,7 mmol/l) aduli 2 - 20 UI/l copii sub 40 UI/l
3 luni

GOT

GPT

Se

Aduli
Copii sun 5 ani

2 16,5 UI/l 10,2 13 UI/ l 15 20 g/100ml (9,3 - 12,4 (Hb/4) mmol/l) 14,0 17,0 g/100ml (8,7 - 10,5 (Hb/4) mmol/l 13 21mg/100ml (3,3 -5,4 mmol/l) 8 11 mg/100ml (2,0 -2,8 mmol/l) 1,9 3,9 mg/100ml (0,5 1,0 mmol/l) totale 400 700 mg/100ml fosfolipide 150 250 mg/100ml trigliceride 80 200 mg/100ml 3,7- 4,7 mg/100ml(1,5-1,9 mmol/l; 3,0-3,9 mEq/l) 1,6-2,3mg/100ml(0,66-0,95mmol/l; 1,3-1,9mEq/l) 1,9-2,9 mg/100ml (0,8-1,2 mmol/l; 1,6-2,4 mEq/l) 2,5 mg/100ml (1,0 mmol/l; 2,0 mEq/l) 20 40 mg/100ml (14,3 - 28,6 mmol/l) 15 18 mg/100ml (11 - 13 mmol/l) 315-350mg/100ml(137-152mmol/l) 300-340mg/100ml(130-148mmol/l) 4 6 g/24 ore (174 261 mmol/24 ore) 30 50 mg/100ml (9,7 16,1 mmol/l) 4 6 mg/100ml (1,3 1,9 mmol/l) 2,5 4,5 mg/100ml (0,8 1,15 mmol/l) 1 1,8 mg/100ml (0,3 0,6 mmol/l) 6,5 - 8,2 g/100ml 5 7,5 g/100ml 6,5 - 8,5 g/100ml 10 30 mg/100ml 3,50-4,20 g/100ml 0,25-0,40 g/100ml 0,50-0,65 g/100ml 0,80-1,02 g/100ml 1,10-1,40 g/100ml 0,2 0,4 100 g/100 ml 21 54 mg/100ml (3,5 9 mmol/l)

Hemoglobin Potasiu

St Se L U Se

Brbai Femei

Lipide

Magneziu

St Se

Nou nscui Aduli

Azot neproteic Sodiu

L Se L Se L U St Se L Se Pl L Se

Fosfor anorganic

Copii Aduli

Proteine

totale

Copii Aduli Alb. 1 2 1+

2

Fraciuni proteice

FBG

Uree

Se

189

U L

20 30 g/24 ore (0,33 - 0,50 mol/24 ore) 20 60 mg/l (0,33 - 1,00 mmol/l)

Sistemul internaional de uniti

Cantitatea fizic lungime mas timp intensitatea c. electric intensitate luminoas cantitate de subst. temp. termodinamic

Unitatea de msur metru kilogram secund amper candel mol Kelvin

Simbol m kg s A cd mol K

190