Introduzione ai trattamenti biologici: Cenni di microbiologia e cinetica biologica

Claudio Lubello Corso Ingegneria Sanitaria

24/02/2010

I microrganismi

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La suddivisione degli esseri viventi: classificazione filogenetica

MACRORGANISMI

Albero filogenetico della vita come definito dalla comparazione dellRNA ribosomale. Lalbero costituito da tre domini degli organismi: Bacteria ed Archaea che hanno una cellula di tipo procariotico ed Eukarya, di tipo eucariotico. In rosso sono cerchiati i 24/02/2010 macrorganismi tutti gli altri sono quelli comunemente indicati come MICRORGANISMI.

Procarioti ed Eucarioti

Eucariote: organismo costituito da cellule con nucleo ben differenziato e separato dal citoplasma per mezzo di una membrana nucleare. Procariote: organismo unicellulare il cui materiale cellulare non racchiuso dentro una specifica 24/02/2010 membrana. Manca la suddivisione della funzione cellulare in specifici organuli.

Batteri
I batteri sono organismi procarioti costituiti da una singola cellula. Le cellule batteriche si riproducono per scissione binaria. I batteri possono essere di differente forma:
- SFERICA (Cocchi), - a BASTONCINO (Bacilli), - ELICOIDALE (Spirilli).
In genere le cellule batteriche sono lunghe da 1 a 10 micrometri (10 mm) e hanno sviluppato gli adattamenti pi svariati per ottenere energia e sostanze nutritive. Si trovano in quasi tutti gli ambienti: nell'aria, nel suolo, nell'acqua, nel ghiaccio, nelle sorgenti calde e perfino negli sbocchi idrotermali delle profondit oceaniche.
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-3

Alghe verdi-azzurre

Da non confondersi con le alghe. Sono cianobatteri ed appartengono al dominio dei BACTERIA. Sono organismi fotosintetici.

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Alghe
Rientrano fra le alghe numerosi organismi eucariotici che contengono clorofilla e svolgono la fotosintesi. La maggior parte sono microscopiche (quelle di nostro interesse), sono presenti tuttavia organismi macroscopici di dimensione molto elevata.
Le alghe contengono clorofilla e si presentano di colore verde, possono assumere colori diversi (marrone o rosso) per la presenza di altri pigmenti.

Colonie di Volvox
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Protozoi
I protozoi sono organismi eterotrofi generalmente unicellulari, sprovvisti di una ben delimitata parete cellulare. La maggior parte mobile. Possono essere patogeni per luomo o per altri animali.

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Funghi
Sono organismi eterotrofi pluricellulari, caratterizzati dalla presenza di una parete cellulare e dalla produzione di spore. I gruppi di maggiore importanza sono: muffe, lieviti e funghi fruttiferi.
Muffe: Sono funghi con struttura filamentosa, caratteristici per le loro efflorescenze polverose di colore bianco-grigio, verdastro, nero. Si riproducono tramite spore che differiscono nella morfologia, nel modo in cui sono prodotte, nel colore. Le loro condizioni ottimali di pH sono di circa 5,6 con intervallo tra 2 e 9. Lieviti: Funghi unicellulari che vivono in habitat liquidi o umidi.
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Virus
I virus non sono cellule ma particelle composte da acidi nucleici (DNA o RNA) racchiusi in un involucro proteico

Il termine virus significa, veleno e venne usato per la prima volta per indicare particelle patogene pi piccole dei batteri. Essi non possiedono molti degli attributi tipici delle cellule ed, in particolare, sono sistemi dinamici e aperti in grado di assimilare nutrienti ed espellere metaboliti.
24/02/2010 Sono parassiti intracellulari obbligati e solo quando infettano una cellula sono in grado di riprodursi.

Metabolismo microbico
Percorsi metabolici e conseguente classificazione dei microrganismi

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Il metabolismo dei microrganismi

Un organismo per potersi riprodurre e funzionare correttamente ha bisogno di: - Energia - Carbonio - Elementi inorganici (nutrienti) - Fattori di crescita (amminoacidi, vitamine, basi azoto, )

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Anabolismo e Catabolismo
Le attivit metaboliche seguono due percorsi metabolici diversi: - cammino anabolico (consumo di energia), che un processo assimilativo che comporta la sintesi dei componenti della cellula (biosintesi), - cammino catabolico (rilascio di energia), che un processo dissimilativo. Le sostanze assunte vengono degradate attraverso una serie di passaggi intermedi fino a prodotti stabili. In questi passaggi si rende disponibile lenergia necessaria per la crescita e il mantenimento. I due processi si completano luno con laltro.

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Ossido riduzione
Nei sistemi biologici la produzione e la conservazione dellenergia coinvolge reazioni di ossido-riduzione (redox). In queste si ha uno scambio di elettroni tra un elemento donatore che si ossida, ed un elemento accettore che si riduce. Le reazioni redox rispetto ad altre reazioni chimiche, hanno un valore pi elevato della resa di energia per mole di reagenti coinvolti.

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ATP
ATP (Adenosintrifosfato): la molecola che nel metabolismo delle cellule svolge limportante funzione energetica di accumulare energia fornita dal catabolismo e di fornirla successivamente per le reazioni metaboliche, comportandosi come una sorta di batteria. LATP costituito da un gruppo adenosina e tre gruppi fosfatici. Quando lATP perde un gruppo fosfatico, la rottura del legame rilascia una grande quantit di energia e si forma ADP (adenosindifosfato).

ATP ADP + Pi + energia

Con un meccanismo di ricarica lenergia fornita dal catabolismo viene accumulata dalla reazione inversa.

ADP + Pi + energia ATP

opportuno evidenziare limportanza del fosforo che deve essere sempre presente per garantire lo svolgimento delle reazioni metaboliche.
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ATP
Re az io n i Cat abo lic h e
Generazione di energia libera SUBSTRATO (Fonte energetica)

ATP
G
a o r il z i o n e sf

r id

scambio di energia

Re az io n i An abo lic h e
Consumo di energia libera

o li s i

PRODOTTI METABOLICI

iodrolisi ATP

ATP + H2O

Fosforilazione ADP

ADP + Pi

Illustrazione schematica del ruolo svolto dallATP nel metabolismo

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fo

ADP
Sintesi della biomassa Metabolismo di mantenimento

ATPasi

ADP + Pi

G = - 7kcal/mole

Fosforilazione

ATP

G = 7kcal/mole

Enzimi e coenzimi

Gli enzimi negli organismi viventi hanno il compito di velocizzare le reazioni biochimiche che, in loro assenza, avverrebbero tempi lunghi, non compatibili con il metabolismo cellulare. Alcuni enzimi per svolgere la loro attivit hanno necessit di
un 24/02/2010 addizionale, che pu essere costituito da ioni inorganici o da molecole organiche composto dette coenzimi

Enzimi
Cinetica enzimatica La velocit della reazione globale aumenta proporzionalmente alla concentrazione del substrato e quindi del complesso E-S. Come si pu notare dalla figura, questo incremento decresce sino al raggiungimento di un plateau in cui la concentrazione di S cos elevata da mantenere sempre saturo lenzima; in queste condizioni la velocit di reazione per unit di enzimi (o batteri), V/E, massima e pari a k. La relazione tra concentrazione di substrato e la velocit stata studiata da Michaelis- Menten

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Nutrienti
Elementi Carbonio Azoto Idrogeno Ossigeno Fosforo Zolfo Potassio Magnesio Sodio Calcio Ferro
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Forma pi comune in natura CO2, composti organici NH4+, NH3, NO3-, N2, composti organici azotati H2O, composti organici H2O, O2, composti organici PO43H2S, SO42-, comp. organici, metalli solfati K + in soluzione o Sali di potassio Mg2+ in soluzione o Sali di magnesio Na+ in soluzione o Sali di sodio Ca2+ in soluzione o Sali di calcio Fe2+ o Fe3+ in soluzione o come Sali di Ferro

Classificazione dei microrganismi

I principali elementi che devono essere considerati per la classificazione dei microrganismi sono:

SORGENTE DI CARBONIO: viene

convertito in materiale

cellulare (protoplasma) la semireazione di ossidazione e rappresenta la fonte di energia nel cammino catabolico.
ACCETTORE DI ELETTRONI: alimenta DONATORE DI ELETTRONI (SUBSTRATO): alimenta

la semireazione di

riduzione nel cammino catabolico.

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Fonte di Carbonio
Eterotrofi: organismi che utilizzano come fonte il carbonio contenuto nei composti organici Autotrofi: organismi che utilizzano come fonte di carbonio la CO2
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Energia
Le cellule richiedono energia per le attivit di sintesi e di mantenimento. Lenergia pu essere ottenuta da tre fonti diverse: I microrganismi che utilizzano la luce come sorgente di energia sono detti FOTOTROFI; quelli che invece usano lenergia chimica sono definiti CHEMIOTROFI.
-

Composti chimici organici Composti chimici inorganici

Chemiorganotrofi
CHEMIOTROFI

Chemiolitotrofi
-

Luce

FOTOTROFI

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Classificazione in funzione del ruolo dellossigeno

I diversi tipi di metabolismo possono essere distinti sulla base delle modalit con le quali viene prodotta lenergia necessaria per le funzioni vitali. In particolare sulla necessit o meno dellossigeno come accettore finale delle reazioni di ossido-riduzione.

Metabolismo aerobico quando lossigeno funge da accettore finale degli elettroni (i microrganismi che sfruttano questo metabolismo sono detti AEROBICI) Metabolismo anaerobico quando viene utilizzato un accettore finale di elettroni diverso dallossigeno (i microrganismi sono detti ANAEROBICI). Un caso particolare di metabolismo anaerobico quello in cui gli accettori finali di elettroni siano i nitriti e/o i nitrati. Si parla in questo caso di Metabolismo anossico (spesso svolto da microrganismi FACOLTATIVI, che cio in presenza di ossigeno usano questo come accettore ed in sua assenza nitriti e nitrati).
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Respirazione e Fermentazione
Respirazione: ossigeno molecolare o altro composto inorganico come accettore di e-. Il substrato organico viene ossidato a CO2. Fermentazione: assenza di un accettore di e- esterno. Vengono utilizzati gli stessi composti organici donatori.

La fermentazione caratterizzata in termini energetici da una resa inferiore alla respirazione (minore velocit di crescita ed inferiori rendimenti di sintesi)

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Condizioni potenziale redox

Fermentazione anaerobica
Trasformazione del Carbonio

Respirazione anossica

Respirazione aerobica

Substrato organico

Prodotti di fermentazione

Substrato organico

C CO 2

Substrato organico

C CO 2

Accettore di elettroni

Flusso interno di e-

e-

e-

N O 3 -,

SO 4 --,

CO 3 --

O2

Ossido-Riduzioni interne

POTENZIALE REDOX

molto

negativo

debolmente negativo o circa zero

positivo

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Tipo
Aerobico eterotrofo Aerobico autotrorfo Aerobico aut Aerobico aut FacololtativoEt erototrofo Anaeraerobico Eterot. Anaer. Eterot. Anaer. Eterot. Anaer. Eterot.
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Reazione
Respirazione Aerobica Nitrificazione

Fonte C
Composti Organici CO2 CO2 CO2 Composti Organici Composti Organici Composti Organici Composti Organici Composti Organici

Donatore eComposti Organici NH4+, NO2Fe (II) H2S Composti Organici Composti Organici Composti Organici Composti Organici
Acidi Grassi Volatili VFA

Accettore eO2 O2 O2 O2 NO2-, NO3Composti organici Fe (III) SO42CO2

Prodotti
CO2, H2O NO2-, NO3Fe (III) SO42N2, CO2, H2O VFA Fe(II), CO2, H2O H2S, CO2, H2O Metano

Ox. Ferro Ox. Solfuri Denetrificazione Anossica Fermentazione Acida Riduzione Fe

Riduzione Solfati

Metanogenesi

Definizione dei parametri cinetici

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Velocit e tasso di crescita

Sia nei reattori batch, che in quelli a flusso continuo la velocit (rateo) di crescita dei batteri pu essere definita dalla seguente relazione:

rg =

in cui rg la velocit di crescita batterica (massa/unit di volume x tempo) X la concentrazione di microrganismi (massa/unit di volume)I Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita:

dX dt

=
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1 dX X dt

Velocit e tasso di respirazione endogena

Lattivit di respirazione endogena corrisponde allutilizzo come fonte di carbonio ed energia lo stesso materiale cellulare. Tale fase sempre presente in contemporanea con la crescita cellulare. Diventa lattivit prevalente quando il substrato esaurito. La velocit (rateo) di respirazione endogena dei batteri definita dalla seguente reazione:

rd =

in cui rd la velocit di respirazione endogena (massa/unit di volume x tempo) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di respirazione endogena:

dX dt

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kd =

1 dX X dt

Velocit di crescita netta

La velocit di crescita netta data dalla differenza fra quella di crescita e quella endogena (che comporta un consumo del materiale cellulare).

rg = rg - rd
in cui rd la velocit di respirazione endogena (massa/unit di volume x tempo) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di crescita netta:

= - kd

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Velocit di utilizzazione del substrato

La velocit di utilizzazione del substrato (termine con cui spesso si indica il donatore di elettroni) rappresenta la velocit con cui i batteri utilizzano il substrato:

rsu =

in cui rsu la velocit di utilizzazione del substrato (massa/unit di volume x tempo) S la concentrazione del substrato (massa/unit di volume) Facendo riferimento al valore specifico (tasso) rispetto alla concentrazione X della biomassa si introduce il tasso di utilizzazione del substrato:

dS dt

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U =

1 dS X dt

Fattore di resa (rendimento di crescita)

Una parte del substrato convertito in prodotti inorganici ed organici finali mentre unaltra parte porta alla formazione di nuove cellule. La successiva relazione mette in relazione il tasso di utilizzazione del substrato (rsu massa/unit di volume x tempo) con rg il tasso di crescita batterico:
rg = dX dt
dS dt

rsu =

dX / dt dS X dX 1 = = essendo = Y= rsu dS / dt dt Y dt X rg

In cui Y (massa/massa) il fattore di resa. Tenendo conto che una parte del biomassa viene degradata a causa della respirazione endogena utile introdurre il fattore di resa osservato Yobs:

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Yobs =

r 'g rsu

Esempio di calcolo del fattore di resa

Calcoliamo Y nel caso di un substrato noto (p.es. formaldeide CH2O)

8 CH 2 O + 3O2 + NH3 C5 H7 NO2 + 3CO2 + 6 H 2O

substrato biomassa
Peso molecolare del substrato CH2O = 30 Massa atomica C = 12 ; N = 14; H = 1; O = 16 Peso molecolare della biomassa C5H7NO2 = 113

C 5 H 7 NO 2 113 Biomassa prodotta = = = 0 .47 g SSV / g substrato Y = 8 30 Substrato consumato 8 CH 2 O

Il fattore di resa pu anche essere calcolato come: gCOD (nella biomassa prodotta) /gCOD (nel substrato degradato)
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Calcolo di Y in termini di COD

Equivalenza COD/substrato:

8 CH 2 O + 8O2 8 CO2 + 8 H 2O
f COD 8 O2 8 32 = = = 1.06 g COD / g substrato 8 CH 2 O 8 30

Equivalenza COD/biomassa:

C5 H 7 NO2 + 5O2 5CO2 + 2 H 2O + NH 3

fX = 5 O2 5 32 = = 1.42 g COD cell / g biomassa C5 H 7 NO 2 113
Y= biomassa gSSV 0,47 1,42 gCOD = 0,47 = = 0,63 substrato gsubstrato 1,06 gCOD

Pertanto Y:
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Tasso di crescita e concentrazione del substrato

Una relazione empirica della relazione esistente fra il tasso di crescita della biomassa e la concentrazione di substrato, largamente utilizzata nella pratica, quella ricavata da Monod derivata dalla cinetica enzimatica di Michelis-Menten:

= max

S KS + S

Sostituendo questa espressione nella definizione del fattore di resa si ha: SX kSX rg dX / dt dS X dX 1 rsu = max = = = Y= essendo = Y KS + S KS + S rsu dS / dt dt Y dt X Dove k il tasso massimo di utilizzazione del substrato, pari a max/Y. Ks rappresenta il valore della concentrazione del substrato al quale corrisponde un tasso di crescita pari alla met del tasso massimo.
Si noti che Per S>>Ks Per S<< Ks
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= max = maxS/Ks

(cinetica di ordine zero) (cinetica di ordine uno)

Propriet della cinetica di crescita

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Effetto della costante di semisaturazione

Andamento rateo di crescita
7

KS = 10 KS = 50 KS = 100

5 Rateo di crescita (1/d)

0 0 200 400 600 Substrato (mg/l) 800 1000 1200

Allaumentare del substrato disponibile il tasso di crescita aumenta fino ad un valore massimo. Si noti come in presenza di alti valori di Ks il rateo massimo di crescita si ottiene per valori pi elevati dalla concentrazione del substrato, mentre con valori bassi di Ks si ottiene gi con basse concentrazioni. 24/02/2010

Sostanze inibitrici dei processi di crescita

Oggi le acque reflue raccolgono spesso sostanze tossiche (composti organici o metalli pesanti) che possono diventare inibitori della crescita microbica impedendo cos il funzionamento dei sistemi biologici di depurazione. Tale effetto di inibizione si esplica, solitamente, superando una definita soglia di concentrazione. Per esempio, nel caso di microrganismi eterotrofi, alcune soglie sono riportate di seguito: Arsenico 0.05 mg/l; Cadmio 1 mg/l; Cromo tot. 10 mg/l; Cromo esa. 1 mg/l; Rame 1 mg/l, Piombo 0.1 mg/l; Mercurio 0.1 mg/l; Nickel 1 mg/l; Zinco 1 mg/l. Nel caso di microrganismi autotrofi nitrificanti le soglie sono inferiori.

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