Imunologia Básica

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Captulo 1
Imunologia
Antnio Teva Jos Carlos Couto Fernandez Valmir Laurentino Silva
1. Introduo Imunologia
A imunologia uma cincia recente. Sua origem atribuda, por alguns autores, a Edward Jenner, que, em 1796, verificou proteo induzida pelo cowpox (vrus da varola bovina) contra a varola humana, nomeando tal processo da vacinao. No entanto, sabido que, na antiguidade, os chineses j inalavam o p das crostas secas das pstulas de varola ou as inseriam em pequenos cortes na pele, em busca de proteo. O sistema imune o conjunto de clulas, tecidos, rgos e molculas que os humanos e outros seres vivos usam para a eliminao de agentes ou molculas estranhas, inclusive o cncer, com a finalidade de se manter a homeostasia do organismo. Os mecanismos fisiolgicos do sistema imune consistem numa resposta coordenada dessas clulas e molculas diante dos organismos infecciosos e dos demais ativadores, o que leva ao aparecimento de respostas especficas e seletivas, inclusive com memria imunitria, que tambm
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pode ser criada artificialmente, atravs das vacinas. Na ausncia de um sistema imune funcional, infeces leves podem sobrepujar o hospedeiro e lev-lo morte. Porm, mesmo com um sistema imune funcional, o homem, por exemplo, pode adquirir uma doena infecciosa ou um cncer, pois a resposta imune especfica, diante de um agente agressor, leva tempo para se desenvolver e, alm disso, tanto organismos estranhos, como clulas neoplsicas, desenvolvem mecanismos de evaso para fugir da resposta imune. Neste captulo, sero abordados conceitos bsicos dos principais componentes do sistema imune, os mecanismos de resposta especfica ante os diversos agentes infectoparasitrios, como tambm a investigao dos vestgios da passagem desses agentes, por meio de mtodos laboratoriais para pesquisa de antgenos e anticorpos especficos, principal propsito desse texto, uma vez que se destina a alunos de escolas tcnicas de nvel mdio.
2. rgos, tecidos e clulas envolvidos na resposta imunitria 2.1. Clulas que participam do sistema imunitrio
As respostas imunes so mediadas por uma variedade de clulas e por molculas que estas clulas expressam (Figura 1). Os leuccitos so as clulas que desempenham as principais aes, mas outras clulas, que se encontram nos tecidos, tambm participam da resposta imunitria, enviando sinais e recebendo estmulos dos leuccitos. As clulas que participam do sistema imunitrio se originam na medula ssea, onde muitas evoluem para a fase adulta. A partir da medula, e por meio de vasos sanguneos, elas migram junto com todos os elementos celulares do sangue. Inclusive as hemcias, que transportam o oxignio, e as plaquetas que participam da coagulao, uma vez que estes elementos se originam das clulas-tronco progenitoras da medula. As clulas que derivam do progenitor mieloide e do progenitor linfoide so as que mais
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interessam para o entendimento das aes do sistema imunitrio, de modo que, neste texto, no sero considerados os megacaricitos e os eritrcitos. O progenitor mieloide o precursor dos granulcitos, fagcitos mononucleares (macrfagos), clulas dendrticas e mastcitos do sistema imune. Os macrfagos so as clulas fagocitrias mais relevantes. Estas clulas so a forma diferenciada dos moncitos sanguneos, que se encontram estrategicamente distribudos em vrios tecidos para dar origem ao sistema fagocitrio mononuclear. Os microglicitos so os macrfagos do crebro, as clulas de Kupffer so os macrfagos do fgado, os macrfagos alveolares fazem parte do tecido pulmonar, entre outros macrfagos residentes em diferentes tecidos. As funes dos macrfagos se caracterizam pela neutralizao, ingesto e destruio de partculas, incluindo os biopatgenos, alm de processar e apresentar antgenos para os linfcitos T. Neste contexto, so as clulas dendrticas as mais especializadas na captura e na apresentao de antgenos para os linfcitos T. As clulas dendrticas imaturas migram do sangue para residirem nos tecidos e realizam tanto a fagocitose quanto a micropinocitose. Aps o encontro com um patgeno, maturam rapidamente e migram para os ndulos linfticos, onde encontram o ambiente adequado para a apresentao de antgenos. Os granulcitos recebem essa denominao por possurem grnulos em seu citoplasma que se coram densamente por corantes hematolgicos tradicionais. So tambm chamados de leuccitos polimorfonucleares, devido s formas de seus ncleos. Existem trs tipos de granulcitos, sendo eles os neutrfilos, os eosinfilos e os basfilos; todos com um tempo de vida relativamente curto e produzidos em grande nmero durante as respostas inflamatrias. Os neutrfilos, assim como os macrfagos e as clulas dendrticas, so representantes do grupo de clulas fagocitrias do sistema imunitrio, mas, diferentemente destas clulas, no apresentam antgenos para os linfcitos T. Os neutrfilos so os elementos celulares mais numerosos e importantes da resposta inata.
Os eosinfilos parecem ser importantes, principalmente na resposta diante de infeces parasitrias ou processos alrgicos, j que seu nmero aumenta no curso destas reaes. A funo dos basfilos provavelmente similar e complementar dos eosinfilos e mastcitos. Os mastcitos, cujo precursor parece ser comum aos basfilos, devido a semelhanas funcionais, tambm se diferenciam ao chegar aos tecidos onde residem. Eles se localizam principalmente margem dos vasos sanguneos e liberam mediadores que agem nas paredes vasculares quando ativados. Figura 1. Clulas que participam do sistema inunitrio
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O progenitor linfoide comum d origem aos linfcitos. Os linfcitos so as clulas que reconhecem, especificamente, os antgenos. Sua morfologia tpica consiste em uma pequena clula redonda com ncleo esfrico. Apesar da aparncia uniforme microscopia tica, vrios tipos de linfcitos podem ser distinguidos com base nas suas propriedades funcionais e protenas especficas que expressam. A distino mais fundamental consiste na classificao destas clulas em duas linhagens principais, conhecidas como linfcitos B e linfcitos T. Os linfcitos B, tambm chamados de clulas B (de bursa ou bolsa de Fabricius, nas aves, e derivadas da medula ssea, nos mamferos), quando ativados, proliferam e se diferenciam em clulas plasmticas ou plasmcitos, que so as clulas efetoras da linhagem B, cuja funo principal a secreo de anticorpos. Os linfcitos T, ou clulas T (derivados do timo), se apresentam em duas classes principais. Uma se diferencia, quando ativada, em clulas T CD8+ ou citotxicas, que matam as clulas infectadas, ao passo que a outra classe de clulas T, chamadas de clulas T CD4+ ou auxiliares, atuam na ativao de outras clulas, como os linfcitos B e os macrfagos, alm de coordenar a resposta imunitria. O receptor de antgeno da clula B (BCR) (Figura 2) uma forma de anticorpo ligada membrana que a clula B passa a produzir, aps sua ativao e diferenciao em clula plasmtica. Os anticorpos so molculas agrupadas em uma classe de substncias denominadas imunoglobulinas, e o receptor de antgeno do linfcito B tambm conhecido como imunoglobulina de membrana. A imunidade humoral a principal funo das clulas B e dos plasmcitos, e consiste em secretar anticorpos no sangue e em outros lquidos orgnicos, resultando efeitos protetores, mediados por lquidos teciduais. O receptor de antgeno da clula T (TCR) (Figura 2) constitui uma classe heterognea de protenas de membrana que, embora estejam relacionadas evolutivamente com as imunoglobulinas, so diferentes delas, j que esto
adaptadas para detectar antgenos derivados de protenas estranhas ou patgenos que entram nas clulas hospedeiras. Todavia, em contraste com as imunoglobulinas, os TCRs nunca so secretados, de modo que a clula T precisa migrar at as reas de leso para exercer seus efeitos protetores, por meio de contato direto com a clula alvo ou para influenciar as atividades de outras clulas do sistema imunitrio. Juntamente com os macrfagos, as clulas T desenvolvem uma categoria de resposta imune denominada imunidade mediada por clulas. Figura 2. Estruturas bsicas do receptor de superfcie da clula B e do receptor T.
A maioria dos linfcitos virgens possui uma sobrevida muito curta, sendo programada para morrer em poucos dias aps ter sado da medula ssea ou do timo. No entanto, se uma dessas clulas receber sinais indicando a presena de um imungeno (antgeno que estimula uma resposta imune especfica), ela poder responder por meio de um fenmeno conhecido como ativao, durante o qual pode sofrer vrios ciclos de diviso celular.
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Algumas das clulas-filhas retomam ao estado de repouso, tornando-se clulas de memria, que podem sobreviver por vrios anos. Estes linfcitos de memria representam uma grande proporo das clulas do sistema imunitrio. A outra prognie do linfcito virgem ativado diferencia-se em clulas efetoras, que sobrevivem apenas alguns dias, mas que, durante este perodo, executam atividade que resultam em defesa. Outra classe de clulas linfoides, chamada de clulas matadoras naturais ou clulas natural killer (NK), desprovida de receptores antgenoespecficos, sendo parte do sistema imune inato. Essas clulas circulam no sangue como grandes linfcitos, com diferentes grnulos citotxicos, e so capazes de reconhecer e matar algumas clulas anormais, tais como clulas tumorais e clulas infectadas por vrus. E parecem ser importantes na defesa contra biopatgenos intracelulares na imunidade inata.
2.2. Os rgos linfoides e a rede linftica
Os rgos linfoides (Figura 3) so tecidos organizados que contm grandes quantidades de linfcitos em um ambiente de clulas no linfoides. Nesses rgos, as interaes que os linfcitos tm com as clulas no linfoides so importantes, tanto para o desenvolvimento dos linfcitos e o incio da resposta imune adaptativa, como para a manuteno dos mesmos. Tais rgos podem ser divididos em rgos linfoides centrais ou primrios, produtores de linfcitos, e rgos linfoides perifricos ou secundrios, que desempenham a funo de maximizar o encontro entre os linfcitos e os produtos processados pelas clulas apresentadoras de antgenos, dando incio resposta imune. Os rgos linfoides centrais so a medula ssea vermelha e o timo, um grande rgo localizado na poro superior do trax. Tanto os linfcitos B como as clulas T surgem na medula ssea, mas apenas os linfcitos B ali se diferenciam. Os linfcitos T migram para o timo para sofrer seu processo de diferenciao. Uma vez completada sua maturao
celular, os dois tipos de linfcitos entram na corrente sangunea, migrando para os rgos linfoides perifricos. Durante a vida intrauterina, o fgado fetal desempenha o papel que a medula ssea vermelha passa a desenvolver plenamente aps o nascimento. Os rgos linfoides perifricos so especializados na captura do antgeno para possibilitar o incio das respostas imunes adaptativas. Os microrganismos patognicos podem penetrar no hospedeiro por muitas portas de entrada, instalando o processo infeccioso em qualquer stio, mas o encontro do antgeno com os linfcitos acontecer nos rgos linfoides perifricos: os ndulos linfticos, o bao e vrios tecidos linfoides associados s superfcies das mucosas. Os linfcitos esto em contnua recirculao entre esses tecidos, para os quais o antgeno tambm carreado, vindo de todos os locais de infeco, primariamente dentro de macrfagos e clulas dendrticas. Dentro dos rgos linfoides, clulas especializadas, como as clulas dendrticas maduras, apresentam o antgeno para os linfcitos. A rede linftica consiste em um extenso sistema de vasos que coletam o lquido intersticial, fazendo-o retornar para o sangue. Esse lquido intersticial produzido continuamente pela passagem de gua e solutos de baixo peso molecular atravs das paredes vasculares que penetram no espao intersticial, pela secreo celular e outros fatores de excreo. Ao ser parcialmente drenado para os vasos linfticos, passa a ser chamado de linfa. A linfa flui lentamente pelos vasos linfticos primrios, desgua em vasos linfticos de calibre progressivamente maior, que convergem para o ducto torcico, e desemboca na veia cava superior, que, por sua vez, devolve todo o volume para a corrente sangunea, num fenmeno denominado recirculao. Localizados em pontos de convergncia da rede vascular, os ndulos linfticos constituem uma srie de rgos encapsulados em forma de caroo de feijo, que se distribuem ao longo dos vasos linfticos. Os
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vasos linfticos aferentes drenam o fluido dos tecidos e carregam antgenos e clulas infectadas aos seios dos ndulos linfticos, onde os antgenos so capturados. Os seios so revestidos por orifcios minsculos, que permitem a linfa e seu contedo atravessarem o ndulo linftico e entrarem em contato com os linfcitos. Nos ndulos linfticos, os linfcitos B se localizam em folculos nas reas corticais, tambm denominadas reas timoindependentes; as clulas T so mais difusamente distribudas em torno das reas paracorticais, tambm conhecidas como zonas de clulas T ou reas timo-dependentes. Alguns dos folculos de clulas B contm reas centrais, denominadas centros germinativos, onde ocorre intensa proliferao dos linfcitos B, aps seu encontro com o antgeno especfico e clulas T auxiliares. Por fim, a linfa sai por um vaso linftico eferente no lado oposto do ndulo linftico, numa regio conhecida como hilo. O bao encontra-se situado atrs do estmago e filtra o sangue da mesma forma como os ndulos linfticos filtram a linfa e coletam antgenos. Tambm captura e se desfaz de clulas vermelhas senescentes. A massa principal deste rgo composta pela polpa vermelha e os linfcitos circundam as arterolas que o penetram, formando reas da polpa branca, cuja regio mais interna dividida em uma camada linfoide periarteriolar, contendo principalmente clulas T e revestidas por uma coroa de clulas B.
Figura 3. rgos, tecidos e clulas envolvidos na resposta imunitria.
2.3.Tecido linfoide associado mucosa
A expresso tecido linfoide associado mucosa (MALT = mucosalassociated lymphoid tissue) uma descrio geral para os tecidos linfoides no encapsulados, que existem nas regies subjacentes s mucosas. Os MALTs se distribuem anatomicamente e seus componentes individuais incluem:
Anel de Waldeyer - Anel de estruturas linfoides que circunda a
faringe. formado pelas tonsilas e adenoides.

Tecido linfoide associado aos brnquios (BALT = bronchial-associated
lymphoid tissue) - Agregados linfocitrios semelhantes, mas organizados difusamente, que protegem o epitlio respiratrio.
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Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT = gut-associated
lymphoid tissues) - Incluem folculos linfoides isolados e o apndice cecal, alm de estruturas especializadas do intestino delgado, as placas de Peyer.
Tecido linftico urogenital Entre outros MALTs (Figura 3).
Coletivamente, estima-se que o sistema imune de mucosa contenha tantos linfcitos quanto o resto do corpo. Esses linfcitos formam um grupo especial de clulas que seguem leis um tanto diferentes. Embora notavelmente diferentes em sua aparncia, os ndulos linfticos, o bao e os tecidos linfoides associados mucosa demonstram a mesma arquitetura bsica. Cada um deles opera segundo o mesmo princpio, capturando o antgeno nos locais de infeco e apresentando-o a pequenos linfcitos migratrios para, assim, induzirem as respostas imunes adaptativas. Os tecidos linfoides perifricos tambm proveem sinais de sobrevivncia aos linfcitos que no encontram seu antgeno especfico. Isto importante para manter o nmero correto de linfcitos T e B circulantes, e assegura que somente os linfcitos com o potencial de responder ao antgeno estranho sejam mantidos.
2.4. Recirculao de linfcitos
Os pequenos linfcitos T e B que se diferenciaram na medula ssea e no timo, mas que ainda no se encontraram com o antgeno, so referidos como linfcitos virgens ou em repouso. Estes elementos circulam continuamente do sangue para os tecidos linfoides perifricos, nos quais penetram por meio de interaes adesivas especiais com os capilares e retornam para o sangue atravs dos vasos linfticos ou, no caso do bao, diretamente ao sangue. Na presena de uma infeco, os linfcitos que reconhecem o agente infeccioso so retidos no tecido linfoide, onde proliferam e se diferenciam em clulas efetoras, capazes de controlar a infeco.
Quando ocorre uma infeco tecidual, os antgenos so capturados por clulas dendrticas, que se deslocam do stio da infeco pelos vasos linfticos aferentes para os ndulos linfticos. Nos ndulos linfticos, essas clulas processam e apresentam o antgeno aos linfcitos T que esto recirculando, os quais elas ajudam a ativar. As clulas B que encontram o antgeno, medida que migram atravs do ndulo linftico, tambm so detidas e ativadas com o auxlio de algumas clulas T ativadas. Uma vez que esses linfcitos especficos tenham passado por um perodo de proliferao e diferenciao, eles deixam os ndulos linfticos como clulas efetoras atravs dos vasos linfticos eferentes.
T: 3. Clulas T: desenvolvimento, diversidade e ativao
Os linfcitos so as nicas clulas do organismo que expressam receptores altamente diversificados para o antgeno, o que permite o reconhecimento de uma grande variedade de substncias estranhas. Essa diversidade gerada durante o processo de desenvolvimento dos linfcitos T e B, a partir de clulas precursoras. O desenvolvimento dos linfcitos T alfa beta (ab) e gama delta (gd) segue estgios sequenciais, consistindo na recombinao somtica e expresso dos genes do TCR, proliferao celular, seleo induzida pelo antgeno e aquisio de fentipos de capacidade funcional. Essas clulas se originam de precursores do fgado fetal ou da medula ssea de adultos e completam o seu desenvolvimento no timo. As clulas T em desenvolvimento no timo so chamadas de timcitos. A maioria dos timcitos imaturos no expressa o TCR ou os correceptores CD4 e CD8 e migram atravs do crtex, onde os eventos de maturao ocorrem quando expressam pela primeira vez o TCR e iniciam a maturao em clulas CD4 ou CD8. Os nveis de proliferao e apoptose so extremamente altos nos timcitos corticais, onde cerca de 95% morrem antes de chegar regio medular do timo. O resultado desse processo seletivo a restrio ao MHC prprio e a tolerncia a muitos autoantgenos. A diferenciao funcional e fenotpica em
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clulas T CD4 ou CD8 ocorre na medula tmica, e as clulas T maduras so liberadas para a circulao.
3.1. Receptores de antgenos e molculas acessrias dos linfcitos T
Os linfcitos T respondem aos antgenos peptdicos, que so expostos pelas clulas apresentadoras de antgenos (APCs). O incio desta resposta requer o reconhecimento especfico do antgeno pelas clulas T, a adeso estvel das clulas T s APCs e a transduo dos sinais ativadores. Cada um desses eventos mediado por molculas distintas, expressas pelas clulas T. As molculas de MHC e os peptdeos formam um complexo na membrana plasmtica das APCs. O receptor que reconhece esse complexo peptdeo-MHC o TCR (Figura 2), que distribudo clonalmente, ou seja, os clones de linfcitos que apresentam diferentes especificidades expressam distintos TCRs. Os sinais bioqumicos, que so acionados na clula T pelo reconhecimento do antgeno, no so transduzidos pelo TCR, mas por protenas no variveis chamadas CD3 e dzeta (z), que esto ligadas de forma no covalente ao receptor do antgeno para formar o complexo TCR. Portanto, nas clulas T, o reconhecimento do antgeno basicamente realizado por dois grupos de molculas: um receptor para o antgeno altamente varivel, o TCR, e protenas sinalizadoras no variveis (CD3 e cadeia z). Outras molculas acessrias funcionam como molculas de adeso para estabilizar a ligao das clulas T s APCs, permitindo que o TCR mantenha ntimo contato com o antgeno durante o tempo suficiente para a transduo dos sinais necessrios ativao dessas clulas. As clulas T que expressam o TCR d pertencem a uma linhagem distinta das clulas T restritas ao MHC. A percentagem das clulas T d muito varivel nos diferentes tecidos das diferentes espcies, normalmente no excedendo mais do que 5%. Elas no reconhecem os antgenos peptdeos
associados s molculas MHC e no so restritas ao MHC. Alguns clones dessas clulas reconhecem uma pequena molcula que pode ser apresentada por molculas similares s da classe I do MHC, ou seja, uma apresentao no clssica de molculas normalmente encontradas nas microbactrias e em outros microrganismos. A diversidade limitada das clulas d sugere que os ligantes desses receptores so bem conservados. Elas podem iniciar a resposta imune contra um pequeno nmero de microrganismos antes mesmo do recrutamento das clulas T antgeno-especficas ab. Alm dos componentes do complexo TCR, as clulas T apresentam vrias protenas de membrana, as quais exercem papel crucial na resposta destas clulas no reconhecimento do antgeno. Essas molculas presentes na membrana de linfcitos ligam-se especificamente a outras molculas da membrana de outras clulas, como as APCs, clulas do endotlio de vasos e da matriz extracelular. Essas molculas no apresentam regies variveis, no so polimrficas, so idnticas em todas as clulas T de todos os indivduos de uma mesma espcie, e so responsveis pela transduo de sinais bioqumicos para o interior das clulas T. Essa propriedade assegura que as clulas T e as APCs permaneam ligadas o tempo suficiente para permitir aos TCRs a oportunidade de localizar, reconhecer e responder ao complexo peptdeo-MHC na APC.
3.2. Correceptores CD4 e CD8: Receptores envolvidos na ativao
As molculas CD4 e CD8 so protenas das clulas T que se ligam s regies no polimrficas das molculas de MHC e transduzem os sinais que, juntamente com os sinais liberados pelo complexo TCR, iniciam a ativao das clulas T. Normalmente, as clulas T ab maduras expressam CD4 ou CD8, embora existam referncias da expresso de ambos os marcadores. Esses correceptores interagem com as molculas de MHC, quando o TCR reconhe-
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ce de forma especfica o complexo peptdeo-MHC na APC. Cerca de 65% das clulas T ab maduras do sangue e dos tecidos expressam o correceptor CD4 e 35% do CD8.
4. Natureza dos antgenos
O antgeno (do grego anti,contra e gen, gerar) qualquer substncia solvel, celular ou particulada que pode ser especificamente ligada por um anticorpo ou por um receptor de antgeno de clula T. Os antgenos possuem duas propriedades: a da imunogenicidade, que a capacidade de induzir uma resposta imune especfica, e a da antigenicidade, que a capacidade de interagir com os linfcitos T ou linfcitos B j sensibilizados. Assim, todas as substncias imunognicas so tambm antignicas. As molculas que desencadeiam a resposta imune so chamadas de imungenos. Pequenas substncias qumicas no so capazes de estimular uma resposta e, portanto, recebem o nome de hapteno. Para ter capacidade de induzir uma resposta imune, o hapteno ligado a uma macromolcula, que chamada de carreadora. O complexo hapteno-carreador, ao contrrio do hapteno livre, pode atuar como um imungeno.
4.1. Determinante antignico
Os stios de ligao dos anticorpos e dos TCRs interagem com uma rea muito pequena das macromolculas antignicas, que chamada de determinante antignico ou epitopo. Portanto, a menor poro da molcula responsvel pela ligao ao linfcito ou anticorpo. A presena de vrios determinantes iguais chamada de polivalncia ou multivalncia e cada um pode ser ligado por uma molcula com regio varivel. As superfcies celulares, incluindo os microrganismos, geralmente possuem uma grande quantidade de determinantes antignicos.
4.2. Relao filogentica dos antgenos
A estimulao de linfcitos de galinhas com protena de pato resulta em uma resposta imune muito baixa. Por outro lado, se inoculadas em galinhas, protenas de coelho, a resposta imune bastante elevada. Isto acontece porque quanto mais prxima for a relao filogentica, menor ser o estmulo e viceversa. Existe pouca diferena entre as protenas de galinhas e patos e muita diferena entre as protenas de aves e mamferos. Embora este conceito da relao filogentica reflita boa parte das aplicaes imunolgicas, no pode ser tomado como regra. A induo de uma resposta imune muito especfica funo direta da semelhana biolgica entre a fonte do antgeno e o animal receptor, ainda que seja menos intensa. Lebres e coelhos pertencem mesma famlia e so bastante semelhantes, tanto morfolgica quanto fisiologicamente. Portanto, ao se injetar protenas de coelho em lebre, poder se obter anticorpos muito especficos, ou seja, anticorpos que s reagem contra protena de coelho.
4.3. Peso molecular e complexidade molecular
Na maioria dos antgenos, quanto maior for a molcula, maior ser o nmero de epitopo; e quanto maior a complexidade, maior ser a imunogenicidade. Um antgeno complexo contm vrios determinantes antignicos, onde alguns dos quais so mais eficientes na induo da resposta imune e so chamados imunodominantes.
4.4. Configurao espacial e acessibilidade
A imunogenicidade e a antigenicidade de uma protena no depende apenas de sua estrutura primria (isto , da sequncia de aminocido), mas tambm das estruturas secundrias, tercirias e at quaternrias. Assim, se tratarmos uma protena pelo calor, ou agentes qumicos desnaturantes, e inocularmos esta em um animal, poderemos obter a formao de anticorpos com especificidade diferente do que se inoculssemos a protena intacta. A configurao espacial de
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diversos epitopos em uma nica molcula de protena pode influenciar a ligao do anticorpo de vrias formas (Figura 4). A rea importante para a imunogenicidade deve ficar acessvel, na superfcie da molcula. Figura 4. Distribuio dos determinantes antignicos sequenciais e no sequenciais em uma macromolcula proteica
4.5. Forma de administrao e adjuvantes
A dose do antgeno, a via e o esquema de imunizao, assim como o uso de adjuvantes, so fatores atuantes na induo da resposta imune. As vias de inoculao subcutnea, intradrmica e intramuscular levam geralmente os imungenos para os ndulos linfticos regionais, e, mais frequentemente, induzem a imunidade celular. Os antgenos inoculados por via endovenosa e intraperitonial acumulam-se predominantemente no bao, e mais frequentemente induzem a uma imunidade humoral. O adjuvante melhora a imunogenicidade de compostos com ele misturado, sem interferir na especificidade da resposta. Em medicina preventiva, so muitas vezes adicionados s vacinas para reduzir a dose e a frequncia de injees dos antgenos utilizados para a imunoprofilaxia de doenas infecciosas. Normalmente, o antgeno aprisionado por ele, formando depsitos, o qual liberado aos poucos por perodo de tempo mais extenso. Com isso, h o aumento do tempo de exposio do antgeno no organismo pelo retardamento de sua
destruio, estimulando, assim, a migrao de clulas para o local de inoculao e aumentando a interao destas clulas com o mesmo. O tipo de adjuvante mais comumente usado em estudos experimentais o adjuvante de Freund, que pode ser classificado em dois tipos: AIF (Adjuvante Incompleto de Freund), que constitudo por leo mineral neutro e lanolina ou Arlacel; e o ACF (Adjuvante Completo de Freund), que alm do leo mineral neutro mais lanolina, adicionado um componente bacteriano, normalmente o Mycobacterium, morto pelo calor. Alm desses, outros adjuvantes so utilizados, como o sulfato de alumnio, o hidrxido de alumnio, a IL-12, entre outros. Dependendo da composio, adjuvantes podem ou no ser usados em seres humanos.
Bases qumicas da especificidade antignica
Anticorpos formados contra determinadas substncias tm uma reao forte contra elas, principalmente se os anticorpos interagem com os antgenos especficos que induziram a sua formao (antgenos homlogos), mas podem reagir com a mesma ou menor intensidade com outros antgenos, que so chamados de antgenos heterlogos, porm com estrutura semelhante. Essas reaes com antgenos heterlogos so denominadas reaes cruzadas. As reaes cruzadas podem ocorrer basicamente em funo da similaridade entre dois diferentes determinantes antignicos, ou ainda pelo fato de dois antgenos diferentes apresentarem o mesmo determinante antignico.
5. Diversidade das imunogobulinas
Os anticorpos so conceituados como glicoprotenas globulares com funo imunitria e pertencem superfamlia das imunoglobulinas. So sintetizados por linfcitos B e, principalmente, por plasmcitos, em resposta ao estmulo imunognico. Interagem, especificamente, com os imungenos, que estimulam sua biossntese; desencadeiam vrios mecanismos na fase efetora
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da resposta imune que, frequentemente, resultam em anular a ao de biopatgenos, por meio da ativao do sistema complemento, opsonizao dos antgenos para fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), em que os anticorpos marcam os microrganismos para serem destrudos pelas clulas do sistema imune inato e reaes de hipersensibilidades, entre outras ocorrem. Estas funes so estruturalmente separadas na molcula e a regio de ligao ao antgeno varia amplamente, sendo conhecida como regio varivel ou regio V. A regio molecular que participa da funo efetora conhecida como regio constante ou C, e no varia do mesmo modo, embora apresente cinco formas principais que se especializaram na ativao de diferentes mecanismos. A notvel diversidade das molculas dos anticorpos consequncia de um mecanismo altamente especializado, pelos quais os genes expressos so reunidos por rearranjos de DNA, que juntam dois ou trs diferentes seguimentos para formar um gene de regio varivel durante o desenvolvimento das clulas B. Subsequentes rearranjos nucleicos podem reunir o gene composto da regio varivel e qualquer gene da regio constante, produzindo assim anticorpos de cada um dos 5 isotipos. Estruturalmente (Figura 5), a imunoglobulina formada por duas cadeias leves (L-light-leve), idnticas, constitudas de polipeptdeos de cerca de 25 mil Daltons e de duas cadeias pesadas (H- heavy- pesado), tambm idnticas, com peso molecular de 50 mil Daltons ou mais. Cada cadeia leve est ligada a uma cadeia pesada por pontes dissulfdricas. O nmero exato e as posies destas pontes entre as cadeias diferem entre as classes e subclasses de Imunoglobulinas. Alm disso, ambas as cadeias, leves e pesadas, possuem uma regio varivel e outra constante. Portanto, a imunoglobulina possui na cadeia leve uma regio constante (CL) e uma varivel (VL). O mesmo na cadeia pesada, uma regio constante (CH) e uma varivel (VH). Existem dois tipos de cadeias leves, a kappa (k) e a lambda (l). Em humanos, 60% das
cadeias leves so do tipo kappa, e 40% so do tipo lambda. Os primeiros 110, ou mais, aminocidos da regio aminoterminal das cadeias leves ou pesadas variam muito entre os anticorpos de especificidade diferentes e por isto so chamadas de regio varivel. A molcula de imunoglobulina pode ser digerida por enzimas proteolticas. A digesto pela papana quebra a molcula em trs fragmentos (Figura 5): dois fragmentos chamados Fab (fragment antingen binding), que se liga ao antgeno especfico, e um fragmento denominado Fc (fragment crystallizable, fragmento cristalizvel), por formar cristais quando armazenado em locais frios. Os fragmentos Fab so os que contm as cadeias leves (L) completas, emparelhadas com os domnios V (varivel) e C (constante) da cadeia pesada, enquanto o Fc, contm apenas o domnio C (constante). A papana cliva a molcula na poro aminoterminal das pontes de enxofre, permitindo que as metades carboxiterminais da Fc permaneam unidas, deixando o fragmento Fc livre. J a pepsina, cliva na mesma regio, mas na poro carboxiterminal das pontes dissulfrdicas, produzindo o (Fab)2, onde os dois braos dos Ac permanecem unidos. Figura 5. Estrutrua bsica de uma imunoglobina e a formao dos fragmentos pela digesto enzimtica.
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5.1. Gerao da diversidade na resposta imune humoral e maturao da afinidade
Mesmo a resposta a um Ag simples diversa, com muitas molculas de Igs, cada uma com afinidade nica e especificidade acurada. Durante a organizao dos diferentes segmentos genticos necessrios para produzir uma molcula de Ig, combinaes ao acaso dos diferentes componentes gnicos produzem uma enorme diversidade potencial. Durante as fases iniciais do desenvolvimento do linfcito B, a IgM de membrana produzida como receptor. A mudana de isotipo em clulas B ocorre ao serem estimuladas pelo antgeno. Isto assegura a manuteno da mesma regio varivel, garantindo a especificidade ao Ag correspondente, expressa nos diferentes isotipos, aos quais orientam diferentes funes efetoras. Uma diferena bsica entre o Ac produzido na resposta primria e na resposta secundria a sua afinidade. O Ac da classe IgM, produzido para um Ag na resposta primria, tende a ser de afinidade relativamente baixa e pode contar com uma avidez adicional, causada por sua estrutura pentamrica, para ligar-se eficientemente ao Ag. Entretanto, a IgG e outras classes produzidas na resposta secundria tendem a ter uma afinidade maior. Vale ressaltar que o aumento gradual da afinidade do Ac pelo Ag indutor, que observado no curso de uma resposta, acontece no ndulo linftico. Este fenmeno (maturao da afinidade) a consequncia da hipermutao somtica dos genes de Ig acoplada com a seleo das clulas B com Ig de superfcie de alta afinidade. A maturao da afinidade, no curso de uma resposta imune, pode ser encarada como um processo darwiniano, requerendo primeiro a gerao de variabilidade nos receptores de clulas B e ento a seleo daqueles com maior afinidade pelo Ag. Aps esse processo, as clulas B, que se ligam ao Ag de modo bem-sucedido e sobrevivem seleo, saem do centro germinativo do ndulo linftico para tornarem-se clulas B de memria ou clulas plasmticas secretoras de Ac.
5.2. Distribuio e propriedades dos isotipos
Os agentes infectoparasitrios devem achar seus caminhos para a maior parte dos locais do organismo hospedeiro, e os anticorpos tambm devem ser amplamente distribudos para cont-los. Os anticorpos so distribudos por difuso atravs de mecanismos especiais, para lev-los, por exemplo, para os pulmes e o intestino. Anticorpos de diferentes isotipos (Figura 6) operam em locais diferentes. Os primeiros anticorpos a serem produzidos numa resposta imune humoral so sempre as IgMs. Estes so produzidos antes que a clula B tenha sofrido hipermutao somtica; portanto, tendem a ser de baixa afinidade, como visto anteriormente. Estas molculas formam pentmeros, cujos 10 stios de ligao com o Ag podem se unir simultaneamente a antgenos multivalentes, tais como os polissacardeos de parede celular bacteriana. Esta estrutura pentamrica tambm torna a IgM capaz de ativar o complemento de maneira mais eficaz, o que contribui para o controle mais eficiente de uma infeco. Quanto IgD, no se conhece muito bem a sua funo, mas parece exercer um papel na diferenciao dos linfcitos B induzida pelo Ag. O principal isotipo de imunoglobulina no sangue e nos fluidos extracelulares a IgG, considerando todas as subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). A IgG tem propriedades diversas, dentre as quais, confere proteo ao feto, pois a nica classe de imunoglobulina humana que pode ser transportada atravs da placenta diretamente para a corrente circulatria do feto. A IgG tambm atua na neutralizao de toxinas, imobilizao de bactrias, sensibilizao para NK, ativao do complemento e opsonizao. A IgA a principal imunoglobulina presente em secrees externas, como saliva, muco, suor, suco gstrico e lgrimas. Alm disso, a principal imunoglobulina contida no colostro e no leite, e deve ser no neonato a principal fonte de proteo contra patgenos no intestino. A IgA se divide em duas subclasses, IgA1 e IgA2. A IgA presente no plasma encontrada na forma monomrica e em pequenas concentraes, enquanto a forma dimrica
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encontrada em grandes concentraes nas regies mucosas do organismo. Estas previnem a invaso de bactrias ou a penetrao de toxinas nas clulas epiteliais. A IgE est difundida de maneira moderada nos espaos extravasculares e tem como principal propriedade a sensibilizao de mastcitos e basfilos, promovendo reao inflamatria, atravs da liberao de mediadores qumicos como a histamina, que, por sua vez, promove vasodilatao, permitindo a passagem de Acs do vaso para a rea lesada, e fatores quimioatraentes que recrutam fagcitos para o local de infeco. Alm disso, podem estar envolvidas em processos alrgicos e na ajuda para eliminao de helmintos, quando sensibilizam eosinfilos. Figura 6. Estrutura dos cinco principais isotipos de imunoglobulinas humanas
5.3. Polimorfismo das imunoglobulinas
Quando uma Ig usada como Ag, ela tratada como qualquer outra protena estranha e faz desencadear uma resposta de Ac. Pode ser produzido Ac anti-Ig que reconhea aminocidos caractersticos do isotipo do Ac injetado. Tambm possvel gerar Acs que reconhecem diferenas no Ac de membros da mesma espcie e tal fenmeno se deve variao gentica ou polimorfismo. Tais variantes allicas so chamadas de alotipos e representam
pequenas diferenas polimrficas nos loci, que codificam as regies constantes das cadeias leves e pesadas. Contrastando com os Acs anti-isotipos, os Acs anti alotipos reconhecero Ig de um dado isotipo em alguns representantes de uma dada espcie. Finalmente, as variaes na sequncia dos epitopos de uma Ig so conhecidas como idiotipos (Figura 7). Para a produo de Acs altamente especficos, a clivagem pela papana (Figura 5) essencial, pois esta enzima, como j foi dito anteriormente, corta a molcula antes das pontes de sulfeto, o que mantm a poro Fc inteira, e a produo dos Ac sero altamente especficas contra a regio Fc daquele isotipo. Quando se deseja uma molcula de Ac que no reaja com o sistema complemento e no se fixe em receptores para Fc de superfcie celular, cliva-se a Ig com a pepsina, que corta depois das pontes de sulfeto, o que mantm a frao (Fab)2 ntegra, permitindo a ligao especfica com o alvo desejado e impossibilitando as aes efetoras caractersticas do isotipo. Figura 7. Localizao das variaes isotpicas, alotpicas na molcula de imunoglobina.
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5.4. Anticorpos monoclonais
Em 1975, Georges Khler e Cesar Milstein planejaram um mtodo para a preparao do anticorpo monoclonal (Ac mo), atravs da fuso da clula B ativada normal produtora de anticorpo com uma clula do mieloma (uma clula plasmtica cancerosa). Neste evento, produziram uma clula hbrida (hibridoma), que possua as propriedades de crescimento imortal da clula do mieloma e secretava o Ac produzido pela clula B. Os clones resultantes das clulas do hibridoma que secretam grandes quantidades de Ac mo podem ser indefinidamente cultivadas. Os hibridomas de clulas B so produzidos utilizando polietilenoglicol (PEG) para fusionar as clulas do mieloma com as clulas B de animais que foram imunizados com o Ag, atravs do qual se deseja produzir os anticorpos. As clulas do mieloma contribuem para o crescimento imortal das clulas fusionadas, e as clulas B contribuem com a informao gentica para a sntese do Ac especfico de interesse. As condies do procedimento devem permitir seletivamente a sobrevivncia e o crescimento somente dos hibridomas. Para tal, utilizado o meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). Neste meio, a aminopterina bloqueia a sntese de DNA pela via de novo. Na presena de aminopterina, as clulas devem usar a via de salvamento, onde as enzimas catalisadoras so a fosforribosiltransferase hipoxantina-guanina (HGPRT) ou a timidina quinase (TK), para produzir o DNA. Uma mutao em qualquer uma destas duas enzimas bloqueia a habilidade da clula em usar a via de salvamento. Portanto, clulas do mieloma sozinhas morrero, pois so deficientes para as enzimas HGPRT ou TK, essenciais para a via de salvamento. Somente as hbridas iro sobreviver, pois a clula B contribui com a enzima que falta para a via de salvamento. Embora as clulas B no fusionadas sejam capazes de sobreviver no meio HAT, estas no vivem por perodos extensos in vitro e morrem. Aps a obteno dos hibridomas, estes devem ser diludos e distribudos em placas de cultura apropriada numa concentrao de 0,5 clula por poo. Tal procedimento nos dar a certeza de que o Ac produzido seja oriundo de
um nico clone, pois como no existe meia clula, teoricamente, teremos um poo vazio e outro com apenas uma clula. Feito isso, cada hibridoma, aps multiplicao e produo de Ac, ser examinado por teste sorolgico, tendo em vista a identificao dos hibridomas desejados, ou seja, aqueles que sintetizam o anticorpo monoclonal que reaja com o Ag correspontente. Uma vez identificados, os hibridomas so induzidos proliferao, tornando-se assim uma fonte inesgotvel de anticorpos altamente especficos. Os Ac mo so muito teis como reagentes para diagnstico, exames de imagem e procedimentos teraputicos na clnica mdica. Para diagnstico, podem ser utilizados na deteco de gravidez, diagnstico de numerosos microrganismos patognicos, medidas de nveis sanguneos de vrias drogas, tipagem sangunea, tipagem de antgenos de histocompatibilidade, caracterizao fenotpica de diversos tipos celulares e deteco de antgenos produzidos por determinados tumores. Por exemplo, para esse propsito, Ac mo radiomarcados podem ser utilizados in vivo na deteco ou localizao de antgenos tumorais, permitindo diagnsticos precoces de alguns tumores primrios ou metastticos nos pacientes. Na imunoterapia, o Ac mo especfico para um determinado Ag tumoral de superfcie, acoplado com um quimio ou radioterpico, pode ser potente agente teraputico.
6. Sistema completo
O nome complemento foi originado a partir da atividade complementar de protenas na ao bactericida de alguns Acs. O sistema complemento um complexo proteico existente no plasma, sob a forma inativa, constitudo por substncias termolbeis e/ou termoestveis; e que tem como funo a eliminao de um agente estranho pela ativao de mecanismos inespecficos, que se constitui de:
Fagocitose - quando algumas protenas ativadas do complemento unem-se
a bactrias, opsonizando-as para ingesto pelos fagcitos portadores de receptores do complemento;
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Reao inflamatria - quando os pequenos fragmentos de protenas
promovem eventos vasculares e recrutam fagcitos ao local da atividade inflamatria.

Lise - quando uma vez desencadeada a cascata, os componentes terminais
do complemento lesam certas bactrias, vrus e clulas com a formao de poros na membrana celular. Alm dessas trs funes, o sistema complemento tambm responsvel pela depurao imune, que consiste na remoo de complexos imunes da circulao no bao e no fgado. Este sistema, com cerca de 30 protenas ou mais, interage por ativao enzimtica. O complemento pode agir sozinho ou com Ac e so conhecidas 3 vias, a clssica, a alternativa e a via das lectinas. A via clssica ativada por complexos imunes, enquanto as vias alternativa e das lectinas so ativadas por microrganismos. Todas as vias de ativao convergem para uma etapa final de reao em cadeia denominada sequncia comum (Figura 8). Figura 8. Vias de ativao do sistema complemento
No processo de ativao, que envolve uma srie de etapas proteolticas, uma protena precursora inativa clivada para fornecer um grande fragmento ativo; esta se une superfcie celular e contribui para a prxima clivagem, e um pequeno fragmento peptdico que liberado serve como mediador de resposta inflamatria. Cada uma das trs vias de ativao gera uma convertase de C3 por um caminho diferente, determinando que as principais molculas efetoras e os eventos tardios sejam os mesmos para as trs vias. importante lembrar que a ativao inadequada e a persistncia dos efeitos inflamatrios so potencialmente prejudiciais ao organismo, de modo que a sua regulao precisa ser bem rigorosa. E uma das maneiras de controle se resume ao pouqussimo tempo que os componentes-chaves permanecem ativos (milsimos de segundos), a menos que se liguem a uma superfcie celular. Alm da curta vida-mdia dos fragmentos do complemento, existem vrios pontos na via de ativao, nos quais podem atuar protenas reguladoras, o que previne a ativao inadvertida do complemento sobre clulas do hospedeiro e evita a leso de clulas do organismo. Quanto nomenclatura, todos os componentes da via clssica so designados pela letra C, seguida por uma designao numrica simples: C1, C2. Os componentes foram numerados pela ordem de descoberta e no segundo a sequncia de reaes (C1, 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8 e 9). Quanto aos produtos de clivagem, so designados por letras minsculas, onde o maior fragmento recebe a letra b (exceto o fragmento C2, que recebe a letra a) e o menor, a letra a. Os componentes iniciais da via alternativa, em vez de serem numerados, so indicados pelas letras maisculas B e D, e seus produtos de clivagem tambm so designados pelas letras b e a, onde o maior fragmento Bb e o menor, Ba. Quanto aos componentes ativados, recebem uma linha horizontal superior, por exemplo, Bb.
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6.1. Ativao da via clssica
O componente C1 um complexo formado por trs protenas C1q, C1r e C1s. Uma vez formado o complexo Ag-Ac, o componente C1q se liga na regio Fc do Ac, dando incio a uma reao em cascata, onde C1q ativa duas molculas de C1r capazes de se ligar a outras duas de C1s, resultando no complexo C1q-C1s-C1r-C1r-C1s, que uma serina protease. Desta forma, C1s atua em C4 e C2, dissociando-as em C4a e C4b, C2a e C2b. Nesta etapa, a unio de C4b a C2b (em alguns livros, C2a) forma a C3 convertase. Aps a formao da C3 convertase, esta cliva C3 em C3a e C3b. O C3 a frao mais abundante no plasma e o mais importante entre os componentes do complemento, pois inmeras molculas de C3b podem se ligar superfcie de um patgeno. Alguns fragmentos C3b se ligam a receptores da membrana e atuam como opsoninas, facilitando a fagocitose, outros fragmentos de C3b se ligam a C3 convertase, originando a C5 convertase (C4bC2bC3b) da via clssica (Figura 9), que vai atuar em C5 dissociando-o em C5a e C5b. Com a dissociao de C5, inicia-se uma etapa comum a todas as vias de ativao do complemento, onde a frao C5b interage com C6, que abre um stio de ligao para C7. Por sua vez, o complexo C5bC6C7 deposita-se na superfcie da membrana e abre o stio de ligao para C8, que penetra na membrana da clula. O C8, ento, abre um stio para C9, que, aps a ligao de vrios C9, forma um canal transmembrnico ou poro hidroflico, chamado de complexo de ataque membrana (MAC), ocasionando lise celular e desequilbrio osmtico. importante ressaltar que no curso da cascata do sistema complemento, os fragmentos menores C4a, C2a, C3a e C5a liberados no interstcio, so potentes mediadores inflamatrios.
Figura 9. Ativao da cascata do complemento pela via clssica.
6.2. Via das Lectinas
A via das lectinas (Figura 10) semelhante via clssica. As lectinas so protenas, ou glicoprotenas, que se ligam a carboidratos e podem ativar a via clssica do complemento na ausncia do complexo antgeno-anticorpo. A principal lectina a protena ligadora de manose (MBL), que faz o papel de C1q ao se ligar resduos de carboidratos da superfcie de uma bactria ativadora ou outras substncias. A MBL est associada com duas pr-enzimas MASP-1 e MASP-2 (Serina Protease Associada a MBL). Quando a MBL se liga aos grupamentos manose terminais nos carboidratos bacterianos, MASP1 e MASP-2 so ativadas e continuam a ativar a via clssica.
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Figura 10. Ativao da cascata do complemento pela via das lectinas
6.3. Via Alternativa
Com exceo da etapa inicial, os eventos da via alternativa (Figura 11) so homlogos aos da via clssica e das lectinas. A via alternativa constantemente ativada, em taxa muito reduzida, a qual aumenta drasticamente na presena de superfcies ativadoras adequadas, como as membranas celulares de microrganismos. Esta via pode ser ativada pela ligao do C3b ou de uma forma hidrolizada espontaneamente, conhecida como iC3b, superfcie do patgeno. Este se liga ao fator B, formando C3bB, componente suscestvel ao fator D, uma protease do plasma. O fator D cliva o componente B em Ba e Bb, onde Bb permanece ligado ao C3b, formando a molcula C3bBb que a C3 convertase da via alternada. A C3 convertase da via alternativa produzir mais C3b, tornando o sistema mais ativo, pois muitos fagcitos possuem receptores para este componente. A C3 convertase da via alternativa extremamente instvel e, por isso, costuma sofrer rpida dissociao. No entanto, uma protena plasmtica denominada properdina se liga a esta convertase e a estabiliza, diminuindo sua degradao e permitindo a continuao da cascata.
Nesta via, alguns C3b se ligam ao C3bBb e formam a C5 convertase da via alternada C3b2Bb ou C3bBbC3b. Este complexo cliva C5 em C5a e C5b, dando incio a sequncia comum, onde C5b inicia o complexo de ataque membrana, ligando-se a C6, C7, C8 e C9 (Figura 12). Figura 11. Ativao da cascata do complemento pela via alternativa.
Figura 12. Sequncia final da cascata do complemento comum a todas as vias de ativao, onde C5b inicia o complexo de ataque membrana, ligando-se a C6, C7, C8 e C9.
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7. Complexo principal de histocompatibilidade
Todo organismo multicelular possui algum sistema de defesa que distingue agentes infectoparasitrios e elimina-os do hospedeiro. Mais ainda, os grandes vertebrados tm um sistema imune mais evoludo que pode discriminar o que estranho e fazer uma resposta seletiva para o mesmo. A vantagem de tal imunidade especfica a rpida adaptao do sistema imune aos agentes patognicos que so mais frequentemente encontrados no meio ambiente local. Esta capacidade conseguida atravs do complexo principal de histocompatibilidade, cujos produtos desempenham um papel no reconhecimento intercelular e na discriminao entre o prprio e no prprio. A identificao das molculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) aconteceu pela investigao da sua funo na resposta imunolgica aos tumores, na rejeio de transplantes de pele e no controle da resposta imune.
7.1. Estrutura das molculas do MHC
Os genes que codificam as molculas do MHC esto localizados no cromossomo 6 humano e no 17 em camundongos, denominados antgenos leucocitrios humanos (HLA) e de histocompatibilidade (H-2), respectivamente. O MHC pode ser dividido em quatro subconjuntos de genes ou classes: classes I, II, III e IV, sendo os de classe I e II ligados ao processamento e apresentao de antgenos, enquanto os genes que compem as classes III e IV codificam para outras protenas, estando algumas relacionadas com a resposta imune, tais como componentes do sistema complemento, algumas citocinas, etc. Em humanos, existem trs loci que codificam as molculas de classe I, os quais so denominados HLA-A, HLA-B e HLA-C, e trs loci gnicos do MHC de classe II, que so denominados HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR. Normalmente, um indivduo herda duas cpias de cada locus gnico (um de cada progenitor). Assim, em humanos, temos seis loci de classe I e seis loci de classe II. Todos esses loci apresentam alto grau de polimorfismo, ou seja,
apresentam mltiplos alelos na populao. As molculas do MHC de classe I, que esto presentes na maioria das clulas nucleadas, so reconhecidas principalmente pelo TCR de linfcitos T CD8, ao passo que as molculas de classe II, presentes principalmente na superfcie das clulas apresentadoras de antgenos profissionais, so reconhecidas pelo TCR dos linfcitos T CD4.
7.2. MHC de classe I
As molculas do MHC de classe I so expressas na membrana celular da maioria das clulas nucleadas dos vertebrados. Sua estrutura constituda por uma cadeia a (alfa) de aproximadamente 45kDa, que atravessa a membrana plasmtica. A outra a b2- microglobulina de 12kDa que se encontra fracamente ligada membrana. Os genes que codificam a cadeia a (varivel) esto localizados dentro da regio genmica do MHC, enquanto os genes que codificam a b2-microglobulina (invarivel) esto localizados fora da regio do MHC no cromossomo 15 humano. A cadeia a formada por trs segmentos a1, a2 e a3. A regio em que o peptdeo se liga corresponde regio amino-terminal e composta pelos segmentos a1 e a2, que formam uma fenda ou bolsa onde ele se encaixa. O tamanho dessa fenda permite ligar peptdeos de 8 a 11 aminocidos e corresponde regio do MHC de classe I que interage com o TCR do linfcito T. Por essa razo, os antgenos proteicos precisam ser processados para gerar peptdeos, pequenos o suficiente para se ligarem molcula do MHC. A regio invarivel, que corresponde ao segmento a3, se liga ao correceptor CD8 do linfcito T. Essa ligao confere a especificidade da molcula de classe I com a clula T CD8. O domnio a, tambm se liga de forma no covalente molcula b2-microglobulina, sendo esse complexo estabilizado pelo peptdeo processado que se liga nos domnios a1 e a2 (Figura 13). Somente nessa forma estvel a molcula do MHC de classe I expressa na superfcie das clulas.
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7.3. MHC de classe II
As molculas do MHC de classe II tambm so expressas na membrana celular. Mas estas so expressas na superfcie de clulas apresentadoras de antgenos profissionais. Essas clulas incluem as clulas dendrticas, os macrfagos e os linfcitos B. A molcula de classe II formada por uma cadeia a e uma b. A cadeia a tem 32-34kDa, enquanto a cadeia b tem 29-32kDa (Figura 13). As duas cadeias do MHC de classe II so codificadas dentro da regio genmica do MHC e ambas so polimrficas, ou seja, so variveis. As cadeias a e b, na poro extracelular, possuem domnios a1 e a2 e b1 e b2, onde a poro varivel das duas cadeias so os segmentos a1 e b1, conforme pode ser visto na Figura 13. Os domnios a1 e b1 interagem para formar a fenda de ligao ao peptdeo, que estruturalmente bastante similar molcula do MHC de classe I. Esta fenda, ou bolsa onde se encaixa o peptdeo a ser apresentado clula T. Assim, como de se esperar, esta tambm a regio da molcula do MHC de classe II que apresenta maior variabilidade. Na molcula de classe II, as extremidades da fenda de ligao do peptdeo so abertas, o que permite a ligao de peptdeos de 10-30 aminocidos, mas pode ocorrer ligao de peptdeos maiores, o que no acontece com a molcula de classe I que tem as extremidades fechadas. Figura 13. As trs classes de genes no MHC humano e a expresso dos produtos de classe I e II.
7.4. Processamento e apresentao de antgenos s clulas T CD8
Antgenos apresentados pelas molculas de MHC de classe I so, na maioria das vezes, gerados dentro da mesma clula que produziu a molcula de classe I. Os peptdeos gerados so derivados de protenas que se encontram no citosol da clula, que podem ser da prpria clula, de origem viral ou de outros microrganismos intracelulares e antgenos tumorais. Os antgenos, em geral protenas presentes no citoplasma, so degradados em peptdeos por um complexo multiproteoltico denominado proteassoma. Esses peptdeos so transportados do citoplasma para o retculo endoplasmtico rugoso por intermdio de uma protena transportadora de antgeno (TAP). Os peptdeos transportados pela TAP para dentro do retculo endoplasmtico se ligam molcula nascente do MHC classe I, tornando-a estvel. Assim, o complexo resultante, MHC classe I e peptdeo, deixam o retculo endoplasmtico e movem-se para o complexo de Golgi, do qual transportado para a superfcie da clula onde reconhecido pela clula T CD8.
7.5. Processamento e apresentao de antgenos s clulas T CD4
As molculas do MHC de classe II tambm se ligam a peptdeos originados da degradao proteica, mas, geralmente, os peptdeos resultam da protelise de molculas endocitadas ou partculas fagocitadas pelas APC. As partculas so internalizadas em vesculas intracelulares, denominadas endossomas, que se fundem com lisossomas, contendo enzimas proteolticas. A vescula resultante dessa fuso chamada fagolisossoma. O processo de degradao do antgeno ocorre em condies cidas, que o pH timo para a ao das enzimas proteolticas, e os peptdeos originados da degradao se ligam na fenda da molcula do MHC de classe II. Quando recm-sintetizada no retculo endoplasmtico, a molcula do MHC de classe II tem a fenda protegida por uma protena denominada cadeia invariante (Ii). Desse modo, a fenda do MHC classe II no pode acomodar peptdeos presentes no retculo
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endoplasmtico. Essa molcula de classe II , ento, direcionada para os fagolisossomas, onde se encontram os peptdeos exgenos resultantes da protelise dos antgenos. Nos fagolisossomas, as enzimas proteolticas digerem a cadeia II; porm, no totalmente, restando o fragmento chamado peptdeo de classe II, associado cadeia invariante (CLIP = class II associated invariant chain peptide). Com a remoo do CLIP, por meio da molcula HLA-DM, o peptdeo processado pode se ligar fenda da molcula de classe II e ser reconhecido especificamente pelos linfcitos T CD4.
8. Resposta celular e resposta humoral
Se a resposta inata for suficiente para anular a ao de um agente infectoparasitrio, no ocorrer ativao da resposta imune adaptativa e, portanto, no formar memria imunitria. Por outro lado, caso ocorra persistncia da infeco, devido aos mecanismos de escape desse agente, haver a necessidade da ativao da resposta imune adaptativa. Em funo da natureza do agente infectoparasitrio e da forma com que seus antgenos so processados, a resposta imune adaptativa pode seguir dois caminhos distintos, que levam proliferao de clulas CD8+ (resposta celular predominantemente Th1) e secreo de anticorpos por clulas B e plasmcitos (resposta humoral predominantemente Th2) (Figura 14). Th1 e Th2 no so sinnimos de resposta celular e humoral. Existe predomnio, mas clulas Th2 so funcionais, e existem anticorpos IgG ligados ao Th1. A imunidade mediada por clulas se desenvolve por uma rede de interaes que resulta em defesa contra microrganismos que sobrevivem dentro de fagcitos ou de outras clulas. Os antgenos de patgenos processados no citosol, fora de vesculas cidas, so conduzidos at a superfcie celular pela molcula de classe I e apresentados para as clulas T CD8+ que eliminam diretamente a clula infectada, enquanto os antgenos de patgenos processados em vesculas cidas so apresentados pelas molculas de classe II s clulas
T CD4+, que podem se diferenciar em dois tipos: CD4+Th1, que ativam clulas mononucleares (macrfagos e linfcitos) e CD4+Th2, que induzem a proliferao e diferenciao das clulas B em plasmcitos produtores de anticorpos. Figura 14. Esquema geral da resposta celular e humoral
8.1. Resposta celular e o mecanismo de ao das clulas T CD8+
Os linfcitos T CD8+ ativados se diferenciam em clulas T citolticas (CTL), que destroem somente as clulas portadoras do antgeno associado a produtos de classe I do MHC, no danificando a clula vizinha durante o evento. O mecanismo de ao pode ocorrer pela lise direta atravs das enzimas perforinas e granzimas, como tambm pela induo de apoptose. No primeiro processo, aps a ligao do TCR/CD3 com o antgeno via MHC I, os microtbulos da clula CD8+ se movem para a rea de contato com a clula alvo, e os grnulos contendo as enzimas citolticas tambm se aglomeram nesta regio. Neste contato, as protenas formadoras de poros (perforinas) entram em contato com concentraes de Ca++ e sofrem polimerizao. Esta
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polimerizao forma um canal permevel a ons na membrana plasmtica da clula alvo, levando a um desequilbrio osmtico e lise (Figura 15). Alm de lise direta, as clulas CD8+ CTL produzem IFN-g, que estimula a atividade fagocitria de macrfagos, inibe diretamente a replicao de vrus e induz a expresso de molculas de classe I. O segundo mecanismo de destruio de clula-alvo envolve a interao da molcula ligante de Fas, denominada Fas-L e presente no CTL, com a molcula Fas (CD95), presente na clula alvo. Essa interao leva a clula-alvo apoptose, que tambm pode ser induzida pela ao das granzimas. Neste evento, as clulas acometidas condensam o citoplasma e a cromatina, formando os corpos apoptticos, que sero fagocitados rapidamente por clulas vizinhas sem a formao de reao inflamatria adjacente (Figura 15). Um efeito adicional da apoptose a ativao de enzimas celulares que degradam genomas virais em at 200 pares de bases e seus mltiplos. Figura 15. Necrose e apoptose induzidas por clulas T citotxicas
8.2. Mecanismo de ao das clulas CD4+ Th1 e CD4+ Th2
Alguns microrganismos como Mycobacterium spp so patgenos intracelulares que crescem em vesculas, onde so parcialmente protegidos da ao dos anticorpos e das clulas CD8 CTL. Estes normalmente inibem a fuso destas vesculas com o lisossomo, prevenindo sua destruio. Diante disso, esses microrganismos so eliminados normalmente quando estas clulas so ativadas atravs de citocinas inflamatrias, como o IFN-g, produzido pelas clulas CD4+Th1. O processo de ativao, atravs do contato dos macrfagos com as clulas CD4+Th1, gera uma srie de aes bioqumicas que convertem o macrfago numa potente clula anti bacteriana. Estas reaes so: fuso do fagossomo com o lisossomo, expondo as bactrias s enzimas lisossomais; aumento da expresso de MHC de classe I e classe II; expresso de receptor de TNF-a e secreo de TNF-a, que junto com o IFN- g, sinergiza para o aumento da ao bactericida, resultando na produo de xido ntrico (NO) e oxignio reativo (O2); secreo de IL-12, que orienta a diferenciao de clulas Th0 para Th1; e secreo de IL-10, que inibe a produo de IFN- g e serve para amortecer os efeitos lesivos da ativao exacerbada de macrfagos nos tecidos. Quando um patgeno resiste aos efeitos iniciais da resposta imune celular, pode-se evoluir para uma inflamao crnica, consistindo intenso infiltrado mononuclear e proliferao de tecido conjuntivo caracterstico de inflamao inespecfica ou por um padro de inflamao crnica que se distingue pela formao de granuloma que se caracteriza por agregados de macrfagos ativados, os quais assumem uma aparncia epitelioide circundados por linfcitos T. Frequentemente, mas no invariavelmente, clulas gigantes multinucleadas, que derivam da fuso de vrios macrfagos, so encontradas em granulomas mais antigos. As clulas CD4 Th1 e Th2 participam regulando tais granulomas com produo de citocinas inflamatrias e anti-inflamatrias, prevenindo a disseminao dos patgenos e leses tissulares.
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8.3. Resposta humoral
Muitas bactrias importantes nas doenas infecciosas humanas se multiplicam nos espaos extracelulares do organismo, e a maior parte dos patgenos intracelulares se dissemina de uma clula para outra atravs dos fludos extracelulares. A resposta imune humoral conduz destruio dos microrganismos extracelulares e seus produtos, como, por exemplo, as toxinas; alm de tambm prevenir ou diminuir a disseminao das infeces intracelulares, atravs da neutralizao desses agentes. Os anticorpos tambm facilitam o reconhecimento de microrganismos por clulas fagocitrias, permitindo que assim sejam ingeridos e digeridos, como ativam o sistema complemento, potencializando a opsonizao, recrutando clulas inflamatrias para o local da infeco e lisando certos microrganismos pela formao dos poros em suas membranas (Figura 16). Figura 16. Alguns mecanismos efetores da resposta mediada por anticorpos
Nesta resposta, a ativao das clulas B e sua diferenciao em clulas plasmticas secretoras de imunoglobulinas deflagrada pelo antgeno especfico e requer a participao de clulas CD4 Th2 (Figura 14), que tambm controlam a mudana de isotipo e desempenham papel importante na hipermutao somtica, o que necessrio para a maturao da afinidade dos anticorpos, que ocorre no curso da resposta humoral. A imunoglobulina de superfcie funciona como receptor de antgenos, ou BCR, e realiza dois papis na ativao: a transduo de sinal direto para o interior da clula, quando se une ao antgeno e a conduo desses antgenos aos stios intracelulares, para ser degradado e levado superfcie do linfcito B, onde, por sua vez, so reconhecidos por CD4 Th2 antgenos especficos. Esta resposta dependente da clula T chamada de timo-dependente (TD). Porm, alguns antgenos, como os lipopolissacardeos (LPS) bacterianos, podem ativar diretamente linfcitos B, e tal resposta chamada de timo-independente (TI). Anticorpos de alta afinidade neutralizam toxinas, vrus e bactrias. Mas, podem no resolver o problema, pois muitos agentes no so neutralizados pelos anticorpos e devem ser removidos por outros meios. Assim, o papel dos anticorpos nestas situaes ativar outras clulas (clulas efetoras acessrias), que tenham receptores para Fc de Imunoglobulina. Dentre essas, podemos citar macrfagos e neutrfilos, que ingerem bactrias recobertas por IgG; assim como as NK, que lisam diretamente parasitos recobertos por IgG; e ainda clulas infectadas com vrus, recobertas tambm com IgG. Tal fenmeno acontece por um mecanismo denominado citotoxidade celular, dependente de anticorpo (ADCC). Alm da ADCC, via IgG, exercida pela NK, o mesmo fenmeno pode ser observado por meio da IgE, onde as clulas citotxicas so os eosinfilos, e a importncia da ADCC via IgE se deve ao fato de que alguns parasitos no so mortos diretamente por fagocitose, somente atravs dos mediadores liberados por estas clulas. A IgE tambm participa na sensibilizao e ativao de mastcitos promovendo liberao de substncias que dilatam vasos sanguneos e recrutam clulas inflamatrias.
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9. Resposta imune aos agentes infectoparasitrios
O ambiente em que vivemos povoado por muitas espcies de microrganismos onde uma pequena parcela tem a capacidade de causar doenas. O sistema imune evoluiu no sentido de promover aes que resultem na defesa contra estes microrganismos, contribuindo para a recuperao e manuteno da homeostase. Os agentes infectoparasitrios diferem em sua patogenicidade e virulncia. A patogenicidade refere-se capacidade de um organismo causar doena, e a virulncia o grau de patogenicidade. Portanto, a patogenicidade depende das caractersticas do agente, do estado imunitrio do hospedeiro e dos determinantes socioambientais. Em indivduos com sistema imunitrio normal, os agentes infectoparasitrios devem ser suficientemente virulentos para se estabelecer e causar infeco. Por outro lado, indivduos com sistema imunitrio debilitado, agentes pouco virulentos, tais como os comensais, podem causar leses graves. Neste tpico sero abordados os principais mecanismos de resposta s aes dos vrus, bactrias, protozorios e helmintos que parasitam o organismo humano. Os vrus so microrganismos intracelulares obrigatrios, que se replicam no interior das clulas e podem causar leso tecidual e doena, por vrios mecanismos (Figura 17). A replicao viral interfere com a sntese e com as funes normais das protenas celulares, levando leso da clula infectada e morte. Este o efeito citoptico, e se diz que a infeco ltica. Vrus no citopticos podem causar infeces latentes, durante as quais residem nas clulas do hospedeiro e produzem protenas estranhas ao mesmo tempo em que estimulam a imunidade especfica. Em decorrncia, as clulas infectadas so reconhecidas e mortas pelas clulas CTL. As protenas virais tambm podem estimular as reaes de hipersensibilidade tardia (DTH), e a leso celular uma consequncia direta das respostas imunes fisiolgicas contra os vrus.
Figura 17. Mecanismos pelos quais os vrus lesionam as clulas
Os principais mecanismos de imunidade inata aos vrus envolvem a estimulao direta de IFN a/b pelas clulas infectadas, que funcionam inibindo a replicao viral e lise das clulas infectadas pelas clulas NK. Alm desses mecanismos, a ativao do sistema complemento e a fagocitose servem para eliminar vrus de locais extracelulares. Na imunidade especfica, combina-se a resposta celular com a resposta humoral. Os anticorpos especficos se ligam s protenas do envelope ou do capsdeo, impedindo a fixao do vrus na clula hospedeira e, consequentemente, impedindo sua penetrao (Figura 16). Alm disso, os anticorpos IgG opsonizantes tambm podem potencializar a remoo pela fagocitose (Figura 16) ou destruio das clulas infectadas atravs da ADCC via clulas NK. Embora os anticorpos sejam importantes na imunidade contra vrus, eles no so suficientes para eliminar infeces virais.
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Contudo, o principal mecanismo contra uma infeco viral estabelecida atravs de uma resposta celular via CD8+ citolticos especficos, que destroem as clulas infectadas, estimulam a ao de enzimas intracelulares que degradam genomas virais e secretam citocinas com ao de interferon. As bactrias extracelulares causam doena de duas maneiras: induzindo reao inflamatria que resulta na destruio tecidual no local da infeco e produzindo toxinas, que possuem diversos efeitos patolgicos. Estas podem ser endotoxinas (componentes da parede celular bacteriana) ou exotoxinas (ativamente secretadas pelas bactrias). Portanto, as respostas imunes contra bactrias extracelulares visam eliminar a bactria e o efeito de suas toxinas. O principal mecanismo de imunidade inata a fagocitose por neutrfilos, moncitos e macrfagos, mas a resistncia destas bactrias fagocitose e a sua digesto um determinante na virulncia. A ativao do sistema complemento na ausncia do anticorpo importante, pois a produo de C3b opsoniza a bactria e favorece a fagocitose. O MAC lisa diretamente a bactria e os subprodutos do complemento (fragmentos menores), que participam da resposta inflamatria recrutando e ativando leuccitos. A imunidade humoral especfica a principal resposta protetora contra essas bactrias e consiste do reconhecimento de antgenos proteicos por clulas CD4+ Th2, apresentados via MHC de classe II. Os anticorpos especficos, alm de neutralizarem bactrias e suas toxinas, impedindo sua ligao s clulas alvo, ativam o sistema complemento potencializando suas aes. Quanto s bactrias que sobrevivem no interior de clulas hospedeiras, as mais patognicas so aquelas que sobrevivem no interior dos macrfagos, como as microbactrias. Por serem praticamente inacessveis aos anticorpos, sua eliminao requer mecanismos diferentes daqueles observados para bactrias extracelulares. O principal mecanismo de imunidade inata contra essas bactrias atravs da fagocitose, mas estas podem ativar diretamente ou indiretamente clulas NK, que promovem uma defesa precoce contra bactrias intracelulares
antes da resposta especfica. A principal resposta especfica contra essas bactrias a resposta celular, com atuao de clulas Th1 (CD4+ e/ou CD8+) que estimulam os macrfagos a produzirem diversas substncias bactericidas. Desta maneira, as clulas CD4+ Th1 e CD8+ Th1 atuam em conjunto na resposta celular contra bactrias intracelulares e o mecanismo exercido por uma pode complementar o da outra. importante salientar que a ativao de macrfagos tambm pode causar leso tecidual, manifestada pela reao de hipersensibilidade tardia (DTH ou HT), assim como as observadas nas infeces virais e em outros agentes infectoparasitrios. Em termos muito genricos, os anticorpos so mais eficazes contra os parasitos extracelulares e os CTLs, contra os intracelulares. Em outras palavras, as citocinas produzidas pelas clulas T CD4+ podem ser importantes na determinao do resultado da infeco, uma vez que as clulas Th1 e Th2 possuem um perfil de citocinas contrastante e de contrarregulao, mostrando que o papel das clulas Th1 e Th2 na determinao do resultado da infeco sugere que as respostas das clulas Th1 levem morte dos patgenos intracelulares e que as respostas das clulas Th2 eliminem os patgenos extracelulares. Todavia, isto muito mais uma simplificao didtica do que o quadro real. O tipo de resposta que conferir maior proteo depende da natureza e da fase evolutiva do parasito. Por exemplo, o anticorpo por si s, ou combinado com o complemento, pode danificar alguns parasitos extracelulares, mas ser sempre melhor quando atuando com uma clula efetora. Diferentes mecanismos efetores atuaro em uma nica infeco contra os diferentes estgios do ciclo de vida do parasito. Assim, na malria, os anticorpos contra as formas livres bloqueiam sua capacidade para invadir novas clulas, mas as respostas mediadas por clulas impedem o desenvolvimento da fase heptica nos hepatcitos. A imunidade protetora na malria no se correlaciona simplesmente com os nveis de anticorpos e pode at ser induzida na ausncia deles.
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O parasito precisa superar os mecanismos de defesa preexistentes no hospedeiro, para que possa se estabelecer com sucesso antes da iniciao da resposta imune especfica do hospedeiro. O complemento exerce um papel nesta fase, uma vez que vrios tipos de parasitos, incluindo os vermes adultos e as larvas infectantes, possuem molculas em sua superfcie de revestimento que ativam a via alternativa. Macrfagos, neutrfilos, eosinfilos e plaquetas constituem a primeira linha de defesa. Anticorpos e citocinas, produzidos especificamente em resposta aos antgenos parasitrios, potencializam as atividades antiparasitrias de todas estas clulas efetoras. Entretanto, os macrfagos teciduais, moncitos e granulcitos possuem alguma atividade intrnseca antes mesmo da potencializao. Os tripanossomos e os parasitos da malria (plasmdios) que penetram no sangue so removidos da circulao por clulas fagocticas no fgado e no bao. Antes de agirem como clulas apresentadoras de antgenos na iniciao de uma resposta imune, os macrfagos atuam como clulas efetoras que inibem a multiplicao dos parasitos ou at mesmo os destroem. Estas clulas tambm secretam molculas que regulam a resposta inflamatria e potencializam a imunidade atravs da ativao de outras clulas. A fagocitose pelos macrfagos fornece uma defesa importante contra os parasitos menores; entretanto, estas clulas tambm secretam muitos fatores txicos que permitem a destruio dos parasitos sem a internalizao. Quando ativados pelas citocinas, os macrfagos podem destruir parasitos extracelulares relativamente pequenos, como os estgios eritrocitrios do plasmdio, e tambm os parasitos maiores, como os estgios larvais do esquistossomo. Os macrfagos tambm atuam como clulas exterminadoras atravs da ADCC. A ativao dos neutrfilos e macrfagos uma caracterstica geral dos estgios iniciais da infeco. Todas as funes efetoras dos macrfagos so potencializadas logo aps a infeco. Embora sua ativao especfica seja induzida por citocinas secretadas pelas clulas T, como IFNg, GM-CSF, IL-3 e IL-4,
mecanismos T-independentes tambm podem ativ-los. Neste caso, clulas NK secretam IFNg quando estimuladas pela IL-12 produzida pelos macrfagos. As propriedades efetoras exibidas pelos macrfagos tambm podem ser apresentadas pelos neutrfilos. Os neutrfilos so clulas fagocticas que podem destruir os agressores, seja por mecanismos dependentes de oxignio, seja por independentes, como o xido ntrico. Os neutrfilos produzem uma exploso oxidativa mais intensa do que os macrfagos e seus grnulos secretores contm protenas altamente citotxicas. A destruio extracelular pelos neutrfilos mediada por H202, enquanto os componentes granulares esto envolvidos na destruio intracelular dos organismos internalizados. Os neutrfilos esto presentes nas leses inflamatrias causadas por parasitos e provavelmente atuando na eliminao desses parasitos das clulas rompidas. Como os macrfagos, os neutrfilos possuem receptores para Fc e receptores para complemento e podem participar das reaes citotxicas dependentes de anticorpo, a fim de destruir as larvas de Schistosoma mansoni, por exemplo. Dessa forma, os neutrfilos so mais destrutivos do que os eosinfilos para vrias espcies de nematdeos, embora a eficcia relativa dos dois tipos celulares possa depender do istipo e da especificidade do anticorpo. Os eosinfilos esto associados a infeces helmnticas e se encontram envolvidos especificamente na defesa contra os estgios teciduais de helmintos, que so grandes demais para serem fagocitados. A reao do mastcito dependente de IgE consta primariamente em localizar os eosinfilos prximos ao parasito e, ento, potencializar suas funes antiparasitrias. Os eosinfilos so clulas de menor potencial fagoctico perante os neutrfilos, no entanto, sofrem um processo de desgranulao em resposta a distrbios em sua membrana celular, liberando o contedo granular sobre a superfcie dos parasitos. O dano aos helmintos pode ser causado pela protena bsica principal (MBP). A MBP no especfica para um determinado alvo, mas o dano s clulas do hospedeiro muito pequeno, uma vez que a
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protena fica confinada a um espao diminuto entre o eosinfilo e o verme. Os eosinfilos e os mastcitos podem agir em conjunto na destruio das larvas de helmintos, onde os produtos dos mastcitos potencializam a ao dos eosinfilos. Desta forma, os antgenos liberados provocam desgranulao local dos mastcitos dependentes de IgE e a liberao de mediadores, que atraem seletivamente os eosinfilos para o local, potencializando ainda mais suas atividades (Figura 18). Figura 18. Expulso de helmintos parasitos do lume intestinal
A resposta imune contra Trypanosoma cruzi depende no apenas das clulas T CD4+ e CD8+, mas tambm das NK e da produo de anticorpos. O mesmo verdadeiro para a resposta imune contra o Toxoplasma gondii. As clulas NK, estimuladas pela IL-12 secretadas pelos macrfagos, constituem outra fonte de IFNg. As infeces crnicas normalmente esto associadas com produo reduzida de IFNg e provavelmente explicam a alta incidncia de
tuberculose e toxoplasmose em pacientes com AIDS, os quais possuem nmeros reduzidos de clulas T CD4+. Em algumas infeces parasitrias, o sistema imunitrio no consegue eliminar o parasito, mas reage isolando o organismo com clulas inflamatrias. O hospedeiro reage ao antgeno localmente, o que estimula a liberao de citocinas, que por sua vez recrutam as clulas de defesa para o local afetado. Na esquistossomose, a formao do granuloma outro exemplo da reao do hospedeiro contra o parasito. Essa reao uma resposta crnica mediada por clulas aos antgenos solveis liberados pelos ovos do parasito no fgado. Os macrfagos se acumulam no local e liberam fatores fibrognicos que estimulam a formao do tecido granulomatoso. Embora essa reao possa ser benfica para o hospedeiro, no sentido que isola as clulas hepticas das toxinas secretadas pelos ovos dos helmintos, tambm constitui a maior fonte de dano, provocando alteraes irreversveis no fgado e perda da funo heptica. Em muitas infeces a distino entre uma resposta mediada por clulas ou por anticorpo pode ser difcil, dado que ambas atuam em conjunto contra o parasito. A expulso de alguns nematdeos intestinais ocorre espontaneamente poucas semanas aps a infeco primria. Parece haver dois estgios na expulso, alcanados por uma combinao de mecanismos T-dependentes e Tindependentes. Clulas T (predominantemente Th2) respondem aos antgenos do parasito e induzem a produo de anticorpo pelas clulas que sofreram proliferao. Ocorre proliferao dos mastcitos da mucosa e hiperplasia das clulas caliciformes secretoras de muco no epitlio intestinal. Os vermes so danificados por anticorpo e produtos dos mastcitos sensibilizados por IgE, que desgranulam aps o contato com o antgeno e liberam a histamina que, por sua vez, aumenta a permeabilidade do epitlio intestinal onde o verme se encontra. Esses processos no so suficientes para eliminar os vermes; portanto, molculas inflamatrias inespecficas, secretadas pelos macrfagos, incluindo TNF e IL-1, contribuem para a proliferao das clulas caliciformes e
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provocam aumento na secreo de muco. O muco reveste os vermes e leva sua expulso. Existem inmeros exemplos de estratgias fsicas simples e protetoras nos parasitos. Os nematdeos possuem uma cutcula extracelular espessa que os protege da agresso txica. O tegumento dos esquistossomos sofre um espessamento durante a maturao, oferecendo uma proteo semelhante. A superfcie frouxa de revestimento de muitos nematdeos pode se desintegrar sob o ataque imune. A maioria dos parasitos interfere na resposta imune e a imunossupresso uma caracterstica universal da infeco parasitria, comprometendo tanto as respostas mediadas por anticorpo como as mediadas por clulas. Os antgenos solveis dos parasitos, quando liberados em enormes quantidades, podem prejudicar a resposta do hospedeiro por um processo denominado distrao imune. Assim, os antgenos solveis de vrios agentes infectoparasitrios parecem inativar os anticorpos circulantes, fornecendo uma cortina de fumaa e desviando o anticorpo do parasito. Muitos destes antgenos de superfcie liberados so formas solveis de molculas inseridas na membrana do biopatgeno. Alm dos efeitos destrutivos diretos de alguns parasitos e de seus produtos aos tecidos do hospedeiro, muitas respostas imunes, por si s, possuem efeitos patolgicos. Na malria, na tripanossomose e na leishmaniose visceral, o nmero e a atividade aumentados dos macrfagos e linfcitos, no fgado e no bao, levam ao aumento de tamanho destes rgos. Na esquistossomose, grande parte da patologia resulta dos granulomas dependentes de linfcitos que se formam ao redor dos ovos no fgado. As alteraes significantes que ocorrem nos indivduos com elefantase so provavelmente resultado de respostas imunopatolgicas s larvas adultas nos linfticos. A formao de complexos imunes comum, eles podem ser depositados nos rins, como na sndrome nefrtica da malria, e podem dar origem a vrias outras alteraes patolgicas.
A IgE das infeces helmnticas pode promover desde efeitos brandos reaes severas no hospedeiro, por meio da liberao de mediadores pelos mastcitos, caracterizados por pruridos, eritemas, dificuldades respiratrias ou mesmo choque anafiltico.
10. Aplicao e importncia do diagnstico imunosorolgico das doenas infecto parasitrias
O diagnstico sorolgico das doenas transmissveis consiste na investigao da infeco no indivduo ou na populao, mediante a deteco, quantificao e caracterizao de variveis (imunoglobulinas, antgenos, citocinas) presentes no plasma/soro sanguneo ou em outros materiais biolgicos, tais como amostra fecal, urina, saliva, escarro ou tecidos. O desenvolvimento de novas informaes cientficas est relacionado com os progressos na metodologia pelo desenvolvimento de novos procedimentos, novas tcnicas ou instrumentos. Os primeiros mtodos de identificao e medida de imunoglobulinas foram desenvolvidos por Von Behring & Kitasato, influenciados pelos experimentos de Pasteur sobre a Teoria dos Germes, ao encontrarem no soro de animais imunizados contra difteria e ttano, substncias neutralizantes e especficas que denominaram anticorpos. As pesquisas desenvolvidas por vrios cientistas se voltaram imediatamente para a caracterizao bioqumica dessas substncias neutralizantes e o desenvolvimento de tcnicas capazes de induzir a formao de elevadas concentraes de anticorpos em animais de laboratrio. Este foi o perodo fundador do diagnstico sorolgico. Neste tpico, as tcnicas sorolgicas sero abordadas, principalmente, sob o ponto de vista dos profissionais que realizam o diagnstico sorolgico das doenas infectoparasitrias.
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10.1. Aplicaes dos testes sorolgicos
Os testes sorolgicos vm sendo constantemente empregados para auxiliar na confirmao diagnstica das suspeitas clnicas de infeces, permitindo a obteno de resultados em curto espao de tempo, em funo de algumas caractersticas que incluem a simplicidade de execuo, baixo custo operacional e a possibilidade de automao. Suas contribuies, entretanto, so inestimveis, principalmente quando o patgeno, ou seus produtos, dificilmente podem ser demonstrados nos fluidos biolgicos ou na estrutura hstica do hospedeiro. Estes mtodos so utilizados na qualificao e quantificao de diversos componentes, incluindo antgenos, anticorpos, imunocomplexos, enzimas e hormnios, entre outras molculas relacionadas ao processo inflamatrio. O conhecimento dos fundamentos gerais para adequada aplicao e criteriosa interpretao dos resultados exige que estas tcnicas sejam realizadas por profissionais bem treinados, a fim de se prevenir a ocorrncia dos falsos resultados, que conduzem para o diagnstico e tratamento incorretos dos pacientes. O mtodo sorolgico pode ser qualitativo ou quantitativo. O mtodo qualitativo indica uma resposta do tipo ou tudo ou nada, por exemplo: aglutinou ou no aglutinou, infectado ou no infectado. O ensaio quantitativo mede a concentrao de antgeno ou anticorpos, podendo ser expressa sob a forma de cruzes, titulaes, densidades ticas em reaes fotocolorimtricas ou outras unidades de medida que se aplicam. A expresso do resultado sob a forma de cruzes, ou por titulaes, que correspondem a maior diluio em que ainda se observa a reao antgeno-anticorpo, bastante subjetiva, por retratar a intensidade de uma reao determinada visualmente por critrios pessoais. A utilizao de aparelhos que realizam a leitura automtica das reaes sorolgicas traduz em nmeros os resultados obtidos de maneira visual, reduzindo, por um lado, a probabilidade dos erros, mas por outro, elevando (em alguns casos) o custo do exame laboratorial.
10.2. A importncia do diagnstico individual
O indivduo sintomtico ou assintomtico com nveis de anticorpos especficos detectveis denominado soropositivo. Aquele que no possui anticorpos detectveis o soronegativo. No caso do indivduo diagnosticado soronegativo (em uma primeira anlise), que ao reavaliar a primeira amostra junto com uma segunda, de coleta mais recente (processo conhecido como sorologia pareada), e no caso de resultado da primeira amostra se repetir e a segunda resultar positiva, diz-se que ocorreu soroconverso. O diagnstico individual normalmente se realiza com a finalidade de elucidar processos patolgicos com sinais e sintomas comuns a vrias doenas, procedimento este denominado diagnstico diferencial. Como exemplos, podem-se distinguir sorologicamente doenas como a leishmaniose tegumentar difusa e a hansenase lepromatosa, a leishmaniose visceral e a hepatite viral, a hepatite B e a hepatite C, a toxoplasmose e a rubola, entre outras. Em algumas situaes torna-se importante determinar a fase clnica da doena, principalmente aquelas em que os patgenos possuem habilidade para atravessar a barreira placentria e gerar embriopatias ou fetopatias. A presena de anticorpos especficos uma evidncia da exposio atual ou anterior aos agentes infecciosos, caracterizada pela diversidade funcional das vrias classes de imunoglobulinas e a ordem em que se apresentam nos fluidos biolgicos. Determinada por fatores genticos, a IgM, regra geral, a primeira a apresentar nveis que possibilitam a deteco aps estmulo imunognico e caracterizar fase inicial na maioria das infeces. O seu decrscimo compensado pelo surgimento da IgG, normalmente encontrada ao final de um processo agudo, permanecendo durante a fase crnica, e podendo ser detectada durante longo perodo no plasma do hospedeiro, mesmo aps a cura, como imunoglobulina de memria. Nor-
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malmente, nas solicitaes de exame laboratorial, pedem-se a pesquisa de IgM e IgG especficas. Porm, em infeces recentes por Toxoplasma gondii ou por citomegalovrus, a IgM e IgG podem eventualmente resultar negativas, mas a IgA positiva pode corrigir falhas no diagnstico. Por estas razes, imunoglobulinas como a IgE e a IgA especficas tm sido pesquisadas e utilizadas com maior preciso na determinao de fase inicial das infeces, uma vez que possuem vida mdia menor e permanecem na circulao aps o incio do processo infeccioso, por um perodo ainda mais curto que o da IgM. Os testes sorolgicos so tambm utilizados para verificao do potencial de virulncia e de invasividade dos enteroparasitos. A Entamoeba histolytica, por exemplo, enquanto parasita o lume intestinal, parece no induzir, ou pouco induz, a formao de anticorpos especficos. Por outro lado, a ulcerao, a penetrao tecidual e a consequente multiplicao e disseminao deste parasito no hospedeiro, pode proporcionar elevados ttulos de IgG anti ameba no plasma sanguneo, facilmente detectveis. Alm das imunoglobulinas, as Protenas de Fase Aguda (PFA), presentes normalmente em baixas concentraes no plasma sanguneo, alteram-se em resposta aos estmulos inflamatrios aps leso tecidual ou infeco. Em linhas gerais, as PFA constituem um vasto nmero de protenas plasmticas de origem heptica, cuja sntese aumenta em 25% ou mais e podem ser classificadas em funo do incremento de sua produo aps estmulo inflamatrio (Quadro 1). Tradicionalmente, a quantificao da Protena C Reativa (PCR) na prtica clnica tem vrios objetivos, entre eles, a avaliao da extenso e a atividade da inflamao, o que permite o acompanhamento do processo patolgico, diferenciao entre doena inflamatria e no inflamatria e estimativa de seu respectivo prognstico.
Quadro 1. Caractersticas cinticas das protenas de fase aguda

Protenas de fase aguda Grupo 1: aumenta menos de uma vez Ceruloplasmina C3 C4 Grupo II: aumenta de duas a quatro vezes a-1- glicoprotena cida a-1 - antitripsina a-1 - antiquimotripsina Haptoglobina Fibrinognio Grupo III: aumenta acima de cinco mil vezes Protena C reativa Encefalites virticas, citomegalia, herpes sistmica e tuberculose Amiloide srico A 6-10 horas 2-10 horas 110 180 24 horas 10 horas 10 horas 24 horas 24 horas 41 54 68 86 340 48-72 horas 48-72 horas 48-72 horas 132 180 206 Tempo de resposta entre estmulo e elevao dos nveis plasmticos Peso molecular (kDa)
Os testes sorolgicos tambm so utilizados para selecionar doadores e receptores de sangue e de rgos, no s no contexto de quem desempenha a determinao de grupos sanguneos ou antgenos de histocompatibilidade, como tambm para quem se compromete na deteco e preveno de doenas infecciosas transmissveis por meio da transfuso sangunea e hemoderivados, como tecidos e rgos transplantados. No Brasil, o Ministrio da Sade estabeleceu estratgias de controle apoiadas na triagem clnica, epidemiolgica e sorolgica para preveno das doenas transfusionais, que incluem a doena de Chagas, a sfilis, as hepatites B e C, a sndrome de imunodeficincia adquirida (SIDA/AIDS), o vrus da leucemia T do adulto (HTLV-I e II), em todo o territrio nacional, e a malria, em regies endmicas. As condies que constituem contraindicao absoluta para doao de rgos, relacionadas s doenas infecciosas, alm das empregadas na preveno de doenas transmissveis por meio da transfu-
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so sangunea e hemoderivados, incluem avaliao laboratorial de septicemia bacteriana ou fngica, ativa. As molculas liberadas pelo parasito e os anticorpos correspondentes encontrados no hospedeiro so chamados de marcadores sorolgicos. Estes marcadores podem ser utilizados para avaliar o prognstico de doenas e alguns marcadores indicam evoluo para cura, enquanto outro agravamento. Baseandose nestes princpios, pode-se avaliar a eficcia teraputica. Os anticorpos protetores, induzidos por parasitos em processos infecciosos ou por vacinas, podem ser pesquisados e utilizados como marcadores para avaliar a imunidade especfica, naturalmente adquirida ou artificialmente induzida por vacinas. Os testes sorolgicos realizados em paciente pr-natal so de fundamental importncia na pesquisa de doenas congnitas, como a toxoplasmose, a sfilis, a citomegalia, entre outras; e na avaliao da imunidade especfica, principalmente para doenas imunoprevinveis com a aplicao de vacinas (hepatite B, rubola, difteria, ttano).
10.3. A importncia do diagnstico coletivo
A aplicao dos testes sorolgicos em inquritos epidemiolgicos denomina-se soroepidemiologia e serve para estimar a soroprevalncia, que corresponde ao nmero de indivduos positivos em um perodo de tempo determinado, sem distinguir os casos novos dos antigos. Como a soroprevalncia est intimamente relacionada com a taxa de infeco e a permanncia dos anticorpos circulantes, este indicador auxilia nos seguintes propsitos em relao s doenas infectoparasitrias: estabelecer prevalncia sorolgica, identificar os principais problemas sanitrios, estabelecer prioridades de vacinao, demarcar a distribuio e verificar a erradicao de doenas, verificar a reintroduo de doenas em reas consolidadas, determinar a periodicidade das epidemias, avaliar as campanhas de vacinao,
investigar enfermidades descobertas recentemente (doenas emergentes) e estimar as perdas econmicas atribudas enfermidade. Testes sorolgicos tambm so aplicados na anlise do contedo intestinal de insetos hematfagos, para identificao das fontes alimentares dos vetores envolvidos na transmisso de doenas. Estabelecer o padro alimentar dos insetos hematfagos de grande importncia para o entendimento de sua biologia, alm de possuir valor fundamental para a Sade Pblica, no delineamento de estratgias de controle de vrios agravos gerados por esses vetores.
11. Fundamentos gerais do imunodiagnstico
A pesquisa laboratorial da resposta imune pode ser empregada para a verificao da resposta humoral e da resposta celular. A pesquisa da resposta humoral pode ser realizada de duas maneiras. Uma dessas maneiras refere-se ao emprego de anticorpos especficos para identificar um antgeno parasitrio ou outras substncias que desempenham o papel de antgenos na reao, tais como drogas, hormnios, cidos nuclicos, citocinas, receptores de clulas, etc. Uma outra maneira a deteco de anticorpos especficos na amostra a ser testada, passvel de determinar se um indivduo foi exposto a um organismo especfico. A medida das interaes entre antgeno-anticorpo com o propsito de diagnstico conhecida como imunosorologia. As tcnicas imunossorolgicas fundamentam-se na natureza da interao antgeno-anticorpo, nas quais podem expressar-se de duas formas distintas, em decorrncia da utilizao de imunorreagentes livres de marcao ou de reagentes marcados. As tcnicas em que no se empregam marcadores demonstram-se por fenmenos visveis. Portanto, ao se combinar anticorpos com antgenos solveis, os complexos resultantes podem
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formar precipitados insolveis. Se os antgenos so particulados (bactrias, protozorios, hemcias), os anticorpos os aglutinam. Se o anticorpo pode ativar a via clssica do sistema complemento e o antgeno se encontra em uma superfcie celular, o resultado pode ser a citlise. As tcnicas que empregam imunorreagentes marcados caracterizam-se pela simples combinao do antgeno com o anticorpo, necessitando que um deles esteja marcado convenientemente. O imunorreagente pode ser marcado com corantes fluorescentes ou quimioluminescentes, radioistopos, enzimas, ouro ou prata coloidais, entre outros marcadores.
11.1 Reaes de precipitao
As reaes de precipitao ocorrem entre antgenos solveis e seus anticorpos correspondentes, com formao de agregados insolveis que se precipitam. Os determinantes mais importantes das reaes de precipitao consistem nas concentraes relativas de antgeno e anticorpo. Esta relao ilustrada esquematicamente na Figura 19. Ocorre precipitao mxima quando a quantidade se antgenos e de anticorpos so equivalentes (zona de equivalncia), com quantidades decrescentes nas zonas de excesso de antgeno ou excesso de anticorpo. O fenmeno de prozona refere-se precipitao subtima, invisvel aos nossos olhos, que ocorre na regio de excesso de anticorpo. Portanto, necessrio que diluies de antissoros reajam com quantidades fixas de antgeno a fim de obter o mximo de linha de precipitao. O fenmeno de prozona pode ser responsvel pelo aparecimento de resultados falso-negativos em outros testes sorolgicos, alm dos testes de precipitao, como nas reaes de aglutinao. Existem vrios sistemas disponveis para a prtica da reao de precipitao, dentre estes, destacam-se a precipitao em meios lquidos, meios semisslidos, como gar ou agarose, e outros suportes, tais como o acetato de celulose.
Figura 19. Curva de formao de imunocomplexos visveis
11.2. Reao de precipitao em meio lquido
Conhecida tambm como tcnica da precipitina ou tcnica do anel, a reao de precipitao em meio lquido (Figura 20) consiste em se colocar em tubos de ensaio ou em tubos capilares uma soluo de anticorpos conhecidos (soro hiperimune) e sobre ela se adicionar, cuidadosamente, a soluo antignica que se deseja pesquisar, de modo a constituir-se uma interface entre ambas. As molculas da soluo antignica iro difundir-se atravs da outra soluo, formando um gradiente de concentrao. Ao nvel em que a equivalncia antgeno/anticorpo for a ideal, se formar uma faixa de precipitado visvel (um anel de turvao branco leitoso na interface).
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Figura 20. Imunodifuso em meio lquido (Teste de Precipitina)
11.3. Reao de imunodifuso simples em meio semisslido
Neste sistema, tambm chamado imunodifuso unidirecional ou tcnica de Oudin, a soluo antignica sobreposta a uma coluna de gar, em um tubo de 35 a 45 mm de altura contendo o soro hiperimune. As molculas de antgeno penetram no gel e se difundem com velocidade caracterstica para cada espcie molecular (coeficiente de difuso) influenciada pela concentrao do gel. Ao final de certo tempo de difuso, que em geral de uma semana, cada antgeno ter formado, com o seu anticorpo correspondente, um disco ou zona de precipitao.
11.4. Reao de imunodifuso dupla (imunodifuso de OUCHTERLONY)
Em uma delgada camada de gel sobre uma lmina de vidro escavam-se pequenos orifcios. Em um deles, coloca-se soro ou plasma e, em outro orifcio, coloca-se o antgeno. Um difunde em direo ao outro, formando precipitados brancos em forma de linhas ou arcos, tambm chamados de
bandas de precipitao (Figura 21). Quando a concentrao de antgenos e anticorpos muito pequena, as bandas no so visveis, necessitando, nesse caso, que se use soluo corante para protenas. Quando necessrio, corar o gel para visualizar as bandas deve-se retirar do gel os imunorreagentes que no formaram imunocomplexos (imunorreagentes solveis) por processos de lavagem com soluo fisiolgica. O imunocomplexo (agregado insolvel), em funo do seu tamanho efetivo, fica retido nas malhas do gel, onde, em seguida, submetido ao corante adequado, o que possibilita a visualizao das bandas quando formadas. A velocidade de difuso de cada imunorreagente regida pelas leis da difuso e depende da concentrao e do tamanho dos poros do gel, da temperatura, da concentrao do gar e de sua pureza. Figura 21. Representao esquemtica da reao de imunodifuso dupla Ouchterlony.
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11.5. Reao de imunodifuso radial simples (imunodifuso de MANCINI)
Nesta tcnica, o anticorpo especfico para determinado antgeno incorporado ao gel e distribudo sobre uma lmina de vidro ou placa de Petri. Em posies adequadas, so feitos orifcios onde se colocam solues antignicas a serem testadas, bem como solues padro, com pelo menos trs concentraes conhecidas do antgeno. A partir desse momento, ocorre difuso radial do antgeno, resultando na opacificao em forma circular (halo ou anel) em torno do orifcio. O dimetro deste anel de precipitao proporcional concentrao do antgeno e, deste modo, a quantidade deste pode ser determinada por comparao com os dimetros obtidos por padres conhecidos por meio de uma curva de referncia.
11.6. Reao de imunoeletroforese (mtodo de GRABAR e WILLIAMS)
A imunoeletroforese uma tcnica de imunoprecipitao em meio gelatinoso que combina a eletroforese com a imunodifuso radial. A tcnica realizada em duas etapas: na primeira, os antgenos so fracionados por eletroforese, enquanto na segunda etapa, ocorre a difuso dos antgenos contra o antissoro especfico, presente nas canaletas abertas no gel. A reao antgeno-anticorpo nesse sistema evidenciada pela formao de linhas ou bandas de precipitao no gel, correspondendo cada banda a um complexo imune especfico.
11.7. Reao de imunoeletroforese unidimensional simples
Tambm conhecida como eletroforese de foguete ou tcnica de Laurell, a imunoeletroforese unidimensional utiliza antissoro especfico para o antgeno, ou o anticorpo que se quer quantificar, incorporado ao gel de agarose, que colocado em lminas de vidro. Assim como na tcnica de
Grabar e Williams, o pH do gel determinado de modo que a molcula a ser analisada fique com carga negativa, migre para o polo positivo e a substncia incorporada no migre ao gel. As amostras a serem quantificadas, bem como os controles, so distribudos em pequenos orifcios do gel e submetidos eletroforese. A partir dos orifcios de aplicao, formam-se cones de precipitao, cujas extenses variam de acordo com as concentraes das substncias pesquisadas. O padro de precipitao se assemelha a um foguete, por se formar nas margens laterais do curso da migrao eletrofortica, at que se esgote a substncia em anlise, resultando na convergncia das margens laterais em forma de ponta.
11.8. Reao de contraimunoeletroforese
Tambm chamada de eletroimunodifuso dupla unidimensional. Nesta tcnica, antgenos e anticorpos migram por eletroforese, simultaneamente, em direes opostas, a partir de orifcios separados do gel, no mesmo eixo, resultando na precipitao no ponto de encontro dos imunorreagentes entre os orifcios. Para a realizao deste mtodo, antgenos e anticorpos devem apresentar diferentes mobilidades eletroforticas. Os anticorpos possuem propriedades de migrar para o polo negativo (ctodo) em um campo eltrico, enquanto os antgenos devem ser previamente tratados com soluo tampo de pH adequado para otimizar os efeitos eletroendosmticos que orientem sua migrao para o polo positivo (nodo). Este fenmeno pode ser induzido com o uso de tampes alcalinos (Figura 22). Este mtodo permite a realizao de vrias anlises em uma nica lmina, fornece resultados mais rpidos e mais sensveis que a imunodifuso convencional e pode ser realizado em outros suportes, como o acetato de celulose.
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Figura 22. Representao esquemtica da reao de contraimunoeletroforese
11.9. Reaes de aglutinao
A aglutinao a formao de redes de clulas ou partculas inertes (ltex ou gelatina), interligadas por pontes moleculares de anticorpos, que se combinam simultaneamente com dois determinantes antignicos nas superfcies de clulas ou partculas adjacentes.
11.10. Reao de aglutinao direta
A aglutinao direta a formao de agregados suficientemente grandes que ocorre entre partculas insolveis, em sua forma ntegra ou fragmentada, contendo antgenos naturais de superfcie. Hemcias, bactrias, fungos e protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpos, os quais, sendo bivalentes, formam pontes, ligando determinantes antignicos nas superfcies de partculas vizinhas. Para se detectar anticorpos especficos, diluies seriadas das amostras so postas para reagir junto a uma quantidade constante de antgeno. Aps um perodo de incubao, a reao se concretiza
(Figura 23) e o resultado geralmente expresso como ttulo da amostra, ou seja, a mxima diluio em que ocorre aglutinao. Figura 23. Representao esquemtica da reao de aglutinao direta
11.11. Reao de inibio da aglutinao direta de hemcias por antgenos virais
Diversos antgenos virais encontram receptores na superfcie de hemcias, principalmente hemcias avirias, e induzem sua aglutinao. Esta propriedade particular de muitos vrus aproveitada para a titulao de anticorpos produzidos contra esses antgenos virais, na vigncia dos processos infecciosos ou na convalescena, para fins diagnsticos e de segmento evolutivo. Todas as reaes de inibio baseiam-se na competio, seja de dois determinantes antignicos semelhantes por um mesmo stio de combinao ou de dois anticorpos diferentes por um mesmo determinante antignico. A reao se efetua entre os imunorreagentes que formam o composto mais estvel. Neste caso, o soro do paciente, contendo anticorpos especficos, em diluio seriada, misturado a quantidades fixas de antgeno viral padronizado, sendo incubado a 37 0C e, em seguida, as hemcias so adicionadas (Figura 24). Verifica-se at qual diluio houve neutralizao, ou seja, inibio da propriedade aglutinante para hemcia.
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Figura 24. Representao da inibio da aglutinao viral das hemcias
11.12. Reao de aglutinao passiva de hemcias e suportes inertes
A reao se baseia na aglutinao de hemcias ou de partculas inertes (ltex, gelatina) que funcionam como suporte, recobertas por um antgeno especfico solvel, em presena de amostra de soro ou plasma contendo os anticorpos correspondentes. A formao de pontes de anticorpos entre as partculas adjacentes indica a ocorrncia da reao (Figura 25). Figura 25. Esquema da reao de aglutinao passiva de hemcias e suportes inertes
11.13. Reao de inibio passiva de partculas inertes (ltex)
Partculas de ltex tendo antgenos ancorados sua superfcie podem ser aglutinadas pela formao de ponte anticrpica, do mesmo modo que a aglutinao direta de hemcias, como j foi exposto. No entanto, ao se
misturar antgenos solveis aos soros contendo anticorpos, haver bloqueio dos stios de combinao das molculas de anticorpo e inibio da aglutinao.
11.14. Reao de fixao do complemento
A fixao do complemento ocorre aps a interao antgenoanticorpo. O consumo de complemento in vitro pode ser utilizado como um teste para detectar e medir concentraes de anticorpos e antgenos. A reao se manifesta em trs momentos: no primeiro, o antgeno se combina com o anticorpo. No segundo, se os imunocomplexos estiverem presentes, os componentes do sistema complemento ligam-se, sendo assim consumidos. Finalmente, adiciona-se o sistema revelador que consiste de hemcias de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo antieritrocitrio). Aps um perodo de incubao, observa-se se ocorreu ou no lise das hemcias sensibilizadas e a atividade hemoltica pode ento ser medida, a fim de se determinar a quantidade do imunorreagente pesquisado (Figura 26). Ao se pesquisar a presena de anticorpos em fludos biolgicos, a ausncia de lise do sistema hemoltico indica a sua presena na amostra, pois como os principais componentes do sistema complemento foram consumidos na lise do imunocomplexo inicial, no estaro disponveis para a lise do sistema hemoltico e a reao ser positiva. Tanto os anticorpos como os antgenos devem ser destitudos de atividade anti-complementar para no ativar o complemento, independentemente do imunocomplexo. O complemento obtido de soro de cobaia, colhido e estocado de maneira apropriada para preservar a atividade hemoltica.
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Figura 26. Representao da reao de fixao de complemento
11.15. Reaes de imunofluorescncia
A tcnica de imunofluorescncia foi descrita pela primeira vez por Albert H. Coons e seus colaboradores, em 1941. Estes pesquisadores objetivavam empregar corantes em tcnicas sorolgicas e utilizaram para isso, alm dos corantes comuns, radicais fluorescentes. Neste perodo, j era conhecida a capacidade dos anticorpos de se ligarem a radicais qumicos sem perder sua caracterstica de reconhecimento e ligao aos antgenos. J haviam sido descritos trabalhos utilizando conjugados de anticorpos e corantes em tcnicas de aglutinao. O produto resultante desta conjugao no s mantinha suas propriedades aglutinantes originais como ainda coloria os grumos aglutinados. Porm, esta colorao foi considerada de fraca intensidade, o que levou Coons a optar pelos corantes fluorescentes. Uma das grandes vantagens da tcnica a intensa luminosidade emitida por quantidades muito pequenas de corantes fluorescentes, permitin-
do identificar estruturas fluorescentes entre vrias outras estruturas presentes em cortes de tecidos ou esfregaos. A tcnica de imunofluorescncia representou um grande avano no imunodiagnstico, principalmente no que diz respeito sorologia. At a elaborao deste mtodo, as reaes ocorridas entre antgeno e anticorpo s podiam ser evidenciadas atravs de reaes secundrias, como a precipitao ou a aglutinao, que geram fenmenos decorrentes da formao de imunocomplexos em grande quantidade ou utilizando partculas relativamente grandes. Uma das vantagens da imunofluorescncia foi o fato de ter maior sensibilidade que os mtodos existentes na ocasio, permitindo distinguir uma nica clula bacteriana corada por fluorescena entre 107 bactrias no coradas. S foi possvel o desenvolvimento da tcnica de imunofluorescncia devido a caractersticas especiais que algumas substncias possuem de armazenar energia luminosa e liber-la mais tarde. A este fenmeno foi dado o nome de luminescncia. Se a substncia capaz de armazenar e emitir luminescncia por perodos mais longos, chama-se ento fosforescncia; se o perodo de emisso da luminosidade mais curto, chama-se a isso fluorescncia. Entre os corantes fluorescentes mais utilizados destacam-se a rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT) e a fluorescena (isotiocianato de fluorescena FITC), esta ltima supera a primeira por possuir maior eficincia quntica, ou seja, maior capacidade de absoro e de emisso de luminosidade. Porm, com a modernizao dos equipamentos, no s de microscpios como tambm de citmetros, foram feitas modificaes para aumentar a eficincia quntica dos demais corantes para utiliz-los em testes que buscam mais de um marcador em superfcies celulares. A intensidade da luz emitida por este corante sofre grande interferncia do meio em que ele se encontra. O pH um dos fatores que mais interfere, pois h um mnimo de fluorescncia em pH cido e mxima fluorescncia em
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pH alcalino, por isso o material deve ser montado em glicerina tamponada alcalina antes da observao em microscpio de fluorescncia. Para se obter bons resultados com as tcnicas imunofluorescentes, fundamental a utilizao de um bom microscpio tico equipado com acessrios e filtros que permitam a boa visualizao e captao da fluorescncia. Atualmente, existem vrios modelos de variadas procedncias. Para a escolha do equipamento que mais se adapte s necessidades do laboratrio, deve-se ter em mente qual o objetivo do teste, que tipo de material ser utilizado como antgeno ou como amostra (para que seja feita a escolha das objetivas e oculares), qual o corante ou corantes que sero utilizados (para que sejam definidos os filtros do equipamento), quantos exames sero realizados em mdia e quantas vezes por semana, uma vez que tal escolha ir interferir na vida til e escolha da lmpada a ser utilizada, entre outros fatores. A ligao qumica de anticorpos a corantes d origem a um composto chamado conjugado, que associa a capacidade de reconhecimento e ligao do primeiro s propriedades corantes do segundo, sem que ocorra nenhum tipo de prejuzo para ambos. Apesar de processo de conjugao ser relativamente simples, h uma srie de cuidados que precisam ser seguidos devido s variaes que podem ocorrer em cada um dos reagentes a cada associao. Um dos cuidados principais a imunizao dos animais com os antgenos mais purificados possveis para evitar a reatividade cruzada com outros antgenos. Atualmente existem no mercado compostos conjugados de extrema pureza e alta especificidade, direcionados contra os mais variados antgenos e que atendem perfeitamente s necessidades da grande maioria dos laboratrios. A partir do mtodo descrito por Coons e seus colaboradores, sugiram numerosas variaes, das quais, a imunofluorescncia direta foi a mais simples e a primeira a ser descrita. Nesta tcnica, o conjugado reage diretamente com antgenos presentes na superfcie de clulas (Figura 27). Como esta tcnica se presta pesquisa de substncias que atuam como antgenos para o conjugado,
torna-se necessria, a cada procura de um antgeno diferente, a produo de um conjugado diferente. Alm disso, de todas as variaes da imunofluorescncia, esta a menos especfica, j que principalmente em tecidos ou esfregaos, devido grande quantidade de material na amostra, pode ocorrer a presena de antgenos homlogos ao que se est pesquisando. Quando se trata de clulas ntegras, h certa facilidade no reconhecimento, porm em fragmentos celulares ou estruturas muito pequenas necessrio grande conhecimento e intenso treinamento para diminuir a inespecificidade. Esta variao do mtodo ainda bastante aplicada no diagnstico de infeces por Chlamydia trachomatis em esfregaos cervicais e uretrais. Este mtodo tambm foi largamente utilizado na identificao de antgenos do MHC e na tipagem de linfcitos B e linfcitos T. Figura 27. Esquema da reao de imunofluorescncia direita
Outra variedade do mtodo a imunofluorescncia indireta. Nesta modalidade, pode-se realizar a pesquisa de anticorpos contra os mais variados antgenos. O conjugado uma imunoglobulina que reconhece a outra
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imunoglobulina como antgeno, ou seja, uma anti-imunoglobulina ou anticorpo secundrio (Figura.28). A vantagem deste mtodo que o anticorpo pode estar ancorado superfcie de qualquer antgeno e ainda assim ser reconhecido pelo conjugado. Assim, um nico conjugado pode ser utilizado na pesquisa de anticorpos contra vrias infeces diferentes, tornando o mtodo mais barato. Uma vez que o reconhecimento de uma imunoglobulina por outra se d pela regio estvel do fragmento cristalizvel (poro Fc), a ligao espcie especfica, conferindo ao mtodo grande especificidade. Ele tambm mais sensvel do que o mtodo direto, porque existem normalmente mais epitopos na imunoglobulina para o conjugado se ligar. Quanto maior a quantidade de conjugado maior ser a emisso de fluorescncia. Figura 28. Esquema da reao de imunofluorescncia
Esta modalidade do mtodo auxilia o diagnstico de vrias doenas e permite a pesquisa de diferentes isotipos de imunoglobulinas, sendo que, neste caso, h a necessidade de utilizar um conjugado para cada um dos isotipos. Desta forma, o mtodo utilizado no acompanhamento da doena e, em alguns casos, pode ser tambm utilizado como critrio de cura.
De uma maneira geral, a tcnica de imunofluorescncia apresenta nveis de sensibilidade que variam de 70% a 90%, e especificidade que varia de 85% a 99%. Por ser um mtodo com perfil mais especfico, este mais utilizado em confirmaes sorolgicas. Deve-se utilizar o mtodo de imunofluorescncia sempre aliado a outro mtodo mais sensvel para a realizao da triagem e fornecer os dois resultados em combinao. A sua utilizao pesquisando IgM e IgG sricas pode aumentar a sensibilidade, uma vez que a primeira aparece mais precocemente.
11.16. Ensaios imunoenzimticos - Enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA
Os estudos preliminares que tornaram passveis de execuo os mtodos imunoenzimticos foram realizados, simultaneamente, em 1966, por Nakane e Pierce, nos Estados Unidos, e por Avrameas e Uriel, na Frana, com a utilizao da peroxidase (horseradish peroxidase - HRP) para a confeco de conjugados proteicos, tendo como precursor o processo de marcao de protenas com corantes fluorescentes, criado por Coons, em 1941. Em 1971, dois grupos de pesquisadores, um holands, formado por Van Weemen e Schurs, e um sueco, formado por Engvall e Perlmann, idealizaram e introduziram, pioneiramente, o mtodo imunoenzimtico para deteco e quantificao de antgenos ou anticorpos especficos. Estes grupos observaram que protenas poderiam ser imobilizadas em uma superfcie slida de poliestireno e a reao imune, ser revelada pela formao de produtos coloridos da reao enzima-substrato, na presena de um componente doador de eltrons, denominado cromgeno. O mtodo ELISA, quando efetuado em timas condies (enzimas altamente ativas, antgenos puros, substratos de alta qualidade, anticorpo e conjugado), apresenta sensibilidade semelhante ao radioimunoensaio, com a vantagem de no ser necessrio utilizar material radioativo. Entretanto, esse
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mtodo apresenta algumas desvantagens, pois alguns substratos usados nessas reaes so teratognicos e a presena de enzimas endgenas interferem nos resultados quando se usa clulas inteiras como antgenos. A reao desenvolvida frequentemente em placas plsticas de microdiluio (suporte), contendo sries de orifcios, onde so depositados os imunorreagentes, antgenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do mtodo. O processo de revestimento da placa com o imunorreagente adequado denomina-se sensibilizao. Para sensibilizar a placa deve-se tratar o imunorreagente com soluo alcalina, deixando-o com carga efetiva negativa, e assim promover, passivamente, a adsoro placa por interaes eletrostticas (foras coulmbicas), as quais ocorrem em virtude das cargas positivas do poliestireno ou polivinil (polyvinyl chloride - PVC) utilizado para confeccionlas. Alm das placas de microdiluio de 96 cavidades, tambm so utilizados outros suportes, entre os quais, esferas de sefarose, esferas de poliestireno ou de PVC, ou tubos de poliestireno ou PVC, que possibilitam a adsoro adequada da maioria dos imunorreagentes. As etapas de lavagem das placas de microdiluio interpem-se s demais etapas de execuo do mtodo e servem para retirar excessos de imunorreagentes no ligados. Podem ser usados procedimentos manuais ou automticos, que vo desde o uso de jorradeiras contendo a soluo de lavagem, ou de pente multicanal adaptado a um sistema de vcuo (lavadora semiautomtica), at a utilizao de lavadoras de placas automticas, que reduzem o tempo de realizao do teste e proporcionam maior uniformidade ao processo. O revestimento da superfcie interna da placa de ELISA, pelo menos no plano terico, no absoluto e, portanto, algumas regies permanecem livres de ligao. Estes espaos devem ser ocupados com qualquer molcula alheia ao sistema reacional, no sentido de reduzir, ou mesmo evitar, a ligao inespecfica, no imune, de componentes da amostra, geradores de reaes indesejveis que possibilitam falsas interpretaes. A cobertura destes espaos
vazios chamada de bloqueio. Entre as protenas mais empregadas nesta etapa destacam-se a soro albumina bovina (BSA), a ovalbumina e a casena, alm de um complexo proteico, como o soro de cobaia. Dependendo do material a ser pesquisado, pode-se conjugar antgenos com enzimas (Ag-E) e anticorpos ou anti anticorpos com enzimas (Ac-E). Enzimas so macromolculas de natureza proteica, com funo biolgica de alto poder cataltico de reaes qumicas e elevada especificidade ao substrato correspondente. As mais usadas nestes testes so a fosfatase alcalina e a peroxidase. Para revelar a presena da enzima no complexo formado, utiliza-se uma soluo reveladora, que consiste em um tampo adequado, onde se adicionam o substrato correspondente enzima conjugada e um componente doador de eltrons (cromgeno). A enzima conjugada quebra o substrato e seus produtos atuam no cromgeno, alterando a colorao do sistema (Figura 29). Figura 29. Esquema do ensaio imunoenzimtico ELISA indireto,para pesquisa de anticorpos especficos
A leitura da reao em condies de trabalho de campo pode ser feita de forma visual, simplesmente pela observao da alterao da colorao. Em condio laboratorial utiliza-se espectrofotmetro apropriado para leitura dos
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orifcios das placas, que transforma a intensidade de cor em nmeros. Quanto maior a leitura, maior ser a concentrao de enzima conjugada e, consequentemente, maior ser a concentrao da substncia pesquisada em tcnicas no competitivas. O mtodo ELISA pode ser classificado de acordo com sua atividade de amplificao, ou seja, por mtodos diretos no competitivos, ou baseados em sua atividade moduladora, que so mtodos competitivos. O ELISA direto mais usado em imuno-histoqumica. Seu fundamento consiste na utilizao de anticorpos primrios marcados com enzima, que se combinam especificamente aos antgenos presentes em cortes histolgicos. A aplicao da soluo reveladora destaca o material pesquisado. O ELISA indireto empregado para a pesquisa de anticorpos, onde amostras de soro ou plasma so colocadas para reagir com antgenos imobilizados em uma fase slida (placas de ELISA). Posteriormente, so revelados com auxlio de conjugado enzimtico especfico levando a formao de um produto corado ao agir sobre substratos cromognicos. Para pesquisa de antgenos presentes em material biolgico, a amostra posta para reagir com anticorpos especficos imobilizados na fase slida. O ELISA competitivo consiste na pesquisa de antgeno, onde o anticorpo mobilizado na fase slida e o antgeno correspondente compete com uma quantidade padronizada e marcado para stios de combinao disponvel. Nesse caso, a reduo da reao indica maior quantidade de antgeno na soluo. Para pesquisar anticorpos, o antgeno imobilizado e poder se ligar ao anticorpo da amostra ou ao j conhecido e marcado (conjugado enzimtico), para, assim, decrescer a intensidade de colorao da reao. Em ambos os mtodos competitivos (Figura 30), dois procedimentos podem ser seguidos: a competio simultnea, cujo antgeno ou anticorpo marcado adicionado junto com a amostra; ou a saturao sequencial, onde o antgeno
ou anticorpo adicionado primeiro, seguido de uma incubao com o imunorreagente marcado. Figura 30. Modelo de mtodo competitivo, onde antgenos marcados e antgenos no marcados de uma amostra competem pelos stios de ligao dos anticorpos imobilizados em um suporte
11.17. Western blotting - WB
A tcnica de Western Blotting, tambm chamada de immunoblotting ou imunoeletrotransferncia, uma ferramenta de grande utilidade para a caracterizao de antgenos, ou para pesquisa de anticorpos especficos para um determinado componente antignico. A tcnica de WB baseia-se numa combinao de trs mtodos muito aplicados em biologia molecular: a separao de macromolculas atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida, na presena de duodecil-sulfato de
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sdio (SDS-PAGE); sua transferncia eletroltica para membranas (geralmente de nitrocelulose); e o ensaio de revelao, utilizando anticorpos ou protena A, marcados por enzimas, radionucldeos, fluorocrmos, metais coloidais ou complexo biotinina-avidina-peroxidase. Assim, as protenas de um dado antgeno so separadas, transferidas eletroliticamente para membranas de nitrocelulose e postas a reagir com anticorpos marcados. No final, a reao antgeno-anticorpo revelada por meio de imunocomplexos formados com protenas definidas, e facilmente identificadas pelos seus pesos moleculares caractersticos. A origem do nome Western Blotting partiu de uma brincadeira acadmica baseada no nome Southern, do autor de um mtodo de eletrotransferncia de fragmentos de cidos nucleicos (DNA), que recebeu o nome de Southern Blot. Pouco tempo mais tarde, Alwine e cols conseguiram fazer uma adequao na tcnica de Southern Blotting, que se consistiu na eletrotransferncia de cido ribonucleico (RNA), o qual, por sua vez, foi analisado atravs de sondas de DNA. Assim, seguindo o princpio da brincadeira inicial, resolveuse chamar a nova tcnica de Northern Blotting. Pouco mais tarde, em 1979, Towbin, Staehelin e Gordon desenvolveram o mtodo de eletrotransferncia de protenas. Para seguir a j ento tradicional forma de referir-se ao mtodo resolveu-se batizar a nova tcnica de Western Blotting. A razo para transferirem-se protenas, a partir de um gel de poliacrilamida para uma membrana sinttica, est na possibilidade de manuseio contnuo do material para anlise, alm de se poder trabalhar com vrios reveladores ao mesmo tempo, ou com sondas de elevado peso molecular, uma vez que a poliacrilamida no um material muito adequado para que molculas de grande tamanho sejam difundidas. As membranas mais utilizadas para o blotting so derivadas da nitrocelulose. Apesar disso, elas so frgeis e apresentam uma baixa capacidade de ligao s macromolculas eletrotransferidas. As membranas de nylon
so muito mais resistentes e ligam-se muito fortemente s protenas. Sua capacidade de ligao seis vezes maior que a das membranas de nitrocelulose. Sua limitao est relacionada a no impregnao por corantes, comumente empregados na revelao de protenas (azul de Comanssie e negro de amido), e grande quantidade de reaes inespecficas, requerendo, assim, um bloqueio muito bem feito antes de se desenvolver o ensaio imunoenzimtico para a revelao do Western Blotting. Outro aspecto muito importante a porosidade da membrana. Recomenda-se a utilizao de membranas com 0,45mm para o uso genrico e com dimetros bastante menores (0,2mm) para estruturas proteicas, com pesos moleculares inferiores a 20 kDa. As melhores membranas, embora sendo bastante caras, so as de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Elas combinam a excelente capacidade ligante e a resistncia mecnica manipulao necessria para a elaborao das fitas, contendo protenas eletrotransferidas.
11.18. Teste imunocromatogrfico
O dispositivo de imunocromatografia composto de uma membrana porosa de celulose modificada e membranas absorventes acessrias de fibra de vidro, contendo os elementos de reao, ajustadas em um invlucro plstico apropriado com uma janela para se acrescentar a amostra de teste e outra para leitura do resultado da reao. O princpio de funcionamento do teste imunocromatogrfico baseia-se na reao especfica antgeno-anticorpo e se constitui por uma fase slida (membrana porosa), onde esto imobilizados elementos de captura, e por uma fase mvel, onde esto suspensos o conjugado (que pode ser a protena A, ligada ao ouro coloidal ou outros conjugados disponveis) e a molcula alvo da amostra. A fase mvel migra sobre a fase slida por efeito de capilaridade, conduzindo o complexo formado entre a molcula alvo e o conjugado, que, por sua vez, ser retido na linha de captura da fase slida, formando um
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complexo macromolecular colorido visvel ao olho humano. Caso a amostra no contenha a molcula alvo, esta linha de reao no se formar. Uma segunda linha de reao, denominada linha de controle, se forma pela captura do conjugado livre, que permite a confirmao da migrao da fase mvel (Figura 31). Figura 31. Princpio doTeste Imunocromatogrfico
11.19. Imuno-histoqumica
A imuno-histoqumica (IHQ) rene a interao antgeno anticorpo in vitro, tcnicas histolgicas e reaes qumicas, em um mtodo que permite detectar diferentes estruturas de tecidos, revelados por diversos tipos de processos de visualizao. utilizada no diagnstico anatomopatolgico de vrias doenas degenerativas ou parasitrias, bem como na identificao de estruturas normais em estudos de histologia bsica. As tcnicas de IHQ permitem a localizao de protenas nas clulas de uma seo de tecido, fixados em formol ou includo em blocos de parafina. Existe, atualmente, a disponibilidade de um nmero crescente de anticorpos para uso em IHQ, o que vem possibilitado uma maior preciso diagnstica.
Existem dois tipos de tcnicas de imuno-histoqumica:

Tcnica direta Os anticorpos primrios so ligados a um marcador
apropriado, e o corte de tecido, que contm antgenos especficos, incubado com o anticorpo durante algum tempo. Aps a interao entre os anticorpos e as protenas, os anticorpos que no se ligaram so removidos por lavagem. Dependendo do marcador utilizado, a leitura da reao ser realizada pela microscopia adequada; para marcadores fluorescentes, por exemplo, o corte observado por microscopia de imunofluorescncia, enquanto para outros marcadores, utiliza-se a microscopia tica convencional.
Tcnica indireta Nesta tcnica, se utiliza o anticorpo primrio
especfico para uma determinada protena e para o anticorpo secundrio, uma anti-imunoglobulina marcada que reconhece o anticorpo primrio. O corte de tecido incubado com o anticorpo especfico para determinada protena. Depois de lavado, incubado com o imunoconjugado, que se vai ligar ao anticorpo primrio. Em seguida, h a observao por microscopia adequada, dependendo do marcador utilizado. A tcnica de IHQ pode tambm estar associada a um processo enzimtico de colorao, como ao complexo avidina-biotina-enzimacromgeno (Figura 32). O complexo formado pela ligao de uma molcula de estreptavidina com vrias de biotina associadas a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como funo a converso de um cromgeno incolor em um produto final colorido. O cromgeno mais utilizado o DAB (diaminobenzidina), que confere cor marrom-ferruginosa ao precipitado permanente.
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Figura 32. Amplificao de sinal devido ao maior nmero de molculas de enzimas biotinaladas ligadas avidina
O anticorpo marcado com a peroxidase pode se ligar a stios teciduais inespecficos, prejudicando a resultado do exame. A utilizao de protenas inertes alheias ao sistema reacional, tais como soro fetal bovino, soro albumina bovina ou casena, ao competirem com os stios de ligao inespecficos, reduzem a reao inespecfica. A peroxidase endgena, encontrada em diferentes tecidos, tambm pode mascarar uma reao e deve ser inibida pela incubao prvia do corte com perxido de hidrognio. A fosfatase alcalina est amplamente distribuda nos tecidos humanos e encontrada em altas concentraes na mucosa intestinal e nos tbulos proximais dos rins, entre outros tecidos. A biotina endgena, assim como as outras protenas utilizadas na IHQ, tambm encontrada em tecidos, particularmente no fgado, pulmo, bao, tecido adiposo, glndula mamria, rim e crebro. A atividade da biotina pode ser suprimida pelo uso de tampes alcalinos, pela pr-incubao com avidina ou com leite desnatado.
A avidina uma glicoprotena bsica com PM de aproximadamente 68 mil, obtida a partir da clara do ovo de vrias espcies de aves. A molcula de avidina quadrivalente e simtrica, onde cada lado da molcula contm um par de receptores para a biotina. A estreptavidina, obtida a partir do Streptomyces avidinii, possui ponto isoeltrico prximo ao neutro e mantm as propriedades de ligao da avidina sem apresentar prejuzos ao resultado final. O sistema avidina-biotina permite a amplificao de sinal, pois muitas molculas de biotina podem se ligar a um anticorpo. E a adio da avidina marcada com corantes fluorescentes, ou com enzimas, resultam em uma amplificao da reao, facilitando a visualizao do corte corado.
11.20. Citometria de fluxo
A citometria de fluxo uma tcnica utilizada para contar, examinar e classificar partculas microscpicas suspensas, em fluxo, em um meio lquido. Permite a anlise de vrios parmetros simultaneamente, sendo conhecida tambm por citometria de fluxo multiparamtrica. A verso mais aplicada da citometria de fluxo denominada FACS (fluorescence-activated cell sorter, separador de clula ativado por fluorescncia), que foi projetada para automatizar a anlise e a separao das clulas coradas com anticorpo fluorescente. O FACS utiliza um feixe de laser e um detector de luz para contar as clulas intactas nicas em suspeno. Atravs de um aparelho de deteco ticoeletrnico so possveis anlises de caractersticas fsicas e/ou qumicas de uma simples clula. Em sistemas celulares, as principais propriedades analisadas so o tamanho relativo, a granulosidade relativa, a complexidade interna das partculas e a intensidade relativa da fluorescncia. Essas caractersticas so determinadas por meio de um sistema de acoplamento ptico-eletrnico que registra a forma como a clula, ou partcula, dispersa a luz do laser incidente, emitindo fluorescncia (Figura 33).
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Figura 33. Deteco de linfticos B fluorescente, por citometria de fluxo
O fundamendo da citometria de fluxo consiste na emisso de um feixe de luz (normalmente laser), de nico comprimento de onda (cor), direccionado a um meio lquido em fluxo. Um nmero de dectores apontado ao local onde o fluxo passa atravs do feixe de luz. Um na linha do feixe (Forward Scatter ou FSC) e vrios perpendiculares a este ( Side Scatter ou SSC), alm de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partcula suspensa passando atravs do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes qumicos fluorescentes encontrados na partcula, ou juntos partcula, podem ser excitados, emitindo luz de menor frequncia do que o da fonte de luz. Esta combinao de luz dispersa e fluorescente melhorada pelos dectetores e, analisando as flutuaes de brilho de cada detector (uma para cada pico de emisso fluorescente), possvel explorar vrios tipos de informao sobre a estrutura fsica e qumica de cada partcula, individualmente. FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade interna da partcula (Ex: forma do ncleo, quantidade e tipo dos grnulos citoplasmticos e rugosidade da membrana). Atualmente, alguns citmetros de
fluxo tm eliminado a necessidade da fluorescncia e usado somente disperso de luz para sua medio. Outros citmetros de fluxo formam imagens de cada fluorescncia da clula, disperso de luz e transmisso de luz. O citmetro de fluxo dividido fundamentalmente em cinco sistemas:
Sistema fluido Local onde ocorrer a introduo e o alinhamento
das clulas por diferena de presso, e que sero interceptadas pela luz do laser.
Sistema ptico Contm a fonte de luz do laser. Normalmente
so usadas lmpadas de mercrio ou xenon, lasers de alto poder (argnio, kripton), lasers de poder baixo (argnio-488nm, redHeNe-633nm, green-HeNe e HeCd-UV) e lasers diodo (azul, verde, vermelho e violeta).
Sistema eletrnico Responsvel por converter os sinais ticos
detectados em sinais eletrnicos proporcionais, atravs de um sistema analgico para digital (ADC), gerando FSC e SSC, assim como sinais fluorescentes.
Sistema de amplificao Codifica e processa as informaes
recebidas em escala linear ou escala logartimica.

Sistema computacional Responsvel pela anlise, processamento
dos sinais e emisso do resultado, utilizando softwares especficos. Existe ainda um filtro e um sistema detector que capta a luz proveniente das clulas. A emisso de luz frontal mede o tamanho da clula e a luz lateral avalia a sua granulosidade e complexidade interna. Modernos citmetros de fluxo so capazes de analisar vrias partculas em cada segundo, em tempo real, e podem separar e isolar partculas com propriedades especficas. Os parmetros possveis de medir so: volume e complexidade morfolgica das clulas, pigmentos celulares (como a
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clorofila), DNA, RNA, anlise e classificao de cromossomas, protenas, antgenos superfcie celular (marcadores CD) e antgenos intracelulares, entre outras molculas. A hematologia foi uma das primeiras modalidades biomdicas a se beneficiar das aplicaes clnicas da citometria de fluxo. Algumas destas aplicaes so utilizadas regularmente para o diagnstico ou o acompanhamento teraputico de diferentes afeces. Em cancerologia, a deteco da clula tumoral a aplicao mais desenvolvida. Esta deteco repousa essencialmente sobre a medio de contedo anormal de DNA no ncleo da clula tumoral e da expresso proteica dos antgenos tumorais. Atualmente, a imunologia, a biologia molecular e as anlises clnicas so as reas da cincia que mais utilizam a citometria de fluxo para a deteco ou identificao de subtipos de clulas implicadas na imunidade. A contagem de linfcitos T consiste em classificar e quantificar as subpopulaes desses linfcitos, pela pesquisa imunofenotpica dos CDs, por meio de conjugados fluorescentes especficos. Dependendo dos fluorocromos que estaro ligados aos anticorpos monoclonais, as fluorescncias emitidas por eles, quando excitados pelo laser , tero comprimentos de ondas diferentes e, consequentemente, cores diferentes. H diversos tipos de fluorocromos, como o isotiocianato de fluorescena (FITC), a ficoeritrina (PE), a protena Clorofil peridinina (PerCP) e o Texas Red. Os sinais eletrnicos so usados para analisar as clulas de acordo com seus marcadores de superfcie, e esta anlise interpretada atravs de um grfico de separao dividido em janelas (gates) (Figura 34). O citmetro fornece o nmero absoluto de linfcitos, por exemplo, linfcitos T CD3+/ CD4+ e de linfcitos T CD3+/CD8+, porque em cada tubo de amostra existe um nmero conhecido de partculas de referncia conjugadas com fluorocromos (valor padro).
Figura 34. Anlise do linftico feita pelo Citmetro de Fluxo mostrando os Gates e as populaes marcadascom FITC, PE e PerCP
11.21. Testes de hipersensibilidade celular cutnea tardia
Embora existam mtodos in vitro para o exame da imunidade celular, como, por exemplo, a linfoproliferao e a citometria de fluxo, a resposta celular tambm pode ser verificada in vivo por meio de testes de hipersensibilidade celular cutnea tardia. Estes testes so muito simples e podem ser empregados na avaliao geral da imunidade celular em estudos de deficincia imunolgica e na verificao da exposio a determinados agentes infectoparasitrios individuais ou em inquritos epidemiolgicos. importante ressaltar que um teste positivo para um agente infeccioso no significa necessariamente diagnstico de doena ativa ou infeco por este agente, mas apenas a presena de clulas Th1 de memria, cuja origem foi induzida por uma infeco primria assintomtica ou de uma doena curada. O teste negativo indica que o indivduo no deve ter tido contato com o agente que se investiga.
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Estes testes, alm de representarem o principal exame complementar para o diagnstico e acompanhamento do curso de vrias enfermidades infectoparasitrias, so indicados tambm para a avaliao da diminuio da imunidade celular Th1, ou anergia, que se configura pela ausncia de resposta a uma bateria de antgenos comuns, determinada por fatores genticos ou ambientais. Como ocorre, por exemplo, em indivduos com infeces recorrentes, com infeces causadas por microrganismos que normalmente no so patognicos, indivduos em uso de imunossupressores, indivduos com imunodeficincias primrias ou com doenas que levam imunodeficincia secundria, como a AIDS, neoplasias, doenas autoimunes, etc. Na suspeita de anergia, feita a aplicao na pele, de certos produtos qumicos que reagem com protenas que induzem sensibilizao sistmica a vrios metablitos do agente sensibilizante. O dinitroclorobenzeno (DNCB) um agente que tem sido utilizado desta maneira, com a finalidade de testar a imunidade celular em pacientes com suspeita de anergia. Este no deve ser um procedimento de rotina, e deve ser reservado a pacientes que apresentaram ausncia de resposta celular aos antgenos comumente testados. Dentre os antgenos mais utilizados, para a avaliao da resposta celular de hipersensibilidade tardia, figuram os seguintes: a tuberculina, tambm chamada de PPD (derivado proteico purificado), empregada no teste de Mantoux, que utilizado para a avaliao da exposio ao Mycobacterium tuberculosis; a lepromina, ou antgeno de Mitsuda ou mitsudina, que utilizada diante da suspeita de hansenase; o extrato de Leishmania contido no teste de Montenegro, utilizado no diagnstico complementar e em inquritos epidemiolgicos de leishmaniose tegumentar; os antgenos de Candida albicans, candidina ou oidiomicina, empregados diante da suspeita de candidase; a tricofitina, para as dermatofitoses causadas por fungos; a paracoccidioidina, utilizada sob a forma de filtrado de cultura na avaliao da resposta celular ao Paracoccidioides brasiliensis, e outros.
O teste se procede pelo inculo, aps antissepsia da pele com lcool, de 0,1 mL de antgeno especfico, por via intradmica na face anterior do antebrao, usando seringas de 1 mL com agulhas n 8x0,25mm, estreis e descartveis. Como controle, deve-se injetar o mesmo volume de soluo salina em outro ponto do antebrao. A formao de uma ppula pequena e uniforme indica injeo correta. A injeo subcutnea leva diluio do antgeno e pode gerar resultados falso-negativos. A leitura realizada por medio dos maiores dimetros do eritema e da endurao aps 48-72 horas na maioria dos procedimentos. Endurao maior que 5 mm de dimetro geralmente indica resposta positiva.
12. Alguns parmetros utilizados no controle de qualidade do diagnstico sorolgico
O controle de qualidade para o diagnstico sorolgico das doenas infectoparasitrias, da mesma maneira que para todos os outros procedimentos laboratoriais, deve ser criteriosa em todas as etapas do processo. Comeando pela fase pr-analtica, que inclui a indicao e solicitao corretas do teste adequado, coleta da amostra do paciente convenientemente preparado, alm do transporte e manuseio da amostra em condies apropriadas at o laboratrio de anlise. A fase analtica compreende a escolha do mtodo adequado, a realizao do teste de acordo com as recomendaes do fabricante e o registro do resultado obtido. A fase ps-analtica inclui os eventuais clculos e a apresentao do resultado em forma de laudo final. A partir desta fase, deve ser feita a interpretao do resultado, em conjunto com os dados clnicos e demais exames laboratoriais, para que seja definida a melhor conduta.
12.1. Construo de banco de soros
O banco de soros uma coleo catalogada de amostras representativas de uma populao que se mantm para preservar suas caractersticas imunolgicas.
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Para a adequada constituio, necessrio a incluso de amostras provenientes de pessoas infectadas e de pessoas no infectadas. As amostras de pessoas infectadas, chamadas controles positivos, devem ser pertencentes s reas endmicas (se a doena possuir tal caracterstica) e vir com diagnstico conclusivo que demonstre o parasito ou por provas que deem tais indicaes, como, por exemplo, os testes intradrmicos de hipersensibilidade celular, reao de hibridizao ou a reao polimersica em cadeia ( Polymerase Chain Reaction - PCR). As amostras de indivduos no infectados, considerados normais e chamados de controles negativos, so selecionadas mediante a apresentao de resultados negativos obtidos com as mesmas provas utilizadas para seleo das amostras positivas e, se possvel for, provenientes de reas no endmicas da modalidade estudada. Se houver a incluso de soros provenientes de indivduos com outras doenas, para a verificao de respostas cruzadas, as mesmas provas diagnsticas de certeza devem ser realizadas. Todo banco de amostras necessita da aprovao de comisso de tica em pesquisa envolvendo seres humanos, bem como da aprovao de comisso de tica para uso de animais (CEUA), quando envolve amostras no humanas.
12.2. Avaliao dos mtodos sorolgicos
Ao analisar o comportamento sorolgico de duas populaes, onde uma delas seja constituda por amostras provenientes de pessoas infectadas e a outra de pessoas no infectadas, ao se comparar os resultados sorolgicos obtidos em ambas, com frequncia relativa em porcentagem, encontram-se duas curvas gaussianas bem definidas (Figura 35).
Figura 35. Distribuio de frequncias dos ttulos sorolgicos de duas populaes hipotticas, uma normal A e outra infectada B, encontradas com um teste sorolgico hipoteticamente ideal
Entretanto, estes dados hipotticos ideais no refletem o que se observa em uma rotina de diagnstico sorolgico. Os resultados dos testes sorolgicos se agrupam em quatro categorias, de acordo com a existncia ou no da doena e a positividade ou no do teste. Para qualquer infeco que se analise, observa-se sobreposio entre as curvas de distribuio da populao normal (A) e a de infectados (B), como se mostra na Figura 36, onde os soros, com resultados positivos ao teste e provenientes de pacientes nos quais o diagnstico de certeza era positivo, denominam-se verdadeiros-positivos. Soros com resultados negativos obtidos de controles normais so chamados verdadeiros-negativos. Soros com resultados negativos provenientes de pacientes infectados so denominados falsosnegativos e aqueles com resultado positivo ao teste sorolgico, porm obtidos de controles normais, so os falsos-positivos.
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Figura 36. Distribuio de frequncias dos ttulos sorolgicos, semelhantes ao que se encontra habitualmente: uma normal A e outra infectada B, obtidas com um teste sorolgico hipoteticamente ideal
Neste exemplo hipottico, a sobreposio das curvas simtrica e a linha de corte (cut off) encontra-se marcada ao centro, fornecendo assim, igual quantidade de resultados falsos-negativos (C) e falsos-positivos (D). Os dados com que se obtm as curvas podem ser extrados de um quadro de dupla entrada, como apresentado no Quadro 2. Quadro 2 Demonstrao de populaes de indivduos infectados e no infectados, onde: a = Verdadeiros-positivos, b = Falsos-positivos, c = Falsos-negativos, d = Verdadeiros-negativos e P = Prevalncia.
INDIVDUOS TESTE POSITIVO NEGATIVO TOTAL INFECO PRESENTE a c a + c (P) AUSENTE b d b+d TOTAL a+b c+d n
Apesar de testes sorolgicos produzirem muitos resultados verdadeiros, alguns resultados falsos, como j mencionado, podem ser gerados, sejam eles positivos ou negativos; e, por conseguinte, comum dizer que os testes sorolgicos so presuntivos, ou seja, de valor probabilstico. Estes testes, obrigatoriamente, devem ser avaliados para definir parmetros importantes quanto s suas qualidades fixas (sensibilidade, especificidade e acurcia), uma vez que estes valores independem da prevalncia da infeco estudada na populao. Um teste de triagem sorolgica ideal deve ser capaz de identificar todos os indivduos com a condio estudada e de excluir todos os indivduos que no apresentem esta condio. A probabilidade do teste em identificar corretamente, em uma populao, os indivduos que apresentem a infeco, denomina-se sensibilidade (S) e pode, tambm, ser conceituada como a capacidade de um teste sorolgico proporcionar resultados positivos nos indivduos infectados ou, ainda, como a capacidade do mtodo sorolgico em detectar quantidades mnimas do material desejado. Calcula-se a sensibilidade com a seguinte relao: Sensibilidade = a : (a + c) De acordo com os dados do quadro 3 Sensibilidade = 300 : 400 = 0,75 ou 75% Os resultados podem ser apresentados em uma escala de 0 a 1, mas normalmente so expressos em porcentagem. A capacidade do teste para excluir aqueles que no so afetados chamada especificidade (E), que tambm pode ser conceituada como a qualidade que um teste apresenta em distinguir molculas diferentes, porm, com elevado grau de homologia. Aproveitando os dados do Quadro 3, a especificidade calcula-se por:
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Especificidade = d : (b + d ) onde Especificidade = 540 : 600 = 0,9 ou 90%
Quadro 3 Resultados sorolgicos hipotticos encontrados em duas populaes de indivduos infectados e no infectados
INDIVIDUOS TESTE POSITIVO NEGATIVO TOTAL INFECO PRESENTE 300 a 100 c 400 a + c (P) AUSENTE 60 600 b b+d 540 d TOTAL 360 a + b 640 c + d 1000 n
A acurcia (A), tambm chamada de confiabilidade ou eficincia do teste, refere-se ao somatrio dos resultados verdadeiros positivos e negativos em relao populao estudada.
Acurcia = (a + d) : n onde Acurcia = (300 + 540) : 1000 = 0,84 ou 84%
O coeficiente de prevalncia (P) pode ser conceituado como a porcentagem de indivduos infectados, parasitologicamente comprovados em uma populao. Esse conceito difere da soroprevalncia, (SP) que considera a porcentagem de indivduos soropositivos na populao estudada.
Prevalncia = (a + c) : n Soroprevalncia = (a + b) : n onde Prevalncia = 400 : 1.000 = 40% onde Soroprevalncia = 360 : 1.000 = 36%
A determinao das qualidades fixas de um teste sorolgico, por si s, no satisfaz suficientemente s necessidades do controle sob os resultados sorolgicos, uma vez que a ocorrncia de resultados falsos pode alterar, em funo da prevalncia de infeco. Como as tcnicas sorolgicas so utilizadas em diversos lugares do mundo em reas com diferentes coeficientes de
prevalncia, importante conhecer a probabilidade de que os resultados positivos segundo a tcnica empregada sejam realmente positivos, bem como os resultados negativos sejam realmente negativos. Estas probabilidades so os valores de predio (VP) da tcnica. O parmetro mais frequentemente utilizado o valor de predio de positividade (VPP), que permite identificar os doentes em um grupo de indivduos considerados soropositivos. O valor de predio de negatividade (VPN) conceituado como a probabilidade de que a doena estudada no exista em um grupo de indivduos considerados como soronegativos. Disto deduz-se que o valor de predio pode ser dado pelo teorema de Bayes: VPP = (P x S) : (P x S) + (1 - P) x (1 - E) VPN = E x (1 - P) : E x (1 - P) + (1 - S) x P Por outro lado, os clculos podem expressar-se de uma forma mais simples, mediante os valores do Quadro 3 apresentado anteriormente: VPP = a : (a + b) VPN = d : (c + d) onde VPP = 300 : 360 = 0,83 (83%) onde VPN = 540 : 640 = 0,84 (84%)
feita a aplicao do mesmo teste sorolgico, com sensibilidade e especificidade invariveis, em duas reas endmicas para uma determinada doena, onde a nica diferena entre estas populaes seja a prevalncia de infeco encontrada, representada por uma populao (A) de baixa prevalncia e uma (B) de alta prevalncia. A alterao no comportamento do teste se verifica pela modificao dos valores de predio de positividade e de negatividade. A partir dos valores apresentados no quadro 4, podese verificar tais modificaes.
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Quadro 4 - Quadro explicativo para os clculos do valor de predio de positividade em duas populaes hipotticas: populao A = baixa prevalncia e populao B = alta prevalncia, para uma determinada infeco.
Resultado (A) Prevalncia de infeco = 1% (B) Prevalncia de infeco = 10% do teste Infectados No infectados total Infectados No infectados total Positivo Negativo Total
P = 1%
980 20 1000
S = 98%
990 98010 99000

SP = 99%
1970 98030
9800 200
900 89100 90000

S = 98%
10700 89300 100000

SP = 99%
100000 10000
P = 10%
VPP = 980 / 1970 X 100 = 49,7%
VPP = 9800 / 10700 X 100 = 91,6%
Conforme demonstrado, embora o teste sorolgico tenha sensibilidade e especificidade elevadas, 98% e 99% respectivamente, sua aplicao em rea de baixa prevalncia gerou valor de predio de positividade inferior a 50%. Contrariamente, em rea de alta prevalncia o valor de predio de positividade elevou-se acima de 90%. O Quadro 5 ilustra, com maiores detalhes, como o valor de predio de positividade dos testes sorolgicos, com diferentes nveis de sensibilidade e de especificidade, sofrem alteraes em funo dos valores crescentes do coeficiente de prevalncia. Via de regra, o teste sorolgico no deve ser empregado em reas de baixa prevalncia em consequncia da gerao de numerosos resultados falsos-positivos. Em tcnicas parasitolgicas dificilmente ocorrem resultados falso-positivos, como, por exemplo, a identificao de hemoparasitos em exames microscpicos pela extenso sangunea em lmina, ou enteroparasitos em fezes, definitivo para comprovar uma infeco. Por outro lado, no podem ser utiliza-
dos para estimar a prevalncia real de infeco, por apresentarem resultados falso-negativos. Quadro 5 - VPP de testes com diferentes ndices de sensibilidade e especificidade para diversas taxas de prevalncia
VARIAO DO VALOR DE PREDIO DE POSITIVIDADE especificidade = 99% Prevalncia % 0,5 1,0 5,0 10,0 20,0 sensibilidade % 70 80 90 95 99 2 2 5 9 33 3 5 9 17 50 15 21 34 51 84 27 35 52 69 92 45 55 71 83 96 sensibilidade = 99% especificidade 99% 70 80 90 95 99 26 41 79 89 95 29 45 81 90 95 31 48 83 91 96 22 49 83 91 96 33 50 84 92 96
Valores de predio de positividade
Os resultados dos testes sorolgicos tambm podem ser confrontados para a verificao da copositividade, da conegatividade e da concordncia bruta. Estes parmetros podem ser obtidos em funo da distribuio dos resultados dos testes sorolgicos, como representados no Quadro 6 de maneira semelhante sensibilidade, especificidade e confiabilidade. A concordncia ajustada Kappa (K) um parmetro que se baseia na comparao do ndice de concordncia esperada com o ndice de concordncia observada.
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Quadro 6 - Quadro explicativo para os clculos da Copositividade, e da Conegatividade, Concordncia bruta e Concordncia ajustada Kappa (K.)
TESTE 1 (Teste de referncia) TESTE 2 POSITIVO NEGATIVO TOTAL PRESENTE a c a + c (p2) AUSENTE b d b + d (q2) TOTAL a + b (p1) c + d (q1) a+b+c+d
Copositividade = a : (a + c) Conegatividade = d : (b + d) Concordncia bruta= (a + d) : ( a + b + c +d) Kappa = [2 (ad + bc) : (p1q2 + p2q1)] Pode-se utilizar o seguinte critrio para conceituar os resultados do controle de qualidade: valores 40,0% so considerados pobres, de 40,1 at 79,9% regulares, valores 80,0 a 89,9% so considerados bons e 90% so considerados excelentes.
Resumo do captulo
O sistema imunitrio, assim como os demais sistemas do organismo, possui suas prprias clulas, tecidos, rgos e molculas. A principal clula desse sistema o linfcito. Os linfcitos so as nicas clulas do organismo que expressam receptores altamente diversificados para o antgeno, o que permite o reconhecimento de uma grande variedade de substncias estranhas. A ativao do sistema imune adaptativo depende da apresentao de antgenos. Um antgeno qualquer substncia que pode ser reconhecida por um anticorpo ou por um receptor de clula T. Os antgenos possuem duas propriedades: a imunogenicidade e a antigenicidade. Os que no so capazes de induzir uma resposta imune so chamados de haptenos e precisam ser acoplados s molculas carreadoras para adquirirem tal capacidade. O determinante antignico, ou epitopo, a menor poro da molcula e responsvel pela propriedade de estimular uma resposta imune. As superfcies celulares, incluindo os microrganismos, geralmente possuem uma grande quantidade de determinantes antignicos. Os anticorpos atuam na resposta imune ligando-se especificamente ao agente patognico ou seu subproduto, ativando o sistema complemento, opsonizando para aumentar a fagocitose e a citotoxicidade dependente de anticorpo, e permitindo, assim, que microrganismos e parasitos sejam destrudos pelas clulas do sistema imune. Os anticorpos se encontram distribudos por todo o organismo, pois os agentes infecciosos podem vencer as diversas barreiras naturais e estabelecer uma infeco em qualquer parte do corpo. Os primeiros anticorpos a serem produzidos numa resposta imune so as IgM e tendem a ser de baixa afinidade, mas so muito potentes na ativao do sistema complemento. A IgG o principal isotipo no sangue e fluidos extracelulares, e transportada atravs da placenta diretamente para a corrente circulatria do feto durante a vida intrauterina. A IgA tem papel importante na proteo das superfcies
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mucosas contra patgenos ou seus subprodutos. A IgE tem como principal funo o recrutamento de clulas inflamatrias atravs da ativao de mastcitos e basfilos, como tambm pode estar envolvida na eliminao de parasitos e processos alrgicos. Existem vrios sistemas proteicos de reao em cadeia no plasma sanguneo, dentre estes, o sistema complemento, que um complexo sistema constitudo por molculas termolbeis e termoestveis, e que tem como funo a eliminao de um agente estranho, facilitando a fagocitose, quando algumas protenas ativadas do complemento opsonizam a superfcie do patgeno; por reao Inflamatria, quando os pequenos fragmentos de protenas recrutam fagcitos ao local da atividade inflamatria; ou por lise direta, quando, uma vez desencadeada a cascata, os componentes terminais do complemento lesam a membrana dos microrganismos. Todo organismo multicelular possui algum sistema de defesa que distingue os patgenos e elimina-os do hospedeiro. A vantagem de tal imunidade especfica que o sistema imune pode rapidamente adaptar-se queles patgenos que so mais frequentemente encontrados no meio ambiente local. Esta capacidade conseguida atravs do complexo principal de histocompatibilidade, cujos produtos desempenham um papel no reconhecimento intercelular e na discriminao entre o prprio e o no prprio. Didaticamente, a imunidade adaptativa se organiza em imunidade humoral e imunidade celular. A imunidade mediada por clulas se desenvolve por uma rede de interaes que resulta em defesa contra microrganismos, os quais sobrevivem dentro de fagcitos ou de outras clulas. A resposta iniciada pelo reconhecimento do antgeno de microrganismos intracelulares por clulas T atravs do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Na resposta via CD8, somente a clula alvo que porte o antgeno associado classe I pode ser lisada ou induzida a entrar em apoptose. Em outro mecanismo da resposta celular, as clulas T CD4+ Th1 ativam, por exemplo, macrfagos
infectados atravs de citocinas como o IFN-g. Quando um patgeno resiste aos efeitos dos macrfagos ativados, pode-se desenvolver uma infeco crnica. J a resposta imune humoral conduz destruio dos microrganismos extracelulares e previne ou diminui a disseminao das infeces intracelulares, por meio da neutralizao, opsonizao e ativao do sistema complemento. A ativao das clulas B e sua diferenciao em clulas secretoras de imunoglobulinas so deflagradas pelo antgeno especfico e requer a participao de clulas CD4+ Th2, que tambm controlam a mudana de isotipo e desempenham papel importante na hipermutao somtica, o que necessrio para a maturao da afinidade dos anticorpos. Em algumas infeces, o sistema imunitrio no consegue eliminar o parasito, mas reage isolando o agente com clulas inflamatrias. Na esquistossomose, a formao do granuloma um exemplo da reao do hospedeiro contra o parasito. A maioria dos parasitos desenvolve mecanismos de escape do sistema imune para garantir sua sobrevivncia e alguns comprometem tanto as respostas mediadas por anticorpos como as mediadas por clulas. A medida das interaes entre antgeno-anticorpo com o propsito de diagnstico conhecida como imunossorologia. As tcnicas imunossorolgicas fundamentam-se na natureza da interao antgeno-anticorpo nas quais podem expressar-se em duas formas distintas, em decorrncia da utilizao de imunorreagentes livres de marcao ou de reagentes marcados. As tcnicas que no empregam marcadores demonstram-se por fenmenos visveis. Portanto, ao se combinar anticorpos com antgenos solveis, os complexos resultantes podem formar precipitados insolveis. Se os antgenos so particulados (bactrias, protozorios, hemcias), os anticorpos os aglutinam. Se o anticorpo pode ativar a via clssica do sistema complemento e o antgeno se encontra em uma superfcie celular, o resultado pode ser a citlise. As tcnicas que empregam imunorreagentes marcados caracterizam-se pela simples combinao do antgeno com o anticorpo, necessitando que um deles esteja marcado convenientemente.
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O imunorreagente pode ser marcado com corantes fluorescentes ou quimioluminescentes, radioistopos, enzimas, ouro ou prata coloidais, entre outros marcadores. Apesar de testes sorolgicos produzirem muitos resultados verdadeiros, alguns resultados falsos podem ser gerados, sejam eles positivos ou negativos e, por conseguinte, comum dizer que os testes sorolgicos so presuntivos, ou seja, de valor probabilstico. Estes testes, obrigatoriamente, devem ser avaliados para definir parmetros importantes quanto s suas qualidades fixas (sensibilidade, especificidade e acurcia), uma vez que estes valores independem da prevalncia da infeco estudada na populao.
Questes
1) Descreva o processo de maturao das clulas T, no timo. 2) Comente sobre a importncia das molculas de adeso na resposta imune. 3) Defina imunogenicidade e especificidade. 4) Defina adjuvante e sua funo na resposta imune. 5) Descreva as principais propriedades das cinco classes de Imunoglobulinas. 6) Como voc prepararia um anticorpo contra IgG humana? 7) Descreva o processo de ativao da via clssica e da via alternativa do complemento. 8) Descreva os principais mecanismos de atuao do sistema complemento na eliminao de patgenos. 9) Descreva o processamento e apresentao de um antgeno intracelular presente no citoplasma da clula.
10) Descreva o processamento e apresentao de um antgeno, oriundo de uma bactria extracelular, que foi ativamente fagocitada por um macrfago. 11) Descreva os principais mecanismos de atuao da resposta humoral. 12) Descreva os mecanismos de ao exercidos pelas clulas CD8 na resposta celular. 13) Descreva os principais mecanismos de imunidade inata e adaptativa contra vrus. 14) Descreva os principais mecanismos de imunidade adaptativa e especfica contra bactrias extracelulares e bactrias intracelulares. 15) Como os helmintos parasitas do lume intestinal so expulsos do organismo? 16) Sempre que encontramos uma reao imunolgica positiva, ela determina a presena do agente etiolgico? Justifique. 17) O que converso sorolgica? 18) Explique o fenmeno prozona e como fazemos sua neutralizao. 19) O que causa reao cruzada em provas sorolgicas? O voc sugere para impedir esse fenmeno? 20) Quais a provas sorolgicas realizadas em banco de sangue para preveno de doenas transmissveis? 21) Quais as vantagens e desvantagens do uso de anticorpos monoclonais em provas sorolgicas? 22) Como se processam as reaes de aglutinao direta? D um exemplo de teste comumente usado para fins de diagnsticos. 23) Qual o fundamento da reao de imunofluorescncia indireta (RIFI)? 24) Fale sobre a reao Imunoenzimtica (ELISA), quanto ao seu modo de ao, suas vantagens e desvantagens.
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25) Na etapa de sensibilizao das placas plsticas de microdiluio, da reao imunoenzimtica ELISA, utilizamos tampes com pH elevado (por volta de 9,6) para preparar os antgenos proteicos. Por qu? 26) Com que propsito utilizamos casena (protena do leite) no desenvolvimento do ELISA? 27) Fale sobre o fundamento do teste de imunoeletrotransferncia ( Westernblotting). 28) Conceitue: a) Sensibilidade; b) Especificidade
Bibliografia consultada
ABBAS, A. K. ; LICHTMAN, A. H. ; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 6. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. BACAL, N. S, FAULHARER, M. H. W. Aplicao prtica em citometria de fluxo. So Paulo: Atheneu, 2003. BENJAMINI, E. ; COICO, R. ; SUNSHINE, G. Imunologia. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. DUARTE, R. Ensaio imunoenzimtico (ELISA) para identificao experimental de fontes alimentares em Panstrongylus megistus Burmeister, 1835 (Hemiptera: Reduviidae). Dissertao (Mestrado). Fundao Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 1997. FERREIRA, W.; VILA, S.L.M. Diagnstico laboratorial das principais doenas infecciosas e auto-imunes. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. HALLIWELL, R. E. W. ; GORMAM, N. T. Inmunologia clnica veterinria. Zaragoza: Acribia, 1992. JANEWAY, C. A. J.; et al. Imunobiologia: o sistema imunolgico na sade e na doena. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. KINDT, T. J. ; GOLDSBY, R. A. ; OSBORNE, B. A. ; Imunologia de Kuby. 6.ed. Bookman, 2008. OCONNOR, J. E. et al. The relevance of flow cytometry for biochemical analysis. IUBMB Life. v. 51, n. 4, p. 231-239, 2001.
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Figura 3. rgos, tecidos e clulas envolvidos na resposta imunitria.

2.3.Tecido linfoide associado mucosa

faringe. formado pelas tonsilas e adenoides.

Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT = gut-associated

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4.2. Relao filogentica dos antgenos

4.5. Forma de administrao e adjuvantes

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5.1. Gerao da diversidade na resposta imune humoral e maturao da afinidade

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5.2. Distribuio e propriedades dos isotipos

5.3. Polimorfismo das imunoglobulinas

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5.4. Anticorpos monoclonais

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a bactrias, opsonizando-as para ingesto pelos fagcitos portadores de receptores do complemento;

Reao inflamatria - quando os pequenos fragmentos de protenas

promovem eventos vasculares e recrutam fagcitos ao local da atividade inflamatria.

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6.1. Ativao da via clssica

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Figura 9. Ativao da cascata do complemento pela via clssica.

6.2. Via das Lectinas

Figura 10. Ativao da cascata do complemento pela via das lectinas

6.3. Via Alternativa

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7. Complexo principal de histocompatibilidade

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7.3. MHC de classe II

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7.4. Processamento e apresentao de antgenos s clulas T CD8

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8.1. Resposta celular e o mecanismo de ao das clulas T CD8+

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8.2. Mecanismo de ao das clulas CD4+ Th1 e CD4+ Th2

8.3. Resposta humoral

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9. Resposta imune aos agentes infectoparasitrios

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Figura 17. Mecanismos pelos quais os vrus lesionam as clulas

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10.1. Aplicaes dos testes sorolgicos

72 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

10.2. A importncia do diagnstico individual

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Quadro 1. Caractersticas cinticas das protenas de fase aguda

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Figura 19. Curva de formao de imunocomplexos visveis

11.2. Reao de precipitao em meio lquido

Figura 20. Imunodifuso em meio lquido (Teste de Precipitina)