ANLISE DE RNA Introduo O RNA total utilizado em diversos tipos de anlises de expresso gnica e caracterizao de transcritos, baseado nos

s mtodos de Northern, RT-PCR, construo de bibliotecas de cDNA, ESTs, etc. citando apenas os mais comuns. Para essas anlises recomendvel a purificao de molculas de RNA que estejam mais intactas e mais completas em termos de comprimento, de forma mais pura e ntegra possvel. Diversos mtodos foram descritos e aplicados para extrao de RNA total, baseados na utilizao de agentes desnaturantes fortes, tais como fenol e sais de guanidina. A principal preocupao na extrao de RNA consiste na sua degradao por ribonucleases (RNAses), que so enzimas extremamente resistentes a vrios tratamentos, inclusive trmicos (fervura, autoclavagem etc.). A utilizao de agentes desnaturantes fortes permitem a lise das clulas e a inativao das ribonucleases. O mtodo bsico emprega a extrao com fenol seguida da precipitao do RNA por etanol. De forma a diminuir a contaminao com RNAses das solues, equipamentos, vidrarias e reagentes recomendvel trat-los com autoclavagem e/ou com DEPC (dietilpirocarbonato). DEPC um forte inibidor de RNAses. Os passos bsicos da extrao de RNA consistem: 1. Triturao dos tecidos por moagem sob baixa temperatura (N lquido); 2. Liberao dos componentes celulares no tampo de moagem (extrao) por lise das membranas com detergentes; 3. Inativao das nucleases por agentes qumicos e desnaturao das protenas com fenol e clorofrmio; 4. Remoo dos restos celulares e precipitao das protenas desnaturadas por centrifugao. Recuperao dos cidos nucleicos por precipitao com etanol; 5. Fracionamento do DNA e RNA por solubilizao diferencial sob alta concentrao de sal. Vrios mtodos empregam a precipitao seletiva usando cloreto de ltio (LiCl).

TRIZOL O produto comercial TRIZOL (Invitrogen) consiste num reagente pronto para o uso no isolamento de RNA total de clulas e tecidos. O reagente consiste numa soluo monofsica de fenol e guanidina isotiocianato, que deriva da melhoria do mtodo de isolamento de RNA num nico passo desenvolvido por Chomczynski & Sacchi (1987. Anal. Biochem 162, 156). Durante a homogenizao ou lise da amostra, o TRIZOL mantm a integridade do RNA enquanto rompe as clulas e dissolve os componentes celulares. A adio do clorofrmio, seguido da centrifugao, separa a soluo em fases aquosa e orgnica. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. Depois da transferncia da fase aquosa para um novo tubo, o RNA total recuperado por precipitao com isopropanol. Depois da remoo de fase aquosa, o DNA e as protenas da amostra ainda podem ser recuperados por precipitao seqencial. A precipitao com etanol resulta em DNA na interface e uma precipitao adicional com isopropanol produz protenas a partir da fase orgnica. A co-purificao do DNA pode ser til na normalizao da produo de RNA entre amostras. Essa tcnica apresenta bons resultados com pequenas quantidades de tecido (50 a 100 mg de tecido) e clulas (5 x 106) ou at grande quantidades de tecidos (>1 g) e clulas (>107) de

origem humana, animal, plantas ou bacteriana. O procedimento de extrao pode ser realizado em menos de 1 hora e um grande nmero de amostras podem ser preparadas. O RNA total produzido livre de contaminaes por DNA ou protenas. Preparo de material livre de RNAse: As ribonucleases so de difcil controle. O nico mtodo possvel evitar a sua presena nos reagentes, vidrarias e materiais, evitando a subsequente contaminao. Durante a manipulao das amostras e solues, deve-se sempre usar luvas de ltex descartveis. Devem ser usadas boas prticas de microbiologia. Os materiais plsticos devem ser descartveis e pipetadores automticos devem ser dedicados a manipulao de RNA para evitar contaminao cruzada com RNAses (empregadas no isolamento de DNA ). Os cadinhos e pistilos deve ser lavados com uma soluo de 0,01 % SDS (p/v), e enxagados com gua, gua destilada e gua ultrapura (milliQ). A seguir, os cadinhos e pistilos so incubados com gua tratada com 0,01% de dietilpirocarbonato (DEPC) ativo por duas horas na capela e secos, antes de serem embalados com papel alumnio, autoclavados (120C) por 20 minutos e secos na estufa (80C). Todas as solues usadas para trabalhos com RNA devem ser preparadas com gua 0,01% DEPC autoclavada. As cubas de eletroforese e pentes para RNA devem ser lavadas com 0,01% SDS e enxaguadas com gua livre de RNAse. A vidraria tambm lavada da mesma forma e depois autoclavada. Na presena de TRIZOL o RNA est protegido contra ribonucleases. Aps a precipitao e lavagem, recomendvel que os tubos e plsticos estejam livres de RNAse para evitar a degradao. Uma outra possibilidade de tratamento das vidrarias pode ser a 150C por 4 h e os tens plsticos tratados por 10 min com 0,5 M NaOH, lavados completamente com gua e autoclavados. OBS. O DEPC deve ser manuseado com cuidado, usando luvas, mscara e manipulado em capela sempre que possvel, pois inflamvel e mutagnico. Como o DEPC reage com aminas, no pode ser usado para tratar solues contendo tampo Tris, nem no tratamento de solventes orgnicos, deve-se obrigatoriamente separar um frasco de reagente para o perparo exclusivo de solues a serem utilizadas para a extrao de RNA.

Extrao de RNA total (mtodo do Trizol) Reagentes necessrios: - clorofrmio - isopropanol - etanol 75% em gua tratada com DEPC - gua livre de RNAse ou soluo de 0,5% de SDS. [Para preparar gua livre de RNAses, coloque gua em garrafas livre de RNAses. Adicione dietilpirocarbonato (DEPC) at 0,01% v/v. Deixe por toda noite e autoclave. A soluo de SDS deve ser preparad com gua autoclavada tratada com DEPC] O mtodo bsico recomendado de extrao de RNA usando Trizol (Invitrogen Life Technologies), utiliza 100 mg de tecido fresco pulverizado em cadinhos com nitrognio lquido. Antes de descongelar, o macerado recebe 1 mL de reagente Trizol sendo ento transferido para

microtubo (1,7 mL), e vortexado. A proporo deve ser 50 a 100 mg de amostra para 1 mL de TRIZOL. Em caso de uso de suspenso celular, centrifugue as clulas e ressuspenda em TRIZOL. A lise das clulas deve ser feita pela pipetagem repetitiva. Usar 1 mL de TRIZOL para 5-10 x 106 clulas de animal, plantas ou leveduras e 1 x107 de bactrias. Aps ser incubado a temperatura ambiente por 5 min para permitir a completa dissociao dos complexos de nucleoprotenas, a soluo centrifugada (11.400 rpm, 15 min a 4C). A fase aquosa cuidadosamente transferida para um tubo novo para realizar uma lavagem com clorofrmio (200 L) sob agitao intensa por 15 segundos e posterior incubao a temperatura ambiente por 5 min., seguido de nova centrifugao (11.400 rpm, 15 min a 4C). A mistura se separa em 3 fases: inferior orgnica (avermelhada contendo fenol), interfase e a superior aquosa e mais clara. A fase aquosa (at 60% do volume original de TRIZOL) ento transferida novamente para um microtubo limpo e o RNA total precipitado com isopropanol (0,5 ml de isopropoanol por mL de TRIZOL usado). No caso de tecidos vegetais ricos em polissacardeos, recomenda-se usar 250 L de isopropanol contendo 0,8 M citrato de sdio e 1,2 M da NaCl (250 L). Aps a adio do isopronol, segue-se com centrifugao (11.400 rpm, 10 min a 4C). O pellet ento lavado com 1 mL de etanol 75%, e seco a 37C por 10 min. O RNA total ento ressuspenso em 30 L de gua livre de RNAse. Os estoques de RNA so mantidos a -80C. A primeira avaliao do RNA realizado em gel agarose 1% em TAE livre de RNAse. Quantificao de RNA: A quantificao das amostras de RNA deve ser realizada por espectrofotmetro, sendo a concentrao calculada em g mL-1 atravs da formula: (A 260 nm - A 320 nm ) x 40 x fator de diluio = [RNA] em g/ml OU
[RNA] = A260 x Fc x fd 1000

Onde A260nm valor de leitura da amostra a 260 nm; Fc corresponde ao fator de converso, no qual a A260 mxima 1 e corresponde a 40 g mL -1 de RNA; fd corresponde ao fator de diluio da amostra de leitura; o resultado da multiplicao divido por mil para obtermos a concentrao em g L-1. A qualidade do RNA analisada com base na relao da absorbncia A260nm A280nm e da leitura a A320nm, assim como na visualizao do RNA aps eletroforese em gel de agarose 1% em TAE livre de RNAse. Gel eletroforese de RNA: Amostras de RNA podem ser corridas em gel de agarose no-desnaturante, similar ao empregado na anlise de DNA. Nessas condies, possvel alguma separao de RNA, sendo possvel identificar RNA ribossomial. Entretanto, esse tipo de gel eletroforese no recomendada para procedimentos analticos, tais como a hibridizao por Northern. O RNA separado em gis no-desnaturantes no adere bem a nitrocelulose e no migra precisamente de acordo com o tamanho pois o RNA no encontra-se desnaturado. O comportamento

eletrofortico do RNA depende do tamanho, carga e principalmente estrutra secundria da molcula. Para eliminar o efeito da estrutura secundria do RNA (ala, stem-loop), a eletroforese realizada em gis contendo agentes desnaturantes tais como formaldedo, glioxal/DMSO, hidrxido de metil-mercrio. Esses mtodos empregam agarose como meio, mas tipicamente contm reagentes que mantm o RNA desnaturado, sendo necessrio algum tipo de tratamento das amostras antes de carregar utilizando formaldedo e formamida como agente desnaturante de RNA na eletroforese. Solues 1. EDTA tratado com DEPC (0,1 M Na2EDTA, pH 8,0; 0,1% DEPC) EDTA 7,4 g Dissolver EDTA em cerca de 100 ml de ddH2O Ajustar pH para 8,0 Completar volume para 200 ml DEPC 0,2 ml Mexer por 3-4 horas e autoclavar. 2. 10X estoque de MOPS (0,2 M de 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid), 0,05 M de acetato de sdio, 0,01 M EDTA; pH 5,5-7,0) MOPS 41,86 g Acetato de sdio 6,8 g 0,1 M EDTA, pH 8,0 100 mL ddH2O para 1 litro DEPC 1 mL Mexer por algumas horas e autoclavar 3. ddH2O tratada com DEPC ddH2O 1 litro DEPC 1 mL Mexer por algumas horas e autoclavar 4. Tampo 1 XMOPS (0,02 M de 3-[N-morpholino]propanesulfonic acid), 0,005 M de acetato de sdio, 0,001 M EDTA; pH 5,5-7,0) ddH2O tratada com DEPC 990 mL 10X estoque de MOPS 110 mL 5. Tampo da Amostra (guardar refrigerado) 10X estoque de MOPS 1 mL Formaldedo 1,77 mL ddH2O tratada com DEPC 2,23 mL Formamida redistilada 5,0 mL

6. Tampo de carregamento 0,1 M EDTA pH 8,0 100 l Glicerol 5 mL ddH2O tratada com DEPC 4,9 mL Opcional: adicionar 0,25 % de azul de bromofenol e 0,25% de xileno cianol. Mas em gis de 1,2% a sombra pode afetar a visualizao na transferncia para membranas. Azul de bromofenol corre com tamanho de 0,24 kb e fluoresce junto com brometo de etdeo. 7. Brometo de etdeo (0,5 mg/mL) Brometo de etdeo 0,5 mg ddH2O tratada com DEPC 1 mL Preparao do gel: 1. Pese a agarose (1,2%) e dissolva em 119,5 mL de gua tratada com DEPC. Aquea no microondas. Aguarde esfriar abaixo de 65C; 2. Acrescente 13,75 mL de tampo 10X MOPS e 4,1 mL de formaldedo, e mexa. Aplique a soluo na bandeja do gel e aguarde solidificar; 3. Prepare as amostras dissolvendo em 50 L tampo da amostra. Adicione 10 L de tampo de carregamento e 2 l de brometo de etdeo; 4. Aquea as amostras a 65C por 10 minutos e coloque no gelo rapidamente; 5. Coloque a cuba sobre uma placa agitadora magntica; 6. Aplique o tampo 1X MOPS at submergir o gel. Sugere-se pr-aquecer o gel com uma corrida prvia; 7. Aplique as amostras e coloque a 70 V por 15 cm. Aplique a agitao para recirculao do tampo de corrida aps 15 minutos (aps a entrada das amostras no gel). A presena de brometo de etdeo no gel ou no tampo das amostras permite a visualizao direta dos fragmentos no gel.

-P 250 P Raiz 33 34 35 36 41 42 43 44 8.1 8.2 8.3 8.4 T