Asromao 200701

Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento de Plantas
LGN 5799 - SEMINRIOS EM GENTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
ANLISE DA EXPRESSO GNICA DURANTE A INTERAO FUNGO-PLANTA

Aline Silva Romo
Orientador: Dr. Welington Luiz de Arajo
Departamento de Gentica Avenida Pdua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - So Paulo - Brasil Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Interaes Fungo-Planta
Patgenos
fungos biotrficos fungos hemibiotrficos fungos necrotrficos
epiftico epiftico
Mutualistas
patgeno patgeno
fungos endofticos fungos epifticos fungos micorrzicos fungos da rizosfera
endfito endfito
micorriza micorriza
TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
Interaes Fungo-Planta
Dificuldade de entender como comunidades fngicas interagem no interior da planta
Wagner & Lewis, 2003
Anlise da Expresso Gnica

Abordagens
Estudo de genes especficos
- Nothern-blot - RT-PCR (Reverse Transcription PCR) - PCR quantitativo (qPCR)
Estudo do transcriptoma
Transcriptoma da Interao
Hospedeiro Microrganismo
Genes no expressos na interao Genes induzidos Transcriptoma da Interao Genes com expresso constitutiva Genes reprimidos
Birch & Kamoun, 2000
Transcriptoma da Interao
Hospedeiro Interao Fungo
Mtodos de anlise da expresso gnica diferencial
modificado de Birch & Kamoun, 2000
Anlise da Expresso Gnica em Larga Escala

Diversas metodologias disponveis limitaes especficas e plataforma de dados distintas Base do mtodo Hibridizao
Macroarranjos de cDNA Oligo-microarranjos Microarranjos de cDNA Hibridizao Subtrativa
PCR
cDNA-AFLP Differential Display Hibridizao Subtrativa Supressiva RDA
Seqenciamento
SAGE MPSS ORESTES
ESTs
4000
3637
3500 3000
n publicaes
2802
2500 2000 1500 1000 500

116 794 824 485 9 74 746 399 1821
Hibridizao PCR Seqenciamento
D D
m ic ro ig ar ora m y ic ro ar ra y
cD
Pesquisa feita na base de dados PubMed >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?dh=pubmed>. Acesso em 02 jun 07.
ol
N A-
cD
M PS S O R ES TE S
SS H
SH
AF LP
D A
A TO G
N A-
SA G
Anlise da Expresso Gnica

Microarranjos de cDNA Differential Display (DD) Anlise Serial da Expresso Gnica (SAGE) PCR quantitativo (qPCR)
Microarranjos de cDNA
(Schena et al., 1995)
Princpio cDNAs marcados hibridizam, com alta sensibilidade e especificidade, com seqncias de genes conhecidos imobilizadas em um substrato slido Permite a anlise simultnea da expresso de centenas a milhares de genes em um nico experimento Permite estudar as mudanas nos nveis de expresso gnica de um hospedeiro em resposta colonizao por um fungo (e vice-versa). Fornece viso molecular dos eventos que seguem a infeco.
Microarranjos
Passo 1
Preparo das lminas
estrutura genmica anotada amplificao das sondas por PCR
spotting das sondas na lmina
at 20000 genes
0,05-0,15cm
modificado de Ehrenreich, 2006
Microarranjos
Passo 2
Preparo das amostras

amostra A extrao de RNA total amostra B
Cy5
RT-PCR e marcao com corante fluorescente
Cy3
Microarranjos
Passo 3
Hibridizao e Leitura
amostra A amostra B
+
hibridizao
amostra A > B amostra A ~ B amostra B > A
sada digital
leitura da fluorescncia
anlise das imagens
Cy5 532 nm Cy3 635 nm
imagens cruas
Microarranjos
Passo 4
Anlise dos Dados Digitais

Armazenamento dos dados in local ou em bancos de dados pblicos
Anlise de imagem: determinao da margem dos sinais dos spots e quantificao dos dados de fluorescncia
Anlise de agrupamento ou interpretao biolgica

experimentos
Teste para expresso diferencial
Correo do background e seleo dos sinais de qualidade
Normalizao dos dados
Transformao dos dados

genes
Microarranjos
Aspectos importantes
Repeties

Spotting mesma sonda mltiplas vezes num mesmo arranjo

Marcar e hibridizar vrias vezes (ex. dye swap) Repetir condies experimentais e extrao de RNA (3x pelo menos)
Origem das sondas para anlise de arranjos de DNA

Colees de ESTs ORFs de seqncias genmicas Seqncias sintetizadas na lmina (Biochip) Bibliotecas de cDNA Fragmentos de DNA genmico (lminas cegas)
Microarranjos
Principais Vantagens da Tcnica

Anlise global da expresso gnica; Viso da expresso de milhares de genes simultaneamente; Anlises rpidas; Anlise da expresso de genes que atuam em um carter complexo; Dados digitais; Fcil manuseio; Reagentes seguros.
Microarranjos
Pontos Crticos
Necessidade de conhecimento prvio de seqncias genmicas/ESTs; Sistema fechado; Necessidade de grandes quantidades de mRNA para cada hibridizao; Alto custo e alta demanda tcnica; Sensibilidade das sondas questionada (tamanho e cross-hybridization); Baixa reprodutibilidade; Necessidade de validao dos genes diferencialmente expressos por mtodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).
Differential Display (DD)

(Liang & Pardee , 1992)
Princpio Uso de um nmero limitado de primers curtos e arbitrrios em combinao com primers oligo-dT ancorados para amplificar e visualizar de forma sistmica a grande maioria dos mRNAs de uma clula. DD combina trs tcnicas moleculares comuns: RT-PCR PCR Eletroforese em gel de poliacrilamida
Differential Display
Passo 1
RT-PCR
Amostra Y
RNA total
Amostra X
RNA total
Primers => oligo-dT ancorados

Ex. 5 AAGCTTTTTTTTTTTC-3 H T11 M Notao H-T11M H = stio de restrio da enzima HindIII (AAGCTT) T11 = seqncia de 11 timinas (T) M = Guanina (G), Citosina (C) ou Adenina (A)
Populao de mRNAs
RT-PCR
O uso de oligo-dT ancorados resulta em trs subpopulaes de cDNA, cada qual representa 1/3 dos possveis mRNAs expressos na amostra
modificado de Liang et al., 2007
Passo 2
Amplificao por PCR

Combinao dos primers oligo-dT ancorados (H-T11M) com um grupo de primers arbitrrios (H-AP)
Subpopulao de cDNAs
PRIMERS ARBITRRIOS (H-AP)

Curtos (13 bases) e aleatrios H = stio de restrio da enzima HindIII (AAGCTT) AP = 7 bases com combinaes aleatrias Ex. 5 AAGCTTGATTGCC-3 H AP N possvel de primers arbitrrios: 47 > 16.000 combinaes de bases Cada primer tem a probabilidade de reconhecer 50-100 mRNAs
PCR
N primers arbitrrios (n) 20 30 40 80
N Reaes PCR 3x20 = 60 3x30 = 90 3x40 = 120 3x80 = 240
Probabilidade de n deteco P=1-(0.96) 56% 71% 80% 96%
Passo 3
Produtos de amplificao
Eletroforese
Amostra Y
Amostra X
Para cada combinao de primers!
Eletroforese
Anlise fluorescncia
banda representa mRNA diferencialmente expresso
Exciso da banda
Gel de poliacrilamida desnaturante melhor resoluo de bandas permite fcil recuperao dos transcritos acomoda grande n amostras
Reamplificao Clonagem Seqenciamento


Anlise da expresso gnica diferencial; Simplicidade tcnica; Sensibilidade; Alta reprodutibilidade; Baixo custo; Sistema aberto.
Pontos Crticos
Alta incidncia de falsos positivos em sistemas com muitas variveis; Alta intensidade de trabalho; Dados no digitais (geralmente); Desconhecimento imediato dos genes diferencialmente expressos; No permite leitura ampla e simultnea de muitos transcritos; Necessidade de validao dos genes diferencialmente expressos por mtodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).
Anlise Serial da Expresso Gnica (SAGE)

(Velculescu, 1995) 2 Princpios Bsicos
1 Princpio - Uma seqncia de nucleotdeos (tag) de 9-10pb possui informao suficiente para identificao de um transcrito nico.
~ 256pb
Uma seqncia de apenas 9 pb pode distinguir 49 = 262.144 transcritos

Madden et al., 2000
Anlise Serial da Expresso Gnica (SAGE)

2 Princpio - Ligao (concatenao) dos tags permite anlise eficiente dos transcritos de um modo serial, pelo seqenciamento de mltiplos tags contidos em um nico clone.
Anlise Serial
Anlise paralela 64 a 96 amostras por corrida (1600-2400 tags por corrida) Anlise paralela Seqenciadores mltiplos
Anlise paralela 2 corridas por dia (3200-4800 tags por dia)
Madden et al., 2000
SAGE
Passo 1
mRNA
RT-PCR
cDNA
Sntese do DNA complementar (cDNA) a partir de mRNA, utilizando-se como iniciador uma seqncia oligo-d(T) biotinilada
Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000
SAGE
Passo 2
Digesto com endonuclease (enzima de ancoramento NlaIII). A maioria dos cDNAs deve ser cortada pelo menos uma vez.
cDNA
DIGESTO
Fragmentos de cDNA
44 = 256 bases
CAPTURA
cDNA ligado a estreptavidina
As fraes dos cDNAs mais prximas extremidade 3 so capturadas por ligao da biotina dos iniciadores com estreptavidina ligada partculas magnticas.
SAGE
Passo 3
Cada metade dos cDNAs ligada nas extremidades a um adaptador distinto, mas ambos contendo seqncia de reconhecimento para enzima de restrio do tipo IIS (enzima de tagging BsmFI).
cDNAs ligados a estreptavidina

Diviso da amostra de cDNAs em duas partes
LIGAO
Adaptador B
Adaptador A
cDNAs ligados a estreptavidina e adaptador
DIGESTO
cDNAs ligados a adaptador
Digesto com enzima BsmFI, que corta a uma distncia definida a partir do seu stio de reconhecimento. Da clivagem resulta a liberao dos adaptadores ligados a um pedao curto de cDNA (9-10pb + stio NlaIII).
SAGE
Passo 4
cDNAs ligados a adaptador
LIGAO
Aps terem suas extremidades reparadas pela enzima Klenow, as duas fraes de cDNAs so ligadas pela enzima T4 DNA ligase.
AMPLIFICAO
Amplificao das ditags usando iniciadores complementares aos adaptadores.
SAGE
Passo 5
A clivagem com enzima de ancoramento (NlaI) libera os adaptadores das ditags e cria extremidades coesivas.
grande quantidade de ditags
DIGESTO
LIGAO
Aps fracionamento dos concatmeros por tamanho via eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, coleta-se fraes de 300-500pb e 500-1000pb e introduz-se separadamente em vetores para que sejam clonadas e depois seqnciadas.
concatmeros
CLONAGEM SEQENCIAMENTO CONTAGEM ANOTAO DAS tags
SAGE
Passo 6
Anlise dos Dados Digitais

Seqncias de referncia (genes conhecidos do EMBL/NCBI GenBank) ou ESTs
Extrao das tags e anotao Extrao e tabulao das tags a) remoo das ditags em duplicata b) extrao das tags a partir das ditags
Arquivos com seqncias dos clones SAGE
Projeto dos perfis de abundncia das tags
Banco de dados de tags de referncia espcie-especfico

Gerao de relatrios
Comparao do projeto e verificao da identidade com tags de referncia

Filtragem e classificao
maiores investigaes
Tuteja & Tuteja, 2004
tags candidatas para
SAGE
Pontos Crticos
Comprimento das tags; Long Sage, SuperSage e GLGI Necessidade de grande quantidade de material inicial (mRNA); MiniSage, MicroSage Tipo de enzima de restrio IIS (BsmFI) que nem sempre produz fragmentos de um mesmo comprimento; Temperatura constante 65C Construo das bibliotecas envolve muitos passos; Alto custo com seqenciamento; Necessidade de validao dos genes diferencialmente expressos por mtodos independentes (ex. Nothern-blot; qPCR).
SAGE

Permite leitura ampla da expresso gnica; Deteco de genes pouco expressos; Dados gerados so passveis de mltiplas comparaes; Aplicvel nas mais diferentes reas; No requer conhecimento prvio dos genes de interesse nem do genoma; Gerao de dados digitais qualitativos e quantitativos.
Microarranjos X DD X SAGE
TCNICA
Comparao entre amostras 2 (ou mais) ilimitada
Diferenas detectveis
Sensibilidade
Complexidade
Custo
Deteco de novos genes geralmente no sim
Confiabilidade
Intensidade de trabalho mdia alta
Anlise da expresso global sim no sim
Microarranjos de cDNA Differential Display SAGE
>2 vezes 1,1-1vezes ou mais todas
mdia alta
depende/alta baixa
alto baixo/mdio
mdia mdia
ilimitada
mdia
baixa
baixo/mdio
sim
alta
alta
modificado de Stein & Liang, 2002 e Spira, 2005
PCR Quantitativo (qPCR)

Se baseia na tcnica de PCR (Mullis, 1986), com adequaes para um nvel de sensibilidade muito maior. Tcnica descrita como quantitativa porque consegue realizar a avaliao do n de molculas produzidas ciclo a ciclo.
Estratgia para monitorar e quantificar em tempo real o aumento de molculas de RNA, cDNA ou DNA durante a PCR
PCR Quantitativo (qPCR)

Princpio
Molcula alvo, durante a amplificao, emite fluorescncia e um leitor no termociclador captura a fluorescncia ciclo a ciclo.
A emisso dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporo direta da quantidade de produto da PCR
Os valores da fluorescncia so gravados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado
qPCR
Requisitos do qPCR
Corantes especiais; Procedimentos de otimizao; Termociclador com sistema tico; Computador com programa para aquisio de dados e anlise final da reao.
Bio-Rad
Applied Biosystems
Roche
qPCR
Sistemas de Fluorescncia
Fluorforos so molculas que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda especfico TIPOS Corantes que se ligam a dsDNA Sondas de hibridizao Sondas de hidrlise Sondas do tipo grampo (hairpin)
Corantes dsDNA
Sondas de Hibridizao
Sondas de Hidrlise
SYBR Green I
TaqMan
Sondas do tipo grampo
Molculas Beacon
Scorpion
Sunrise primers
LUX primers
Wong & Medrano, 2005 TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
qPCR
Curva padro
declividade reflete a eficincia de amplificao (E)
(logN) concentrao inicial
Construo: a partir de diluies seriadas e em condies otimizadas (sem limitao de reagentes)

qPCR
Curva de Amplificao
plat fase exponencial (log)
fase linear
CT (Cycle Threshold) => ciclo na qual a reao atinge o limiar da fase exponencial Este ponto permite a quantificao exata e reprodutvel baseado na fluorescncia
Novais & Pires-Alves, 2004
qPCR
Quantificao
Curva de amplificao Curva padro
(logN) concentrao inicial
Tn
Tn=T0(E)n
CT diretamente proporcional ao log de quantidade inicial de DNA / RNA
Tn= Nmero de molculas de DNA no ciclo de referncia (CT) T0= Nmero inicial de molculas DNA E = Eficincia da PCR (0<E<1)
qPCR
Aplicaes
Avaliao quantitativa dos nveis de expresso de genes; Anlise de splicing alternativo; Diagnsticos clnicos; Anlise de seqncias virais, bacteriana, fngicas ou de protozorios a partir de vrias fontes; Anlise de mutaes; Discriminao allica em DNA genmico; Deteco de transgnicos; Anlise de patgenos em alimentos.
qPCR

Quantifica expresso gnica com alta preciso; Mtodo rpido e independente de processos ps-PCR; Alta sensibilidade e facilidade na quantificao; Alta reprodutibilidade e acurcia; Melhor controle de qualidade no processo e menor risco de contaminao (qualitativo).
OBJETIVOS Determinar o perfil de expresso gnica de plantas de arroz colonizadas por um fungo simbionte (Glomus intraradices), atravs de microarranjos; Comparar a expresso gnica em resposta ao fungo simbionte com a expresso em resposta patgenos (Magnaporthe grisea e Fusarium
moniliforme)
Comparar a resposta colonizao por fungos entre monocotiledneas e dicotiledneas.
METODOLOGIA
Infeco pelo simbionte: Razes de Oryza sativa cv. Nipponbare (45 plantas, 6 semanas) inoculadas com
Glomus intraradices;
Infeco pelos patgenos: Razes de Oryza sativa cv. Nipponbare (plntulas com 10 dias) foram inoculadas com os patgenos Magnaporthe grisea linhagem Guy 11 e Fusarium moniliforme. Razes foram coletadas 2, 4 e 6 dias aps inoculao. Anlise de expresso gnica por microarranjos: RNAtotal foi isolado de razes infectadas; Uso do GeneChip (sySYNG003a) de genoma de arroz (Syngenta, Basel) - ~50.000 genes. PCR em Tempo Real: Validao dos dados de microarranjos e testes de expresso gnica com patgenos. TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
RESULTADOS Transcriptoma de arroz em resposta colonizao micorrzica MICROARRANJOS 256 genes regulados pela colonizao micorrzica: - 20 genes foram reprimidos (3 a 14 vezes) - 236 genes foram induzidos (3 a 203 vezes)
Genes regulados pela colonizao micorrzica aqueles que apresentaram uma mudana de expresso de 3 vezes (reprimidos ou induzidos) em relao s plantas controle.
Controle positivo (acmulo de transcritos especficos do fungo micorrzico): - gene OsPT11 presente no chip => apresentou aumento de expresso de 154 vezes.
RESULTADOS Validao dos dados de Microarranjos qPCR Teste da expresso de 224 genes (dos 256 candidatos): - Induo (1,5 a 300.000 vezes) => 209 genes - Represso (2,4 a 23 vezes) => 15 genes Gene controle positivo (OsPT11) => apresentou induo de 1500 vezes em relao s plantas controle.
RESULTADOS Transcriptoma de arroz em resposta patgenos qPCR

Teste da expresso dos 224 genes regulados pela colonizao micorrzicas em razes infectadas por M. grisea e F. moniliforme:
Expresso diferencial de 95 genes em resposta colonizao micorrzica e um ou ambos os patgenos.
Figura 1. Esquema da viso geral dos genes de arroz regulados pela colonizao micorrzica em comparao com a resposta aos patgenos. Nmeros em preto representam genes induzidos; nmeros em cinza representam genes reprimidos.
RESULTADOS Genes regulados pela colonizao micorrzica so conservados entre monocotiledneas e dicotiledneas? tBlastX foi conduzido entre 625 genes de dicotiledneas (descritos anteriormente como regulados por micorrizas) e os 224 genes de arroz:
- 96 genes foram identificados: 76 apresentaram mesmo padro de expresso em mono e dico - 44 genes de arroz regulados especificamente por micorrizas - 25 genes relacionados com colonizao geral por fungos - 20 genes apresentaram padro de expresso oposto entre mono e dico
CONCLUSES 43% dos genes avaliados apresentaram respostas similares para G. intraradices, M. grisea e F. moniliforme; A induo do gene OsAM205 durante as trs interaes fungo-planta avaliadas sugere que esse seja um fator de transcrio envolvido na regulao da reposta de plantas diferentes infeces fngicas; Foi possvel observar certa conservao da resposta transcricional do arroz colonizado por simbiontes e patgenos; Os padres de expresso observados refletem uma resposta geral de plantas colonizao por fungos, sugerindo que apesar da divergncia filogentica, mono e dico possuem mecanismos conservados de resposta colonizao.
OBJETIVO Isolar genes, do patgeno Penicillium expansum e de mas, induzidos durante a interao fungo-planta via DD RT-PCR.
METODOLOGIA
DD RT-PCR Penicillium expansum Link, isolado CMP1; Frutos (mas) pr-tratadas (imerso em gua a 37C por 4 dias) inoculados com 20L de suspenso de esporos ou gua esterilizada; Isolamento RNA: - a partir de culturas de P. expansum cultivadas em pectina de ma
- a partir de cilindros (16x6mm) de tecido dos frutos infectados - a partir de cilindros (16x6mm) de tecido dos frutos sadios
Amplificaes DD: combinao entre 15 oligonucleotdeos Clonagem Dot-blot Nothern-blot Southern-blot TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
RESULTADOS Genes expressos durante a interao fungo-planta DD RT-PCR Combinao de 15 primers => ~ 1450 bandas 98 bandas mais intensas ou exclusivamente presentes em mas infectadas Reamplificao Clonagem - Dot-blot - Nothern-blot => 26 genes provavelmente diferencialmente expressos. CARACTERIZAO
RESULTADOS Caracterizao dos cDNAs selecionados

Seqenciamento dos 26 cDNAs 20 cDNAs - BLAST contra banco de dados no-redundante e dbEST EMBL:
- 9 no apresentaram qualquer homologia (P>0,0001) com seqncias do banco de dados (tanto de nucleotdeos como de aminocidos); - 7 apresentaram homologia com genes de fungos; - 4 apresentaram homologia com seqncias de plantas;
Validao dos 20 cDNAs como diferencialmente expressos => Nothern-blot

- 18 apresentaram maior nvel de expresso em mas infectadas do que nos controles; - 2 (similares manitol desidrogenase) apresentaram maior nvel de expresso em culturas de P. expansum.
Determinao da origem dos 18 cDNAs => Southern-blot

- Correlao perfeita com dados de homologia de seqncias; - Determinao da origem dos 8 transcritos que no apresentaram homologia com seqncias do banco de dados: 7 derivaram do fungo e 1 da ma.
RESULTADOS
Anlises das seqncias dos clones de ma e de P. expansum isolados por DD RT-PCR a partir de mas infectadas.
CONCLUSES
Atravs de DD RT-PCR foi possvel identificar 12 genes diferencialmente expressos em resposta interao P. expansum-ma: - 8 genes associados com processo de infeco do fungo - 4 genes associados resposta de defesa dos frutos A maioria dos genes isolados do fungo estavam expressos tanto in planta como in vitro, entretanto, a expresso desses genes era muito maior durante o processo de infeco; Apenas um cDNA do fungo apresentou similaridade a genes de poligalacturonases (PG), enzimas extensivamente descritas como fatores de patogenicidade; A maioria dos outro genes apresentou similaridade com protenas provavelmente envolvidas na adaptao ao ambiente hospedeiro; Dois genes de mas expressos durante a interao fungo-planta correspondiam com putativos PP2C e -glucosidase (enzima envolvida na liberao de compostos txicos a partir de precursores glicosilados inativos). TCATCGAGTCGTAGAGTCAGTGACAATTCGAGTCGACGTAGCAGTGACACACATAGCTAGTTAGA
OBJETIVOS Anlise dos perfis de expresso gnica simultaneamente, de arroz (hospedeiro) e Magnaporthe grisea (patgeno), pela tcnica de SuperSAGE; Avaliar e comparar a capacidade do estudo da expresso gnica por meio da tcnica de SuperSAGE.
METODOLOGIA Fonte de inculo Folhas de Oryza sativa L. cv. Norin1 infectadas com fungo M. grisea raa 007. Material Vegetal: Dois cultivares de arroz, cv. Kakehashi (susceptvel) e cv. Himenomochi (resistente), foram inoculadas com fungo M. grisea raa 007. Folhas foram coletadas 10 dias aps a inoculao. SuperSage Anlise dos mRNAs extrados de folhas de arroz infectadas por M. grisea.
RESULTADOS
Perfil de expresso gnica em folhas de arroz infectadas

Obteno de 12.119 SuperSAGE tags ; 7.546 tags diferentes => correspondem a genes diferentes Identificao dos genes: blast das tags (26pb) contra banco de dados completo do GenBank (cDNAs, ESTs, genomas); Na maioria dos casos apenas uma seqncia se alinhou perfeitamente com a seqncia da tag (26pb) de SuperSage; Informao das tags suficiente para identificar o gene de origem
RESULTADOS
Perfil de expresso gnica em folhas de arroz infectadas

Genes relacionados com a fotossntese foram os mais expressos nas folhas de arroz.
Tabela 1. Os 10 genes que apresentaram maior expresso em folhas de arroz infectadas.
RESULTADOS
Perfil de expresso gnica em M. grisea

Blast das tags apenas contra genoma de M. grisea; 74 tags supostamente derivam de mensagens de M. grisea = 0,6% dos transcritos avaliados; 35 tags diferentes alinharam com genes putativos de M. grisea, sendo que no houve homlogos no genoma do arroz; Metade das tags referem-se ao gene hidrofobina; Os genes da nucleoside-diphosphate kinase e da protena ribossomal 60S contriburam com 2 tags cada.
RESULTADOS
Perfil de expresso gnica em M. grisea

Tabela 2. Alguns genes de M. grisea expressos em folhas de arroz infectadas.
RESULTADOS
Validao de genes expressos por M. grisea

RT-PCR
Amplificao dos genes de hidrofobina, nucleoside-diphosphate kinase e protena ribossomal 60S utilizando cDNA isolado de folhas infectadas dos seguintes cultivares: Norin1 (susceptvel); Kakehashi (susceptvel) e Himenomochi (resistente).
Figura 1. (A) RT-PCR dos genes hidrofonina, nucleoside-diphosphate kinase e protena ribossomal 60S, de M. grisea, a partir cDNA do cv. Norin1. (B) RT-PCR dos genes de M. grisea a partir do cDNA dos cv. Kakehashi e cv. Himenomochi, ambos falso inoculados (-) e inoculados com M. grisea raa 007 (+).
CONCLUSES
Genes relacionados com a fotossntese foram os mais expressos nas folhas de arroz. Os resultados mostraram que o gene da hidrofobina o mais expresso em M. grisea infectando folhas de arroz => hidrofobina necessria para formao de apressrio durante a infeco do fungo; Os dados gerados por SuperSAGE so compatveis com os dados do SAGE convencional e fornecem perfis de expresso gnica bastante confiveis; SuperSAGE abre a possibilidade de estudar diretamente a expresso gnica de dois organismos simultaneamente.
CONSIDERAES FINAIS
Genmica Funcional
bioinformtica
Metaboloma
gentica
Transcriptoma
bioqumica
Funo
fisiologia
citologia
Proteoma
bioqumica estrutural
modificado de Vukmirovic & Tilghman, 2000
CONSIDERAES FINAIS
P FL A ADN H c S S DD
Mic r oar r anjo s R D SA A G E
TRANSCRIPTOMA
S SS MPS MP Ts Ts ES ES
BIOINFORMTICA
MELHORAMENTO
GENES CANDIDATOS
para anlise de ligao em cruzamentos experimentais
modificado de Camargo, 2006
Obrigada pela Ateno!


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LGN 5799 - SEMINRIOS EM GENTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

ANLISE DA EXPRESSO GNICA DURANTE A INTERAO FUNGO-PLANTA

fungos endofticos fungos epifticos fungos micorrzicos fungos da rizosfera

Wagner & Lewis, 2003

Anlise da Expresso Gnica

Mtodos de anlise da expresso gnica diferencial

modificado de Birch & Kamoun, 2000

Anlise da Expresso Gnica em Larga Escala

2500 2000 1500 1000 500

Hibridizao PCR Seqenciamento

Pesquisa feita na base de dados PubMed >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?dh=pubmed>. Acesso em 02 jun 07.

Anlise da Expresso Gnica

Preparo das lminas

estrutura genmica anotada amplificao das sondas por PCR

spotting das sondas na lmina

modificado de Ehrenreich, 2006

Preparo das amostras

RT-PCR e marcao com corante fluorescente

modificado de Ehrenreich, 2006

amostra A > B amostra A ~ B amostra B > A

anlise das imagens

Cy5 532 nm Cy3 635 nm

Anlise dos Dados Digitais

Anlise de agrupamento ou interpretao biolgica

Teste para expresso diferencial

Correo do background e seleo dos sinais de qualidade

Normalizao dos dados

Transformao dos dados

Spotting mesma sonda mltiplas vezes num mesmo arranjo

Origem das sondas para anlise de arranjos de DNA

Principais Vantagens da Tcnica

Differential Display (DD)

Primers => oligo-dT ancorados

modificado de Liang et al., 2007

Amplificao por PCR

PRIMERS ARBITRRIOS (H-AP)

N primers arbitrrios (n) 20 30 40 80

N Reaes PCR 3x20 = 60 3x30 = 90 3x40 = 120 3x80 = 240

Probabilidade de n deteco P=1-(0.96) 56% 71% 80% 96%

modificado de Liang et al., 2007

Para cada combinao de primers!

Reamplificao Clonagem Seqenciamento

Principais Vantagens da Tcnica

Anlise Serial da Expresso Gnica (SAGE)

Uma seqncia de apenas 9 pb pode distinguir 49 = 262.144 transcritos

Anlise Serial da Expresso Gnica (SAGE)

Anlise paralela 2 corridas por dia (3200-4800 tags por dia)

Madden et al., 2000

Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000

Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000

cDNAs ligados a estreptavidina

cDNAs ligados a estreptavidina e adaptador

Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000

cDNAs ligados a adaptador

Amplificao das ditags usando iniciadores complementares aos adaptadores.

Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000

grande quantidade de ditags

CLONAGEM SEQENCIAMENTO CONTAGEM ANOTAO DAS tags

Ho Song & Wyse, 2004; Madden et al., 2000

Anlise dos Dados Digitais

Arquivos com seqncias dos clones SAGE

Projeto dos perfis de abundncia das tags