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Produo de piruvato

PRODUO DE PIRUVATO DURANTE A FERMENTAO DE GLUCOSE PELA LEVEDURA

Em 1931 Embden, Meyerhof e Parnas juntaram todo o conhecimento existente at essa altura e propuseram um esquema para as transformaes sofridas pela glucose nas leveduras e em extractos de msculo. Na figura 1 apresenta-se, muito esquematicamente, a reaco global da degradao anaerbia pela glucose nas leveduras: Glucose

Fosfoenolpiruvato Piruvato piruvato descarboxilase Acetaldedo Etanol

Fig. 1. Gliclise e formao de etanol numa levedura.

Neste trabalho pretende-se demonstrar a formao de piruvato durante a fermentao de glucose pela levedura. Uma vez que o piruvato, tal como a maioria dos intermedirios das vias metablicas, est presente em pequenas quantidades, o modo de demonstrar a sua existncia impedir a progresso da reaco que o degrada. Muitos intermedirios das vias metablicas que hoje se conhecem foram identificados deste modo. Para este efeito, podemos assim: (a) bloquear a enzima que catalisa a converso do composto em estudo, atravs de um inibidor; (b) alterar as condies fisiolgicas de modo a que a enzima funcione muito abaixo da sua actividade mxima; ou (c) adicionar ao meio de reaco um composto que reaja com o intermedirio, de modo a formar-se um composto que j no metabolizado. Vamos recorrer a uma estratgia do tipo indicado em (b): a enzima piruvato descarboxilase (E. C. 4.1.1.1, 2-oxocido carboxiliase) inactiva em solues ligeiramente alcalinas, de modo que h uma acumulao de piruvato e a sua presena

Produo de piruvato

demonstrada quer pela reaco com o nitroprussiato, quer pela reaco com a dinitrofenil hidrazina.

Reagentes Glucose 100 g/l Piruvato (concentrao desconhecida) Nitroprussiato de sdio 50 g/l cido tricloroactico 100 g/l Hidrxido de amnio Sulfato de amnio 2,4-dinitrofenil hidrazina (soluo saturada em HCl 1M) Hidrxido de sdio 100g/l Suspenses de levedura: - 25 ml de suspenso 100 g/l em K2HPO4 0.5 M - 25 ml de suspenso 100 g/l em KH2PO4 0.5 M

Tcnica I. Formao de piruvato a partir da glucose


(1) Pipete 2,5 ml de glucose para 2 tubos de ensaio diferentes, devidamente identificados (A e B). (2) Adicione ao tubo A 2,5 ml da suspenso de levedura em KH2PO4 e ao tubo B 2,5 ml da suspenso em K2HPO4. (3) Coloque os tubos num banho termostatizado a 37C durante 30 minutos. Enquanto espera, v preparando os tubos para a parte B do trabalho. (4) Quando passarem ao 30 minutos, retire os tubos do banho a 37C. (5) Adicione 1 ml de cido tricloroactico a cada tubo, agite e transfira o contedo para tubos de centrfuga bem identificados. Centrifugue durante 5 min velocidade mxima. Com uma pipeta de Pasteur, remova os sobrenadantes para tubos identificados e teste a presena de piruvato (partes II e II do protocolo).

II. Teste do nitroprussiato de sdio para o piruvato


(1) Identifique 3 tubos de ensaio: um para a amostra A, outro para a B, e um terceiro para o piruvato. Em cada um dos tubos, coloque cerca de 1 cm de sulfato de amnio slido (pode medir com uma rgua a partir do fundo do tubo). (2) Adicione 2 ml de cada sobrenadante e do piruvato, ao tubo respectivo. Junte a cada um 4 gotas da soluo de nitroprussiato de sdio, agitando a seguir.

Produo de piruvato

(3) Na hotte, utilizando uma pipeta de Pasteur, deixe cair lentamente amnia concentrada ao longo das paredes do tubo de ensaio, de modo a formar duas camadas. Por vezes aparece um anel cor de rosa na juno das duas fases, antes do aparecimento da cor azul ou verde dada pelo piruvato. Este anel cor de rosa devido presena de grupos sulfidrilo. (4) Compare e registe, na Tabela a seguir, o aspecto dos 3 tubos, no que respeita colorao desenvolvida e sua intensidade. Tire concluses quanto presena ou ausncia de piruvato, e quanto s concentraes relativas.
Tabela 1. Resultados do teste do nitroprussiato.

Tubo

Cor / intensidade

Presena / ausncia do anel rosa

A B piruvato

III. Teste da 2,4-dinitrofenilhidrazina para o piruvato


(1) Identifique 3 tubos de ensaio: um para a amostra A, outro para a B, e um terceiro para o piruvato. Para cada um deles retire 2 ml do sobrenadante da centrifugao (ou de soluo de piruvato). Adicione a cada tubo 1 ml de soluo saturada de dinitrofenilhidrazina e agite bem. (2) Transfira 3 gotas de cada uma das misturas preparadas na alnea anterior para outros 3 tubos devidamente identificados. Adicione a cada um 1 ml de NaOH 10% e junte-lhe 5 ml de gua. Homogenize bem e registe os resultados na tabela a seguir. A presena de piruvato indicada por uma cor vermelha. (3) Leia a absorvncia a 520 nm de cada uma das solues e registe-a igualmente na tabela 2.
Tabela 2. Resultados do teste da dinitrofenilhidrazina.

Tubo

Cor / intensidade

Abs 520 nm

A B piruvato
(4) Utilizando a recta de calibrao, calcule a concentrao de piruvato existente em cada um destes tubos.

Produo de piruvato

Dados para a recta de calibrao (OBTIDOS ANTES DA AULA PRTICA): [Piruvato] (mM) 0 5 10 20 25 Abs 520 nm 0 0.150 0.313 0.400 0.461

Bibliografia consultada PLUMMER, D.T.1978. "An introduction to practical Biochemistry", 2 edio, McGraw-Hill, London. STROEV, E.A. & MAKAROVA, V.G. 1989. "Laboratory Manual in Biochemistry", Mir Publishers, Moscovo.