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Em 1931 Embden, Meyerhof e Parnas juntaram todo o conhecimento existente at essa altura e propuseram um esquema para as transformaes sofridas pela glucose nas leveduras e em extractos de msculo. Na figura 1 apresenta-se, muito esquematicamente, a reaco global da degradao anaerbia pela glucose nas leveduras: Glucose
Neste trabalho pretende-se demonstrar a formao de piruvato durante a fermentao de glucose pela levedura. Uma vez que o piruvato, tal como a maioria dos intermedirios das vias metablicas, est presente em pequenas quantidades, o modo de demonstrar a sua existncia impedir a progresso da reaco que o degrada. Muitos intermedirios das vias metablicas que hoje se conhecem foram identificados deste modo. Para este efeito, podemos assim: (a) bloquear a enzima que catalisa a converso do composto em estudo, atravs de um inibidor; (b) alterar as condies fisiolgicas de modo a que a enzima funcione muito abaixo da sua actividade mxima; ou (c) adicionar ao meio de reaco um composto que reaja com o intermedirio, de modo a formar-se um composto que j no metabolizado. Vamos recorrer a uma estratgia do tipo indicado em (b): a enzima piruvato descarboxilase (E. C. 4.1.1.1, 2-oxocido carboxiliase) inactiva em solues ligeiramente alcalinas, de modo que h uma acumulao de piruvato e a sua presena
Produo de piruvato
demonstrada quer pela reaco com o nitroprussiato, quer pela reaco com a dinitrofenil hidrazina.
Reagentes Glucose 100 g/l Piruvato (concentrao desconhecida) Nitroprussiato de sdio 50 g/l cido tricloroactico 100 g/l Hidrxido de amnio Sulfato de amnio 2,4-dinitrofenil hidrazina (soluo saturada em HCl 1M) Hidrxido de sdio 100g/l Suspenses de levedura: - 25 ml de suspenso 100 g/l em K2HPO4 0.5 M - 25 ml de suspenso 100 g/l em KH2PO4 0.5 M
Produo de piruvato
(3) Na hotte, utilizando uma pipeta de Pasteur, deixe cair lentamente amnia concentrada ao longo das paredes do tubo de ensaio, de modo a formar duas camadas. Por vezes aparece um anel cor de rosa na juno das duas fases, antes do aparecimento da cor azul ou verde dada pelo piruvato. Este anel cor de rosa devido presena de grupos sulfidrilo. (4) Compare e registe, na Tabela a seguir, o aspecto dos 3 tubos, no que respeita colorao desenvolvida e sua intensidade. Tire concluses quanto presena ou ausncia de piruvato, e quanto s concentraes relativas.
Tabela 1. Resultados do teste do nitroprussiato.
Tubo
Cor / intensidade
A B piruvato
Tubo
Cor / intensidade
Abs 520 nm
A B piruvato
(4) Utilizando a recta de calibrao, calcule a concentrao de piruvato existente em cada um destes tubos.
Produo de piruvato
Dados para a recta de calibrao (OBTIDOS ANTES DA AULA PRTICA): [Piruvato] (mM) 0 5 10 20 25 Abs 520 nm 0 0.150 0.313 0.400 0.461
Bibliografia consultada PLUMMER, D.T.1978. "An introduction to practical Biochemistry", 2 edio, McGraw-Hill, London. STROEV, E.A. & MAKAROVA, V.G. 1989. "Laboratory Manual in Biochemistry", Mir Publishers, Moscovo.