UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIS UnUCET Prof.

Plnio Naves

MANUAL DE AULAS PRTICAS

MICROBIOLOGIA

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INTRODUO

Caro(a) estudante; As aulas prticas so muito importantes na disciplina de microbiologia e devido s particularidades de seus objetos de estudo os microrganismos sempre necessitamos de ateno especial no quesito BIOSSEGURANA. Desta forma, siga atentamente as instrues do professor, leia com bastante ateno esse guia e boas aulas!!! Metodologia Aulas prticas no Laboratrio de Microbiologia, nas quais cada grupo realizar as atividades prticas de forma paralela e complementar ao contedo trabalhado nas aulas tericas no decorrer do curso Cada aula prtica ser composta por 3 dias de trabalho:

dia 1: estudo do protocolo e preparao do material, dia 2: processamento das amostras dia 3: leitura e interpretao dos dados e ademais, limpeza e organizao do ambiente e material.

Em cada aula prtica os grupos devero elaborar um relatrio aonde figurem os resultados obtidos e uma discusso destes e dos trabalhos realizados. A participao nas aulas prticas obrigatria e no se esquea de anotar a data na qual cada experimento foi realizado.

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NORMAS GERAIS DE TRABALHO NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA O Laboratrio de Microbiologia um lugar convenientemente habilitado aonde se pode manipular e examinar microrganismos. Este tipo de trabalho deve ser realizado com tcnicas asspticas adequadas, se requerendo, portanto um ambiente limpo e ordenado, alm de se trabalhar sempre em condies que mantenham a esterilidade do material utilizado e assim impedir a contaminao inadvertida do que se investiga (em cmaras de segurana biolgica ou na proximidade da chama de um bico de Bunsen). Os microrganismos de estudo devem ser manipulados com precauo pelo seu potencial patognico e necessrio cumprir dois requisitos bsicos: REQUISITOS BSICOS 1. Restringir a presena dos microrganismos em estudo a seus recipientes e meios de cultura para evitar o risco de contaminao do manipulador ou de um companheiro de trabalho. 2. Evitar que os microrganismos ambientais (presentes nas superfcies, pele, pelos, ar, roupa, etc.) contaminem as amostras em estudo. Para manter estas condies, necessrio respeitar uma serie de NORMAS GERAIS DE BIOSEGURANA: 1. imprescindvel o uso de jaleco no laboratrio. 2. Ao iniciar e finalizar as atividades prticas, o estudante dever lavar as mos com gua e sabo. Procedimento para a lavagem de mos a) Palma com palma b) Palma com dorso c) Palma com palma entrelaando e esfregando os dedos d) Dedos com palmas opostas e) Esfregar os polegares com as palmas f) Esfregar os dedos sobre as palmas.

A LAVAGEM DAS MOS a maneira mais simples e efetiva de se prevenir a disseminao de infeces!

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As luvas no substituem a lavagem de mos, unicamente proporcionam uma proteo adicional ao manipulador!

3. O lugar de trabalho deve estar sempre limpo e organizado. Antes de comear cada aula prtica conveniente desinfetar a superfcie de trabalho. Os desinfetantes mais utilizados so o hipoclorito de sdio e o lcool (etanol 70). 4. Os microrganismos sero manipulados sempre ao redor da chama. Deslocamentos desnecessrios pelo laboratrio devero ser evitados uma vez que originam correntes de ar que podem disseminar contaminaes ou produzir acidentes. 5. Durante as aulas prticas est proibido comer, beber e fumar. Quando microrganismos so manipulados deve-se evitar levar as mos boca, nariz, olhos, etc. 6. Livros, pastas, mochilas, bolsas, e qualquer outro material que no sero utilizados devem ser depositados em um local distinto ao que se vai trabalhar. 7. Para descartar material contaminado sero utilizados recipientes adequados, uma vez que estes sero esterilizados posteriormente. Nunca se deve jogar nada contaminado pela pia ou no cesto de lixo normal. 8. Nenhuma amostra contaminada pode ser retirada do laboratrio. 9. Nunca se deve pipetar com a boca. Utilizar sempre pipetas apropriadas. 10. Em caso de acidente (ruptura de material, derramamento de microrganismos, etc.) devese comunicar imediatamente ao responsvel.

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AP1 - Normas de Biossegurana no Laboratrio de Microbiologia Normas de biossegurana 1. O uso de avental branco (jaleco), preferencialmente comprido e abotoado, obrigatrio em todas as aulas; 2. Bolsas, livros, etc., no devem ser colocados sobre as bancadas de trabalho; 3. Quando for manipular material txico ou infectante, usar luvas de proteo; 4. No fumar, no comer e no beber dentro do laboratrio; 5. Manter as mos, canetas, lpis e quaisquer objetos sem contato com a boca ou face; 6. Refrigeradores e estufas no so apropriados para conservar ou aquecer alimentos; 7. Lavar adequadamente as mos antes de iniciar uma atividade laboratorial. Repetir o mesmo procedimento ao final da anlise; 8. Desinfetar a bancada de trabalho no incio e trmino de cada atividade, e quando ocorrer qualquer respingo ou contaminao durante a prtica. 9. Lmina e lamnula usadas devem ser colocadas em recipiente com desinfetante; nunca deixas sobre a bancada ou pia; 10. As pipetas usadas devem ser colocadas horizontalmente em soluo desinfetante imediatamente aps o uso, antes de se proceder a sua limpeza e esterilizao; 11. Papis e resduos utilizados s devem ser colocados nos recipientes de coleta de lixo comum quando no apresentarem risco de contaminao; 12. Cuidado ao acender o bico de gs (bico de Bunsen). Verificar se no existem substncias inflamveis prximas a chama; 13. Flambar alas, agulhas e pinas antes e aps o uso; 14. Todo o material deve ser identificado. As etiquetas devem ser auto-adesivas; 15. No cheirar os meios de cultura inoculados; 16. Em caso de qualquer acidente, comunicar imediatamente ao professor ou ao tcnico do laboratrio; 17. Desenvolver e manter o hbito da limpeza e da organizao; 18. No permitir a entrada ou permanncia de pessoas no autorizadas ou que no estejam adequadamente protegidas no laboratrio; 19. O estudante deve deixar o laboratrio apenas depois de terminado o trabalho prtico do dia e sem dvidas nas tcnicas realizadas.

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1. COMENTE SOBRE A IMPORTNCIA DAS NORMAS DE BIOSSEGURANA NA DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA PARA O SEU CURSO:

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AP2 Estrutura e funcionamento do microscpio ptico

Objetivo Conhecer a estrutura, o funcionamento e o manejo desse imprescindvel instrumento de trabalho na microbiologia. Fundamento O microscpio um dos instrumentos mais relevantes para um microbiologista, pois permite a observao de organismos que no podem ser estudados detalhadamente a olho nu. Existe uma grande variedade de microscpios que, segundo a fonte de iluminao utilizada, podem ser agrupados em: Microscpios pticos: a fonte de iluminao a luz.
a. De campo claro. Permitem a observao de microrganismos em preparaes com a sua colorao natural ou mediante coloraes, ressaltando os microrganismos sobre um fundo mais brilhante. b. De campo escuro. Permitem a observao de formas celulares que destacam brilhantes sobre um fundo escuro. Este efeito conseguido utilizando diafragmas especiais. c. De contraste de fase. Por meio da utilizao de diafragmas e lentes objetivas especiais, que aumentam as diferenas no ndice de refrao das clulas e o meio que as rodeia, permitem a observao de clulas vivas, j que no necessrio realizar nenhuma colorao das mesmas. d. De interferncia. Possibilitam a observao clulas vivas sem colorao, obtendo uma imagem em relevo das mesmas. e. De fluorescncia. A fonte de iluminao proporciona luz ultravioleta que excita certas molculas presentes nas clulas (de forma natural ou adicionadas a preparao) que emitem fluorescncia, quando excitadas no espectro visvel.

Microscpios eletrnicos: as fontes de iluminao so feixes de eltrons e as lentes so eletro-ims.

a. De transmisso. Permitem a observao de amostras impregnadas com substncias que so resistentes passagem de eltrons, cortadas dando lugar a lminas finas, denominadas cortes finos. Podem alcanar ampliaes entre 10.000 e 100.000 vezes. b. De varredura. Permitem a observao da superfcie de clulas ntegras, sem a necessidade de cortes finos, de modo que aparecem os relevos originais e as superfcies externas. Alcanam entre 1.000 e 10.000 vezes.

Durante as aulas prticas utilizaremos microscpios pticos de campo claro, cujos componentes fundamentais (mecnicos, eltricos e pticos) sero melhor estudados.

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RECONHECIMENTO DA ESTRUTURA DO MICROSCPIO PTICO

Identifique as estruturas e comente suas principais funes: 1.1. Base _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 1.2. Brao / Coluna: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 1.3. Canho / Tubo de observao / Cabeote: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 1.4. Revlver / Porta-objetivas: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 1.5. Lentes objetivas: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

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1.6. Mesa / Platina: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ Charriot: _____________________________________________________________________ Escala de Vernier: _____________________________________________________________ 1.7. Lentes Oculares: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 1.8. Ajustes Macromtrico e Micromtrico: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ 1.9. Condensador: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ Diafragma: ____________________________________________________________________ Ajuste do condensador: _________________________________________________________ 1.10. Condensador de base: _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

UTILIZAO DO MICROSCPIO PTICO Verificar se a lente objetiva de menor aumento se encontra em posio de utilizao e baixar a platina completamente. Colocar a lmina com a preparao sobre a platina adequadamente. Comear a observao com a objetiva de 4x (j est em posio).

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Para conseguir o foco: .1 Aproximar ao mximo a lente objetiva lmina com a preparao, utilizando o ajuste macromtrico. .2 Olhando atravs das lentes oculares, ir lentamente procurando o foco com o ajuste macromtrico at que se observe uma imagem um pouco mais ntida da amostra, devendo nesse momento realizar o ajuste fino do foco com o micromtrico. .3 Passar a seguinte lente objetiva. O foco da imagem estar quase ajustado. Pequenos ajustes no micromtrico devem ser suficientes para focalizar devidamente a imagem e assim sucessivamente se passa as objetivas de maior aumento. Se ao mudar de objetiva a imagem se perder por completo, prefervel voltar a focalizar com a objetiva anterior e repetir a operao. .4 A objetiva de 100x focaliza a uma distncia muito pequena da lmina e por isso fcil que ocorram dois tipos de percalos: quebrar a lmina com a preparao ou manchar com leo de imerso, se o microscpio no foi devidamente utilizado e limpo anteriormente.

Utilizao da objetiva de imerso: .5 Subir totalmente o condensador para ver claramente o crculo de luz que nos indica a zona que vamos visualizar. .6 Girar o revlver de maneira que o espao entre as duas lentes objetivas (40 e 100x) fique sobre a amostra. .7 Colocar uma gota mnima de leo de imerso sobre o crculo de luz. .8 Terminar de girar suavemente o revlver at a posio da objetiva de imerso (100x). .9 Olhando diretamente a objetiva, subir a platina delicadamente com o ajuste micromtrico at que o foco seja encontrado, com muito cuidado, pois o risco de acidente muito grande. .10Uma vez finalizada a observao da preparao a platina deve ser abaixada e se coloca a objetiva de menor aumento girando o revlver. Neste momento se pode retirar a lmina da platina. No se deve retirar a lmina com a objetiva de imerso na posio de observao.
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.11 Limpar a objetiva de imerso cuidadosamente com um papel especial para ptica. Comprovar tambm que as demais lentes estejam perfeitamente limpas.

MANUTENO E PRECAUES Ao finalizar o trabalho, deixar a objetiva de menor aumento na posio de observao, assegurando que a parte mecnica da platina no sobressaia da borda da mesma e cobrir o microscpio com sua capa. Quando no se est utilizando o microscpio, este deve estar coberto. Nunca tocar as lentes com as mos. Se as lentes esto sujas devem ser limpas suavemente com um papel adequado. No deixar a lmina colocada na platina se no estiver utilizando o microscpio. Depois de utilizar a objetiva de imerso, sempre limpar o leo que fica impregnado com papel apropriado, em qualquer caso sempre passar o papel pela lente em um s sentido e com suavidade. Se o leo est ressecado e pregado na objetiva, pode se utilizar uma soluo preparada com lcool-acetona (7:3) ou xilol, sem abusar da frequncia deste tipo de limpeza sob o risco de danificar as lentes com esses solventes. No forar nunca os ajustes giratrios do microscpio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver e condensador). A mudana das objetivas deve ser feita girando o revlver e prestando a ateno ao material na lmina para prevenir o contato da lente com a amostra. Manter seca e limpa a platina do microscpio. conveniente limpar e revisar sempre os microscpios ao finalizar cada sesso de trabalho.

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AP3 - Preparo de meios de cultura e inoculao de bactrias Objetivo Aprendizagem de tcnicas de preparo de diferentes meios de cultivo, esterilizao e armazenamento, assim como a importncia de diferentes meios e sua aplicao. Afim de que o estudante possa conhecer as tcnicas empregadas na Microbiologia para o cultivo e a manipulao de microrganismos em condies asspticas. Fundamento Um meio de cultura um conjunto de nutrientes, fatores de crescimento e outros componentes que modulam as condies necessrias ao desenvolvimento dos microrganismos. Considerando que a diversidade metablica dos microrganismos enorme, a variedade de meios de cultivo tambm muito grande. A maioria dos meios de cultivo comercializada como ps ou liofilizados que devem ser hidratados na hora do uso, a preparao de um meio de cultura geralmente se resume na pesagem da quantidade necessria e sua dissoluo em gua destilada (livre de substncias inibidoras do crescimento) seguindo as instrues do fabricante. As substncias termolbeis devem ser esterilizadas por filtrao e adicionadas assepticamente ao resto dos componentes previamente esterilizados em autoclave. Os constituintes habituais dos meios de cultura so: 1. gar. Utilizado como agente solidificante. um polissacardeo obtido de certas algas marinhas. Geralmente as bactrias no so capazes de degrad-lo. 2. Acares. So uma fonte de carbono para os microrganismos. Os mais empregados so a glicose, a lactose e a sacarose. 3. Extratos. So preparados a partir de determinados rgos ou tecidos animais ou vegetais obtidos com gua e calor. Ex.: extrato de carne, de levedura, de malte, etc. 4. Peptonas. So protenas hidrolisadas obtidas por digesto qumica ou enzimtica de protenas animais ou vegetais. 5. Fluidos corporais. Sangue total, sangue desfibrinado, plasma ou soro sanguneo so adicionados aos meios empregados no cultivo de alguns microrganismos patognicos de difcil crescimento. 6. Sistemas-tampo. Consistem de sais que se adicionam ao meio para manter o pH dentro de um limite timo para o crescimento bacteriano. Ex.: fosfatos disdicos ou dipotssicos. 7. Indicadores de pH. So indicadores cido-base utilizados para indicar mudanas no pH do meio de cultura. 8. Agentes redutores. Substncias que so adicionadas ao meio para criar as condies que permitam o desenvolvimento dos microrganismos microaerfilos ou anaerbios. Ex.: cistena e tioglicolato. 9. Agentes seletivos. Substncias como o cristal violeta, sais biliares etc., que em determinadas concentraes no meio atuam como agentes seletivos para determinados microrganismos em detrimento de outros.

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Tipos de meios de cultura Classificao: CONSISTNCIA a) Slidos. So aqueles que contem um agente solidificante entre seus componentes, normalmente gar. So preparados em placas de Petri ou em tubos (superfcie inclinada). b) Lquidos. So denominados caldos e so preparados em tubos ou frascos Erlenmeyers. c) Semi-slidos. Consistncia intermediria.

COMPOSIO a) Meios de uso geral. Permitem o desenvolvimento de uma grande variedade de microrganismos. b) Meios de enriquecimento. Favorecem o crescimento de determinados microrganismos, sem chegar a inibir totalmente o crescimento de outros que porventura estejam presentes na amostra. c) Meios seletivos. Permitem o crescimento de um tipo ou grupos de microrganismos, inibindo o desenvolvimento dos demais. d) Meios diferenciais. So aqueles que permitem a deteco de caractersticas fenotpicas de determinados microrganismos e auxiliam na sua identificao bioqumica. Semeadura de microrganismos Em termos microbiolgicos se entende por SEMEADURA ou INOCULAO o processo de transferncia de uma populao de microrganismos (inculo) presente em uma amostra ou em cultivo prvio para um meio nutritivo que favorea seu crescimento

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PARA UMA CORRETA SEMEADURA so necessrias CERTAS CONDIES: 1) Utilizar instrumentos estreis sobre meios de cultivo estreis: Para estudar uma determinada bactria necessrio destruir todos os microrganismos contaminantes que possam estar presentes no meio e nos instrumentos de trabalho. Isto conseguido com a ESTERILIZAAO, processos que consistem na destruio total dos microrganismos presentes no material utilizado. Os mtodos de esterilizao so agrupados em: MTODOS FSICOS (calor, filtrao, radiaes). MTODOS QUMICOS (emprego de solues qumicas). Os meios de cultivo podem ser esterilizados em AUTOCLAVE, a qual faz uso do calor mido. Este aparelho eleva a presso e a temperatura a nveis superiores ao ponto de ebulio da gua. Normalmente, a presso chega a 1 atmosfera (acima da ambiental) o que corresponde a uma temperatura interior de 126C. Nessas condies se alcana a esterilizao do material aps 15 minutos. Outra forma de esterilizao o calor seco, sendo o "forno de Pasteur" o aparelho mais utilizado (temperaturas de 140-180C durante 2h-3h: para materiais que no resistem umidade, como ps, leos, etc. No caso de objetos metlicos, como o ala de inoculao, deve-se esterilizar no momento de sua utilizao, mantendo-os na chama at atingir a cor vermelha e tendo a precauo de esfrilos antes do uso em zona assptica. 2) Que o inculo no se contamine, modifique ou seja destrudo: Normalmente se emprega o calor direto, flambando as bocas dos tubos de ensaio, frascos de vidro, pipetas, etc., antes e depois de sua utilizao. 3) Que as condies ambientais durante o processo sejam asspticas para evitar contaminaes durante o manejo de todo material com a utilizao de cmaras de fluxo laminar com desinfeco prvia da superfcie com agentes qumicos e luz ultra-violeta. Quando no se dispe de uma cmara de fluxo laminar, pode se utilizar um bico de Bunsen, pois a fora da circulao do ar no sentido vertical e para cima, capaz de criar um ambiente assptico na zona imediata ao redor e debaixo da chama (+/- 15cm de dimetro), de forma que os riscos de contaminao so diminudos consideravelmente.

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TCNICAS DE INOCULAO As amostras podem ser inoculadas atravs das seguintes tcnicas: Tcnica de esgotamento por estriao: atravs de uma ala ou agulha de semeadura esgotase o material por meio de estrias na superfcie do meio. Tcnica da semeadura em superfcie: o inculo espalhado na superfcie do gar com o auxlio de uma ala de vidro (ala de Drigalski). Mtodo de pour-plate: Uma suspenso de clulas misturada com gar fundido a 45C, que se verte em uma placa de Petri. Quando o gar se solidifica, as clulas nele imobilizadas crescem e formam colnias. Diluio com extino: A suspenso original da amostra diluda seriadamente e semeiam-se amostras de cada diluio. Se apenas algumas amostras de uma diluio particular exibirem crescimento, presume-se que essas culturas se originaram a partir de clulas isoladas. Este mtodo utilizado somente quando no possvel o cultivo em placa por algum motivo e deve ser empregado apenas para isolar o tipo de organismo predominante em uma populao mista. Se a suspenso de clulas que ser inoculada foi previamente diluda, as colnias formadas estaro bem separadas, com alta probabilidade de ser derivada de uma nica clula. Mas para se ter certeza disso necessrio repicar uma colnia desejada, suspend-la em soluo apropriada e plaque-la. Este procedimento dever ser repetido quantas vezes forem necessrias, at assegurar a obteno de uma cultura pura. Material Bico de Bunsen ou similar Ala de platina (inoculao) Tubos com cultivos bacterianos crescidos: Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Material a preparar por cada grupo: Tubos com meio lquido estril (caldo comum): TSB Tubos com meio slido estril (gar inclinado): TSI Placas com gar nutriente Mtodos Preparao de um meio slido em placa 1. Pesar a quantidade de meio (se o preparado no contm gar devemos adicion-lo a uma concentrao de 15 g/l) e hidratar com gua destilada em um frasco apropriado. 2. Autoclavar o frasco com o meio de cultura sem vedar totalmente sua boca. 3. Retirar da autoclave e introduzir o frasco em um banho-maria a 40C por cerca de 30 minutos. 4. Distribuir o meio em as placas de Petri estreis dentro da cmara de fluxo laminar ou nas proximidades do bico de Bunsen, flambando bem a boca do frasco para evitar contaminaes. 5. Deixar que o meio se solidifique.
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Preparao de meio slido em tubo (gar inclinado) 1. Pesar o meio que contenha gar e hidratar com gua destilada em um becker. 2. Aquecer e fundir o meio em um forno micro-ondas ou em uma placa aquecedora at que fique transparente. 3. Distribuir rapidamente o meio nos tubos antes que comece a se solidificar. Os tubos no devem ser preenchidos mais do que 1/3 de sua capacidade. 4. Autoclavar os tubos com ateno para que suas tampas de rosca no estejam vedadas. 5. Retir-los da autoclave, fech-los e inclin-los sobre a bancada a fim de obter os tubos com gar inclinado. Preparao de meio lquido em tubo (caldo) 1. Pesar e hidratar o meio. 2. Distribuir com uma pipeta nos tubos (sem encher mais do que 1/3 de seu volume). 3. Autoclavar os tubos com ateno para que suas tampas de rosca no estejam vedadas. 4. Retirar da autoclave e deixar esfriar. Todos os meios devem ser armazenados no refrigerador a 4C. REALIZAO DA SEMEADURA 1. Marcar o material com o nome do grupo. 2. Realizar a inoculao, como a seguir: a) Semeadura em meio lquido: Se introduz a ala de platina no tubo com cultivo crescido e se retira um inculo para transferir ao outro tubo com meio lquido, tomando as precaues mencionadas anteriormente. b) Semeadura em placa: Dividir mentalmente a placa em trs partes, semear em cada tero o inculo obtido dos cultivos crescidos. Se introduz a ala de platina no tubo com cultivo crescido e se transfere o inculo, distribuindo-o sobre a superfcie do gar deslizando a ala suavemente em zig-zag.

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c) Semeadura em gar inclinado: Se introduz a ala de platina no tubo com cultivo crescido e se transfere o inculo sobre o gar inclinado deslizando a ala suavemente pela superfcie em zig-zag, no caso do meio TSI, a semeadura ser realizada tanto na superfcie (aerobiose) como no fundo do tubo - em profundidade no gar (anaerobiose). INCUBAO dos meios semeados a 37C por 24h. Esquema alternativo de transferncia de um tubo a outro

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OBSERVAO DOS RESULTADOS: Em primeiro lugar, se observa caractersticas como a cor, o tamanho e as bordas das colnias crescidas no gar, assim como o odor e a turbidez do meio. Essas caractersticas podem ser teis no incio da identificao de determinados microrganismos.

Anotaes _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

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AP4 - Obteno de cultivos puros Objetivo Estudar as diferentes tcnicas de isolamento de microrganismos a partir de uma populao mista para obter um cultivo puro ou isolado. Fundamento Um CULTIVO PURO aquele que contm uma s classe de microrganismo. Para obt-lo necessrio recorrer a uma das chamadas tcnicas de isolamento. Ainda que existam outras, as tcnicas mais empregadas utilizam meios de cultura slidos, nos quais os microrganismos crescem em colnias separadas. Pode-se demonstrar que cada colnia procede de uma s clula o de um grupo reduzido de clulas do mesmo tipo, caso o microrganismo forme agregados. Devido a esse fato o mais correto falar de Unidades Formadoras de Colnias (UFC) ao referirmos origem de uma colnia. Por tanto, geralmente as bactrias de uma colnia so geneticamente idnticas e constituem um clone. Nessa aula prtica empregaremos dois mtodos para obter um cultivo puro: Isolamento por estriao (esgotamento de ala) Isolamento por semeadura de diluies seriadas (que ser objetivo de uma prxima aula prtica). Esgotamento por estriao Trata-se de um mtodo rpido e simples de esgotamento progressivo e contnuo do inculo sobre um meio slido contido em uma placa de Petri. O objetivo obter, a partir de um elevado nmero de bactrias, um nmero reduzido distribudo individualmente sobre a superfcie da placa. Cada uma destas bactrias originar uma colnia. Procedimento: 1. Esterilizar a ala de platina e deixar que se esfrie nas proximidades do bico de Bunsen. 2. Transferir o inculo como descrito anteriormente. 3. Transferir o inculo a uma pequena rea da superfcie da placa, prxima a borda. Estend-lo formando estrias muito prximas, sempre no sentido da borda para o centro da placa, numa regio correspondente a 1/3 da placa. 4. Passar rapidamente a ala de platina na chama e deixar que se esfrie. Passar uma nica vez a ala de platina na 1 estriao semeada e realizar a 2 estriao sobre em sentido perpendicular a 1 estriao e sem toc-la novamente. 5. Flambar e esfriar a ala de platina. Repetir a operao descrita anteriormente com a 2 estriao. 6. Incubar as placas a 37C por 24h e fazer a leitura.
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Anotaes _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________

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AP5 Tcnicas de microscopia e colorao de Gram Objetivo Preparar e observar cultivos bacterianos com diferentes tcnicas de colorao que permitam estudo das suas caractersticas morfolgicas e estruturais. Fundamento Para observar as bactrias coradas necessrio, em primeiro lugar, fazer um esfregao da amostra em uma lmina de vidro e fix-lo adequadamente. Para fazer um esfregao, quando se parte de um cultivo de bactrias em meio lquido, se transfere alquotas com a ala de platina que sero estendidas diretamente sobre a lmina. Quando se utiliza um cultivo em meio slido, deve-se dissolver as colnias em uma gota de soluo fisiolgica sobre a lmina e depois realizar o esfregao como no caso anterior. A fixao tem por objetivo provocar modificaes na composio fsico-qumica da bactria (coagulao de protenas, etc.) de forma que esta conserve definitivamente uma estrutura similar a que tinha in vivo, sem deformar-se como consequncia dos tratamentos a que se ver submetida durante a colorao. Por outra parte a fixao impede a remoo dos microrganismos da lmina e permite que a parede celular seja mais permevel aos corantes. Para a fixao se podem utilizar agentes qumicos (formol, metanol) ou calor. Em nosso caso, utilizaremos o calor, e, portanto, uma vez que o esfregao esteja seco, o passaremos pela chama duas ou trs vezes, com o esfregao para cima evitando que se queime. Material Lminas Lamnulas Bico de Bunsen Ala de semeadura Tubos e placas com cultivos bacterianos Cuba para colorao ou recipiente similar Corantes: Cristal violeta, Lugol, lcool-Acetona (1:1) e Safranina.

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Mtodo Realizao do esfregao e a fixao dos diferentes cultivos de bactrias (como descrito anteriormente). COLORAO SIMPLES: Utiliza um s tipo de corante. Como corantes utilizaremos o azul de metileno ou a safranina, ambos de natureza bsica. A tcnica a seguinte: 1. Fazer o esfregao, secar-lo e fixar-lo. 2. Cobrir o esfregao com corante e deixar atuar durante um minuto. 3. Lavar suavemente com gua destilada para eliminar o excesso de corante. 4. Secar ao ar e observar ao microscpio com a objetiva de imerso (100x). Esta tcnica permite a observao da morfologia e tamanho das bactrias, assim como os tipos de arranjos que formam.

COLORAO DE GRAM: a colorao mais utilizada na bacteriologia, pois permite classificar as bactrias em dois grandes grupos, as Gram-positivas e as Gram-negativas. Esta tcnica requer quatro solues: 1. Cristal violeta. um corante bsico que em contato com as clulas carregadas negativamente, reage com elas impregnando-as. 2. Soluo de lugol. Fixa o cristal violeta e aumenta a afinidade entre o corante e as clulas. 3. Sol. de lcool-acetona. Solventes orgnicos que possibilitam a diferenciao entre as bactrias G(+) que resistem ao descoramento e as G(-) que so descoradas nessa etapa. 4. Safranina. Corante bsico de cor distinta ao primeiro corante, tambm conhecido como corante de contraste.

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Princpio A colorao de Gram foi descoberta a mais de 100 anos por Hans Christian Gram e utilizada para o exame microscpico direto de amostras e sub-cultivos. A morfologia bacteriana pode ser observada atravs da colorao de Gram que divide as bactrias em dois grupos: Gram positivas e Gram-negativas. A reao das bactrias tcnica de Gram expressa diferentes aspectos do microrganismo estudado, no que diz respeito patogenicidade, composio qumica, estrutura e permeabilidade da parede celular. A colorao de Gram baseia-se na estrutura molecular da parede celular das bactrias. A parede da clula Gram-positiva consiste de uma nica camada formada principalmente por cido murmico, muito resistente ao dos solventes, retendo assim os corantes. A parede da clula Gram-negativa constituda por mltiplas camadas bastante complexas que, no entanto, no retm os corantes quando submetidas a ao de solventes. composta por uma camada de peptideoglicano e trs outros componentes que a envolvem externamente: lipoprotena, camada externa e lipopolissacardeo. O peptideoglicano, responsvel pela forma das clulas e proteo do citoplasma frente s diferenas de presso osmtica entre os meios externo e interno, confere rigidez ao corpo bacteriano. formado por dois acares aminados, o cido N-acetil glicosamina e o cido Nacetil-murmico, e por um tetrapeptdeo, sempre ligado ao resduo de cido N-acetil murmico; as subunidades peptdeas de cadeias glicdicas adjacentes so unidas entre si por ligaes diretas ou indiretas. O peptideoglicano situa-se no espao periplsmico, localizado entre a membrana citoplasmtica (interna) e a membrana externa, onde tambm so encontradas enzimas hidrolticas (fosfatases, nucleases, proteases e outras), que facilitam a nutrio bacteriana, protenas de ligao, que participam da captao de acares e aminocidos a partir do meio, enzimas que inativam certos antibiticos. A lipoprotena est ligada de modo covalente ao peptideoglicano e no covalente membrana externa; sua funo, inferida de estudos realizados com amostras mutantes, estabilizar a membrana externa e ancor-la camada de peptideoglicano. A membrana externa uma dupla camada, contendo fosfolipdeos e protenas e apresentando, em sua camada externa, o lipopolissacardeo. Entre suas funes, a membrana externa representa uma barreira molecular, prevenindo ou dificultando a perda de protenas periplasmticas e o acesso de enzimas hidrolticas e certos antibiticos ao peptideoglicano; possui receptores para bacterifagos e bacteriocinas e participa da nutrio bacteriana. O lipopolissacardeo consiste no lipdio A (endotoxina), qual esto ligadas duas regies de natureza polissacardica, respectivamente, o core e as cadeias laterais. O lipdeo A um glicofosfolipdeo cujo papel biolgico consiste na participao nos mecanismos de patogenicidade da clula bacteriana. As paredes celulares das bactrias Gram-positivas e Gram-negativas so diferentes. A parede celular das bactrias Gram-positivas espessa, (10 a 50 m, chegando at a 80 m). A parede celular nas bactrias Gram-negativas menos espessa (7,5 a 10 m). A membrana citoplasmtica adere fortemente ao componente interno da clula bacteriana. A parede celular da bactria Gram-positiva nica e consiste de uma camada espessa, composta quase que completamente por peptideoglicano, responsvel pela manuteno da clula e sua rigidez. As mltiplas camadas de peptideoglicano (15 a 50 m) das bactrias Gram-positivas constituem uma estrutura extremamente forte em tenso, enquanto que nas Gram-negativas o
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peptideoglicano uma camada menos espessa e mecanicamente mais frgil. O tcnica de Gram a seguinte: 1. Confeccionar o esfregao. 2. Corar com cristal violeta durante um minuto. 3. Lavar suavemente com gua para eliminar o excesso do corante. 4. Adicionar lugol por um minuto. Atua como mordente ou fixador, aumentando a afinidade do corante pela bactria. 5. Lavar com gua o excesso de lugol, idem etapa 3. 6. Gotejar a soluo de lcool-acetona de forma contnua at que o esfregao deixe de desprender cor e lavar imediatamente com gua corrente. 7. Cobrir com o corante de contraste (safranina), durante um minuto. 8. Lavar com gua e secar a temperatura ambiente antes da microscopia.

Observao dos esfregaos bacterianos ao microscpio As bactrias Gram-positivas aparecero com uma colorao roxa ou violeta enquanto que as Gram-negativas com a cor rosa ou avermelhada. A identificao das bactrias Gram-positivas pode ser problemtica, somente quando as bactrias Gram-positivas se encontram em crescimento exponencial (cultivos jovens) a colorao tpica, em fase estacionria (cultivos velhos) as bactrias Gram-positivas podem parecer Gram-negativas.

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Represente dois dos campos visualizados a 1.000x de ampliao

Gram +

Gram -

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AP6 Colorao de Ziehl Neelsen Objetivo Aprender a confeccionar e corar lminas com essa tcnica, entender seu princpio e distinguir microscopicamente os BAAR bacilos lcool cido resistentes presentes nas amostras. Fundamento A parede celular das micobactrias, devido ao seu alto contedo lipdico, apresenta grande resistncia s coloraes. Entretanto, quando coradas, resistem ao descoramento pela ao de solventes orgnicos fortes, como a soluo lcool-cido, por esta razo, as micobactrias recebem a denominao de bacilos lcool cido resistentes (BAAR). A colorao de Ziehl Neelsen utilizada principalmente para detectar a presena de micobactrias (Mycobacterium sp.) em amostras clnicas, tais como escarro, liquor, urina, secreo traqueal e brnquica (M. tuberculosis - BK), linfa (M. hansen - BH) e secreo epidrmica (M. scrofulaceum). As micobactrias foram caracterizadas com base em suas propriedades especiais de colorao, que dependem da parede celular rica em lipdeos e relativamente impermeveis a vrios corantes bsicos, que uma vez coradas, no se descoram facilmente. Neste grupo de bactrias renem-se desde habitantes incuos do solo e animais at agentes causadores de doenas graves como a tuberculose e a hansenase alm de serem consideradas formas de transio evolucionria entre as eubactrias e os actinomicetos. A parede das micobactrias contm a mesma camada glicopeptdica basal das outras bactrias, apresentando, no entanto, alto teor lipdico (60%) que responde por seu carter hidrofbico. Esta caracterstica lhes confere grande resistncia a ao de antibiticos, anticorpos, complemento, cidos e bases fortes. Entre os lipdeos, extrados da parede celular de micobactrias com solventes orgnicos neutros, encontram-se steres de cidos graxos e alcois graxos (ceras), glicolipdeos (micosdeos) e uma classe de cidos graxos, quase exclusiva deste grupo de bactrias (cido miclico). Material Lminas com esfregaos (amostra clnica) Fucsina de Ziehl Neelsen Azul de metileno Soluo lcool-cido clordrico 3% Bico de Bunsen Microscpio e leo de imerso

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CUIDADOS ESPECIAIS Manusear a amostra clnica em cmara de fluxo laminar e utilizar lminas limpas e desengorduradas manipul-las tocando apenas nas bordas e respeitar rigorosamente os tempos indicados. Mtodo a. Fazer um esfregao em lmina; b. Deixar secar ao ar; c. Fixar na chama do bico de Bunsen; d. Cobrir com Fucsina de Ziehl Neelsen; e. Aquecer at a emisso de vapores (no ferver); f. Deixar descansar (5 minutos); g. Lavar com gua; h. Descorar com soluo lcool-cido clordrico 3% (at no soltar mais corante); i. Lavar com gua; j. Corar com azul de metileno (1 minuto); k. Lavar com gua; l. Deixar secar ao ar; m. Observar ao microscpio com a objetiva de imerso e fazer as anotaes.

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Represente um campo visualizado a 1.000x de ampliao

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AP7 - Colorao de esporos Objetivo Estudar o aspecto microscpico do gnero Bacillus com auxlio da colorao de esporos. Fundamento As espcies dos gneros Bacillus e Clostridium apresentam a capacidade de formar endsporos, que so formas de resistncia capazes de suportar altas temperaturas em condies ambientais adversas ou desfavorveis (esgotamento dos nutrientes, temperaturas extremas, radiaes, compostos txicos, etc.). Como forma de resistncia a esporulao bacteriana consiste na formao de um esporo por cada clula vegetativa (metabolicamente ativa) e vice-versa. Ao finalizar esse processo a clula vegetativa se lisa e libera o esporo ao exterior. Quando o ambiente se torne favorvel, o esporo germina gerando uma nova clula vegetativa. A viabilidade de um esporo pode perdurar por vrios anos. A formao de endsporos uma caracterstica de grande importncia na biologia de um microrganismo. A parede de um esporo apresenta comportamento distinto em relao parede celular, motivo pelo qual se utiliza uma tcnica especial de colorao com verde malaquita ou fucsina bsica (aquecida) como colorantes. Material -Cultivo de Bacillus em meio slido. -Lminas de vidro. -Ala de semeadura. -Bico de Bunsen. -Papel de filtro. -Verde malaquita (soluo aquosa a 2%). -Safranina. -Microscpio. Mtodo 1. Prepara um esfregao de uma amostra ou cultivo em meio slido (preferentemente de ao menos 48 horas) de Bacillus sphaericus ou Bacillus thuringiensis. Secar ao ar e fixar com calor. 2. Colocar a lmina sobre um trip e cobrir a preparao com papel de filtro do mesmo tamanho aproximadamente que a extenso (cujo objetivo manter mida a preparao e evitar que as bordas da lmina se manchem com o corante). 3. Adicionar a soluo de verde malaquita (soluo aquosa a 2%), esquentar com o bico de Bunsen novamente, sem deixar ferver, at a emisso de vapores brancos.

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Continuar esquentando durante 5 minutos. Adicionar mais corante se este evaporar. importante que a amostra no seque. 4. Lavar com gua intensamente e retirar o papel de filtro. 5. Corar com safranina (como corante de contraste) durante 1 minuto. 6. Lavar com gua, secar e observar ao microscpio com objetivo de imerso. O esporo se apresentar corado de verde enquanto que as clulas vegetativas de vermelho. Interpretao dos resultados

A posio e a morfologia do esporo no interior da bactria; constitui um carter taxonmico til para diferenciar espcies dentro de um mesmo gnero. Por exemplo, Bacillus sphaericus possui um esporo esfrico com localizao terminal e deformante da clula vegetativa, pelo que usualmente denominada como baqueta de tambor. Bacillus thuringiensis tem o esporo elipsoidal localizado no centro da clula vegetativa, o que provoca um abaulamento caracterstico.

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AP8 - Colorao de cpsula Objetivo Estudar as cpsulas bacterianas por meio de uma colorao diferencial para sua visualizao ao microscpio. Fundamento A cpsula definida como uma estrutura superficial que muitas bactrias apresentam em seus ambientes naturais, formado pelo acmulo de material mucoso ou viscoso, situado externamente parede celular. As cpsulas so classificadas em funo do grau de associao com a superfcie celular, ou por sua consistncia: Cpsula rgida: com suficiente consistncia estrutural para evitar a entrada de partculas como as de tinta nanquim ou nigrosina. Cpsula flexvel: pouca consistncia, de modo que no exclui partculas. Ademais, deformvel e carente de limites precisos. Cpsula integral: intimamente associada superfcie celular, com a parede celular Cpsula perifrica: associada superfcie celular em determinadas condies, mas finalmente se dispersa ao meio exterior. H uma confuso na nomenclatura das cpsulas. Por isso cabe destacar que CPSULAS em sentido estrito, so aquelas de tipo rgido e integral. Capas mucilaginosas so as de tipo flexvel e perifrico. As cpsulas so estruturas inertes no vivas, carentes de papel ativo (metablico), mas que conferem importantes propriedades s bactrias: Adeso a outras clulas: microcolnias e consrcios Adeso a substratos inertes ou vivos: colonizao de nichos ecolgicos (p. ex. tecidos de organismos superiores) Proteo contra agentes antibacterianos A estrutura a base de uma matriz muito hidratada, com uma ordenao regular radial, ou s vezes em lminas concntricas. O material capsular se compe de macromolculas assimtricas que, em muitos casos constam de uma srie de unidades repetitivas: polissacardeos o polipeptdeos. Material - Cepas bacterianas: Klebsiella sp em meio lquido - Tinta nanquim - Lminas e lamnulas - microscpio ptico

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Mtodo A observao no microscpio ptico a fresco difcil, j que o ndice de refrao similar ao do meio. Recorre-se a colorao negativa por meio de nigrosina ou tinta nanquim. 1. Colocar uma gota do meio com a bactria em uma lmina, adicionar uma gota de tinta nanquim e homogeneizar bem. 2. Colocar suavemente uma lamnula sobre a suspenso de clulas com tinta nanquim. Evitar que se formem bolhas. 3. Colocar as lminas com as lamnulas entre dois papis absorventes. Pressionar com os dedos e o excesso de suspenso ser absorvido pelo papel. 4. Descartar o papel em um recipiente para material contaminado e lavar rigorosamente as mos. 5. Observar ao microscpio, fundo escuro e halos claros em torno das clulas. Trabalhar com o diafragma do condensador fechado para aumentar o contraste das clulas.

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AP9 - Contagem do nmero de bactrias Objetivo Estudar a metodologia de contagem de microrganismos viveis presentes em uma amostra lquida utilizando a tcnica da diluio seriada. Fundamento O mtodo que vamos utilizar consiste na realizao de diluies sucessivas de uma amostra em condies de esterilidade com o objetivo de se inocular um volume conhecido dessas diluies em uma srie de placas de Petri, considerando que algumas das diluies permitiram a observao e a contagem das colnias isoladas na placa. Contando o nmero de colnias, o volume semeado na placa e a diluio correspondente, poderemos calcular o nmero de UFC presente na amostra. Material - amostras - Pipetas automticas - Tubos com 9 mL de soluo fisiolgica - Placas de gar nutritivo Mtodo A partir da amostra, fazer uma srie de diluies decimais em condies de esterilidade.

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Estender 100L da amostra (caldo crescido) que ser identificado como direto ou D e das diluies 10-2, 10-4 e 10-6 em placas individuais. Incubar 24h a 37C. A partir do nmero de colnias presentes em cada diluio, calcular o nmero de bactrias por mL no cultivo original.

Anotaes _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________
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AP10 - Cultivo de bactrias anaerbias Objetivo Estudar o fundamento da tcnica mais empregada no isolamento e estudo de bactrias anaerbias. Fundamento As bactrias anaerbias so cultivadas eliminando o oxignio do meio ambiente ou estabelecendo um potencial redox baixo, mediante a adio de agentes redutores ao meio de cultura. O cultivo de microrganismos anaerbios feito por vrios mtodos diferentes, o mais utilizado a inoculao de bactrias em placas ou tubos de cultivo, introduzindo-os em jarras de anaerobiose aonde se consegue uma atmosfera livre de oxignio. Estas jarras consistem em um suporte para placas includo em uma cubeta transparente com tapa hermtica. As placas e os tubos inoculados so colocados dentro do suporte no interior da jarra junto a um envelope comercial aberto. Para criar a atmosfera anaerbia se utiliza um envelope que contm um tablete de boro hidrato sdico, outra de bicarbonato de sdio e cido ctrico e um catalisador de paldio. Quando se adiciona gua ao envelope, o boro hidrato sdico, bicarbonato de sdio e cido ctrico reagem para formar hidrognio e dixido de carbono. O catalisador de paldio acelera a reao entre o hidrognio e o oxignio presentes dentro da jarra. Esta reao produz gua, que se condensa nas paredes da jarra. Para confirmar que a atmosfera anaerbia se coloca dentro da jarra um papel indicador que contm azul de metileno. Este azul na presena de oxignio e vira branco no ambiente anaerbio.

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AP11 - Antibiograma Objetivo Determinar a sensibilidade bacteriana a distintos antibiticos mediante a tcnica de Kirby-Bauer, metodologia simples e acessvel a qualquer laboratrio de microbiologia. Fundamento Atualmente se encontra a disposio na luta contra as doenas infecciosas uma grande quantidade de agentes antimicrobianos. Os antibiticos so substncias qumicas produzidas por microrganismos ou derivados semisintticos destes, enquanto que os quimioterpicos so produtos de sntese qumica, ambos apresentam algum tipo de ao antimicrobiana. As bactrias no possuem a mesma sensibilidade aos diferentes tipos de antimicrobianos. A avaliao desta sensibilidade nos ajuda na seleo do composto mais adequado para o tratamento de uma infeco bacteriana. Os ensaios mais utilizados para avaliar a sensibilidade de uma bactria a um agente antibacteriano esto embasados no enfrentamento in vitro da bactria com distintas concentraes do agente. Concentrao mnima inibitria (CMI) definida como a menor concentrao do antimicrobiano capaz de inibir o desenvolvimento de uma determinada cepa bacteriana. Concentrao mnima bactericida (CMB) definida como a menor concentrao de antimicrobiano capaz de destruir uma determinada cepa bacteriana. O antibiograma pelo mtodo de difuso em gar uma prova na que se confronta a bactria inoculada na superfcie do gar com uma soluo antibitica absorvida em discos de papel de filtro. Este mtodo est estandardizado e os halos de inibio em torno dos discos esto correlacionados com as CMIs obtidas por diluio. H vrios fatores que afetam o tamanho do halo de inibio: a carga do antibitico nos discos, a difuso do antibitico no meio de cultura, o tamanho do inculo bacteriano, a composio e grossura dos meios de cultura, a velocidade do crescimento bacteriano e o tempo de incubao. Os discos de antibiticos so adquiridos comercialmente. Devem conter a quantidade estabelecida de antibitico e ser conservados a 4C protegidos da umidade. O inculo bacteriano deve ter uma turbidez similar ao 0,5 da escala de McFarland, aproximadamente 108 ufc/mL e ser preparado em soluo salina estril ou caldo de cultivo.

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Material - Cultivo puro de Staphylocous aureus e Escherichia coli. - Placas de gar Mueller-Hinton. - Discos comerciais de antibiticos. - Swabs estreis - Pinas de laboratrio - Escala 0,5 de McFarland Mtodos 1. Preparao e semeadura do inculo Partindo de um cultivo puro, transferir com a ala de platina 3-5 colnias da bactria e introduzir no caldo de cultivo. A turbidez do inculo deve equivaler ao estndar 0,5 de McFarland.

1.

Inocular o gar com o swab passando-o uniformemente por toda a superfcie em trs direes. Por ltimo, passar o swab pelas bordas da placa. Deixar secar por 5 minutos. Colocar os discos de antibiticos sobre a superfcie do gar utilizando pinas estreis e apert-los suavemente. Os discos no devem estar a menos de 15 mm das bordas da placa e o bastante separado entre eles para que no se superponham suas zonas de inibio. Deixar as placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comecem a difundir os antibiticos. Incubar a placa em posio invertida a 37C durante 18-24 horas. Medir os dimetros dos halos de inibio com uma rgua.

2.

3.

4. 5.

Ensaio qualitativo: em um mesmo cultivo se testa distintas solues antibiticas. Ensaio quantitativo: em um mesmo cultivo se testa a um s antibitico, preparado a distintas concentraes.

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Interpretao de os resultados Os dimetros dos halos de inibio se traduzem em categorias: resistente (R), intermedirio (I) ou sensvel (S).

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AP12 - Efeitos das altas temperaturas sobre o crescimento microbiano Objetivo Avaliar o efeito e a resistncia de um cultivo bacteriano a altas temperaturas. Fundamento As altas temperaturas provocam efeitos letais ou sub-letais sobre os microrganismos. Uma bactria submetida a uma temperatura superior que normalmente cresce, sofre, em primeiro lugar, danos em suas protenas e cidos nucleicos. Estes primeiros danos impedem que a bactria se reproduza e, por conseguinte, forme uma colnia sobre um meio de cultura. Entretanto, se o tratamento de curta durao e se efetua a uma temperatura no excessivamente alta, os danos que a bactria sofre so reparveis e, por isso, se fala de efeitos sub-letais. Quando o tratamento mais drstico, em temperatura ou em durao, os danos se tornar irreparveis e a bactria perde de forma irreversvel sua capacidade de formar colnias, ou seja o efeito letal. Material 3 tubos com um cultivo da bactria problema 3 placa de Petri de gar LB Micropipeta e pontas estreis (ou pipetas) bico de Bunsen banho-maria termosttico a 60C Cronmetro Mtodo Sero utilizados trs tubos com cultivos da bactria problema por grupo e trs placas de Petri com gar LB. 1. Identificar cada placa com o tempo de incubao a ser estudado (0, 15 e 30 minutos). 2. Transferir alquotas de 100L do cultivo e seme-las sobre a superfcie da placa correspondente ao tempo t=0. 3. Colocar os outros dois tubos no banho-maria e incubar a 60C. 4. - O t = 15 e 30 minutos transferir 100l de amostra do tubo que corresponda e seme-los sobre a placa correspondente. 5. - Incubar as placas a 37C durante 24h. 6. - Ao dia seguinte, fazer uma contagem das colnias nos diferentes tempos (a t = 0 ser impossvel porque se tratar de um crescimento em toda a superfcie).

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AP13 - Efeitos de agentes qumicos desinfetantes e anti-spticos Objetivo Determinar a eficcia de alguns compostos qumicos usados em hospitais e casas como agentes antimicrobianos. Ademais, aprender a calcular o coeficiente fenlico. Fundamento Na primeira parte do experimento vamos examinar a ao microbicida de vrios compostos comerciais. De uma forma mais especfica a eficincia microbicida de um composto qumico definida mediante a ao do fenol, sendo a comparao conhecida como coeficiente fenlico (CF). A determinao do efeito anti-sptico ou desinfetante dos diferentes produtos complicada porque este efeito depende de um grande nmero de fatores externos (temperatura, umidade, pH, etc.) assim como dos diferentes tipos de microrganismos que se deseja eliminar ou controlar. Existem protocolos que regulam como se deve avaliar a eficcia de um composto germicida e entre elas destaca-se a prova do coeficiente fenlico (CF) em a que se toma como referncia de desinfetante o fenol e como referncia de microrganismos Staphylococcus aureus, Salmonella typhi o Pseudomonas aeruginosa. CF = dil fenol / dil desinf Onde dil fenol o inverso da maior diluio do fenol que elimina completamente a bactria de referncia em 10 min de tratamento, e dil desinf a maior diluio do desinfetante que elimina o microrganismo de referncia em 10 min de tratamento, realizando-se o estudo dos sobreviventes aps um cultivo de 48h. O valor de CF simplesmente indicativo j que se trata de uma medida realizada sobre cultivos puros e na realidade, os germicidas so utilizados em populaes mistas. Vrios so os fatores que podem interferir na eficcia dos agentes qumicos. Sua ao microbicida ou microbiosttica e sua eficincia frequentemente determinada considerando a habilidade de deter o crescimento microbiano. Em outras palavras, o coeficiente fenlico calculado pela diviso da menor concentrao do antimicrobiano teste, a qual mata todos os microrganismos aps 10 minutos de incubao, mas no depois de 5 minutos, pela menor concentrao de fenol com o mesmo efeito. Entretanto, esta comparao deve ser utilizada com compostos derivados do fenol, alm de considerar que exime efeitos bacteriostticos e o efeito inibitrio no neutralizado no cultivo subsequente.

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A seguir apresentada uma lista dos agentes mais comumente empregados e sua rea de aplicao.

Material Desinfetantes comerciais Cultivos das bactrias testes ( Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa) Tubos esterilizados Tubos com 5mL de caldo TSB Tubos com 5mL de gua esterilizada Pipetas Micropipetas e pontas Fenol (cido carblico) Lysol (produto comercial) Mtodo Primeira etapa: Inibio do crescimento 1. Cada grupo deve selecionar um dos desinfetantes 2. Colocar 5mL do desinfetante em dois tubos estreis. Adicionar 0,05 mL de P. aeruginosa a um dos tubos e 0,05mL de S. aureus no outro.
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3. Identificar cada tubo. Agitar-los at obter suspenses homogneas 4. Transcorridos os intervalos de 1, 2, 5, 10 e 15 minutos, transferir 0,1mL das suspenses a tubos com caldo TSB. Faz-lo para as duas bactrias e tambm para o caldo com os inculos sem desinfetante controles positivos 5. Incubar todos os tubos por 48h a 35C Coeficiente fenlico 1. Diluir o fenol em gua destilada estril (1/80, 1/90 e 1/100). Diluir o Lysol (1/400, 1/450 e 1/500) ao volume final de 5mL em cada tubo 2. Rotular 18 tubos com 5mL de caldo TSB com a diluio e o tempo de incubao (ex. 5min, fenol 1/80). Cada diluio debe ser testada aps 5, 10 e 15 minutos de incubao 3. Ordenar os tubos em uma grade 4. Adicionar 0,5mL do cultivo de S. aureus a cada tubo. Homogeneizar as suspenses 5. Aps a incubao de 5, 10 e 15 minutos, transferir alquotas com ala a outros tubos com caldo TSB 6. Incubar os tubos por 48 horas a 35C

Segunda etapa: Inibio do crescimento 1. Agitar os tubos e observar si esto crescidos ou no 2. Anotar as leituras na tabela 1 Coeficiente fenlico 1. Agitar os tubos e observar si esto crescidos ou no. 2. Anotar as leituras na tabela 2 3. Calcular o coeficiente do Lysol partindo de sua menor concentrao capaz de matar a bactria em 10 minutos pela menor concentrao do fenol com o mesmo efeito: CF = conc. fenol conc. Lysol CF = n de vezes que um dado desinfetante mas efetivo que o fenol

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AP14 - Anlise microbiolgica da contaminao ambiental Objetivo Determinar o grau de contaminao ambiental para estudar a influncia no nmero e tipo de microrganismos que podem contaminar alimentos, produtos farmacuticos e outros insumos mdicos ou industriais. P14.1 - Anlise do ar P14.2 - Anlise de superfcies P14.3 - Anlise de manipuladores Fundamentos Os microrganismos esto presentes em todos os ambientes: no ar, na gua, na superfcie dos objetos e inclusive sobre nossa pele. Quando o tema a tratado a microbiologia de alimentos, importante determinar o grau de contaminao ambiental, j que as condies higinicas do lugar de trabalho (utenslios, superfcies, etc.) e do prprio manipulador vo influir no nmero e tipo de microrganismo presente no alimento. 14.1 ANLISE DO AR O ar, alm das partculas em suspenso, portador de bactrias ou seus esporos. Por isso, pode ser a causa tanto de contaminao de alimentos e superfcies como de infeces no ser humano (patologias respiratrias, etc.). Existem distintos mtodos para as anlises do ar: sedimentao, filtrao, choque em lquidos e precipitao eletrosttica, entre outros. Nesta prtica vamos explicar o primeiro mtodo, por ser um dos mais empregados. O mtodo de sedimentao em placa bastante simples para a determinao de microrganismos do ar. A pesar disso, os resultados obtidos so orientativos das cifras de microrganismos presentes no ar, ainda assim se deve considerar que estes nveis variam em funo das correntes de ar e do tamanho das partculas em suspenso. Material Placas de PCA Mtodo 1. Destampar a placa de PCA em o lugar cujo nvel de contaminao se deseje examinar durante diferentes intervalos de tempo: 0,5; 1 e 1,5 horas. 2. Tampar as placas e incubar durante 24-48 horas a 37 C. 3. Determinar o nmero de aerbios mesfilos totais ambientais.

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15.2 ANLISE DE SUPERFCIES Para realizar uma correta manipulao dos alimentos necessrio fazer uma limpeza adequada tanto nas superfcies de trabalho como nos utenslios que sero utilizados. A no ser que os alimentos tenham sido esterilizados, todos os produtos levaro consigo microrganismos. Na manipulao, durante os processos de embalagem e armazenamento, estes microrganismos devem ser mantidos a todo o momento em nveis que assegurem a qualidade microbiolgica do alimento. O objetivo das anlises microbiolgicas de superfcies comprovar o estado higinico do lugar de trabalho, de modo que evitemos contaminaes cruzadas durante o processamento dos alimentos. Existem distintos mtodos para o exame microbiolgico das superfcies: mtodo do swab, da placa de contato, da seringa de gar, da pelcula adesiva, etc. Nesta prtica se descrevem os mtodos do swab (para o estudo de superfcies no planas) e o da placa de contato RODAC (para o estudo de superfcies planas). 15.2.1 Anlises de superfcies no planas (mtodo do swab) Este sistema o mais antigo e o mais utilizado no exame microbiolgico de superfcies, pode ser empregado tanto em superfcies planas como no planas. especialmente recomendado para analisar superfcies de equipamentos e utenslios (mquinas moedoras de carne, talheres, etc.). Ademais, permite o estudo de superfcies muito contaminadas, uma vez que a partir da soluo salina inoculada com o swab possvel realizar diluies decimais precisas. Material Moldura esterilizada de papel alumnio Swabs 10 ml de soluo salina Placas de PCA e VRBG Mtodo 1. Delimitar a superfcie que ser analisada mediante uso da moldura de papel de alumnio com uma abertura de dimenses conhecidas (ex. 9 cm2). 2. Umedecer o swab na soluo de 10 ml de soluo salina estril e esfregar vrias vezes sobre a superfcie delimitada pela moldura. 3. Introduzir de novo o swab no tubo com soluo salina e deixar durante 15-30 min de maneira que os microrganismos sejam liberados no caldo. 4. Inocular 0,1 ml do caldo em placas PCA e VRBG. 5. Incubar durante 24-48 horas a 37C. O resultado expressado em ufc/9cm2

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15.2.2 Anlises de superfcies planas por placas de contato (RODAC: Replicate Organisms Direct Agar Contact) Material Placas RODAC Meio PCA fundido e resfriado a 55C Mtodo 1. O meio PCA, uma vez fundido e resfriado a 55C, deve ser vertido em placas de maneira que sobressaia a borda da placa para facilitar o contato com a superfcie a examinar. 2. Pressionar suavemente a placa sobre a superfcie. 3. Incubar durante 24-48 horas a 37C. A superfcie delimitada pelas placas de 25cm 2 e o resultado expressado como ufc/25cm2. Nota: o principal inconveniente deste mtodo sua ineficcia em superfcies muito contaminadas e a possibilidade de no recuperar todos os microrganismos presentes na superfcie. Entretanto, so obtidos bons resultados nos casos em que a carga microbiana baixa.

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AP15 - Contagem de microrganismos viveis em manipuladores de alimentos Objetivo Conhecer a tcnica de contagem em placa (pour plate count) e avaliar o efeito da lavagem de mos na contagem de microrganismos viveis em manipuladores de alimentos. Fundamentos Um alimento pode estar contaminado em sua origem ou pode ser o manipulador a fonte de contaminao durante o processamento. Consideramos normal que o manipulador tenha uma abundante carga microbiana em sua pele, mas nunca devero apresentar microrganismos patognicos ou que indiquem pouca higiene. Portanto, resulta evidente a necessidade de que o manipulador mantenha perfeitas condies de higiene durante o processamento de alimentos. O objetivo das anlises de manipuladores comprovar que a pessoa que processa o alimento no uma fonte de contaminao deste. Normalmente so estudadas mos, unhas e cavidades nasais. Material Swab estril Placas com gar Manitol Sal e gar VRBG Tubos com gar nutritivo Banho-maria Sacos plsticos Pipetas esterilizadas Soluo fisiolgica Placas de Petri Tubos Mtodo 1. Coletar com swab estril amostra do interior do nariz e inocular o swab sobre a placa de gar Manitol Sal. 2. Introduzir as mos em um saco plstico. 3. Verter 20ml de soluo fisiolgica estril de maneira assptica para evitar contaminaes ambientais. 4. Lavar as mos seguindo o procedimento bsico de lavagem de mos (pg. 03). 5. Transferir 5ml da soluo a um tubo estril. 6. Preparar diluies seriadas das amostras (101, 102 e 103). 7. Transferir 1ml de cada diluio a placas Petri sem meio (Direta 103).
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8. Verter 20mL de gar fundido a 45C em cada placa. 9. Homogeneizar as placas com movimentos em forma de oito. 10. Repetir o processo depois da lavagem de mos (com gua corrente e/ou seguida de antissepsia com lcool a 70%). 11. Incubar as placas a 37C por 24h. 12. Determinar a quantidade total e de cada tipo de colnia como ufc/mL. 13. Observar o crescimento das colnias caractersticas em cada meio de cultura: colnias violetas com halo da mesma cor no caso de Enterobacteriaceae em placas de VRBG e amarelas (Staphylococcus aureus) ou brancas (Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus saprophyticus). no gar manitol sal. Mtodo

0,1mL

gar Manitol e VRBG

direta

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AP16 - Anlises microbiolgicas da gua Objetivo Determinar a presena de coliformes e obter ndices como o nmero possvel de coliformes presentes em uma amostra de gua a ser testada. Conhecer cada etapa (presuntiva, confirmativa e completa) na tcnica dos tubos mltiplos para determinao de coliformes em gua e realizar o teste de presena/ausncia de coliformes. Fundamento Em uma amostra de gua pode estar presente uma grande variedade de microrganismos, os quais afetam em maior ou menor medida a potabilidade da gua e suas caractersticas organolpticas. Ademais da microbiota normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), podem existir microrganismos contaminantes, uma das fontes principais de contaminao so as guas residuais que contm fezes que podem ser veculos de transmisso de patgenos. Aparte do problema de transmisso de enfermidades, a contaminao da gua tambm acarreta outras consequncias. Por exemplo, a degradao biolgica pelos microrganismos de grandes quantidades de resduos orgnicos vertidos na gua ocasiona a diminuio drstica do oxignio existente, criando um ambiente desprovido de toda forma de vida que no seja anaerbia: morrem os peixes, diminui a vida vegetal e se produz o mau odor caracterstico devido s atividades dos microrganismos anaerbios. O nmero de coliformes totais (Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Escherichia) em uma amostra de gua pode ser determinado por uma estimao estatstica denominada Nmero Mais Provvel (NMP) (figura 46.1). Este mtodo implica na visualizao da fermentao em uma srie mltipla de tubos com tubos invertidos de Durham e se divide em trs partes: a presuntiva, a confirmativa, e a prova completa. No ensaio presuntivo, as diluies das mostras de gua so adicionadas a tubos com caldo lactose ou lauril-triptose. Depois de 24 a 48 horas de incubao a 35C, se observa a produo de gs devido fermentao da lactose, se presume assim que so coliformes uma vez que o caldo seletivo para Gram-negativas. Na prova confirmativa se realiza a transferncia de material da maior diluio dos tubos com caldo lactose que mostrou crescimento e produo de gs a outro caldo (verde brilhante bile lactose - VBBL) que seletivo e diferencial para coliformes. O tubo incubado durante 483 horas a 35C. A formao de gs no tubo de Durham confirma a presena de coliformes totais. Na prova completa, uma amostra positiva de caldo VBBL semeada em gar Levine EMB ou LES Endo e se incuba durante 18 a 24 horas a 35C. No gar EMB, os coliformes produzem pequenas colnias com centros escuros. Em gar LES Endo, os coliformes produzem colnias de cor avermelhada. As amostras so ento inoculadas em caldo verde brilhante bile lactose (VBBL) e em gar nutriente inclinado. Estes tubos se incubam durante 24 horas a 35C. Se h produo de gs no caldo VBBL e a bactria isolada um bacilo Gram-negativo no formador de esporos, se considera o teste como positivo. Uma estimativa do nmero de coliformes (o nmero mais provvel) pode ser feito na prova presuntiva. Neste procedimento, so inoculadas amostras de gua em 15 tubos com caldo
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lactose, em 5 tubos se inoculam 10mL de gua, em outros 5 tubos se adicionam 5mL e 0,1mL de gua nos ltimos 5 tubos. Se contam os tubos nos quais h produo de gs e o nmero comparado com uma tabela (tabela 46.1) desenvolvida pela American Public Health Association. O resultado o Nmero Mais Provvel (NMP) de coliformes por cada 100mL da amostra de gua. Mais recentemente foi desenvolvida uma simples e muito sensvel alternativa ao procedimento clssico do NMP: a prova de presena/ausncia (PA) de coliformes. Esta prova uma modificao do NMP na qual uma grande amostra de gua (100mL) incubada em um s frasco de cultivo com caldo lactose, lauril sulfato de sdio e o indicador prpura de bromocresol. A prova PA se baseia no suposto de que no devem estar presentes coliformes em 100mL de gua potvel. Lauril sulfato de sdio inibe muitas bactrias, mas no os coliformes, uma prova positiva a produo de cido a partir da fermentao de lactose (mudana da cor roxa/rosa para o amarelo) e se constitui numa prova presuntiva positiva. Igual ao que ocorre com o NMP, requerida confirmao. Se no h mudana de cor, os resultados so negativos para coliformes em 100 ml de amostra de gua. Material 10 tubos com 10mL de caldo lactose com tubos invertidos de Durham (os caldos lauril triptose ou presena/ausncia tambm podem ser utilizados) 5 tubos com 10mL de caldo lactose (dupla concentrao) com tubos de Durham Amostra de gua com no mnimo 125mL Kit colorao de Gram Placas de gar EMB 1 tubo com gar inclinado 3 tubos com caldo VBBL 2% ou 2 tubos de caldo lauril triptose com tubos de Durham Pipetas esterilizadas (10mL e 1mL) 1 Frasco de 250mL para cultivo P/A com 50mL de caldo presena/ausncia com o triplo de concentrao

Mtodos Procedimento para o teste do NMP Teste presuntivo 1. Homogeneizar o frasco de gua a ser testada 25 vezes. 2. Inocular 10mL de gua em 5 tubos com caldo lactose de dupla concentrao. 3. Inocular 1mL de gua em 5 tubos com caldo lactose de concentrao normal. 4. Inocular 0,1mL de gua em outros 5 tubos com caldo lactose de concentrao normal. 5. Homogeneizar cuidadosamente cada tubo com as palmas das mos.

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6. Incubar as 3 sries de tubos por 24 a 48 horas a 35C. 7. Observar a presena de gs nos tubos. Se aps 483 horas de incubao no h formao de gs o teste considerado negativo. 8. Determinar o nmero de coliformes por 100mL de gua (conferir na tabela 46.1). Por exemplo, se h produo de gs em todos os 5 tubos com 10mL de amostra, 1 com 1mL e nenhum com 0,1mL, o teste deve ser lido como 5-1-0 e a tabela nos indica que h 33 coliformes por 100mL de gua. Teste confirmativo 1. Apontar os resultados do teste presuntivo e inocular com uma ala, a partir da diluio mais alta que apresente produo de gs, um tubo com caldo VBBL. 2. Incubar por 483 horas a 35C a formao de gs em qualquer momento durante as 48 horas de incubao constitui no teste confirmativo positivo. Teste completo 1. Partindo do caldo VBBL positivo, inocular uma placa de gar EMB. 2. Incubar-la por 24 horas a 35C. 3. Se os coliformes esto presentes, selecionar uma colnia bem isolada e inocular-la em tubos com caldo VBBL e gar nutriente inclinado. 4. Preparar um esfregao com Gram do crescimento no gar nutriente. 5. A formao de gs no caldo VBBL, a visualizao de bacilos Gram-negativos no formadores de esporos revela a presena de coliformes e indica que a gua est contaminada.

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Procedimento para o teste de presena/ausncia (P/A) de coliformes 1. Inocular 100mL da amostra em um frasco de 250mL que contm 50mL do caldo P/A de tripla concentrao. Agitar-la vigorosamente por 5 vezes. 2. Incubar a 35C 3. Inspecionar o frasco depois de 24 e 48 horas de incubao para a produo de cido. A colorao amarela formada quando a lactose fermentada; a existncia da produo de gs pode ser constatada agitando suavemente o frasco e observando a formao de espuma. 4. Transferir uma alquota quando h fermentao da lactose e produo gs (o que indica o teste presuntivo como positivo) a um tubo com caldo VBBL que contenha um tubo de Durham, que se incuba a 35C. 5. Um aspecto turvo e produo de gs em 48 horas confirmam a presena de coliformes. 6. Anotar o resultado como teste P/A positivo ou negativo em 100mL de gua.

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Deteco de clostrdios sulfito-redutores So bactrias de morfologia bacilar, Gram(+), anaerbios estritos, capazes de formar esporos e com atividade redutora do sulfito. Algumas espcies de Clostridium habitam o trato intestinal de animais, outras no solo, etc. Esse teste consiste em contar o nmero de bactrias anaerbias formadoras de endsporos com capacidade de reduzir o sulfito em um meio que contm sulfito sdico e um sal frrico, denominado meio Wilson Blair (WB). Estas colnias aparecem de cor negra devido formao de sulfato ferroso por reduo do sulfito. Procedimento 1. Fundir previamente 20mL do meio Wilson-Blair (WB) e manter em banho-maria a 60C. 2. Aquecer a amostra de gua (10mL que em um tubo estril) durante 10 minutos a 80C, para matar formas vegetativas e induzir a esporulao. Esfriar na torneira. 3. Transferir uma alquota de 1mL da amostra a uma placa de Petri, verter o meio fundido, homogeneizar em forma de oito. 4. Incubar a 37C durante 24-48 horas. 5. Contar o n de colnias negras existentes (sem considerar as colnias puntiformes). 6. O resultado se expressa como n de clostrdios existentes no volume de gua semeada.

Meio Wilson Blair (WB) Peptona 10,0 g/l Sulfito sdico 0,5 g/l Citrato frrico 0,5 g/l gar 15,0 g/l

Bibliografia Harley & Prescott Laboratory exercises in microbiology, 5th edition. The McGrawHill Companies, 2002. Goi CS microbiologia General Guon Prcticas. Instituto de Agrobiotecnologa e Recursos Naturales. UPNA/CSIC, 2005.

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