UNIVERSIDADE JOS DO ROSRIO VELLANO CURSO DE BIOMEDICINA

BANCO DE SANGUE E ANLISES HEMATOLGICAS

Apostila Terico-Prtica

Belo Horizonte 2011

BANCO DE SANGUE E ANLISES HEMATOLGICAS

CONTEDO: Determinao dos grupos sanguneos Classificao do Fator Rh Identificao do D fraco Teste de Coombs Eletroforese de hemoglobinas Teste de falcizao Prova Cruzada Velocidade de Hemossedimentao Tempo de Sangria Tempo de Coagulao Tempo de Protrombina Tempo de Tromboplastina p. 03 p. 05 p. 06 p. 07 p. 08 p. 09 p. 10 p. 11 p. 12 p. 13 p. 14 p. 15

Anlise e Interpretao de Exames Laboratoriais Prof Ana Paula Lucas Mota

AULA PRTICA 01: Determinao dos grupos sanguneos do sistema ABO

1) Fundamento Os grupos sanguneos surgiram quando foram descobertas estruturas qumicas na superfcie celular, denominadas antgenos dos grupos sanguneos. Quando as hemcias so testadas com soros conhecidamente dotados de anticorpos especficos e no ocorre nenhuma interao, podese concluir que estas hemcias so destitudas de antgenos. Inversamente, quando ocorre qualquer interao, subentende-se que estas hemcias possuem o antgeno em questo. 2) Procedimento TCNICA EM LMINA - Colocar uma gota de sangue homogeneizado, colhido com anticoagulante, em ambas as extremidades da lmina. - Colocar uma gota do soro anti-A sobre a gota de sangue esquerda da lmina. - Colocar uma gota do soro anti-B sobre a gota de sangue direita da lmina. - Misturar as gotas com o auxlio de uma pazinha ou ponteira. - Fazer a leitura observando se houve ou no aglutinao.

TCNICA EM TUBO - Tomar 2 tubos de hemlise. - Colocar no primeiro tubo uma gota do soro anti-A. - Colocar no segundo tubo uma gota do soro anti-B. - Em cada um dos tubos adicionar uma gota da suspenso de hemcias a 5% do paciente. - Homogeneizar e centrifugar os tubos a 1.500 rpm durante 2 minutos. - Fazer a leitura observando se houve ou no aglutinao.

PREPARO DA SUSPENSO DE HEMCIAS A 5% - Em um tubo cnico colocar 1 mL de sangue total homogeneizado colhido com anticoagulante + 9mL de soro fisiolgico (NaCl 0,85%). - Centrifugar a 2.500 rpm durante 2 minutos. - Desprezar o sobrenadante. - Repetir este procedimento mais 2 vezes. - A partir do sedimento de hemcias lavadas, preparar uma suspenso a 5% (50 L do sedimento de hemcias + 950 L de soro fisiolgico).

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3) Interpretao

Grupo Sanguneo AB A B O
Sinal + indica presena de aglutinao Sinal indica ausncia de aglutinao

Anti-A + + -

Anti-B + + -

4) Significado Clnico Os grupos sanguneos so determinados pela presena de antgenos na superfcie das clulas, particularmente as hemcias. Estes antgenos possuem natureza bioqumica variada, podendo ser compostos de carboidratos, lipdios, protenas ou uma mistura destas biomolculas. A determinao dos grupos sanguneos tem importncia em vrias reas da sade: - Hemoterapia; medicina transfusional - Neonatologia - Antropologia - Medicina forense etc. Os tipos sanguneos mais frequentes so O+ e A+. O sistema ABO o mais importante na prtica transfusional por ser o mais imunognico, seguido pelo sistema Rh.

5 AULA PRTICA 01: Classificao do Fator Rh

1) Fundamento As hemcias so classificadas com Rh positivas ou Rh negativas, dependendo da presena ou ausncia do antgeno D na membrana celular. As hemcias so testadas com um soro especfico anti-D. Uma reao positiva indica presena do antgeno D e estas hemcias so classificadas como Rh positivas. Por outro lado, a ausncia de aglutinao indica que as hemcias so Rh negativas. 2) Procedimento TCNICA EM LMINA - Pr-aquecer uma lmina. - Colocar uma gota do soro anti-D. - Acrescentar uma gota de sangue total homogeneizado colhido com anticoagulante. - Misturar as gotas. - Observar se houve ou no aglutinao.

TCNICA EM TUBO - Utilizar a suspenso de hemcias a 5%. - Tomar 3 tubos de hemlise e numer-los de 1 a 3. Proceder conforme o esquema a seguir:

Reagentes Suspenso de hemcias 5% (teste) Suspenso de hemcias Rh positivas Albumina bovina 22% Soro anti-D

Tubo 1 (teste) 1 gota 1 gota

Tubo 2 (controle positivo) 1 gota 1 gota

Tubo 3 (controle negativo) 1 gota 1 gota -

- Misturar e incubar todos os tubos em banhio-maria 37C durante 20 minutos. - Aps este tempo centrifugar todos os tubos a 1.500 rpm durante 2 minutos. - Fazer a leitura observando se houve ou no aglutinao. 3) Interpretao Rh+ .................... se houver aglutinao Rh- .................... se no houver aglutinao

6 AULA PRTICA 02: Identificao do D fraco

1) Fundamento Um nmero muito reduzido de pessoas possuem hemcias que no so aglutinados diretamente com soro anti-D, mas que do reao positiva pelo teste da anti-globulina. Durante a incubao com soro anti-D ocorre sensibilizao das hemcias portadoras do fator D fraco. Acrescentando-se a anti-globulina, esta vai reagir com os anticorpos que esto sensibilizando as hemcias (anti-D), promovendo a aglutinao. O fator D fraco um alelo do gene D, to imunognico quanto o prprio antgeno D. 2) Procedimento - Preparar uma suspenso de hemcias a 5%. - Tomar 3 tubos de hemlise, numer-los de 1 a 3 e proceder segundo o esquema abaixo:

Reagentes Suspenso de hemcias 5% (teste) Suspenso de hemcias 5% (Rh+) Soro anti-D Albumina bovina 22%

Tubo 1 (teste) 1 gota 1 gota -

Tubo 2 (controle positivo) 1 gota 1 gota -

Tubo 3 (controle negativo) 1 gota 1 gota

- Incubar em banho-maria 37C durante 20 minutos. - Lavar 3 vezes com soro fisiolgico (2.500rpm durante 2 minutos).

Reagentes Soro de Coombs

Tubo 1 (teste) 2 gotas

Tubo 2 (controle positivo) 2 gotas

Tubo 3 (controle negativo) 2 gotas

- Homogeneizar e centrifugar a 1.500rpm durante 2 minutos. - Observar se houve ou no aglutinao.

3) Interpretao D fraco positivo .................... se houve aglutinao D fraco negativo .................... se no houve aglutinao

7 AULA PRTICA 03: Teste de Coombs Direto

1) Fundamento Hemcias sensibilizadas com anticorpos so aglutinadas em presena do soro anti-globulina (soro de Coombs), que interage com os anticorpos, formando as pontes de ligao entre estes, promovendo a aglutinao. 2) Procedimento - Preparar uma suspenso de hemcias a 5%. - Tomar 3 tubos de hemlise e proceder como a seguir:

Reagentes Suspenso de hemcias 5% (teste) Suspenso de hemcias 5% (Rh+) Soro anti-D Albumina bovina 22%

Tubo 1 (teste) 1 gota 1 gota

Tubo 2 (controle positivo) 1 gota 1 gota -

Tubo 3 (controle negativo) 1 gota 1 gota

- Incubar o tubo 2 (controle positivo) em banho-maria 37C por 15 minutos. - Lavar o mesmo 3 vezes com soro fisiolgico (2.500rpm durante 2 minutos).

Reagentes Soro de Coombs

Tubo 1 (teste) 2 gotas

Tubo 2 (controle positivo) 2 gotas

Tubo 3 (controle negativo) 2 gotas

- Homogeneizar e centrifugar a 1.500rpm durante 2 minutos. - Fazer a leitura, agitando delicadamente para verificar se houve aglutinao.

3) Interpretao Coombs direto positivo .................... se houve aglutinao Coombs direto negativo .................... se no houve aglutinao

8 AULA PRTICA 04: Eletroforese de Hemoglobinas pH 8,6

1) Fundamento A eletroforese um processo analtico de separao de misturas, cujo principal agente o campo eltrico. A eletroforese de hemoglobinas baseia-se no fato de que a molcula de hemoglobina tem carga negativa em meio alcalino, migrando no sistema eletrofortico para o polo positivo. 2) Procedimento - Encher cada compartimento da cuba de eletroforese com quantidades iguais de tampo trisglicina ou tampo tris-EDTA-borato. - Mergulhar a fita de acetato de celulose no tampo durante 15 minutos. - Retirar o excesso de tampo enxugando a fita de acetato de celulose entre 2 folhas de papel de filtro. - Adaptar a fita sobre a ponte na cuba de eletroforese, fazendo as conexes entre a fita e o tampo. - Aplicar a amostra (hemolisado) a 2,0 cm do polo negativo. Aguardar 5 minutos para absoro da amostra. - Tampar a cuba. Ligar o aparelho durante 30 minutos. - Ao fim da corrida eletrofortica, retirar a fita e cor-la durante 5 minutos, empregando uma soluo de Ponceau S ou Negro de Amido. - Aps colorao, descorar a fita com vrios banhos de soluo de cido actico a 5%.

3) Interpretao

9 AULA PRTICA 04: Teste de Falcizao

1) Fundamento As hemcias que contm hemoglobina S (HbS) adquirem a configurao peculiar de foice, em presena de um agente redutor (metabissulfito de sdio). As hemcias normais no falcizam nestas condies. A falcizao se explica pela polimerizao da desoxihemoglobina S. 2) Procedimento - Colocar uma gota de sangue total, colhido em anticoagulante EDTA, sobre uma lmina. - Adicionar sobre a gota de sangue 2 gotas de uma soluo de metabissulfito de sdio a 2%. - Homogeneizar. - Cobrir a preparao com uma lamnula, vedando-a com esmalte comum. Esta vedao visa impedir a entrada de oxignio e formao de bolhas de ar. - Incubar a preparao em estufa a 37C durante 1 hora. - Examinar ao microscpio com aumento de 400x, procurando hemcias em forma de foice. 3) Resultado Expresso como positivo ou negativo, conforme a presena ou a ausncia de drepancitos, respectivamente. 5) Interpretao Quando o teste positivo indica que o paciente portador de hemoglobina S (HbS), podendo ser homozigoto (SS) ou heterozigoto (AS, SD, SC, S- tal).

10 AULA PRTICA 05: Prova Cruzada pr-transfusional

1) Fundamento Consiste na pesquisa de incompatibilidade entre receptor e doador, mediante a mistura dos dois sangues. Se ocorrer reao antgeno-anticorpo (incompatibilidade), esta poder ser visualizada atravs da aglutinao ou hemlise. 2) Procedimento - Centrifugar as amostras de sangue do doador e receptor. - Tomar 4 tubos de hemlise e numer-los de 1 a 4. - Nos tubos 1 e 3 colocar 2 gotas do plasma do receptor e uma gota de hemcias do doador. - Nos tubos 2 e 4 colocar 2 gotas de plasma do doador e uma gota de hemcias do receptor. - Aos tubos 1 e 2 acrescentar duas gotas de albumina bovina 22%. - Aos tubos 3 e 4 acrescentar duas gotas de soro fisiolgico. - Colocar os tubos 1 e 2 em banho-maria a 37C durante 40 minutos a 1 hora. Os tubos 3 e 4 sero deixados a temperatura ambiente, durante o mesmo perodo. - Aps incubao, ler os quatro tubos, observando se houve aglutinao e/ou hemlise. - Se no houver aglutinao, nem hemlise, realizar o teste de Coombs nos tubos 1 e 2. - Em caso de transfuses hetero-grupo, o plasma do doador dever ser diludo 1/100 (1 gota de plasma em 5 mL de soro fisiolgico) e os tubos 2 e 4 recebero plasma diludo. 3) Interpretao No poder ocorrer hemlise ou aglutinao em nenhum dos tubos. O teste de Coombs tambm dever apresentar resultado negativo. Caso contrrio, a transfuso no poder ser realizada.

11 AULA PRTICA 06: Hemossedimentao

1) Fundamento Consiste na medida da velocidade de sedimentao espontnea das hemcias, a qual est relacionada com a agregao destas clulas em grumos. 2) Procedimento Preencher a pipeta de Westergreen at a marca zero e adapta-la ao suporte de Westergreen. Aguardar 60 minutos exatos e fazer a leitura do volume de plasma que foi liberado. 3) Resultados Expresso em mm/ 60 minutos 4) Valores de Referncia Homens at 15 mm Mulheres at 20 mm 5) Interpretao Sabe-se que as hemcias possuem em sua superfcie carga eltrica negativa, no permitindo que estas clulas formem grumos. A presena de macromolculas proticas neutraliza parte dessas cargas negativas, favorecendo a aproximao e sedimentao das hemcias. Valores elevados de hemossedimentao: Aumento das alfa-2-globulinas (ppte haptoglobina) encontrada nos processos inflamtrios agudos. Aumento das gama-globulinas, geralmente devido elevao de imunoglobulinas policlonais. Aumento de fibrinognio, devido a um estado inflamatrio ou nos distrbios da coagulao.

Em geral os processos inflamatrios e/ou infeciosos cursam com elevao discreta ou acentuada da velocidade de hemossedimentao (VHS).

12 AULA PRTICA 07: Tempo de Sangria (TS)

1) Fundamento O tempo de sangria mede o tempo necessrio para ocorrer o estancamento da hemorragia provocada por uma pequena inciso, realizada na ponta do dedo ou lobo da orelha. O tempo de sangria depende do nmero e atividade funcional das plaquetas, da possibilidade de lquidos tissulares em acelerar ou retardar a formao de cogulos, bem como da elasticidade da pele e pequenos vasos capilares que irrigam o local da inciso. 2) Procedimento Limpar a ponta do dedo ou lobo da orelha com um algodo embebido em lcool e esperar secar. Fazer a inciso com uma lanceta apropriada e estril. Disparar o cronmetro to logo seja feito o ferimento. Limpar o excesso de sangue a cada 15 segundos com papel de filtro, sem coloc-lo em contato direto com a ferida. Parar o cronmetro logo que o sangramento cessar. Anotar o tempo. Se o tempo for maior que 6 minutos, interromper o sangramento pressionando o local da leso. 3) Valor de Referncia

Normal 1 a 3 minutos

4) Interpretao

O tempo de sangria prolongado nas deficincias quantitativas (plaquetopenia) e qualitativas das plaquetas (doena de Glanzman e doena de von Willebrand). Em pacientes com disfuno plaquetria adquirida ou congnita, o sangramento pode ser prolongado devido incapacidade das plaquetas formarem agregados. A ingesto exagerada de aspirina pode levar disfuno plaquetria.

13 AULA PRTICA 07: Tempo de Coagulao (TC)

1) Fundamento O tempo de coagulao mede o tempo necessrio para uma amostra de sangue coagular fora do espao vascular, a 37C. 2) Procedimento Colher aproximadamente 5 mL de sangue por puno venosa. Acionar o cronmetro, assim que o sangue aparecer na seringa. Transferir o sangue para 3 tubos de ensaio, colocando cerca de 1,0 mL em cada tubo. Colocar os tubos em banho-maria a 37C. Aps 5 minutos examinar um dos tubos, inclinado-o para observar se j houve coagulao da amostra. Este procedimento deve ser repetido de 30 em 30 segundos at que o sangue coagule. Aps coagulao do 1 tubo, marcar o tempo e fazer o mesmo procedimento para os outros 2 tubos, examinando a coagulao de 30 em 30 segundos. Marcar os tempos de coagulao e fazer uma mdia com os trs tubos. 3) Expresso do Resultado

Ex: 1 tubo 630 2 tubo 7 3 tubo 730 Tempo de coagulao (mdia) = 7

4) Valor de Referncia 5 a 11 minutos 5) Interpretao Este teste auxilia a avaliao da coagulao pela via intrnseca, a partir da ativao do fator XII, at a formao do cogulo de fibrina. O teste no especfico e pouco sensvel, podendo apresentar resultados normais mesmo com a presena de coagulopatias. O tempo de coagulao apresenta-se prolongado nas deficincias dos fatores que participam da via intrnseca da coagulao, nas sndromes por anticoagulantes e nos estados de desfribrinao.

14 AULA PRTICA 08: Tempo de Protrombina (PT)

1) Fundamento O tempo de Protrombina uma prova global para avaliao da coagulao extrnseca. Este ensaio baseia-se na medida do tempo que um plasma calcificado demora para coagular, colocado a 37C e na presena de um excesso de tromboplastina tissular e clcio. 2) Procedimento Colocar o plasma em banho-maria a 37C durante 2 a 3 minutos. Em um tubo de hemlise colocar 0,2 mL de Soluplastin reconstitudo e pr-incubar a 37C durante 2 a 3 minutos. Pipetar 0,1 mL do plasma e adicionar rapidamente ao tubo contendo 0,2 mL de Soluplastin, disparando simultaneamente o cronmetro. Manter o tubo dentro do banho. Antes do tempo de coagulao estimado, retirar o tubo do banho e inclinar suavemente 1 ou 2 vezes por segundo. Parar o cronmetro no momento exato da apario do cogulo. 3) Clculos RNI Relao Normatizada Internacional Para seu clculo, utilizar a tabela de valores prpria do Kit reagente. 4) Valores de Referncia O intervalo de valores obtido em pacientes normais varia de 10 a 14 segundos, com atividade de Protrombina entre 70 e 100%. 5) Interpretao Sua determinao se aplica a estudos de rotina nas anlises pr-cirrgicas, deteco de alteraes nos nveis de um ou mais fatores envolvidos na via extrnseca da coagulao e controle da teraputica com anticoagulantes. Valores elevados de PT podem ocorrer nas deficincias congnitas ou adquiridas dos fatores de coagulao pertencentes via extrnseca

15 AULA PRTICA 08: Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (PTTa)

1) Fundamento Este ensaio baseia-se na medida do tempo que um plasma descalcificado demora para coagular, colocado a 37C e na presena de um excesso de cefalina, ativador e clcio. 2) Procedimento Pr-aquecer o cloreto de clcio a 37C. Em um tubo de hemlise colocar: 0,1 mL de plasma (amostra teste). 0,1 mL de Reagente (Ativador e cefalina). Misturar e incubar durante 3 minutos, a 37C. Logo aps esse tempo, adicionar 0,1 mL de Cloreto de Clcio, mantendo a amostra no banhomaria. Disparar simultaneamente o cronmetro. Aguardar cerca de 25 segundos, retirar o tubo do banho, inclinar suavemente uma ou duas vezes por segundo. Parar o cronmetro no momento exato da apario do cogulo. 3) Valores de Referncia O intervalo de valores obtido em pacientes normais varia de 30 a 43 segundos. 4) Interpretao Sua determinao se aplica a estudos de rotina nas anlises pr-cirrgicas, deteco de alteraes nos nveis de um ou mais fatores envolvidos na via intrnseca da coagulao e controle da teraputica com anticoagulantes. Valores elevados de PTT podem ocorrer nas deficincias congnitas ou adquiridas dos fatores de coagulao pertencentes via intrnseca.

REFERNCIAS CARVALHO, M. G.; SILVA, M. B. S. Hematologia Tcnicas laboratoriais e Interpretao. Belo Horizonte, 1988. Manual de Exames do Laboratrio Clnico. LORENZI, T.F. Manual de Hematologia Propedutica e clnica. Rio de Janeiro: Medsi, 2003. 655 p. ZAGO, M. A. et al. Hematologia Fundamentos e Prtica. So Paulo: Atheneu, 2001. 1081p.