CITOCROMO P450 1.

- ASPECTOS BIOQUMICOS(1A) Desde un punto de vista bioqumico, la superfamilia del citocromo P450 se caracteriza por ser hemoprotenas capaces de transportar electrones28. Al ser hemoprotenas, poseen una parte proteica (apoprotena) y un grupo hemo (grupo prosttico) donde se localiza un tomo de hierro. El citocromo P450 funciona como una monooxigenasa, es decir, cataliza reacciones en las que solamente se incorpora uno de los tomos del oxgeno y el otro se reduce a H2O. Adems, precisa de dos sustratos para actuar como reductores de los dos tomos de la molcula de O2. El principal acepta uno de los oxgenos y un cosustrato proporciona tomos de H para reducir el otro a H2O28. Gracias a su intervencin se produce una hidroxilacin del sustrato que tiene como consecuencia la formacin de productos ms solubles en agua y generalmente de derivados farmacolgicos menos potentes que pueden ser excretados directamente o despus de una conjugacin con el cido glucurnico o el glutation entre otros. De esta forma, entre las funciones que ejerce el citocromo P450, y teniendo en cuenta que tambin puede ser mediador de la activacin de precarcingenos, cabe destacar como importante el papel detoxificador que realiza gracias al cual se facilita la eliminacin de muchas drogas y sustancias perjudiciales para el organismo. El mecanismo de accin consistente en la hidroxilacin de un sustrato orgnico RH (sustrato principal) a R-OH a expensas de un tomo de una molcula de oxgeno. El otro tomo es reducido a H2O por los equivalentes de reduccin proporcionados por el NADH o NADPH (cosustrato), habitualmente transferidos al P450 directamente o va citocromo b5, gracias a una flavoprotena oxidoreductasa.

2.-CARACTERSTICAS GENERALES DEL CITOCROMO P450 (1B) El sistema de monooxigenasas es un complejo multienzimtico cuya oxidasa final es una hemoprotena denominada citocromo P450 (CYP). Este sistema se encuentra presente en diferentes tejidos como el rin, pulmn, piel, intestino, corteza adrenal, testculos, placenta y otros, pero es particularmente activo en el hgado. Adems de participar en el metabolismo de sustratos de naturaleza exgena como drogas, pesticidas, procarcingenos, anestsicos, solventes orgnicos, entre muchos otros, el CYP participa en el metabolismo de sustratos endgenos de importancia biolgica como colesterol, cidos biliares, hormonas esteroidales y cidos grasos. En los mamferos, el CYP se encuentra presente en la mitocondria y en diversos tipos de membranas celulares, siendo particularmente abundante en el retculo endoplsmico liso (microsomas). La denominacin citocromo P450 proviene de la caracterstica de que esta hemoprotena en su forma reducida y unida a monxido de carbono, presenta un mximo de absorbancia a los 450 nm.

Las diversas especies de enzimas CYP se caracterizan por ser fcilmente inducibles inclusive por las mismas drogas a ser biotransformadas, lo que tiene consecuencias clnicas puesto que aproximadamente 50% de los frmacos que consume el hombre son metabolizados por estas enzimas. Adems, su expresin y actividad son influenciadas por diversos factores como la edad, sexo, dieta, especie, tejido y estado hormonal y, a diferencia de las enzimas clsicas, presentan especificidad superpuesta para algunos sustratos. La mayora de los CYP estn formados por 400-500 aminocidos de los cuales cerca de 55% son de naturaleza apolar; la mitad heme es protoporfirina IX y el ligando axial para el hierro es un residuo cistena ubicado cerca del extremo carboxi-terminal de la protena. Numerosos agentes que reaccionan con los grupos sulfidrilos o que rompen interacciones hidrofbicas, convierten al CYP a una forma inactiva llamada P420. 3.- ACTIVIDAD CATALTICA (1C) El CYP cataliza la biotransformacin de un sinnmero de xenobiticos, proceso que se realiza principalmente en el hgado, pero en ste y otros rganos participan adems en el metabolismo de una serie de compuestos de naturaleza endgena. La gran gama de reacciones qumicas catalizada y la amplia especificidad de sustrato caracterstico de estas enzimas, hacen del CYP uno de los catalizadores ms verstiles conocidos. Aunque la principal funcin del CYP es participar en reacciones de detoxificacin transformando un compuesto farmacolgicamente activo en inactivo excretado por la orina, tambin participa en procesos de activacin metablica, de manera que compuestos inertes y poco reactivos son convertidos en otros de gran reactividad qumica que son txicos para el organismo. Por ejemplo, el acetaminofn es metabolizado por el CYP2E1 a N-acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI), un compuesto muy hepatotxico.

El CYP cataliza una amplia variedad de reacciones, incluyendo epoxidaciones, Ndeaquilaciones, O-deaquilaciones, S-oxidaciones e hidroxilaxiones de sustratos aromticos y alifticos y, dependiendo de la disponibilidad de oxgeno en el tejido, reacciones de reduccin. La mayora de las reacciones catalizadas requieren de un paso inicial, que involucra la insercin de un grupo hidroxilo en el sustrato para formar un intermediario hidroxilado el cual puede, dependiendo de la naturaleza del sustrato y la estabilidad del intermediario, sufrir posteriores reacciones de dealquilacin, deaminacin, etc. La reaccin general catalizada por el CYP es la siguiente: RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP+ + H2O El CYP tiene requerimiento absoluto de NADPH y oxgeno molecular para la catlisis de la monooxigenacin. Los electrones necesarios para activar al oxgeno pasan del NADPH al CYP a travs de la accin de la enzima NADPH-citocromo P450 reductasa, la que junto con el CYP, estn insertas en la membrana. 4.- MECANISMOS DE ACCIN DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR EL CYP (1D) El mecanismo de accin es complejo y an no est bien esclarecido debido a la baja vida media de sus intermediarios. Existen evidencias de que en el proceso se generaran especies reactivas de oxgeno como el anin superxido (O2-) y perxido de hidrgeno (H2O2), adems del radical libre sustrato (R) el que al unirse a un radical hidroxilo, generara finalmente el producto hidroxilado (ROH). La descomposicin del CYP oxigenado es descrita como una de las mayores fuentes de radicales superxido de los sistemas biolgicos y su produccin depende de la isoforma del CYP, la naturaleza del sustrato unido (si lo hay) y de la eficiencia en la entrada del segundo electrn (etapa 4).

Figura 2. Traspaso de electrones desde el NADPH al citocromo P450, catalizado por la enzima de membrana NADPH citocromo P450 reductasa.

Figura 3. Mecanismo de accin del citocromo P450. Este esquema es una simplificacin del mecanismo de accin del citocromo P450 (CYP) propuesto por Coon7. En l, el Fe3+ representa al hierro del grupo heme del CYP oxidado, RH y ROH a los sustratos y productos respectivamente. En este ciclo de xido-reduccin se liberan anin superxido (O2-) y perxido de hidrgeno (H2O2).

5.- ENZIMAS CYP EN EL SER HUMANO (1D) Aproximadamente la mitad de las 53 enzimas CYP humanas actualmente conocidas, pertenecen a las familias 1, 2 y 3 y son las responsables de la biotransformacin de la mayora de los xenobiticos. Existen otras enzimas CYP que metabolizan sustratos endgenos y que cumplen importantes funciones fisiolgicas en el organismo, por ejemplo, las enzimas de la subfamilia 4A (CYP4A9 y 4A11 seran las detectadas en el hombre) estn presentes en gran cantidad en el hgado humano y se caracterizan por participar en el metabolismo de cidos grasos como el araquidnico. Otros CYPs presentes en hgado humano son los pertenecientes a las subfamilias 4B y 4F, 11A y 11B y a las familias 17, 19, 21 y 27. Las diversas isoenzimas del CYP son fcilmente inducibles, lo que posee implicaciones clnicas importantes, puesto que constituye un mecanismo bioqumico de interaccin farmacolgica. Los inductores ms utilizados en los roedores, son el fenobarbital, 3metilcolantreno y beta-naftoflavona, en cambio en humanos, la rifampicina y el fenobarbital son algunos de los inductores ms potentes15. En el aumento de la expresin de los diversos tipos de CYPs, estn involucrados un incremento de la transcripcin gnica o mecanismos postranscripcionales como la estabilizacin del RNA. Especial mencin merece el CYP2E1, que es una de las enzimas CYP ms estudiadas tanto en animales como en humanos, debido a su papel en el metabolismo del etanol y por su participacin en la activacin metablica de una serie de procarcingenos, como N-dimetil nitrosamina y de solventes orgnicos como el tetracloruro de carbono y el benceno. El contenido heptico de CYP2E1 es alrededor de 7% del CYP total y tambin se encuentra presente en el cerebro y pulmn. La mayora de sus 70 sustratos demostrados son molculas pequeas e hidrofbicas, incluyendo slo algunos pocos productos farmacuticos como paracetamol, clorzoxazona, enflurano y halotano. El disulfiram es el inhibidor del CYP2E1 usado en clnica y muchos de sus sustratos son adems sus inductores, tal como acetona, etanol, piridina, pirazol e isoniazida. El CYP2E1 adems metaboliza acetominofn, formando N-acetil-p-benzoquinoneimina (NAPQI), metabolito hepatotxico el que en condiciones normales se elimina conjugado con glutatin. En una

situacin de sobredosis de acetominofn o frente a una ingesta aumentada de etanol (fuerte inductor de CYP2E1) se puede producir hepatotoxicidad. Adems de activar procarcingenos, el CYP2E1 es importante en patologa puesto que se ha descrito como una de las enzimas que produce mayor cantidad de especies reactivas de oxgeno (anin superxido y H2O2), las que son formadas en presencia o en ausencia de sustrato y que seran los que posteriormente causaran dao tisular. Los diversos individuos responden en distinta forma a la accin de ciertas drogas, lo que se debera a un diferente contenido de cada isoforma CYP. Una de las causas de esta variacin sera la existencia de un polimorfismo gentico, lo que produce variantes genticas que difieren en su actividad para biotransformar xenobiticos. Se conocen alrededor de 50 enzimas de biotransformacin polimrficas que varan entre individuos y en diferentes etnias. El polimorfismo ms estudiado es el del CYP2D6, el que divide a la poblacin en metabolizadores rpidos y lentos de la droga debrisoquina. Actualmente se sabe que ms de 50 drogas, incluyendo antidepresivos, antipsicticos y drogas cardiovasculares, son metabolizadas primariamente por el CYP2D6. 6.- FACTORES MODULADORES DE LA ACTIVIDAD DE LOS CITOCROMOS P450(1E) El patrn de citocromos P450 de un individuo se encuentra regulado no slo a nivel gentico, sino que tambin est modulado por otros factores: Edad: Parece ser que existen diferencias en la actividad del citocromo P450 dependiendo de la edad del individuo, si bien los estudios realizados entre poblaciones de diferentes edades no han aportado resultados significativos. Sexo: En primates no humanos y roedores se han observado variaciones ligadas al sexo, pero es sobre todo en ratas donde se han encontrado citocromos P450 que solo aparecen en ratas macho y otros que solo aparecen en ratas hembras. El origen de estas diferencias parece ser la existencia de un control hormonal sexo-dependiente de la expresin de los P450. Fisiologa: Diferentes estados fisiolgicos como el embarazo o el ayuno, alteraciones fisiopatolgicos que afectan a la homeostasis general del organismo, entre los que se

incluyen desequilibrios hormonales, procesos inflamatorios, obesidad, neoplasias, etc. o enfermedades hepticas, tales como esteatosis, cirrosis o tumores hepticos modifican la expresin del citocromo P450 y su capacidad funcional. Dieta: La influencia de la dieta y del estado nutricional del individuo ha sido ampliamente estudiada. La expresin del citocromo P450 puede modularse por cambios en los niveles de macro o micronutrientes, por el ayuno y la reduccin en la ingesta calrica, o por la presencia en los alimentos de otros componentes que no pueden considerarse como nutrientes y que pueden producir induccin o inhibicin de los citocromos P450. Entre estos ltimos se pueden incluir aditivos alimentarios (conservantes, estabilizantes, colorantes, antioxidantes, etc.), compuestos indlicos presentes en ciertos vegetales, la cafena, flavonoides naturales de ciertos vegetales, terpenoides y una larga lista de compuestos a la que habra que aadir los productos que se generan como consecuencia de la preparacin de los alimentos a elevadas temperaturas. Mencin especial merecen los efectos inductores producidos por el alcohol y ciertos componentes del humo del tabaco. Xenobiticos: La ingesta, inhalacin o contacto de otros xenobiticos tales como contaminantes ambientales, pesticidas, cosmticos, productos txicos o los propios frmacos provocan posibles efectos inductores e inhibidores en los citocromos P450.

6.- INHIBICIN ENZIMTICA (1E) Tmese un frmaco A que es metabolizado por una enzima del citocromo P450. Por otra parte, un frmaco B que al actuar sobre dicha enzima la inhibe, es decir, que disminuye su actividad. En este caso lo que ocurrir es que el frmaco A mantendr durante ms tiempo niveles elevados en plasma ya que su inactivacin es ms lenta. En consecuencia, la inhibicin enzimtica trae consigo un aumento del efecto del frmaco. Esta situacin puede dar lugar a una amplia serie de reacciones adversas. En ocasiones puede darse una situacin paradjica y es que la inhibicin enzimtica conlleve una disminucin del efecto del frmaco: Tngase un frmaco A que al ser metabolizado da lugar a un producto A2, el cual es el que realmente ejerce el efecto del frmaco. Si se inhibe la metabolizacin mediante un frmaco B, disminuimos la cantidad de A2 circulante y por tanto se disminuye el efecto final del frmaco. Un gran nmero de sustancias extraas a nuestro organismo (xenobiticos) penetran por la piel, sangre o pulmones y pueden ocasionar trastornos inmediatos o a largo plazo, lo que se evita gracias a que poseemos sistemas enzimticos que llevan a cabo su biotransformacin. La biotransformacin de xenobiticos se realiza bsicamente en 2 fases: Fase I, catalizada principalmente por el sistema de monooxigenasas dependiente del citocromo P450. Fase II, en la que participan una serie de transferasas que catalizan reacciones de conjugacin de los xenobiticos con diversas molculas de naturaleza endgena como cido glucornico, sulfatos, acetato, el tripptido glutatin o algunos aminocidos. El objetivo final de ambas fases es aumentar la solubilidad en agua de los compuestos y as facilitar su excrecin del organismo a travs de la orina o la bilis1.

Existen antecedentes que indican que la actividad y expresin de las enzimas que participan en la biotransformacin de xenobiticos estn alteradas en distintas patologas, ya sea producto de la enfermedad, o de su tratamiento.

CONCLUSIONES Los miembros individuales de la superfamilia de enzimas CYP biotransforman un sinnmero de sustratos que han sido extensamente estudiados en animales de experimentacin, principalmente por su rol en el metabolismo heptico de diversas drogas. Sin embargo, existen escasos estudios en humanos, a pesar de que su expresin y actividad est alterada en una serie de patologas, lo que afectara la biotransformacin de drogas y en consecuencia, el tratamiento farmacolgico en estos individuos. Esta dificultad se debera a que la expresin y actividad del CYP es modulada por una serie de factores como sexo, dieta, edad, estado hormonal y tratamiento con drogas. Adems, existe poco conocimiento sobre los sustratos y sondas especficos para cada especie de CYP que pueden ser usados en estudios in vivo. En el futuro, ser importante avanzar en el conocimiento de los factores fisiolgicos, celulares, moleculares y sanguneos responsables en la regulacin del CYP en las diversas patologas humanas y su importancia en el desarrollo de nuevos tratamientos y enfoques teraputicos.

OTRAS OXIGENACIONES MEDIADAS POR HEMOPROTENAS Y FLAVOPROTENAS Anteriormente habamos descrito al citocromo P450 al cual se le ha comprobado que constituye una importante herramienta de investigacin para proporcionar informacin estructural bsica sobre la protena citocromo P450 en humanos, por la cual se sabe que el organismo puede sintetizar otras protenas que funcionan como anlogos de ella como son las protenas Oxido ntrico sintasas (NOS), que han recibido la atencin de la ltima dcada, ya que las protenas oxido ntricos sintasas han sido las primeras en las que se han identificado las protenas con grupos prostticos FAD, FMN, hemo, en una misma cadena polipetdica. Estas protenas tienen importante participacin en diversos eventos fisiolgicos. Tres tipos importantes de xido ntricos son importantes desde el punto de vista teraputico. Su uso est referido desde 1867 cuando Sir Thomas Lauder trataba a sus paciente de angina de pecho con el xido ntrico, esto sin saber en si que este compuesto era el agente activo de la vasodilatacin que se liberaba al endotelio vascular. Esto dio inicio a la bsqueda de la fuente enzimtica de NO, y esto se descubri al grupo guanidino, a partir del aminocido natural L-arginina que se convertira en L-citrulina con la ayuda del NADPH. Se han identificado tres genes que codifican las isoformas del NOS. Las respectivas enzimas se han designado neuronal (NOS-I) de macrfago inducido (NOS-II) o endotelia (NOS-III). Cualquier tejido o clula puede contener ms de una isoforma de xido ntrico sintasa, contribuyendo as a la produccin de NO en diversas condiciones fisiolgicas. Los estudios realizados con el oxido ntrico sintasa de los macrfagos llevaron a la conclusin de que despus de tratar a los animales con citoquinas o lipopolisacridos el aumento del NO se deba a esta forma, entonces de ello decimos que es la primera fuente de NO. Luego se vi que la L-arginina era la principal fuente de NO en clulas endoteliales y nerviosas. La produccin de NO era necesaria para el mantenimiento de: Tono vascular. Agregacin plaquetaria.

Transmisin nerviosa. Citotoxicidad bacteriana o tumoral.

ESTRUCTURA DE LAS OXIDOS NTRICOS REDUCTASAS: La reaccin representa una monoxigenacin, y su mecanismo es similar al catalizado por la citocromo P450. Los tomos de oxigeno se incorporan a la L-citrulina y al NO provienen del oxgeno atmosfrico. Inicialmente se pens que la oxigenacin se daba por mediacin de la tetrahidrobiopterina (H4B) cofactor necesario para la reaccin global anloga a al reaccin de la fenilalanina hidroxilasa. El descubrimiento de que el grupo hemo es un grupo prosttico funcional asociado a tres isoformas del NOS, ha hecho que los estudios posteriores se incluyan las interacciones entre los dominio de flavoprotena y hemoprotena de estas enzimas. Estas complejas protenas han entenderse ahora desde el punto de vista del papel de las flavinas, el hemo y la H4B que estn bajo el control del Ca+2//calmodulina en el caso de las isoformas NOS-I y endotelial NOS-III. En el siguiente esquema se puede revisar la estructura global de la isoforma

Se cree que el flujo de electrones se puede dar de forma anloga a la de los sistemas electrnico en los que intervienen el citocromo P450. El donador de electrones es el NADPH, que cede electrones al FAD, el cual a su vez reduce el FMN. El FMN reduce el

grupo prosttico ferrohemo a su forma ferrosa, a la cual se puede unir ahora el oxgeno para oxigenar el sustrato, la L-arginina. La reaccin global, se puede inhibir por el monxido de carbono, y la actividad enzimtica es completamente dependiente de la unin a la calmodulina, por lo cual requiere elevada cantidad del Calcio molecular en el medio para las isoformas neural y endotelial. La calmodulina cumple una funcin de control en el flujo electrnico entre los grupos prostticos de la flavina, y su salida, FMN, y el grupo prosttico hemo del mdulo oxigenasa. Como este sistema es anlogo al de la citocromo P450, puede existir una prdida en el flujo de electrones hacia el O2 molecular para formar el anin superxido, reducido con un electrn en condiciones en las que no se da el traspaso de electrones al grupo hemo. Esto puede tener lugar en ausencia de H4B, en el caso de la xido ntrico sintasa endotelial. La adicin del complejo calcio-calmodulina, a las isoformas de xido ntrico sintasa en ausencia de L-arginina y/o H4B aumenta el flujo electrnico, el cual se disipa en forma de produccin de anin superxido. Esto tiene una aplicacin clnica en cuadros como la formacin del anin superxido en la lesin isquemia/reperfusin en circunstancias en las que se ha eliminado oxgeno de los tejidos y luego hay un ingreso de sangre rica en oxgeno. Este tipo de lesin se da comnmente en la trombosis cerebral y en tejidos listos para transplante.

CICLO DE KREBS

El ciclo de Krebs (de los acidos tricarboxilicos o del cido citrico) es una va metablica presente en todas las clulas aerobias, es decir, las que utilizan oxigeno como aceptor final de electrones en la respiracin celular. En los organismos aerobios las rutas metablicas responsables de la degradacin de los glcidos, cidos grasos y aminocidos convergen en el ciclo de Krebs, que a su vez aporta poder reductor a la cadena respiratoria y libera CO2C1.

Figura 1. Visin panormica de la convergencia de las vas catablicas de glcidos, aminocidos y cidos grasos al ciclo de Krebs. Los hidrgenos presentes en esas molculas son los que abastecen a la cadena respiratoria desde el NAD o FAD, hasta combinarse con el oxgeno y formar agua. Los carbonos se eliminan como CO2.

El catabolismo oxidativo de glcidos, cidos grasos y aminocidos puede dividirse en tres etapas, de las cuales el ciclo de Krebs es la segunda. En la primera etapa, que incluye a las vas catablicas de cidos grasos y a la glucolisis se genera acetil-CoA (2C). Los aminocidos pueden dar indirectamente acetil CoA, o directamente intermediarios del ciclo de Krebs. En la tercera etapa el poder reductor aportado por el ciclo de Krebs es drenado hasta el oxgeno a travs de los transportadores de cadena respiratoria (NADH.H, FADH2, CoQ y citocromos) y parte de la energa liberada se emplea en la sntesis de ATP por fosforilacin oxidativa (figura 1).C1

El ciclo de Krebs es una ruta anfiblica: participa en procesos catablicos y anablicos. El ciclo proporciona a-cetoglutarato y oxalacetato para la sintesis de glutamato y aspartato respectivamente, entre otras molculas fundamentales para la clula.C1

El piruvato genera la principal molcula abastecedora del ciclo: la acetil coenzima A La reaccin de oxidacin - decarboxilacin del piruvato es el nexo entre la glucolisis y el ciclo de Krebs. Esta reaccin irreversible es catalizada por un complejo enzimtico (piruvato deshidrogenasa) localizado en la matriz mitocondrial de eucariotas, y en el citosol de procariotas (figura 2).C1

El piruvato pierde el grupo carboxilo como CO2, y los dos carbonos restantes unidos a la CoA conforman la acetil-CoA (figura 2). En la reaccin se reduce un NAD a NADH.H que a su vez cede los H a los otros transportadores de cadena respiratoria, con la consecuente formacin de 3 ATP.C1

Una vision panoramica del ciclo de Krebs La acetil-CoA generada por los diferentes catabolismos se condensa con el oxalacetato y genera citrato. A travs de 7 reacciones de oxidacin y descarboxilacin sucesivas (de la 2 a la 8, figura 3) se regenera oxalacetato, capaz de iniciar un nuevo ciclo.C1

 En cuatro reacciones del ciclo ocurren oxidacin de intermediarios y reduccin de coenzimas de cadena respiratoria: tres NAD y un FAD (figura 3). Esas molculas reducidas que integran la cadena respiratoria se reoxidan, y parte de la energa liberada se usa para fosforilar el ADP a ATP. En el ciclo propiamente dicho se produce una fosforilacin a nivel de sustrato que produce un GTP, que equivale energticamente a un ATP. El ciclo se puede resumir en la siguiente ecuacin: Acetil-CoA + 3NAD + FAD + GDP + Pi _ CoA-SH + 3 NADH.H + FADH2 + GTP + 2 CO2C1

Las reacciones del ciclo Reaccion 1: condensacin del oxalacetato con la acetil CoA La enzima citrato sintasa condensa a la acetil-CoA (2C) con el oxalacetato (4C) para dar una molcula de citrato (6C). Como consecuencia de esta condensacin se libera la coenzima A (HSCoA). La reaccin es fuertemente exergnica: es irreversible.C1

Reaccion 2: isomerizacin del citrato a isocitrato La isomerizacin del citrato en isocitrato ocurre por dos reacciones, que se resumen en una.C1

Reaccin 3: oxidacin y decarboxilacin del isocitrato El isocitrato es sustrato de la isocitrato deshidrogenasa, enzima que tiene como cofactor un NAD, que forma parte de la cadena respiratoria. En la reaccin 3 se resumen dos reacciones a partir de las cuales el isocitrato forma B-cetoglutarato (5C). Para lograr ese producto ocurre una decarboxilacin, es decir la liberacin de una molcula de CO2, y la reduccin de un NAD que permite la formacin de 3 ATP.C1

Reaccion 4: el --cetoglutarato se transforma en succinil-CoA Este paso implica la segunda decarboxilacin oxidativa, catalizada por la B-cetoglutarato deshidrogenasa, que lleva a la formacin de succinil-CoA (4C). El NAD es la coenzima de la deshidrogenasa, de manera que se formaran 3 ATP como consecuencia de la actividad de cadena respiratoria.C1

Reaccion 5: la succinil-CoA rinde succinato y GTP La succinil-CoA, es un tioester de alta energa con un DGF de hidrolisis de -33.5 KJ.mol-1 aproximadamente. La energa liberada por la ruptura de ese enlace se utiliza para generar un enlace fosfoanhidro entre un fosfato y un GDP para dar 1GTP por fosforilacin a nivel de sustrato. En la reaccin se libera HSCoA. El GTP se puede convertir en ATP segn la siguiente reaccin: GTP + ADP GDP + ATP DGF = 0 KJ.mol- 1C1

Reaccion 6: el succinato se transforma en fumarato El succinato es oxidado a fumarato por la succinado deshidrogenasa, enzima que tiene como cofactor al FAD: se producen 2ATP en la cadena respiratoria. La enzima usa FAD porque la energa asociada a la reaccin no es suficiente para reducir al NAD. El complejo enzimtico de la succinato deshidrogenasa es el nico del ciclo que est asociado a la membrana mitocondrial de eucariotas, y en la membrana plasmtica de procariotas.C1

Reaccion 7: el fumarato se hidrata y genera malato La fumarasa cataliza la adicin de agua, es decir la hidratacin del fumarato. El producto de la reaccin es el malato.C1

Reaccion 8: el malato se oxida a oxalacetato Dada la naturaleza cclica de la va, las reacciones en su conjunto conducen a la regeneracin del oxalacetato. La malato deshidrogenasa cataliza la oxidacin del malato a oxalacetato, con la reduccin de un NAD: se forman 3 ATP en la cadena respiratoria.C1

UTILIZACIN DEL ATP EN LA BIOSNTESIS DE MACROMOLCULAS: Podra decirse que el ATP es la moneda energtica del metabolismo. Es principalmente esta molcula la que intercambia la energa metablica en todos los organismos vivos.C2 La capacidad de almacenamiento energtico de esta molcula radica en su naturaleza qumica. Estructuralmente es un nucletido formado por adenina unida a un azcar de cinco carbonos (la ribosa) por el carbono nmero uno de esta ltima. El carbono cinco de la ribosa une un conjunto de tres fosfatos en cadena mediante enlaces fosfodister ricos en energa. Esto quiere decir que la ruptura de estos enlaces mediante hidrlisis libera gran cantidad de energa. A nivel energtico, se dice que la reaccin de hidrlisis de ATP es termodinmicamente favorable o exergnica. La energa liberada en esta reaccin puede ser aprovechada por las enzimas para realizar su funcin cataltica. C2

El ATP es la principal fuente de energa para la mayora de las funciones celulares, incluyendo la sntesis de macromolculas como el ADN, el ARN y las protenas, as como el transporte de macromolculas a travs de las membranas celulares (exo y endocitosis).C2

CICLO DEL ATP EN EL TRANSPORTE ACTIVO Y EN LA CONTRACCION MUSCULAR La adenosina de trifosfato (ATP) es uno de los compuestos de alta energa mas importantes, puesto que proporciona directamente energa a las reacciones que la requieren en todas las clulas del organismo. Este compuesto se produce en las clulas al utilizar los nutrientes que provienen de las plantas y animales. El ATP representa el almacen de energa del cuerpo. Por hidrolisis (catabolismo), el ATP se descompone hasta adenosina de difosfato (ADP), liberando energa directamente para diferentes funciones vitales del cuerpo, tales como la contraccin muscular, transporte activo, digestin, secrecin glandular, sntesis de compuestos qumicos, reparacin de tejidos, circulacin, transmisin nerviosa, entre otras.(d1) TRANSPORTE ACTIVO Una de las protenas transportadoras mejor estudiadas de las implicadas en el transporte activo es la Na+-K+-ATPasa. Esta molecula es la bomba de Na+-K+. La molecula se designa ATPasa porque adems de ser un transportador actua como una enzima. La Na+-K+-ATPasa capta energa unida al ATP en forma directa, dado que cataliza la hidrolisis del ATP con el fin de obtener la energa necesaria para el transporte activo de Na+-K+. El mecanismo mediante el cual la Na+-K+-ATPasa y otros transportadores que hidrolizan el ATP transforman la energa unida al ATP en energa impulsora de iones no se conoce con certeza. No obstante, es evidente que la funcin de todas estas protenas transportadoras depende en parte de un acoplamiento riguroso entre su conformacin molecular y la escisin del ATP; durante cada ciclo de bombeo la conformacin de la preoteina fluctua entre dos estados o mas, segn si tivo lugar la hidrolisis del ATP. Uno d elos mecanismos posibles mediante los cuales estas alteraciones conformacionales podran inducir el movimiento de iones es la modificacin de la afinidad por los iones de diversas subfracciones moleculares. Los investigadores aislaron la Na+-K+-ATPasa y estudiaron con detalle su estructura y su funcin. El modelo de ciclo de bombeo desarrollado a continuacin describe el

funcionamiento del transportador segn lo conciben algunos grupos de investigadores comenzando en la parte superior de la figura, tres iones de Na+ se fijan a sitios de union de alta afinidad por el Na+ presentes en la fraccin intracelular de la protena transportadora. Luego, la protena hidroliza el ATP con la finalidad de adquirir un grupo fosfato en un sitio intracelular especifico. La fosforilacion induce alteraciones conformacionales que modifican la afinidad por el Na+ de distintos sitios de unin para el Na+ de la molecula. En estos sitios intracelulares la afinidad por el Na+ disminuye, mientras que en sitios ubicados en otras fracciones de la molecula la afinidad por el Na+ aumenta. Estas alteraciones atraen iones de Na+ hacia la parte mas profunda de la molecula. Los resultados de algunos estudios recientes muestran que durante su transporte, los iones de Na+ se ocluyen transitoriamente en el interior del transportador, lo que significa que es imposible acceder a ellos desde los medios extracelular o intracelular. La alteracin de la conformacin inducida por la fosforilacion en ultima instancia determina que los iones de Na+ se desplacen a travs de las clulas para llegar al liquido extracelular. En el momento en que la protena transportadora experimenta las alteraciones que determinan el transporte de Na+ hacia el exterior de la celula, los sitios de unin para el K+ localizados del lado extracelular de la molecula transportadora adquieren simultneamente una alta afinidad por el K+. Despus de fijar dos iones de K+ el transportador experimenta un proceso de desfosforilacion, lo que a su vez determina una alteracin conformacional nueva. En este caso la afinidad por el K+ disminuye en los sitios d eunion externos y aumenta en los sitios d eunion localizados en el interior de la molecula. Este fenmeno determina que los iones K+ sean atrados hacia la profundidad de la molecula, donde tambin experimentan un proceso de oclusin transitoria hasta que terminan por liberarse en el liquido intracelular.(d2)

CONTRACCIN MUSCULAR Los musculos no pueden extraer directamente la energa til para su contraccin a partir de los alimentos. Nosotros disponemos de un intermediario entre la energa liberada por los alimentos y la energa necesaria para la contraccin muscular. Este intermediario es un compuesto fosforado: el ATP, o adenosintrifosfato, cuya rotura libera la energa que la celula muscular puede utilizar directamente para contraerse. Por lo tanto, el ATP es un verdadero intermediario energtico entre los musculos y los nutrientes. Es indispensable para el organismo, puesto que una celula sin ATP muere rpidamente. La estructura del ATP consta de tres partes principales: 1) adenina, 2) ribosa, 3) fosfatos enlazados. El ATP se forma a partir de la combinacion del ADP con un fosfato inorgnico (Pi), es decir, aportado por la alimentacin. Esta asociacin requiere una gran energa ( 7 kcal por cada molcula de ATP sintetizada a partir del ADP y del Pi). Una parte de esta energa se almacena en los enlaces qumicos entre el ADP y el Pi. Por eso, estos ltimos se califican de enlaces de alta energa. Cuando la enzima ATPasa rompe este enlace, la energa (las 7 kcal que haban permitido formar el ATP) se libera. Esta enegia podr contribuir a realizar un ejercicio breve, como un simple salto vertical. Pero el ATP sirve, sobre todo, como intermediario, como moneda de intercambio energtico, entre los nutrientes y el musculo. Una vez sintetizado, el ATP permitir disponer inmediatamente de energa para la contraccin muscular; dichos depsitos raramente disminuyen gracias a la movilizacin de otros compuestos fosforados, molculas que permiten volver a sintetizar rpidamente ATP. Se realiza un verdadero ciclo del ATP, que puede resumirse mediante la siguiente reaccion: ATP ADP + Pi + energa ATPasa Cmo se alimenta esta sntesis de ATP para proseguir el ejercicio? Ello depender de su velocidad (potencia), de su duracin (que se relaciona con la intensidad, tal como vimos en los modelos precedentes) y de su modalidad de aplicacin y continua o discontinua, al igual que en los deportes colectivos y los entrenamientos llamados fraccionados, practicados

por los deportitas que preparan pruebas continuas e intensas, como en el caso de un corredor de 1.500m. Vamos a describir el catabolismo que utiliza los nutrientes para suministrar a las fibras musculares del compuesto fosforado, el adenosintrifosfato, que aportara la energa necesaria para la contraccin muscular; veremos que el ATP se sintetiza continuamente (anabolismo). Esta es una forma esencial de almacenamiento d ela celula. Los nurtientes debido a que se trasnforman en ATP, son los carburantes necesarios para el ejercicio. De manera que gracias a los alimentos y al ATP, la energa puede almacenarse en forma qumica en el organismo antes de ser transformada en movimiento (forma mecnica d ela energa) por los musculos.(d3) Varios mecanismos reabastecen las reservas de ATP en el musculo El ATP requerido como la fuente de energa constante para el ciclo de contraccinrelajacin de musculo puede generarse: 1) mediante glicolisis, usando la glucosa sangunea o glicgeno muscular 2) mediante fosforilacion oxidativa 3) a partir del fosfato de creatinina 4) a partir de las molculas de ADP en una reaccin catalizada por adenililcinasa. La cantidad de ATP en el musculo esqueltico solo es suficiente para proporcionar energa para contraccin durante algunos segundos, de modo que el ATP se debe renovar constantemente a partir de una o ms de las fuentes anteriores, dependiendo de las condiciones metablicas.

FORMACIN DE LA CREATIN FOSFATO

Histricamente, la idea de que los fosfatos eran la forma de almacenamiento de energa libre procedente de la oxidacin de los combustibles se remonta a 1925. Gustav Embden, bioqumico alemn, observ que se difunda mucho ms PO4-3 en la solucin que baaba un preparado de msculo motor en contraccin aislado que alrededor de un msculo en reposo. Dos aos ms tarde, en 1927, dos grupos de investigadores descubrieron simultneamente una sustancia denominada fosfato de creatina (CP), un derivado muy inestable de una sustancia que contiene nitrgeno denominada creatina. Encontramos creatina en considerables concentraciones en las clulas musculares y nerviosas, y las mayores cantidades se encuentran en los msculos del aparato motor. Ms tarde, en 1929, Karl Lohmann, en Alemania, descubri el ATP y el ADP y al mismo tiempo lo descubrieron tambin dos cientficos americanos. Durante los aos que siguieron, el trabajo se centr en dilucidar de qu forma estas distintas sustancias que contenan PO4-3 actuaban recprocamente en en alacenamiento y liberacin de enrgaE1. El estudio clsico apareci en 1934, cuando Lohmann demostr nicamente que los extractos de CP musculares nicamente se descomponan en PO4-3 y creatina en presencia de ADP, resultando de ello la formacin de ATP. Esta explicacin de la situacin era sencilla. El CP una reserva de PO4-3 (en efecto, una reserva de energa), utilizable nicamente si se produce en principio una falta de ATP, Lohmann contemplaba la generacin de tensin muscular como un proceso que implicaba la descomposicin del ATP directamente en ADP. En cuanto se haba formado el ADP, el CP disponible volva a fosforilarse en ATP. Las investigaciones subsiguientes demostraron que ello era correcto , y a menudo se denominan ecuaciones Lohmann a las ecuaciones 1 y 2 como reconocimiento a su xito en la identificacin de estos fenmenosE1.

. (1) . (2)

La ecuacin 2, tal como se ha demostrado es reversible. Es decir, puede desarrollarse en cualquiera de las direcciones, aunque su equilibrio normalmente tiende hacia la derecha, manteniendo siempre el ADP fosforilado como ATP utilizando el CP. As, la reserva de CP constituye un almacenamiento reducido aunque lbil de grupos de alta energa PO4-3. Cuando hay abundancia de ATP tambin la hay de CP. Cuando se da una cuantiosa demanda sbita de ATP en las clulas musculares y no puede producirse este metabolismo de hidratos de carbono y grasas en el periodo conveniente para proporcionar la energa exigida, el CP la proporcionar. En sprint, por ejemplo, ya sea carrera de 100 m o los 50 m finales para alcanzar la victoria en una carrera de 10.000 m, el CP jugar un papel importante. Con ello veremos que los msculos motores son capaces nivel bioqumico de generar tensin para breves periodos (quizs unos 20 s), incluso sin ningn tipo de energa derivada de la descomposicin en curso de los hidratos de carbono o grasas. Entre el citoplasma y las mitocondrias existe un puente de CP. En la regin miofibrilar del citoplasma se extrae PO4-3 del CP para convertir ADP en ATP. Con ello obtenemos una fuente inmediata de ATP para la generacin de tensin muscular. En cuanto el CP vuelve a la membrana mitocondrial, se refosforiza la creatina. Este proceso es initerrumpido y su intensidad est determininada por la correlacin ATP/ADP en el sarcoplasma. Cuanto mayor sea el consumo del ATP y el crecimiento de la concentracin del ADP, ms intenso ser el procesoE1,2.

IMPORTANCIA DE LA CREATINA FOSFATO Deposito accesorio de energa. Reposicin de reserva del ATP. Constituye la fuente energtica principal en los ejercicios explosivos de alta intensidad y corta duracin

BIBLIOGRAFIA 1A. Winters DK, Cederbaum AI. Biochemistry of Cytochrome P450. In Hepatic and bile secretion: Physiology and pathophysiology 1993, edited by Tavaloni and PD Berk. Raven Press, Ltd., New York. Chapter 27, 407-20. 1B. Ding X, Kaminsky LS. Human extrahepatic cytochromes p450: Function in xenobiotic metabolism and tissue-selective chemical toxicity in the respiratory and gastrointestinal tracts. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2003; 43: 149-73. 1C Hollenberg PF. Mechanism of cytochrome p450 and peroxidase catalysed xenobiotic metabolism. FASEB J 1992; 6: 686-94. 1D Omura T. Forty years of Cytochrome P450. Biochem Biophys Res Commun 1999; 266: 690-8. 1E. Goeptar AR, Sheerens H, Vermeulen NPE. Oxygen and xenobiotic reductase activities of cytochrome P450. Crit Rev Toxicol 1995; 25: 25-65. 1F. 1.G. Monza, S. Doldan y S. Signorelli., Ciclo de Krebs [versin en lnea], disponible en: http://www.fagro.edu.uy/~bioquimica/docencia/material%20nivelacion/CICLO%20DE%2 0KREBS.pdf [consultado el 17 de marzo del 2012] 1.H. ATP (adenosn trifosfato) [versin en lnea], medicina molecular, disponible en: http://www.medmol.es/glosario/121012glosariomedmol_atp/ [consultado el 17 de marzo del 2012]