LABORATORIO N1 ESPECTROFOTOMETRA: CUANTIFICACIN 1.

Aspectos tericos de espectrofotometra cuantitativa La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella, que puede ser utilizada para su identificacin y cuantificacin. Todas las sustancias absorben luz en alguna regin del espectro electromagntico (VIS, UV, IR, etc.). La absorcin de luz depende de la estructura qumica del compuesto absorbente, y en especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las caractersticas de su espectro de absorcin.

NAD+ NADH

260
Figura 1.

300

340

nm

Espectros de absorcin del NAD+ y del NADH.

Ley de Lambert-Beer Lambert y Beer demostraron que la absorbancia (A), tambin llamada densidad ptica (D.O.) de una sustancia es directamente proporcional a la concentracin (c) de la sustancia absorbente, la longitud del paso de luz (l) (espesor de la solucin) y una constante denominada coeficiente de extincin o coeficiente de absorcin (a), que es caracterstico para cada sustancia a una longitud de onda () determinada. Ecuacin 1.1 Para medir la absorbancia de una sustancia se utiliza el espectrofotmetro, instrumento destinado a medir la absorcin por especies inorgnicas y orgnicas de luz monocromtica en la regin ultravioleta / visible del espectro. 1

A = a

l c

Los espectrofotmetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el porcentaje de transmitancia (%T). La relacin entre ambos es: A = 2 - log % T Anlisis espectrofotomtrico: Todo mtodo espectrofotomtrico se basa en la comparacin de la absorbancia de una sustancia de concentracin desconocida con la de una solucin de la misma sustancia cuya concentracin se conoce y a la cual se denomina solucin patrn o estndar. La absorbancia de una solucin es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben tambin a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todas los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de ste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0, o sea 100% de transmisin. Curva de Calibrado : Se obtiene la curva de calibrado midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de concentraciones conocidas de una misma sustancia tratadas con un mismo mtodo y medidas a igual longitud de onda en el mismo instrumento. Para medir la concentracin de una sustancia se elige por lo general, la regin de mxima absorcin del espectro, denominada longitud de onda analtica. El resultado se expresa en una grfica de la absorbancia (A) en funcin de la concentracin (c). Si el sistema sigue la ley de Lambert-Beer se obtiene una lnea recta que pasa cerca del origen; de cuya pendiente se puede obtener el coeficiente de extincin (a) (Ecuacin 1.3). Es posible determinar grficamente la concentracin de una muestra desconocida (cx) midiendo la absorbancia de la muestra (Ax) e interpolando en la curva de calibrado. Normalmente la concentracin se estima, a partir de la ecuacin de la curva de calibrado. Ecuacin 1.2

A = a

l c + Ao

Ecuacin 1.3

Donde, A es la variable dependiente (y), la pendiente es igual a (a l), c es la variable controlada (x) y Ao es el intercepto. Las unidades del coeficiente de extincin dependen de las unidades de concentracin y de longitud del paso de luz. Generalmente la unidad de longitud es el centmetro y la longitud del paso de luz es 1,0 cm. Si las unidades de concentracin son moles L-1 o 2

milimoles L-1, se hace referencia al coeficiente de extincin molar ( ) o milimolar, respectivamente (Ecuacin 1.4). Si la concentracin est expresada en g/100 mL (% peso / volumen) se obtiene el coeficiente de extincin especfico (E1%).

A =

l c + Ao

Ecuacin 1.4

Cuando la concentracin de la sustancia y la longitud del paso de la luz se hacen iguales a la unidad, la absorbancia corresponde al coeficiente de extincin. Si se midiera la absorbancia de una solucin 1,0 M de una sustancia colocada en una celda de 1,0 cm se obtendra el coeficiente de extincin molar (). Si la concentracin fuera 1,0 g/100 mL se obtendra el coeficiente de extincin especfico (E1%). Estos coeficientes son una propiedad especfica de las partculas absorbentes y su valor es referido a un determinado solvente y a una determinada longitud de onda. Cuando se conoce por bibliografa el coeficiente de extincin de un compuesto (, E1%), o ste es estimado experimentalmente, midiendo la absorbancia (AX) de una muestra del compuesto de concentracin desconocida (cX) se puede calcular su concentracin (ecuacin 1.5). A Ao Ecuacin 1.5 cx = X

En esta forma se obtiene la concentracin (cf) de la muestra problema en la cubeta, para obtener la concentracin original (ci) se debe considerar las diluciones correspondientes al ensayo usado para cuantificar (Ecuacin 1,6). vi * ci = Frmula del Estndar. La concentracin desconocida puede determinarse sobre la base de un slo estndar, de acuerdo a la siguiente ecuacin: cmp vi = AMP CS vi AS vf mp vf Ecuacin 1.7
s

vf * cf

Ecuacin 1.6

As y Amp son las absorbancias del estndar y muestra problema, respectivamente. vi corresponde al volumen de la solucin estndar o de la muestra problema ocupado en el ensayo para cuantificar. vf corresponde al volumen final del ensayo ocupado para cuantificar. cs y cmp corresponden a las concentraciones de las soluciones estndar y muestra problema respectivamente. Ambas concentraciones se refieren a las originales sin la dilucin propia del ensayo ocupado para cuantificar.

Unidades. Absorbancia (A): Adimensional (sin unidades) Longitud (l): cm Concentracin (c): molar, milimolar, g/100 mL Coeficiente de extincin (a) molar ( ) M-1 cm-1 L moles-1 cm-1 mL milimoles-1 cm-1 milimolar () mM -1 cm-1 L mmoles-1 cm-1 mL moles-1 cm-1 Especfico (E1%) dL g-1 cm -1 (g/100mL) 1 cm-1 Cuantificacin de protenas de solucin: En general, no hay un mtodo completamente satisfactorio para medir la concentracin de protenas en una muestra. La eleccin del mtodo depende de la naturaleza de la protena, de los otros componentes de la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad deseada. En este trabajo prctico se vern dos de los mtodos que se usan corrientemente para medir concentraciones de protenas, Biuret y Lowry. Mtodo Biuret Los compuestos que tienen dos o ms uniones peptdicas (pptidos y protenas) dan color prpura caracterstico cuando se tratan con una solucin alcalina de sulfato de cobre diluida. El color se debe aparentemente al complejo de coordinacin del Cu con cuatro tomos de nitrgeno, que participan en el enlace peptdico. Este mtodo es reproducible, pero requiere una alta concentracin de protenas para la formacin de color. La sensibilidad del mtodo es de 0,25 200 mg de protenas por mL de solucin. Mtodo de Lowry Los aminocidos pueden dar reacciones caractersticas con ciertos reactivos de acuerdo a la naturaleza de sus cadenas laterales. Muchas reacciones de este tipo se caracterizan por la formacin de productos coloreados. La tirosina por ejemplo, debido a su grupo hidroxifenilo, reacciona con una solucin de cido fosfomolbdico tungstico 4

en un medio cprico alcalino, produciendo una coloracin azul, la cual absorbe a 650 nm. Este mtodo llamado originalmente Foln Ciocalteau debido a sus estudios iniciales ha sido desarrollado y transformado, por Lowry y colaboradores, en un procedimiento muy sensible que ha sido ampliamente usado para la determinacin cuantitativa de protenas en una muestra. En el mtodo de Lowry la muestra se trata con el reactivo de Folin Ciocalteau modificado. Si hay protenas presentes se produce una coloracin azul debido principalmente a la presencia de residuos de tirosina y triptofano en las protenas. Se mide la absorbancia a 650 nm y se compara con las medidas obtenidas de soluciones de protenas de concentracin conocida (patrn), tratadas de forma idntica. Sin embargo, debido a las diferencias en el contenido aminoacdico de una protena a otra, cantidades iguales de protenas distintas, producen coloracin diferente con el reactivo de Lowry, motivo por el cual no es posible obtener la concentracin real de una muestra de protena por este mtodo, an as, cuando se requiere una estimacin relativa de la concentracin de protenas, este mtodo es ampliamente satisfactorio, debido a su alta sensibilidad. Sensibilidad 1 200 g de protenas por ensayo. 2. Objetivos. Cuantificar protenas ocupando tcnicas espectroscpicas como el mtodo de Lowry y el mtodo de Biuret. 3. Parte experimental 3.1 Equipos y materiales espectrofotmetro (visible) celdas para espectrofotmetro 1 bao termostatizado 1 termmetro. 16 tubos de ensayo 2 gradillas 2 pipetas graduadas de 5 ml 2 pipetas graduadas de 1 ml 1 pizeta. 1 vaso precipitado de 250 ml 1 vaso precipitado de 100 ml

3.2 Reactivos. Reactivo de Biuret: Solucin estndar de ovoalbmina al 5% en NaCl 9%. Reactivo de cobre alcalino (RCA). 5

 Reactivo Folin (RF) Ovoalbmina Albmina de suero de bovino (BSA). 4. Procedimiento. 4.1. Mtodo de Biuret. De acuerdo a la tabla 1.1: Prepare una batera de tubos enumerados. Agregue el volumen indicado de la solucin de ovoalbmina estndar o muestra problema con una pipeta graduada de 1 mL. Agregue el volumen indicado de agua con una pipeta graduada de 1 mL. Agregue 4,0 mL del reactivo de Biuret con una pipeta graduada de 5 mL.
TABLA 1.1

TUBO

Ovoalbmina (mL) 5% MP

H2O (mL)

R. BIURET

Absorbancia Concentracin %

1B 2S 3S 4S 5S 6S 7 MP 8 MP 9 MP

0,0 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2

---

-----

------------1,0 MP1 1,0 MP2 1,0 MP3

1,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 0,0 0,0 0,0

(mL) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Agite y espere 20 minutos a temperatura ambiente para la formacin del complejo coloreado. Mida la absorbancia de los tubos en un espectrofotmetro a 540 nm, previa calibracin del equipo con el blanco. De acuerdo a los datos: Calcule la concentracin de la ovoalbmina en los tubos (2S 6S) Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin. Obtenga la ecuacin de la recta y el coeficiente de regresin por regresin lineal. Construya una grfica absorbancia versus concentracin, trace la recta obtenida por regresin. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las cubetas mediante la ecuacin 1.5. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin1.6). Recuerde que cx (Ecuacin 1.5) corresponde a cf (Ecuacin 1.6).

4.2. Mtodo de Lowry. De acuerdo a la tabla 1.2: Prepare una batera de tubos enumerados. Agregue los volmenes indicados de la solucin de seroalbmina de bovino (BSA) estndar o muestra problema con una pipeta graduada de 1 mL. Agregue los volmenes indicados de agua con una pipeta graduada de 1 mL. Agregue 1,0 mL del reactivo alcalino (RCA) con una pipeta de 1 mL. Espere 10 minutos exactos Despus de los 10 minutos, agregue 4,0 mL del reactivo de Folin con una pipeta de 5 mL y mezcle. Caliente los tubos por 5 minutos exactos a 55C en el bao termostatizado. Enfre y lea en el espectrofotmetro a 650 nm, previa calibracin con el blanco.
TABLA 1.2

TUBO 1B 2S 3S 4S 5S 6S 7MP 8MP 9MP

BSA (mL) 0,4 mg/mL MP -----0,1 --0.2 --0,3 --0,4 --0,5 ----0,5 MP1 --0,5 MP2 --0,5 MP3

R.F. H2O (mL) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,5 0,5 0,5 R.C.A. (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 (mL) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Conc. %

De acuerdo a los datos: Calcule la concentracin de BSA en los tubos (2S 6S). Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin. Obtenga la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de regresin. Construya una grfica absorbancia versus concentracin, trace la recta obtenida por regresin. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en la cubeta mediante la ecuacin 1.5. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin 1.6). 5. Bibliografa Bohinski Robert, 1991, Bioqumica , 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana. D Skoog, D. West y F. Holler, 1995, Qumica Analtica, 6 Edicin. 7

D.Bozimowsk, J.D. Artiss and B. Zak, 1983, Spectrophotometric comparison of several reactions used for cerebrospinal fluid protein determinations. Microchemical Journal 23, 285-293.