PCR-Real Time

Vantagens:
Permite a deteco da amplificao do PCR durante as fases iniciais da reao Mede a cintica da reao nas fases iniciais da PCR e oferece uma vantagem distinta sobre a deteco de PCR tradicional Mtodos tradicionais usam gel de agarose para a deteco de amplificao pela PCR na fase final ou ponto final da reao de PCR.

Fases da PCR:

Desnaurao: separao das fitas Anelamento: Hibridizao das fitas com primers Elongao: Sntese das novas fitas Observar as temperaturas de cada etapa. Elas sempre so nessas faixas.

- Se todas as etapas ocorrerem corretamente Eficincia da reao de 100% - A amplificao por PCR corresponde a uma funo exponencial com base 2 y = a.2x ou [ X ] = [ Xo] . 2c => Essas frmulas so usadas, caso a eficincia seja de 100% - y = quantidade final de amostra - a = quantidade inicial de amostra - x = nmero de ciclos - [X] = concentrao final - [Xo] = concentrao inicial - Entretanto, a eficincia quase nunca de 100%, ento, amplificao por PCR corresponde a uma funo exponencial com base = 1 + Ef => usada outra frnula: [ X ] = [ Xo] . ( 1 + Ef )c fazendo-se log da exponencial, obteremos uma reta:

- eficincia => deslocamento para direita(1 grfico) => inclinao da reta (2 grfico)

Fases da PCR-RT no grfico:

Exponencial: duplicao (assumindo 100% de eficincia de reao) exata do produto est acumulando a cada ciclo. A reao muito especfica e precisa. Linear (alta variabilidade): Os componentes de reao esto sendo consumidos, a reao est desacelerando. Amostras comeam a divergir em suas quantidades durante a fase linear

Plat (End-Point: deteco pelos mtodos tradicionais com gel): A reao parou, produtos no esto sendo mais feitos. Cada tubo ou reao ter seu plat em um ponto diferente, devido cintica de reao diferente para cada amostra. A fase de plat onde feita a medio da PCR tradicional, tambm conhecido como ponto final de deteco. Quando so amostras em replicatas, que comearam com a mesma quantidade no incio da reao, elas devem ter quantidades idnticas no final. Portanto, ser mais preciso fazer medies durante a fase exponencial, onde a amostras idnticas, esto ampliando exponencialmente

Efeito do uso do Hot-start PCR:

- A amplificao iniciada a uma temperatura maior para ativar a polimerase e tem como finalidade aumentar a especificidade e sensibilidade da reao (FIG. ESQ => PCR convencional; FIG DIR => Hot Start PCR) Fitas vermelhas produtos inespecficos - So adicionados anticorpos, bloqueadores e inibidores polimerase que se dissociam dela apenas com o aumento da temperatura, evitando o anelamento inespecfico dos primers.

Hot Start

Aplicaes da PCR em Tempo Real:

- A PCR em tempo real pode ser empregada em todas as situaes em que uma PCR tradicional j era utilizada - Com a possibilidade de monitoramento da reao e coleta dos dados na fase exponencial, o poder de deteco da reao de PCR foi expandido para aplicaes como: - Quantificao viral - Quantificao da expresso gnica - Verificao e validao de microarranjos - Teste de eficcia de terapias com drogas - Medidas de danos no DNA - Ensaios de validao e controle de qualidade - Deteco de patgenos - Nmero de cpias gnicas - Genotipagem

Tipos de Resultados produzidos:

- O resultado fornecido pelos tipos de fluorescncia, que indicam a quantidade de DNA presente na amostra - O resultado fornecido pela curva padro dito absoluto (mas ele relativo ao padro) e o fornecido pelos grficos dito relativo - Com a RT-PCR pode-se avaliar SNPs (homozigotos, heterozigotos), presena ou ausncia de um patgeno, quantificar amostras e etc.

Sistemas de deteco em PCR em tempo real:

- A amplificao das molculas de DNA que so produzidas a cada ciclo da PCR quantificada atravs da variao na fluorescncia interna. A fluorescncia, que aumenta de forma exponencial nos ciclos iniciais da amplificao por PCR, pode ser expressa na forma logartmica, originando uma curva contendo uma regio linear.

- Os mtodos de deteco so baseados em:

1. 2. Fluorforos intercalantes de DNA em dupla fita SYBR-Green Oligonucleotdeos marcados com fluorforos TaqMan, Molecular Beacons PS: o comprimento de onda da absoro geralmente MENOR que da emisso SYBR-Green: - O SYBR se liga entre a dupla fita de DNA e com a excitao da luz amitida pelo sistema tico do termiciclador, emite uma fluorescncia verde. No comeo da amplificao, a mistura da reao contm o DNA desnaturado, os primers e o SYBR Green. As molculas no-ligadas do SYBR apresentam fluorescncia fraca produzindo um sinal mnimo sendo este subtrado durante a anlise do computador. Aps o reconhecimento dos primers, algumas molculas do SYBR podem ligar-se na fita dupla previamente formada. Durante a polimerizao pela Taq, as molculas do SYBR vo se ligando ao DNA recentemente sintetizado, aumentando, assim, a fluorescncia detectada. No ciclo seguinte, na etapa de desnaturao do DNA, as molculas de SYB Green so liberadas e h queda no sinal de fluorescncia. A deteco de fluorescncia no fim da etapa de extenso de cada ciclo permite monitorar a quantidade crescente de DNA amplificado.
*O SYBR no ligado ao DNA emite uma fluorescncia muito pequena que realada quando ligado fita dupla do DNA Fluorforos so molculas que absorvem luz e emitem em um comprimento de onda especfico.

Vantagens: baixo custo, facilidade no uso e sensibilidade Desvantagens: Ligao em todo o DNA fita dupla que surge durante a reao, incluindo os dmeros de primers e outros produtos inespecficos, podendo superestimar a concentrao do fragmento alvo.

- Na PCR em tempo real utilizando SYBR green, estamos simplesmente medindo o aumento de fluorescncia medida que o corante se liga e a quantidade de DNA aumenta. Desejamos que este aumento na fluorescncia seja proveniente do DNA que desejamos medir, mas uma parte do sinal pode vir de DNA diferente do que estamos tentando ampliar. Uma maneira de verificar os produtos fazendo uma curva de melting fuso). A mquina da RT-PCR no s monitora a sntese de DNA durante a PCR, como tambm determina o ponto de melting do produto no final das reaes de amplificao. A temperatura de melting (Tm) de uma dupla de DNA depende da sua composio de bases (e de sua extenso se for muito curto). Todos os produtos de PCR para um mesmo par de primers devem ter a mesma Tm - a menos que haja contaminao, mispriming, artefatos de primers, ou algum outro problema. Como o SYBR green no faz distino entre um e outro DNA, um importante meio de controle de qualidade verificar se todas as amostras tm uma temperatura de melting similar. Depois da amplificao da PCR-RT, a mquina pode ser programada para fazer uma curva de melting, em que a temperatura elevada por uma frao de um grau e a mudana de fluorescncia medida. No ponto de melting, as duas fitas de DNA sero separadas e a fluorescncia diminui rapidamente. *Um artefato de primer d um pico com uma temperatura de fuso mais baixa (porque um DNA a um curto). *Na Tm, 50% das fitas esto desnaturadas Mispriming: produtos de PCR feita devido ao anelamento dos primers para seqncias complementares, ou parcialmente complementares sobre DNAs no alvos. Artefatos de Primer: os primers podem s vezes se anelar entre si e criar modelos pequenos para a amplificao PCR.

Sondas TaqMan: - Essa sonda apresenta em uma extremidade um fluorforo e na outra um quencher (molcula que aceita enerdia do fluorforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor). Os produtos da reao so detectados pela fluorescncia gerada aps a atividade axonuclease 5 3 da Taq DNA polimerase. Durante a RT-PCR, a sonda TaqMan hibridiza com a sequncia da fita simples de DNA complementar alvo para a amplificao. No processo da amplificao, a sonda TaqMan degradada devido atividade da polimerase, separando o quencher da molcula fluorescente durante a extenso. A separao do fluorforo do quencher aumenta a distncia entre eles e resulta em um aumento da intensidade de fluorescncia. Assim, durante o processo de amplificao, a emisso de luz aumentada na forma exponencial. Esse aumento de fluorescncia apenas ocorre quando a sonda hibridiza e quando a amplificao da sequncia alvo feita. Ele proporcional quantidade de produto sendo formado.

Molecular BEACONS MB - So oligonucleotdeos usados como sondas de fita simples que formam uma estrutura secundria entre as extremidades 5 e 3. O loop contm uma sequncia que complementar sequncia-alvo e a haste formada pelo anelamento das sequncias complementares que esto localizadas nas extremidades. Um fluorforo covalentemente ligado numa extremidade e um quencher covalentemente ligado na outra extremidade. Os oligonucleotdeos molecular beacons no emitem fluorescncia quando esto livres em soluo. Entretanto, quando hibridizam com a fita de DNA contendo a sequncia-alvo, as sondas assumem uma mudana conformacional, tornando-a capaz de emitir fluorescncia. Na ausncia de alvos, o oligonucleotdeo no emite fluorescncia, pois o quencher est prximo do fluorforo captando energia. Quando o molecular beacon encontra o seu alvo, ele hibridiza e ocorre uma reorganizao conformacional, onde o fluorforo se dissocia do quencher, emitindo a fluorescncia. Os molecular beacons podem ser sintetizados com diferentes cores de fluorforos, possibilitando ensaios para detectar diferentes alvos. Podem discriminar sequncias-alvo que diferem entre si por apenas um nucleotdeo substitudo, sendo, portanto, timas para visualizar SNPs.

Quantificao absoluta e relativa:

- Q. Absoluta => Determinar a quantidade absoluta de uma amostra. Quando feita um diluio seriada ou replicatas, devemos realizar uma curva padro e, ento, a mquina estima um valor para a quantidade de DNA presente na amostra.

- Q. Relativa => mensurada a amplificao da amostra comparada com a do controle de referncia. Geralmente, usada aps a quantificao absoluta. Ela geralmente usada para: Comparar os nveis de expresso de um gene em diferentes tecidos. Comparar os nveis de expresso de um gene em uma amostra tratada versus uma amostra no tratada. Comparar os nveis de expresso de alelos de tipo selvagem vs alelos mutados. Primeiro, obtida a fluorescncia relativa(Rn) e depois o deltaRn, em que calculada a linha de base (mdia dos valores da linha o 0, descontado depois dos outros valores da amostra).