MC JEANETT CHVEZ ONTIVEROS

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE SINALOA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS LICENCIATURA EN INGENIERA BIOQUMICA

Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Enterobacterias

Indol Rojo de Metilo Vogues Proskauer Citrato como nica fuente de carbono Fermentacin de hidratos de carbono Descarboxilasa Fenil-Alanina desaminasa Citocromo-oxidasa

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Culiacn, Sinaloa.

Reduccin de nitratos Ortonitrofenil galactsido

Indol

Es uno de los productos de la degradacin metablica del triptfano, el cual surge por la hidrlisis del mismo con la ayuda de la enzima triptofanasa. Caldo de triptfano (1% Trp)

Medios Reactivos.M di y R ti Interpretacin.-

Reactivo de Kovac (Soln. Acidificada de pdimetilaminobenzaldehido en alcohol isoamlico) Reactivo de Ehrlich

Positiva: Color fucsia brillante en la interfase del reactivo. Negativa: Un anillo amarillo

Control.Control positivo: E. coli Control negativo: Klebsiella pneumoniae

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Rojo de Metilo
Principio.Prueba cuantitativa de la produccin de cidos que requiere que los m.o produzcan cidos fuertes (lctico, actico y frmico) a partir de glucosa, por la va de fermentacin de cidos mixtos mixtos.

Prueba Positiva

Prueba Negativa

Medios y Reactivos.Caldo Rojo de Metilo-Voges-Proskauer (RM/VP) Indicador Rojo de Metilo

Interpretacin.Positiva: Aparicin de color rojo en la superficie del medio Negativa: Puede producir un color anaranjado

Controles.Control Positivo: E. coli Control Negativo: Enterobacter aerogenes

Voges- Proskauer
Principio.El cido pirvico es un compuesto formado de la degradacin de la glucosa

Citrato
Medios y Reactivos.Medio.Medio

Prueba verifica:
Uso de citrato como nica fuente de C Uso de compuestos amoniacales como fuente de N

Se degrada a acetona (acetilmetilcarbinol)

va butanodilica

Caldo RM/VP Reactivos.Alfa-naftol (5%) Alcohol etlico absoluto Hidrxido de potasio (40%)

Acetona + O2 + KOH (40%) Diacetilo alfa-naftol (rxna. Guanidina y/o arginina)

(5% EtOH)

Interpretacin.-

Rojo

Se cultivan en agar citrato de Simmons (Citrato de sodio y (NH3)3PO4; azul de bromocresol) Si es positiva habr una alcalinizacin del medio.

Positiva: Aparicin de un color rojo 15 minutos o ms despus del agregado de los reactivos Negativa: No aparece coloracin roja, puede aparecer color cobre

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Fermentacin de Carbohidratos (Caldo Rojo de Fenol) Glucosa

Hidratos de Carbono Sacarosa Lactosa Rojo de Fenol

pH < 6.8

pH > 7.4

Amarillo

Roja-Rosado

IMViC
(E.coli ++--) (Enterobacter --++) (Salmonella -+-+ ) (Citrobacter -+-+)

Interpretacin.POSITIVO

Amarillo

Amarillo/ gas

NEGATIVO

No hay cambio en la coloracin

Rojo-rosado oscuro

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Fermentacin de Azcares

Glucosa

Lactosa

Organismo Organismo 1) Control 2) S. aureus 3) P. vulgaris 4)P. aeruginosa 5) E. coli Resultado del test Negativo cido cido, gas Negativo cido, gas 1) Control 2) S. aureus 3) P. vulgaris 4)P. aeruginosa 5) E. coli

Resultado del test Negativo cido Negativo Negativo cido, gas

Sacarosa

Organismo 1) Control

Resultado del test Negativo cido cido, gas Negativo Negativo

2) S. aureus 3) P. vulgaris 4)P. aeruginosa 5) E. coli

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

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Agar TSI (Triple Sugar Iron)

Si produce cido sulfhdrico (debido a la reduccin de las sales de hierro), se presentar un ennegrecimiento del tubo. La produccin de sulfhdrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentacin de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa. Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas.

Diferentes pruebas sobre agar TSI

Si la bacteria problema fermenta la glucosa, acidificar el medio haciendo virar a amarillo el indicador en el fondo del tubo, mientras que si no es fermentadora de glucosa, el medio permanecer de color rojo. rojo. Si la bacteria problema fermenta lactosa y/o sacarosa, acidificar el medio en su superficie f f volvindolo de color amarillo, mientras que si no lo es, la superficie del medio continuar de color rojo. rojo.

Fermentacin de azcares (TSI)

Resultados (slant/butt) 1)No cambio/ no cambio 2)Amarillo/amarillo con burbujas Smbolo NC/NC A/A Interpretacin No Fermentacin Fermentacin de glucosa y lactosa y/o sacarosa, con produccin de gas ? Fermentadora de glucosa ?

3)? Rojo/amarillo con precipitado negro 4)Amarillo/amarillo con precipitado i it d negro 5)Rojo/Rojo

? NC/A

No fermentacin, peptona catabolizada

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Ejemplo de la Fermentacin de Carbohidratos en microorganismos

UREASA
O
2HN

Urea

NH2

Principio
O
2HN

NH2

+ 2HOH Ureasa

CO2 + H2O + 2NH3

(NH4)2CO3 Qu azcares fermentan Shigella s. y E. coli?

Fermentacin de azcares (Lactosa Agar Mac Conkey)

Materiales y Reactivos

Caldo Urea de Stuart

Agar Urea de Christensen

Extracto de levadura Fosfato monopotsico Fosfato disdico Urea Rojo de Fenol

0,1g 9,1g 9,5g 20g 0,01g

Peptona Glucosa Cloruro de sodio Fosfato monopotsico Urea Rojo de fenol Agar

1g 1g 5g 2g 20g 0,012g 15g

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Procedimiento

Controles
1) Inoculacin

Control Positivo
2) Incubacin
35C / 18-24 hrs.

Proteus

Control Negativo
3) Interpretacin de resultados

E. coli

Interpretacin de Resultados
Positivo Caldo Stuart Negativo No existe cambio en la coloracin Color rojo solo en un principio solo en el pico de flauta, pero luego se torna en todo el tubo Coloracin roja

Fenil- Alanina Desaminasa

Enterobacteriaceae

Hidrolizado lento.Positivo Agar Christensen

Proteus

Providencia

Hidrolizado rpido.- Color rojo en el medio p Hidrolizado lento.Negativo Color amarillo original

Morganella

Hidrolizado rpido.- Color amarillo original

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Materiales y Reactivos
DL Fenilalanina Extracto de Levadura 2g 3g 5g 1g 2,5 ml 12g 12g 100ml

Interpretacin
Positiva Negativa
Coloracin verde

Agar Fenil - Alanina

Cloruro de Sodio Fosfato de Sodio HCl concentrado Agar Cloruro Frrico Agua Destilada

No hay cambio de y coloracin

Controles
Control positivo.- Especies de Proteus Control negativo.- E. coli

Procedimiento
Inoculacin del pico de flauta

Decarboxilasas
Lisina Ornitina
Cadaverina Putrescina Citrulina
Peptona Extracto de carne Prpura de bromocesol Rojo de cresol Glucosa 5g 5g 0,01g 0,005g 0,5g 0,005g 1l

35C/18-24 hrs

Incubacin

Arginina

Se agregan de 4 a 5 gotas de cloruro frrico

Medios y Reactivos

Se gira el tubo

Piridoxal Agua destilada

Interpretacin

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Procedimiento
1)

Citocromo Oxidasa
Inoculacin de 2 tubos

Figura 1. CADENA RESPIRATORIA (5 complejos).

Medio Moeller (control) Medio Moeller + Aminocido CITOCROMO-OXIDASA 2)

Se cubren con aceite mineral estril

1 cm por encima de la superficie

3)

Incubacin

(35C/18-24hrs)

Interpretacin
Positiva.- Indica un vire de color azul-prpura Negativa.- No existe cambio de coloracin g

Control
Aminocido Lisina Ornitina Arginina Control Positivo Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae Control Negativo Enterobacter cloacae Especies de Klebsiella Enterobacter aerogenes

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SE ENCUENTRA EN:

MEDIOS Y REACTIVOS CLORHIDRATO DE TETRAMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE KOVAC)

o Microaerfilos CLORHIDRATO DE DIMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE GORDON Y MCLEOD)

o Anaerobios Facultativos

La prueba de la oxidasa es importante para identificar microorganismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados.

REACCIN

Cit crd Cit cox

Incoloro Azul (azul de indofenol)

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REACTIVO DE KOVAC vs REACTIVO DE GORDON Y McLEOD

PROCEDIMIENTO
Directa 2 o 3 gotas de reactivo se agregan directamente en colonias bacterianas aisladas en un medio en placa. Indirecta Se agregan unas pocas gotas del reactivo a una tira de papel de filtro o se usan tiras o discos comerciales p g impregnados con reactivo desecado.

Ventajas del reactivo de Kovac INTERPRETACIN Estabilidad durante el almacenamiento Mas sensible para la deteccin de citocromo-oxidasa M Menos txico i 10 s Las colonias que tienen actividad de citocromooxidasa desarrollan un color azul oscuro en el sitio de inoculacin en 10 s. Debe evaluarse an ms porque probablemente no pertenezca a la familia Enterobacteriaceae.

10 60 s

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Reduccin de Nitratos

No deben usarse asas o alambres de inoculacin de acero inoxidable o Nichrome para esta prueba.

Propsito
Este examen detecta la habilidad de un organismo para reducir nitratos (NO3) a nitritos (NO2) o algunos otros compuestos nitrogenados, tales como nitrgeno molecular (N2), usando la enzima nitrato reductasa.

Control Positivo

CONTROLES Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli

Control Negativo

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Reactivo A

cido Sulfanlico

8g

PROCEDIMIENTO
Inoculacin

cido actico (5N), 30%

1L

Incubacin
Reactivo B -naftalamina 8g
(a 35C, 18 a 24 horas)

cido actico (5N), 30%

1L

Agregar 1mL de cada uno de los reactivos A y B

CALDO DE NITRATO O AGAR NITRATO (PICO DE FLAUTA) Extracto carne peptona Nitrato de potasio (KNO3) Agar (sin nitritos) Agua destilada 3g 5g 1g 12g 1L

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El polvo de zinc se agrega a los tubos cuyo resultado parezca ser negativo (siga siendo claro).

Ortonitrofenil Galactsido

CONTROLES CONTROL POSITIVO E. coli

CONTROL NEGATIVO

Acinetobacter calcoaceticus

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CLASIFICACIN DE LAS BACTERIAS (criterio ONPG TEST) Bacterias no fermentadoras de lactosa Bacterias no fermentadoras de lactosa (carecen de permeasa, pero si poseen -galactosidasa) Son incapaces de producir cidos a partir de lactosa. Dan una prueba positiva de ONPG.

Fermentadores tardos de lactosa

Poseen una actividad permeasa lenta. Dan una prueba positiva de OMPG rpida.

-Galactosidasa

Fermentadores normales

Asa de crecimiento Bacteriano + 0.5 mL de solucin fisiolgica

PROCEDIMIENTO
Se agrega una gota de tolueno

Mezclar durante unos s

Agregar solucin A l i ONPG amortiguadora

Lactosa permeasa

Bao de agua a 37C

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INTERPRETACIN 5-10 min Algunos.

MEDIO RICO EN LACTOSA

Agar-hierro de Kligler (KIA)

1 hora

La mayora. El color amarillo por lo comn es evidente.

Agar-hierro-triple-azcar (TSI)

24 horas

Las reacciones no p deben interpretarse como negativas hasta despus de 24 horas de incubacin.

Fosfato de sodio buffer,1M, pH7 O-nitrofenil--galactsido (ONPG), 0.75 M REACTIVOS Solucin Fisiolgica Tolueno

CONTROLES CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO E. coli Proteus

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http://www.uprm.edu/biology/cursos/micro/pruebas.htm http://html.rincondelvago.com/pruebas-bioquimicas.html http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.tro ybio.com/images/Product_Images_BBL/MCONKEYECOLI.gif&imgrefurl=http://www.troybio.com/images/Produ ct_Images_BBL/BBL.htm&h=1648&w=1629&sz=745&tbnid =fOb6kWI8BPcJ:&tbnh=150&tbnw=148&hl=es&start=14&p rev=/images%3Fq%3Dagar%2Bmacconkey%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D

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