PLAGUICIDAS

DEFINICIN: Segn la OMS, un pesticida o plaguicida es cualquier sustancia o mezclas de sustancias, de carcter orgnico o inorgnico, que est destinada a combatir insectos, caros, roedores y otras especies indeseables de plantas y animales que son perjudiciales para el hombre o que interfieren de cualquier otra forma en la produccin, elaboracin, almacenamiento, transporte o comercializacin de alimentos, produccin de alimentos, productos agrcolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, tambin aquellos que pueden administrarse a los animales para combatir insectos arcnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos. CLASIFICACION: Segn la especie a combatir Compuestos arsenicales Compuestos fluorados Azufre Derivados del selenio Organofosforados Organoclorados Carbamatos Aceites antracnicos Aceites de petrleo Nicotina Piretrina Rotenona Sales de NH4+, Ca++, Cu++, Fe+++, Mg++, K+, Na+, en forma de sulfatos, nitratos, cloruros, cloratos. Fitohormonas Derivados de la urea Triazinas y Diazinas Derivados de los fenil sustituidos y las quinoxalinas Derivados de la oxiquinolena Derivados de las tiadizinas y tiadiazoles Parquat Diquat Piclorame Sales de cobre Compuestos arsenicales Aceites minerales Derivados rganomercuriales

MINERALES

ORGANICOS DE INSECTICIDAS SINTESIS MINERALES A BASE DE ACEITES MINERALES DE ORIGEN VEGETAL

MINERALES

HERBICIDAS

ORGANICOS

OTROS

FUNGUICIDAS

MINERALES ORGANOMETALICOS

ORGANICOS Derivados cumarnicos Inorgnicos

Carbamatos y ditiocarbamatos Derivados del benceno Amicidas Benzonitrilos Warfarinas Sales de talio

RODENTICIDAS

El trmino plaguicida incluye tambin los siguientes tipos de sustancias: reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de la fruta, agentes para evitar la cada prematura de la fruta y sustancias aplicadas a los cultivos antes o despus de la cosecha, para proteger el producto contra el deterioro, durante el almacenamiento y transporte. Desde el punto de vista de la toxicologa, es importante sealar que las formulaciones de plaguicidas adems del principio activo incluyen sustancias transportadoras, diluyentes como agua o solventes orgnicos, aditivos e impurezas, que pueden tener potencial txico por si mismas. El anlisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas reas: -Forense -Diagnstico de urgencia -Control de poblaciones expuestas y no expuestas. -Contaminacin ambiental. Si el plaguicida fue causa de muerte, estar en alta concentracin, al igual que en una intoxicacin aguda grave. En las dos ltimas reas se trabaja con muestras con niveles muy bajos de plaguicidas (menores de 0,1 ppm), se habla de residuos de plaguicidas. De todos ellos estudiaremos los insecticidas organoclorados, organofosforados y carbamatos, por ser los ms utilizados actualmente y producir efectos txicos muy caractersticos. PROPIEDADES FISICOQUMICAS Estas propiedades son las determinantes de su cintica ambiental. El aire, el agua, el suelo y los alimentos retienen gran parte de los pesticidas y stos llegarn a los seres vivos. Constituye un problema actual su persistencia en el medio ambiente, su concentracin y transformacin en organismos vivos. ORGANOFOSFORADO ORGANOCLORADO Estabilidad Persistencia Toxicidad aguda Solubilidad en agua Hidrofobicidad Muy baja baja alta alta bajo elevada alta muy grande baja baja alto

Efectos bioacumulativo no posee

Costo Selectividad ETIOLOGIA

alto alta

bajo baja

Las intoxicaciones accidentales son generalmente de origen profesional, afectando al los obreros que trabajan en la preparacin de los insecticidas o a los peones rurales durante o inmediatamente despus de la aplicacin en cultivos. Las intoxicaciones alimentarias se deben al consumo de alimentos tratados impropiamente con pesticidas. Las intoxicaciones casuales se deben generalmente a confusiones, manejo imprudente y falta de vigilancia de los nios. Las intoxicaciones suicidas y criminales se han hecho ms frecuentes debido a su alta toxicidad y fcil adquisicin. LAGUICIDAS ORGANOCLORADOS Desde el punto de vista estructural, constituyen un grupo de sustancias, muy heterogneo, teniendo en comn la presencia de estructuras monocclicas o policclicas con distinto nmero de sustituyentes cloro. Incluyen varios grupos: a) Grupo de los Ciclodienos:Aldrn y su epxido, el Dieldrn, Mirex b) Grupo del DDT (dicloro-difenil-tricloroetano): p-p-DDT, o-p-DDT, p-pMetoxiclor. c) Grupo del Hexaclorociclohexano (HCH) y Hexaclorobenceno(HCB): HCH, HCH, HCB. d) Grupo de los indenos clorados: hepatacloro, a-Clordano. e) Grupo de los terpenos clorados: Toxafeno.

Absorcin

Por va digestiva principalmente; a travs de la piel cuando estn en solventes lipdicos y a travs de la va respiratoria por su aplicacin en forma de pulverizaciones. Mecanismo de accin Poseen accin neurotropa, aunque no se conoce bien el mecanismo sobre el sistema nervioso. A largo plazo, inducen las enzimas microsomales hepticas. Son inductores en cantidades residuales, del orden de las que pueden estar acumuladas en el tejido adiposo. En el hombre, al igual que en el medio ambiente, se degradan lentamente y se pudo determinar que tienen una gran afinidad por los tejidos grasos. Estas cantidades acumuladas en grasas preocupan, pues por ejemplo, en el caso de adelgazamiento brusco pasan a la circulacin general y producen sntomas de intoxicacin. Preocupa tambin, porque pasan en cantidades considerables a la grasa de la leche. Los recin nacidos se pueden ir contaminando, debido a los residuos de pesticida presentes en su alimento natural. Muestras La sangre es la muestra ms adecuada para la bsqueda de plaguicidas organoclorados ya que por su gran liposolubilidad rara vez aparecen en orina. Se colectan 8-10 ml de sangre en tubo de centrfuga heparinizado. Jugo gstrico: evitar el agregado de carbn vegetal . Conservar en la heladera. Distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos crneos y aguas. Los alimentos son considerados como la principal va de acceso de los pesticidas organoclorados al organismo (80-90% del ingreso diario de plaguicidas segn Kaphalia, 1985). PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS Son sustancias biodegradables en la naturaleza, sin tendencia a acumularse en las grasas del organismo, pero con gran actividad neurotxica que va a producir intoxicaciones agudas de gravedad. Son los insecticidas, junto con los carbamatos y piretroides, ms ampliamente utilizados en la actualidad. Sus estructuras qumicas derivan de la sustitucin por restos orgnicos en el fsforo pentavalente. Pueden clasificarse como: a) Derivados de la molcula del cido fosfrico. Si los dos primeros oxhidrilos se esterifican con radicales alqulicos se obtienen los alquil-fosfatos o alquil-pirofosfatos (ejemplo: dichlorvos) . Si dichos oxhidrilos se sustituyen por amidas se obtienen las fosforamidas (ejemplos: metamidofs, acefato). b) Derivados de la molcula del cido fosforotinico: De este cido derivarn a su vez numerosos steres tiofosfricos (ejemplo: paratin). c) Derivados del cido fosforotiolotinico. (ejemplo: malatin).

d) Derivados del cido fosforotilico (ejemplos: malaoxn, demeton-S-metil.).

Mecanismo de accin Los insecticidas organofosforados actan combinndose con gran afinidad con cierto tipo de esterasas, con la consecuencia de su inactivacin. Esta reaccin, en el contexto de la fisiologa de sus funciones, es irrevesible. Los oxofosforados (enlces P=O) son fuertemente inhibidores, mientras que los tiofosforados (P=S) no son fuertemente inhibidores y necesitarn de una biotransformacin a la forma oxo para actuar como inhibidores. En particular, la inhibicin de las colinesterasas es la que va a derivar en los sntomas y signos de la intoxicacin aguda. El papel fisiolgico de la colinesterasa consiste en la hidrlisis de la acetilcolina, mediador qumico en la transmisin del impulso nervioso. Se acumulan as grandes cantidades de acetilcolina en las sinapsis. Existen dos tipos de colinesterasas: la colinesterasa verdadera, presente en eritrocitos y tejido nervioso y la pseudocolinesterasa presente en suero o plasma. Ambas enzimas son inhibidas por los compuestos organofosforados, pero la eritrocitaria es la que mejor refleja el estado de inhibicin de la colinesterasa del sistema nervioso, por lo que se utiliza para evaluar el estado de intoxicacin aguda de un paciente. Por otro lado, la colinesterasa plasmtica o pseudocolinesterasa es la que ms tarda en regenerarse, por lo que se utiliza en la evaluacin de la exposicin crnica a organofosforados. Absorcin: Los steres fosforados se absorben fcilmente a travs de la piel y ms rpidamente por va digestiva. La absorcin respiratoria es casi instantnea.

Muestras La muestra mas utilizada para la determinacin de organofosforados y sus metabolitos es orina de 24 hs, colectada en envase de vidrio y conservada en heladera. Tambin, como ndice de la intoxicacin, puede determinarse la actividad de las colinesterasas sanguneas: plamtica o eritrocitaria. La determinacin de residuos se realiza, por un lado, en distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos crneos y aguas de bebida, y por otro lado en muestras ambientales como aguas superficiales y suelos.

CARBAMATOS Forman parte de una gran familia de plaguicidas entre los que se hallan herbicidas, fungicidas e insecticidas. Todos ellos derivan del cido carbmico:

Se los divide en tres grupos: 1-N-metil carbamatos: uno de los hidrgenos del grupo amino es reemplazado por un grupo metilo (ejemplos: Aldicarb, Carbaryl, Carbofuran). 2-N,N, dimetil Carbamato: ambos hidrgenos del grupo amino son reemplazados por grupos metilos (ejemplos: Isolan, Pirolan). 3-N-fenil Carbamatos: un grupo fenilo sustituye a uno de los hidrgenos del grupo amino. Mecanismo de accin Es equivalente al mecanismo de accin de los organofosforados, unindose a las colinesterasas e inactivndolas. Pero sta unin es reversible espontneamente en menos de una hora, de manera que en el curso de una intoxicacin aguda por carbamatos se manifiestan los mismos signos y sntomas de la intoxicacin por organofosforados pero con un curso ms rpido hacia la recuperacin. Muestras Se los encuentra en orina de 24 hs. Tambin se los halla en distintos tipos de alimentos contaminados, principalmente de origen vegetal.

INVESTIGACION DE PLAGUICIDAS
CONSIDERACIONES GENERALES

Los plaguicidas deben aislarse de los materiales en los que se encuentran para su investigacin. Los extractos deben someterse a una purificacin antes de investigarlos y/o determinarlos cuantitativamente. La identificacin se realiza por CGL o TLC. La CGL permite alcanzar ms bajos lmites de deteccin , sobre todo con detectores especficos para cada clase de pesticida (OC, OP ). Se distinguen tres pasos fundamentales en su determinacin: 1- EXTRACCION del plaguicida de la matriz originaria y traspaso a una fase separable. La mayora de los plaguicidas se extraen de las muestras con solventes como el ter de petrleo, acetonitrilo o acetona; o bien cloroformo o ter etlico en medio neutro o cido dependiendo del plaguicida y del tipo de muestra. MUESTRAS que pueden llegar al laboratorio: -Biolgica: lavado gstrico, sangre, orina , vsceras. -No biolgica: preparados (polvos, emulsiones, etc.), alimentos, agua, aire, suelo. 2- PURIFICACION del plaguicida (eliminacin de otras sustancias interferentes).Los mtodos de purificacin no son generales para los distintos plaguicidas y algunos no lo son, siquiera para todos los plaguicidas de una misma familia. En general, los extractos pueden purificarse por particin con solventes y/ o por cromatografa en columna de florisil, celite, slica gel, almina o carbn activado. 3- DETERMINACION Cualitativa y/o Cuantitativa (TLC y CGL). La identidad de un plaguicida debe confirmarse por un segundo mtodo. Por ejemplo, si el plaguicida se ha reconocido por CGL podr efectuarse un TLC; una CGL empleando un detector selectivo para otro elemento presente en el plaguicida; o bien una CGL con columnas recubiertas con fase(s) de polaridad diferente a las usadas en el primer anlisis; o una CGL combinada con un espectrmetro de masas. Para el dosaje de plaguicidas se requieren mtodos que los separen y detecten cuantitativamente, siendo el ms adecuado la CGL.

A- Investigacin de plaguicidas en frutas y verduras

1- EXTRACCIN: tomar 50 gramos del vegetal elegido y se colocan en un homogeneizador (licuadora) junto con 100 ml de acetonitrilo y 5 gramos de celite, homogeneizar durante 2 minutos a gran velocidad. Filtrar por succin con papel de filtro poro medio y medir el volumen obtenido: V1 Transferir la mitad de V1 a una ampolla de decantacin de 500 ml, agregar 20 ml de ter de petrleo (EP); agitar durante 1 o 2 minutos, luego agregar 10 ml de sol. concentrada de ClNa y 100 ml de agua destilada. Agitar vigorosamente durante 30-45 segundos. Retirar la fase acuosa. Lavar la fase EP con 20 ml de agua destilada dos veces. Filtrar la fase EP por papel de poro medio que contenga sulfato de sodio anhidro y medir el volumen obtenido: V2. Concentrar en plancha calefactora o en Bao de Mara (con mucho cuidado hasta 2 o 3 ml finales).En el residuo se identifican OC y OP por TLC y/ o CG (en el residuo purificado).

2-PURIFICACIN: (Fase Estacionaria por Va Hmeda): tomar entre 3 y 5 gramos de florisil activado a 650C, 5 Hs. y luego mantenido a 130C . Suspender en ter de petrleo. Agregar esa suspensin a la columna cromatogrfica poco a poco, de manera que se forme una lluvia fina de Florisil, homogeneizando con golpes cuidadosos, hasta obtener una altura de 10 cm. Sobre el Florisil y operando de manera similar, aadir sulfato de sodio anhidro llegando a una altura total de 12 cm. Dejar eluir el EP hasta que slo sobrepase la fase estacionaria Florisil-sulfato de sodio en 2-3 mm. y sembrar la muestra. Dejar eluir hasta unos pocos mm por encima del sulfato de sodio y comenzar con el agregado del eluyente elegido (al principio, el agregado se efecta con pipeta , para no romper la fase estacionaria y luego se llena el reservorio). Se eluye a una velocidad de flujo de 5mm/ min o menor, con tres fracciones de solvente de elucin de 100 ml cada una. El primer solvente de elucin es ter etlico al 6% en ter de petrleo, el segundo es ter etlico al 15% en ter de petrleo, y el tercero es ter etlico al 50% en ter de petrleo. Los plaguicidas se van eluyendo de acuerdo a la relacin de polaridades de estos dos solventes:
Fraccin del 6%: Clorados: Aldrin, DDE, DDT, Heptacloro Fosforados: Ethin Fraccin del 15%: Clorados: Dieldrin, Endrin Fosforados: Metilparatin, Diazinn, Paratin Fraccin del 50%: Fosforados: Malatin

Concentrar cada fraccin hasta no ms de 2-3 ml. Este ser utilizado para sembrar en TLC o inyectar en un cromatgrafo gaseoso.

B-Investigacin de plaguicidas en orina, sangre y lavado gastrico

1-EXTRACCION: Se utilizan las columnas tipo EXTRELUT , rellenas con tierra silcea como soporte inerte. Si la muestra a sembrar consiste en ORINA, se acidificarn 19 ml de la misma con 1 ml de solucin saturada de ACIDO TARTARICO (pH: 5-6).

Si la muestra es PLASMA o SUERO se realiza una dilucin con agua destilada (4 ml de suero o plasma se llevan a 19,5 ml con agua destilada) y se acidifica con 0,5 ml de solucin saturada de cido tartrico. Si la muestra es LAVADO GASTRICO, se toman 9,5 del mismo y se llevan a 19 ml con agua destilada (si no se practica la dilucin , el lquido taponara la columna por su alta densidad) y se acidifica con 1 ml de solucin saturada de cido tartrico. Se realiza una primera elucin con ter de petrleo (E1). Se cambia el recipiente de recoleccin y se eluye ahora con ter etlico obtenindose un segundo extracto (E2). Ambos extractos se concentran por evaporacin a Bao Mara. En el primer extracto (E1), se aislarn los plaguicidas ORGANOCLORADOS. Para sembrarlo en TLC es necesario resuspender con Hexano. En el segundo extracto (E2) se hallarn los ORGANOFOSFORADOS y CARBAMATOS. Para sembrarlo en TLC, es necesario resuspender en una mezcla Tolueno: Propanol (1: 1).

C- Investigacin de plaguicidas en aguas

Se colocan 750 ml de agua (muestra) en una ampolla de decantacin de 1 litro. Se agrega 25 ml de n-hexano. Se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se separan las fases y se recoge la capa de n-hexano. Se efectan 2 extracciones ms con n-hexano y se renen los extractos. Secar la fase orgnica con sulfato de sodio anhidro. Filtrar y concentrar a baja temperatura. Generalmente se hallan trazas de plaguicidas en agua, por eso se parte de un gran volumen de muestra.

D- Investigacin de plaguicidas en visceras. Mtodo de Fassi adaptado.

1-EXTRACCION: En un vaso de precipitados se colocan 50 gr. de papilla de vsceras, bien trituradas, se le agrega cido tartrico slido (como desproteinizante) hasta pH cido y luego sulfato de sodio anhidro mezclando hasta consistencia pastosa. La mezcla se seca bajo una corriente de aire caliente (secador de cabello). El contenido del vaso se transvasa a un erlenmeyer con tapa esmerilada. El material se extrae con ter de petrleo (punto de ebullicin 40-60C ) agregndolo hasta cubrir la papilla. Agitar enrgicamente durante 60 segundos, repitindose el proceso dos veces ms. Dejar en reposo hasta una neta separacin de las fases. Reservar la fraccin etrea para la investigacin de plaguicidas. 2-PURIFICACION: El extracto de ter de petrleo se trata con acetonitrilo saturado en ter de petrleo; se dispersa en agua (200 ml de agua destilada con 10 ml de solucin saturada de ClNa); se extrae con 50 ml de ter de petrleo.

Si el extracto est impuro se toma con Celite 545 , mezclando cuidadosamente y eliminando el solvente en corriente de aire, hasta que no queden partculas aglomeradas. Se prepara una columna (de 0,8 x 16 cm) taponndola con algodn y colocando en ella la muestra absorbida en el Celite a travs de un embudo y compactando el polvo tanto como sea posible con una varilla. Se prepara una segunda columna (de 1,4 x 16 cm) con llave, llenndola con ter de petrleo, empujando con una varilla de vidrio un tapn de algodn hasta el fondo. Posteriormente se agregan 5 g de almina y luego 5 g de Florisil , cubriendo finalmente con una capa de arena de 2 a 2,5 cm de espesor, drenndose el solvente , hasta que el nivel del mismo alcance la parte inferior de la capa de arena. Se inserta el extremo inferior de la columna de 0,8 cm en el extremo superior de la columna de 1,4 cm. La columna pequea que contiene los plaguicidas se eluye con 3-4 ml de dimetilsulfxido (DMSO) aplicando presin positiva. Abriendo la llave de la columna grande se permite la entrada del DMSO en el Florisil, retirndose luego la columna superior y comenzando la elucin con 100 ml de ter de petrleo. Recoger el eludo en un vaso de precipitado y evaporar suavemente.

DETERMINACION cuali / cuantitativa de OC, OP y CARBAMATOS.

a)-IDENTIFICACIN DE ORGANOCLORADOS POR TLC Se usa esta metodologa cuando se sospecha una alta concentracin de plaguicida en la muestra. Sembrar la muestra (el extracto etreo purificado) y patrones en una placa de slica G (9 gramos de slica G: 18 ml de agua). Fase Fija: slica gel G activada a 120C durante 2 Hs. Fase Mvil: n Hexano:Acetona (9:1) Testigos: DDT, Gamexane Desarrollar hasta llegar el frente de solvente a 10 cm. Revelado: Difenilamina al 0.2% en etanol absoluto. Rociar y exponer a UV entre 20 -60 minutos. Determinar los Rf caractersticos de las muestras y patrones. Se detectan concentraciones del orden de los microgramos. b)-IDENTIFICACIN DE ORGANOFOSFORADOS POR TLC Fase fija: slica gel G activada a 120C durante 2 Hs. Fase Mvil: n Hexano:Acetona (8:2) Testigos: Paratin, Malatin Revelado 1: Cloruro de paladio al 0.5% en HCl al 10% Rociar y calentar a 80 C durante 20 minutos. Aparecen manchas pardas para fosforados. Determinar los Rf y caracterizar las manchas halladas en funcin de los patrones.

Revelado 2: Inhibidor de la Colinesterasa. Una vez corrida la placa , se la expone a vapores de bromo dentro de una cuba. El bromo oxidar el azufre de la molcula de OP a oxgeno.

En hgado tambin ocurre una oxidacin del plaguicida por oxidasas microsomales hepticas, aumentando su potencial txico. Luego de exponer la placa al aire para evaporar el exceso de bromo que interfiere en el resto de la reaccin , se hace una aspersin con la enzima Colinesterasa y se lleva a estufa a 37C durante 30 minutos. La enzima se obtiene a partir de un homogenato de hgado (lugar donde se sintetiza) o bien puede utilizarse suero o plasma fresco.

Luego de hacer la aspersin , la enzima ser inhibida en los sitios donde se encuentra el plaguicida. Para evidenciarlo se pulveriza con acetato de alfa naftilo/ Fast Blue. El acetato de alfa naftilo es sustrato de la enzima y liberar naftol. Luego el naftol se copula con el Fast Blue dando color lila donde la enzima es activa.

Donde la enzima es inhibida por el plaguicida no se produce la reaccin , quedando blanco. La placa se ver lila con manchas blancas. Sensibilidad: 0,1 a 1 ng. Interferencias: fenotiazinas, cocana dan positiva la reaccin. Cuando da negativa se puede descartar la presencia de OP; si da positiva debe confirmarse con otros revelados. c)-IDENTIFICACION SIMULTANEA DE OP, OC Y CARBAMATOS POT TLC Fase fija: slica gel G activada. Fase Mvil: Ciclohexano:Hexano:Cloroformo:Acetona (4:4:1:1).
Testigos: OCl: Heptacloro y Lindane

OF : Parathion y Malathion Carbamatos: Furadan y Carbaryl.

Revelado: se lleva a cabo un revelado secuencial que consiste en: 1-Difenilamina alcohlica. Rociar y colocar la placa al sol durante 30 minutos. Los pesticidas organoclorados aprecern de color gris verdoso. 2-KOH al 10% en agua. Calentar suavemente. 3-Tetrafluorborato de nitrobencenodiazonio en etanol con gotas de etilenglicol o propilenglicol. Los carbamatos aparecen azules o rosas. 4-Cloruro de Paladio 0,5% en HCl al 10%. Los organofosforados aparecen de color naranja.

REACTIVOS REVELADORES Difenilamina al 0,2% en Etanol: 0,2 gr de Difenilamina en 100 ml de Etanol. PREPARAR EN EL MOMENTO. 0,5 gr de Cloruro de paladio se disuelven en 100 ml de ClH al 10 %. 10 gr de K(OH) en 100 ml de agua. se disuelven 25 mg de este reactivo en etanol:etilenglicol (9:1). Se conoce comercialmente como Fast red.

Cloruro de Paladio al 0,5% en ClH al 10%: Hidrxido de Potasio al 10%: Tetrafluoroborato de 4nitrobencenodiazonio:

d)-IDENTIFICACIN de OC y OP en CGL En la cromatografa gas- lquida la muestra se distribuye entre dos fases: una fija y una mvil. A travs de la fase fija (lquida), adsorbida sobre un soporte inerte, circula la fase mvil (gas) transportando la muestra vaporizada. Las molculas de la muestra tardarn cierto tiempo en recorrer la columna segn su polaridad con respecto a la fase fija. Cuando circula el gas portador, se registrar una lnea de base. Cuando se inyecta la muestra y se detecta, aparecer un pico. Del cromatograma se obtendr la siguiente informacin:

-Tiempo de retencin: es el tiempo que tarda en aparecer el pico, desde la inyeccin hasta la altura mxima del mismo. -rea del pico: es proporcional a la concentracin de la muestra. Para identificar una sustancia se debe pasar la muestra por distintas columnas, de diferente polaridad. Si en todas coincide el tiempo de retencin de la muestra con el testigo, decimos que se trata de esa sustancia.
Se utilizan tres tipos de columnas: OV17 QF1 -DC2000 DC2000 Fenil silicona Trifloruro propil Metil silicona Metil silicona

El flujo a travs de la columna debe ser constante y es necesario regularlo de modo que permita el intercambio y se reproduzca el tiempo de retencin. La cmara inyectora se encuentra a elevada temperatura, en ella se siembra la muestra, la cual es vaporizada y arrastrada por el gas carrier. Ventajas: alta resolucin y gran sensibilidad. Detecta trazas. Desventajas: es necesario la purificacin previa de la muestra, para poder inyectarla. Adems la muestra debe ser de bajo punto de ebullicin para que se volatilice. Conviene usar detectores que respondan a un nmero limitado de elementos o estructuras de modo de separar ms eficazmente el plaguicida contaminante de las interferencias presentes en la muestra. Para determinar OC se utiliza detector de captura de electrones. A medida que el gas portador (Nitrgeno) fluye a travs del detector, una lmina de Ni radiactivo ioniza las molculas del gas y genera electrones. Estos se desplazan hacia el nodo lo cual produce una corriente de fondo que se visualiza como la lnea de base en el cromatograma. Si se inyecta una muestra con molculas que tengan tomos electronegativos , disminuye la seal elctrica y en el cromatograma se ve un pico. Se detectan microgramos y hasta nanogramos de OC. Generalmente se utiliza una columna capilar de polaridad intermedia con polifenil metil siloxano como relleno. Temperatura del detector: 300C. Gas portador: Nitrgeno (caudal: 10 ml/ min.). Programa de temperatura: Temperatura inicial de 190C durante 1 minuto. Temperatura final de 250C durante 6 minutos. La variacin de temperatura es de 1/ min. entre ambas. Para los OP se utiliza un detector fotomtrico de llama. Este detector consiste en una pequea llama de hidrgeno quemndose en un exceso de aire y rodeada por un campo electrosttico. El efluente de la columna (con Nitrgeno como gas portador) entra a la base del mechero y se mezcla con el Hidrgeno.

Los compuestos orgnicos al salir de la columna se ionizan y los electrones libres son colectados en un electrodo cargado positivamente aumentando de esta manera la corriente que circula por l, la cual es amplificada y registrada. Este detector responde slo a tomos de Carbono que sean oxidables. Posee una sensibilidad del orden de los nanogramos. Para la determinacin se inyecta entre 0.5-2 microlitros de muestra. INHIBICION de COLINESTERASA - (Como recurso de identificacin de la intoxicacin con plaguicidas organofosforados y carbamatos ). Debido a que resulta difcil encontrar algn plaguicida organofosforado en suero u orina o sus metabolitos, se recurre a determinaciones en suero, plasma o sangre entera que son muy rpidas y pueden dar indicio de la gravedad de la intoxicacin. Para la identificacin rpida de colinesterasa, existen tcnicas de ejecucin simple, basadas algunas de ellas, en el empleo de papeles reactivos. El denominado Merckotest, se recomienda para determinar la actividad de la enzima en suero o plasma, no slo es til en casos de exposicin o de intoxicacin con inhibidores de colinesterasa, sino tambien en diversos estados patolgicos (lesiones hepticas) o para evaluar la accin de ciertos medicamentos sobre el sistema enzimtico. Mtodo pHmtrico de Michel (para acetilcolinesterasa eritrocitaria). FUNDAMENTO: La acetilcolinesterasa provoca la hidrlisis de la acetilcolina en colina y cido actico. Este mtodo estima la actividad de la enzima, midiendo el cambio de pH a travs del empleo de un electrodo de vidrio. Otros mtodos como el de W. Caraway, registra el cambio de pH usando un indicador colorimtrico. MUESTRA: Se trabaja con sangre heparinizada, aproximadamente 8 ml de sangre, obtenida por venopuncin (evitar la hemlisis), transferirla a un tubo heparinizado (con una gota de heparina), tapar y agitar cuidadosamente por inversin. Es conveniente separar el plasma de las clulas lo ms pronto posible, cuando esto no se pueda llevar a cabo, se debe refrigerar la muestra a 4C durante 2-3 horas (no es conveniente por ms tiempo). Procedimiento para la determinacin de acetilcolinesterasa eritrocitaria
REACTIVOS

Solucion tampon para globulos rojos: Barbital sodico 0,2 N (4,1236 gr), fosfato de potasio diacido, 0,004 N (0,5444 gr) y cloruro de potasio 0,6 N (44,736 gr). Disolver los reactivos en 950 ml de agua. Ajustar el pH: 8,10 exactamente a 25 C, con ClH 0,1 N ( se requieren alrededor de 28 ml). Agregar gotas de tolueno y guardar en refrigerador. Debera comprobarse el pH y la capacidad de la solucion tampon cada vez que se va a usar ya que estos valores tienden a variar con el tiempo. NOTA: dietilbarbiturato de sodio= Barbital sodico= Veronal sodico. Ioduro de acetilcolina: Disolver 3,004 gr de Ioduro de acetilcolina en agua y llevar a 100 ml. Agregar gotas de tolueno y guardar en heladera. Si la muestra fue refrigerada esperar a que alcance la temperatura ambiente. Saponina al 0,01%: Disolver 10 mg de saponina en agua y llevar a 100 ml.

Heparina: 10000 U/ml. Transferir 0.04 ml exactos de glbulos rojos sedimentados a un matraz de 5 ml conteniendo 2 ml de saponina al 0.01 %, enjuagando la pipeta con la mezcla de saponina y glbulos rojos, hasta que todas las clulas se desprendan de la pipeta. Mezclar mediante vortex. Una vez preparadas las muestras, aadir a cada tubo 2 ml de solucin tampn (para eritrocitos), esperar l0 min. Determinar el pH de la solucin hasta 0.01 de unidad y anotarlo como pH1, (si la lectura es< de 7.97 desechar la prueba y comenzar otro ensayo con una solucin tampn recin preparada). Aadir 0.4 ml de sol. 0.1 M de yoduro de acetil colina para eritrocitos, mezclar con vortex y anotar como T1 el momento en que se aadi el yoduro , dejar reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, cumplido este tiempo determinar el pH de la mezcla, se tomar como pH2 y el momento que se mide como T2 CALCULO: El pH/hora se determina siguiendo el siguiente esquema:
(pH1 - pH2 -b) x pH/hora= t reccion

b: correccin para la hidrlisis no enzimtica (ver tabla) : correccin para la variacin de pH/hora con el pH. t reccion : T2-T1, expresado en horas. Los factores de correccin para la hidrlisis no enzimtica, no son lineales con respecto al tiempo. Valor de referencia: La cifra promedio de la actividad de la colinesterasa en un grupo de individuos normales de acuerdo a Michel, es de Delta de pH/hora: 0.75 para GR. Factores de correccin que se emplean en el clculo:
pH b f

7.90 7.20 7.10 7.00

0.03 0.00 0.00 0.00

0.94 1.00 1.00 1.00

6.90 6.80 6.70 6.60 pH

0.00 0.00 0.00 0.00 b

0.99 0.98 0.97 0.97 f

6.50 7.30 7.80 7.70 7.60 7.50 7.40

0.00 0.00 0.02 0.01 0.00 0.00 0.00

0.97 1.00 0.95 0.96 0.97 0.98 0.99

Procedimiento para la determinacin de colinesterasa plasmtica La Colinesterasa srica o plasmtica (Pseudocolinesterasa o Butirilcolina esterasa) cataliza la reaccin de hidrlisis de los steres de la colina, tal como la S-butirilcolina, con mxima actividad a pH 7,7. La tiocolina liberada reacciona con el cido 5,5ditiobis-2- nitrobenzoico (DTNB) produciendo un compuesto amarillo de acuerdo al siguiente esquema de reaccin.
Butirilcolina + agua Tiocolina + DNTB Tiocolina + Butirato

Colinesterasa

2-nitro-5-mercaptobenzoato.

La velocidad de aparicin de color es directamente proporcional a la actividad enzimtica y se mide a 405 nm. Criterios para determinacin del grado y tipo de intoxicacin.
Colinesterasa Srica Colinesterasa Eritrocitaria Indica

>o.75 pH/h normal o Normal o poco descendida poco descendida (0.750.60)

-No intoxicacin. -Leve intox. -Intoxicacin a carbamatos.

discretamente descendida -Intoxicacin moderada o (0.60-0.50) a dosis repetidas Muy descendida muy descendida (0.500.25) -Intoxicacin grave (aguda).