iQ-Check Salmonella II Kit

Catalog #: 357-8123
User Guide
Test for the real-time PCR detection of Salmonella spp. in food, animal feed and environmental samples

TABLE OF CONTENTS

I. II.

Introduction iQ-Check Salmonella spp. technology

III. Kit components IV. Shelf life and storage V. Material required but not supplied VI. Precautions and recommendations VII. Protocol A. Sample enrichment B. DNA extraction C. Real-time PCR D. Data analysis VIII. Confirmation of positive results IX. Confirmation of single colonies using iQ-Check X. Test performances and validations XI. References APPENDIX A: PCR Mix Calculation Guide

2008 Bio-Rad

I. INTRODUCTION Salmonellae are the most frequent causes of food poisoning in the world, despite the many preventive measures taken to control these organisms. In the United States and other industrialized countries, declared cases of salmonellosis vary around 70,000-100,000, however the true incidence of food-borne Salmonella infection is estimated to be much higher, in the order of 4-5 million cases a year. Eggs, dairy products, meat and poultry are the most common foods associated with the transmission of Salmonellae (65% of cases). More than 2000 serotypes have been identified, all of which are potentially pathogenic to man. Due to the low infective dose and the serious threat posed to producers and consumers of food, several countries now require total absence of salmonellae in food products. Conventional bacteriological methods are often long and tedious. In comparison, iQ-Check Salmonella II is a simple and rapid qualitative test, allowing the detection of specific DNA sequences unique to Salmonella spp. found in food products, animal feed and environmental samples. Using real-time polymerase chain reaction (PCR), Salmonella spp. specific DNA sequences are amplified and detected simultaneously by means of fluorescent probes. Up to 94 samples can be processed, with a minimized risk of contamination and an easy to use procedure. The use of this test allows results to be obtained within a few hours following pre-enrichment of a sample. The intended users of this kit are trained laboratory personnel who are performing tests to detect Salmonella spp. II. THE iQ-Check Salmonella II TECHNOLOGY The iQ-Check Salmonella II kit is a test based on gene amplification and detection by real-time PCR. Ready-to-use PCR reagents contain DNA primers and a DNA probe specific for Salmonella spp., as well as DNA polymerase and nucleotides. Detection and data analysis are optimized for use with a Bio-Rad real-time PCR instrument, such as the Chromo4 System and MiniOpticon. PCR is a powerful technique used to generate many copies of target DNA. During the PCR reaction, several cycles of heating and cooling allow DNA denaturation, by heat, followed by primers binding to the target region. The DNA polymerase then uses these primers and deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) to extend the DNA, creating copies of the target DNA. These copies are called amplicons. In real-time PCR, specific probes are used to detect the DNA during the amplification, by hybridizing to the amplicons. These probes are linked to a fluorophore which fluoresces only when hybridized to the target
2008 Bio-Rad 3

sequence; in the iQ-Check Salmonella kits, FAM is the fluorophore linked to the probe hybridizing to the Salmonella spp. specific DNA sequence. In the absence of target DNA, no fluorescence will be detected, and the sample determined to be negative. As the amount of amplicons increases with each round of amplification, fluorescence intensity also increases. During each PCR cycle, at the annealing step, the optical module or detector measures this fluorescence, whereas the associated software plots the fluorescence intensity versus number of cycles. This method allows a simple determination of the presence of Salmonella spp in a sample. To monitor for a successful DNA amplification in each reaction tube, a synthetic DNA "internal control" is included in the reaction mix. This control is amplified with a specific probe at the same time as the Salmonella target DNA sequence, and detected by a second fluorophore. This test allows the detection of Salmonella spp. in all food products, animal feed and environmental samples previously enriched by culture (18h 2h ,or 8h for raw meats) in buffered peptone water. It includes the following four main steps:
ENRICHMENT DNA EXTRACTION REAL-TIME PCR DATA ANALYSIS & INTERPRETATION

III. KIT COMPONENTS

Reference ID A B C D E Reagent Lysis reagent Fluorescent probes Amplification mix PCR negative control PCR positive control Quantity Provided 1 bottle (20 ml) 1 tube (0.55 ml) 2 tubes (2 x 2.2 ml) 1 tube (0.5 ml) 1 tube (0.25 ml)

The iQ-Check Salmonella II kit contains sufficient reagents for 96 tests. IV. SHELF LIFE AND STORAGE Once received, the kit must be stored between +2C and +8C. Reagents stored between +2C and +8C can be used until the expiration date indicated on the reagent tube.

2008 Bio-Rad

V. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Equipment: Bio-Rad real-time PCR system, eg Chromo4 or MiniOpticon Systems. See real-time PCR system user guide for iQ-Check kits (Chromo4/MiniOpticon #: 93269, Rev. B - iQ5 #: 93270, Rev. A - iCycler iQ #: 93271, Rev. A) Stomacher, masticator or equivalent for homogenizing test samples Incubator, capable of maintaining 37C 2C Dry Heat block, for 1.5 ml tubes and/or for 96-well plates (100C 5C), Bench top centrifuge (maximum 10,000-12,000 g, for 1.5 ml tubes) Optional: centrifuge with rotor for 96-well plates or 8-tube strips (max 2,000 g) Vortex apparatus Magnetic stir plate 20 l, 200 l and 1000 l micropipettes Combitip pipettes, or equivalent repeat pipettors Optional for extraction with grinding step (Standard protocol II only): - Cell Disruptor, such as a Disruptor Genie* (Scientific Industries), Bio-Rad cat #: 359-1456 * Contact Bio-Rad for detailed information on instruments recommended by our technical department Note: We recommend using a universal power source (UPS) with the thermal cycler. Supplies PCR plates, tubes, sealing tape and caps, see real-time PCR system user guide for iQ-Check kits Optional for extraction: - 96-well plate full-profile, (Bio-Rad cat.#: 223-9441) - 8 tube-strip 200l full-profile, (Bio-Rad cat. #: 223-9469) - 8-cap strips; for 0.2 ml tubes and plates, ultraclear, 120 cap-strips (Bio-Rad cat. #: TCS-0803) Pre-enrichment medium: buffered peptone water, (Eg. Bio-Rad cat. #: 356-4684 for 500 g; 355-4179 for 225 ml x 6 bottles; 355-5789 for 2.3 L x 5 bags; 355-5790 for 5 L x 2 bags) RAPIDSalmonella agar** (Eg. Bio-Rad cat #: 356-3961 for 90 mm X 20 dishes; 356-4705 for 500 g; 356-4706 for 100 g) ** Can be used outside scope of AOAC-RI validation. Lysis beads (reagent F - for Standard Protocol II only) Bio-Rad cat. #: 357-8136
2008 Bio-Rad 5

 Stomacher bag with incorporated filter 1 ml and 10 ml pipettes Sterile filter tips, adaptable to 20 l, 200 l and 1000 l micropipettes 1.5 ml conical screwcap sterile tubes (E.g. Bio-Rad cat.#: 224-0110) Tips for Combitip pipettes or equivalent repeat pipettors, sterile, individual package 2 ml and 5 ml sterile test tubes Powder-free gloves Distilled sterile water Bleach 5% Cleaning agent such as DNA AWAY or RNase AWAY VI. PRECAUTIONS AND RECOMMENDATIONS FOR BEST RESULTS This test must be performed by adequately trained personnel. Food samples and enrichment cultures must be handled as potentially infectious material and eliminated according to local rules and regulations. All potentially infectious material should be autoclaved before disposal. The quality of results depends on strict compliance with the following Good Laboratory Practice, especially concerning PCR: - The laboratory equipment (pipettes, tubes, etc.) must not circulate from one work station to another. - It is essential to use a positive control and a negative control for each series of amplification reactions. - Do not use reagents after their expiration date. - Vortex reagents from the kit before using them to ensure homogeneity. - Periodically, verify the accuracy and precision of pipettes, as well as correct functioning of the instruments. - Change gloves often, especially if you suspect they are contaminated. - Clean work spaces periodically with at least 5% bleach and other decontaminating agent such as DNA AWAY. - Use powder-free gloves and avoid fingerprints and writing on caps of tubes. Both cases will interfere with data acquisition. It is strongly advised to follow the general requirements described in the standard EN ISO 22174:2005 Microbiology of food and animal feeding stuffs Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food pathogens General requirements and definitions

2008 Bio-Rad

VII. PROTOCOL It is strongly recommended to read the entire protocol before starting the test. The following table outlines the different protocols that can be used depending on the application and the scope of the validation:
Protocol Standard I Easy I Standard II Easy II Easy I Standard II Enrichment 18h 2h, 37C 21h 1h, 37C 8h , 37C 21h 1h, 37C 21h 1h, 37C 8h, 36C Certification AFNOR VALIDATION AFNOR VALIDATION AFNOR VALIDATION AFNOR VALIDATION AOAC-RI AOAC-RI Scope Food products, animal feed, & environmental samples Food products, animal feed, & environmental samples Raw meats Raw beef * Eggs, raw chicken, raw beef, cantaloupe Raw ground beef *

* Protocol used when also detecting E.coli O157:H7 from the same raw ground beef sample.

A. Sample Enrichment Enrichment media must be at the appropriate incubation temperature before use. Homogenize 25 g of sample in 225 ml of pre-heated buffered peptone water, in a stomacher bag with incorporated filter. Standard protocol I - Incubate without shaking for 18 hours 2 hours at 37 C 1C. - Collect 1 ml of decanted, enriched suspension into a 1.5 ml conical tube with screw cap. See DNA extraction below. Standard protocol II - Incubate without shaking for 10 hours 2 hours, at 37 C 1C** -Collect 1.0 ml of decanted, enriched sample using a disposable 1 ml pipette, into a 1.5 ml conical tube with screw cap. See DNA Extraction below (Standard protocol II). ** Within the scope of the AOAC-RI validation, incubate at 36C 1C. Easy protocols I and II - Incubate without shaking for 21 hours 1 hour at 37 C 1C. - Collect 100 l of decanted, enriched suspension into a 1.5 ml conical tube with screw cap, tube-strip or well in 96-well plate containing the lysis reagent. See DNA extraction below (Easy protocol).

2008 Bio-Rad

Note: Do not shake the suspension before collecting sample, except for the Standard protocol II and Easy protocol II, in which case it is important to shake the suspension to homogenize the culture and then allow any debris to decant before collecting the sample. In general, avoid collecting large fragments of food debris. For food samples with a fatty supernatant, collect the sample just below this layer. B. DNA Extraction Before starting the test:
Preheat dry heat block Turn on heat block and set it to 95C - 100C Standard protocol I and Easy protocol I: use lysis reagent A as provided. Standard protocol II and Easy protocol II: Reconstitute the final lysis reagent as follows: Carefully pour all the contents from reagent F (lysis beads) into reagent A (lysis reagent) The lysis reagent mixed with lysis beads (reagents A + F) has a shelf life of 6 months, when stored at 4C.

Prepare lysis reagent

* Reagent F (lysis beads) is included in the iQ-Check E.coli O157:H7 kit or can be ordered separately. Standard protocol I 1 - Centrifuge collected 1 ml enriched sample at 10,000-12,000 g. for 5 minutes. 2 - Discard all the supernatant. 3 - Add 200 l of the lysis reagent (reagent A) to the pellet. Note: Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on a magnetic stir plate, in order to keep it in suspension and collect the resin. 4 - Resuspend pellet by pipetting the reagent up and down in the tube. 5 - Vortex at high speed. 6 - Place the tube in the heat block at 95C - 100C for 10 to 15 minutes. 7 - Vortex at high speed. 8 - Centrifuge at 10,000-12,000 g for 5 minutes.

2008 Bio-Rad

Standard protocol II (includes grinding step) 1 - Centrifuge collected 1.0 ml enriched sample at 10,000-12,000 g for 5 minutes. Discard all the supernatant. 2 - Add 200 l of the final lysis reagent (reagents A + F) to the pellet. Note: Gently shake the lysis reagent by hand first to resuspend the beads. Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on a magnetic stir plate, in order to keep it in suspension and collect the beads. Use consumables with a wide enough tip to allow pipetting of the homogenized lysis reagent. 3 - Resuspend pellet by pipetting the reagent up and down in the tube. 4 - Place tube in the Cell Disruptor for 3 min 1min. 5 - Place tube in the heat block at 95C - 100C for 10 to 15 minutes. 6 - Vortex at high speed. 7 - Centrifuge at 10,000-12,000 g for 5 minutes. Easy protocol I 1- Aliquote 100 l of homogenized lysis reagent to the 1.5 ml screw cap tubes, tube-strips or wells in 96-well full-profile plate that will be used for the DNA extraction. Note: Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on a magnetic stir plate, in order to keep it in suspension and collect the resin. 2 - Add 100 l of the enriched suspension to 100 l of the lysis reagent. Mix the solution by pipetting up and down in the tube and close with caps. 3 - Incubate in heat block at 95C - 100C for 10 to 15 minutes. 4 - Vortex at high speed (for tubes). 5 - If using tube-strips or a plate, allow to cool down to room temperature 6 - Centrifuge at 10,000-12,000 g at least 2 minutes for 1.5 ml screw cap tubes (2,000 g for plates and tube-strips for 1 minute). Open tube strips or wells in plate carefully, one by one, to avoid cross-contaminations between wells.

2008 Bio-Rad

Easy protocol II (includes grinding step) 1 - Aliquote 100 l of reconstituted and homogenized lysis reagent (reagents A + F) to the 1.5 ml screw cap tubes that will be used for the DNA extraction. Note: Gently shake the lysis reagent by hand first to resuspend the beads. Pipette the lysis reagent while it is stirring at medium speed on a magnetic stir plate, in order to keep it in suspension and collect the beads. Use consumables with a wide enough tip to allow pipetting of the homogenized lysis reagent. 2 - Add 100 l of the enriched suspension. Mix the solution by pipetting up and down in the tube until homogenized. 3 - Place tube in the Cell Disruptor for 3 min 1min. 4 - Incubate in the heat block at 95C - 100C for 10 to 15 minutes. 5 - Vortex at high speed, for a few seconds. 6 - Centrifuge at 10,000-12,000 g for at least 2 minutes. For all extraction protocols: Open tubes carefully to avoid any possible cross contaminations. For the amplification reaction, use 5 l of the supernatant obtained, containing the DNA extract* (do not vortex before collecting 5 l sample). *At this step: For samples showing inhibition on a previous test, perform a 1/10 dilution in distilled sterile water, using 10 ul of DNA extract. Then use 5 l of the appropriate dilution for amplification1. The remaining supernatant can be stored for up to 1 year at -20C. Before reusing the supernatant, always allow it to thaw, then centrifuge it at 10,000-12,000 g for 5 minutes. If you choose to temporarily stop the procedure, this is the recommended stopping point.
1

In the scope of the AFNOR certified method for samples showing inhibition with a 1/10 dilution of the DNA extract, it is possible to remove this inhibition by using the following modified enrichment protocol: - Homogenize 25 g of sample in 225 ml of buffered peptone water, in a stomacher bag with incorporated filter. - Incubate without shaking for 18h 1 hour at 37C. - Mix the suspension, collect 20 l and add it to 1 ml of buffered peptone water (warmed to 37C), in a 1.5 ml conical screw cap tube. - Incubate without shaking for 4h 1 hour at 37C. - Carry out the iQ-Check test by centrifuging directly this tube containing the secondary enrichment and following the standard extraction protocol I.

10

2008 Bio-Rad

C. Real-time PCR 1. Instrument and software setup For instrument and software setup, follow instructions in the real-time PCR system user guide for iQ-Check kits. 2. PCR mix preparation 2.1 Prepare a PCR mix containing the amplification solution (reagent C) and the fluorescent probes (reagent B) according to the PCR mix calculation guide found in Appendix A. To find the correct volumes to use, add the total number of samples and controls to be analyzed, and find the corresponding volumes in the table. At least one positive and one negative control must be included in each PCR run. 2.2 After preparation, the PCR mix (reagent B + C) must be used immediately or is stable for 1 hour at 4C. 2.3 Pipette 45 l of this PCR mix in each well according to your plate setup. 2.4 Add 5 l of sample or reagent D (negative control) or reagent E (positive control) and seal the wells. It is important to avoid bubbles at the bottom of the wells by pipetting carefully. To eliminate any bubbles, centrifuge the sealed PCR plate or the PCR strips (quick spin). 2.5 Place the plate or strips in the thermal cycler. Be sure to place the plate correctly: A1 well at the upper left corner. Close the reaction module. 3. PCR Start To start the PCR run, follow instructions in the real-time PCR system user guide for iQ-Check kits. D. Data Analysis Data can be analyzed directly at the end of the PCR run or at a later time by opening the stored data file. Follow instructions in the corresponding real-time PCR system user guide for iQ-Check kits, for opening data files and setting the data analysis parameters.

2008 Bio-Rad

11

1. Interpreting Results Once the data analysis parameters have been set, results are interpreted by analyzing the Ct values of each sample (the cycle at which the amplification curve crosses the threshold). It is also possible to use the software iQ-Check Analysis (cat. # 359-3135) for an automated interpretation and report generation of all data (see iQ-Check Analysis user guide). A complete automated analysis is available with the Opticon Monitor Software, for the Chromo4 and MiniOpticon systems (see Chromo4 and MiniOpticon User Guide for iQ-Check kits, #: 93269, Rev. B). 1.1 Controls: Before interpreting sample results, it is necessary to verify the positive and negative controls. For the experiment to be valid, the controls must have the following results, as summarized in the table below, otherwise the PCR reaction needs to be repeated.
Salmonella detection (FAM) Negative control Positive control Ct = N/A* 26 Ct 36 Internal Control detection 28 Ct 40 Not significant

* The software indicates a Ct value of N/A (not applicable) when the fluorescence of a sample does not rise significantly above the background noise, and hence does not cross the threshold.

1.2 Samples: A positive Salmonella sample must have a Ct value 10 for the fluorophore.

FAM

If the Ct value is below 10, verify that as raw data the curve is a regular amplification curve (with a flat base line, followed by a rapid increase of fluorescence and then a flattening out). If the curve seems correct, it may be considered a positive Salmonella sample. If there is no Ct value (Ct=N/A) for FAM, or the curve is not a typical amplification curve, the internal control for that sample must then be analyzed: - This sample is considered as a negative Salmonella sample if there is no Ct value in FAM, and the internal control has a Ct 28.
12 2008 Bio-Rad

- Should the internal control also not have a Ct value (Ct = N/A), then it is not possible to interpret the result. Such a result probably indicates an inhibition of the PCR reaction. The sample needs to be diluted (1/10, in distilled sterile water), and the PCR repeated (see section VII.B. DNA extraction). - Should the Ct value for the internal control be < 28 it is not possible to interpret the result. Verify that the threshold was correctly placed, or that the curve as raw data is a regular amplification curve. If the curve does not have a characteristic shape, it will be necessary to repeat the PCR test. Interpretation of sample results is summarized in the following table:
Salmonella detection (FAM) Ct 10 Ct = N/A Ct = N/A Internal control detection Not significant Ct 28 Ct = N/A Interpretation Positive Negative Inhibition**

** When both Salmonella and internal control detection give a Ct value = N/A, the sample must be tested again but diluted (1/10).

VIII. CONFIRMATION OF POSITIVE RESULTS In the context of the AFNOR VALIDATION certified method, all positive iQ-Check Salmonella II results need to be confirmed in one of two ways: 1. Using standard tests described in the standardized CEN or ISO methods (including the purification step). For the confirmation test, it is necessary to start from the buffered peptone water enrichment broth after the full 18h 2h enrichment at 37C. 2. Using any other method certified AFNOR VALIDATION and based on a principle different from that used in the iQ-Check Salmonella II PCR test, for example the chromogenic medium RAPIDSalmonella. The validated protocol of this second method must be followed entirely; the confirmation is carried out from the buffered peptone water enrichment broth, if this step is common to both methods. In the event of results that are not in agreement, between iQ-Check Salmonella II and one of the confirmation options listed above, the laboratory should follow the necessary steps to ensure the validity of their results.

2008 Bio-Rad

13

It is possible to store the enriched buffered peptone water between +2C and +8C for 48 hours maximum, following the last incubation at 37C. In the context of AOAC-RI validation, a positive iQ-Check Salmonella II result is considered presumptive positive and it is recommended it be confirmed according to the USDA MLG standard method (available online at http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf ) or FDA BAM standard method (available online at http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html) IX. CONFIRMATION OF SINGLE COLONIES USING iQ-CHECK iQ-Check Salmonella II may also be used for confirming single isolated Salmonella colonies on agar plates. 1. Pick an isolated colony, from an agar plate, selective or non-selective, with a tooth-pick or sterile loop, or other adapted consumable (e.g. pipette tip). 2. Resuspend the colony in 100 l tryptone salt or distilled sterile water in a microfuge tube. Homogenize using a vortex, 3. Use 5 l of the supernatant with 45 l of PCR mix (see section VII.C Real-time PCR) and follow the rest of the iQ-Check Salmonella II protocol for the data and result interpretation.

X. TEST PERFORMANCES AND VALIDATIONS iQ-Check Salmonella II is specific for the Salmonella genus. With this kit it is possible to detect 1-10 CFU/25 g sample, according to the recommended enrichment.

14

2008 Bio-Rad

AFNOR VALIDATION iQ-Check Salmonella II is certified by AFNOR VALIDATION as an alternative method to the reference method NF EN ISO 6579 (2002), for the detection of Salmonella spp. in all products for human and animal consumption, as well as environmental samples. The validation followed the protocol of the NF EN ISO 16140: 2003 standard, and includes the use of the iCycler iQ Chromo4, iQ5 and MiniOpticon systems. Certificate number: BRD 07/06 07/04. Valid until 01/07/2012.

BRD 07/06 07/04 ALTERNATIVE ANALYSYS METHODS FOR AGRIBUSINESS Certified by AFNOR Certification www.afnor-validation.org

AOAC-RI VALIDATION iQ-Check Salmonella II (Easy protocol I) is validated by AOAC-Research Institute under the Performance Tested Method Program for detection of Salmonella spp. in eggs, raw chicken, raw beef and cantaloupe. Standard protocol II is also validated by AOAC-RI for the simultaneous detection of Salmonella spp. and E.coli O157:H7 in raw ground beef. A positive result with iQ-Check should be considered presumptive and it is recommended it be confirmed by standard reference methods. (See 3 and 4, section XI). Certificate number: 010803. XI. REFERENCES 1 - Miras, I., Hermant, N., Arricau, N., and Popoff, M.Y.1995. Nucleotide sequence of iagA and iagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enteritica subsp. Enteritica ser. Typhi. Research in Microbiology. 146. 17-20. 2 - Standard NF EN ISO 6579. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the detection of Salmonella spp. December 2002. 3 - United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. Microbiology Laboratory Guidebook Chapter 4.03. Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry and Egg Products. October 1, 2004. On line at http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf 4 - United States Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition. Bacteriological Analytical Manual - Chapter 5. Salmonella. June 2006. On line at http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html
2008 Bio-Rad 15

Notice to purchaser: limited license Use of this product is covered by one or more of the following US patents and corresponding patent claims outside the US: 5,079,352, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155, 5,677,152 (claims 1 to 23 only) and 5,773,258 (claims 1 and 6 only), and claims outside the US corresponding to US Patent No. 4,889,818. The purchase of this product includes a limited, non-transferable immunity from suit under the foregoing patent claims for using only this amount of product solely in Food testing, Environmental testing, and Industrial microbiology, including reporting results of purchaser's activities for a fee or other commercial consideration, and also for the purchasers own research. No right under any patent claim (such as the 5 Nuclease Process claims in US Patent Nos. 5,210,015 and 5,487,972) is conveyed expressly, by implication, or by estoppel. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

16

2008 Bio-Rad

APPENDIX A- PCR Mix Calculation Guide To find the correct volumes to use when preparing the PCR mix, add the total number of samples and controls to be analyzed, and find the corresponding volumes of reagent B and reagent C in the table.
Total number of Probes samples & controls Reagent B (l) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 5 11 16 22 27 32 38 43 49 54 59 65 70 76 81 86 92 97 103 108 113 119 124 130 135 140 146 151 157 162 167 173 178 184 189 194 200 205 211 216 221 227 232 238 243 248 254 259 Amplication mix Reagent C (l) 40 86 130 173 216 259 302 346 389 432 475 518 562 605 648 691 734 778 821 864 907 950 994 1000 1100 1100 1200 1200 1300 1300 1300 1400 1400 1500 1500 1600 1600 1600 1700 1700 1800 1800 1900 1900 1900 2000 2000 2100 Total number of samples & controls 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 Probes Amplication mix Reagent B (l) Reagent C (l) 265 270 275 281 286 292 297 302 308 313 319 324 329 335 340 346 351 356 362 367 373 378 383 389 394 400 405 410 416 421 427 432 437 443 448 454 459 464 470 475 481 486 491 497 502 508 513 518 2100 2200 2200 2200 2300 2300 2400 2400 2500 2500 2500 2600 2600 2700 2700 2800 2800 2900 2900 2900 3000 3000 3100 3100 3200 3200 3200 3300 3300 3400 3400 3500 3500 3500 3600 3600 3700 3700 3800 3800 3800 3900 3900 4000 4000 4100 4100 4100

2008 Bio-Rad

17

18

2008 Bio-Rad

iQ-Check Salmonella II Kit

Rf. : 357-8123
Notice dutilisation
Test pour la dtection par PCR en temps rel des salmonelles dans les produits dalimentation humaine et animale, et les chantillons denvironnement

19

SOMMAIRE

I. II.

Introduction Principe

III. Composition du kit IV. Validit et conservation V. Matriel ncessaire non fourni VI. Prcautions et recommandations VII. Protocole A. Enrichissement de lchantillon B. Extraction de lADN C. PCR en temps rel D. Analyse des donnes VIII. Confirmation des rsultats positifs IX. Protocole de confirmation partir de colonies isoles X. Performances du test et validations XI. Bibliographie ANNEXE A : Tableau de pipetage

20

2008 Bio-Rad

I. INTRODUCTION Les salmonelles sont toujours en tte de liste des toxi-infections alimentaires en dpit des nombreuses actions prventives menes contre elles. En France, dans 85% des cas de toxi-infections alimentaires collectives dclares o l'agent responsable est identifi, Salmonella a t mis en vidence. Les ufs et ovoproduits, viandes et volailles, sont les aliments qui le plus souvent transmettent des salmonelles (65% des cas). On a dnombr plus de 2000 srotypes, tous potentiellement pathognes pour l'homme. La rglementation franaise et europenne exige une absence de salmonelles dans 25 g d'aliments. Face la mthode bactriologique traditionnelle souvent longue et coteuse, la mthode iQ-Check Salmonella II est un test qualitatif permettant la dtection spcifique de Salmonella spp. dans les produits dalimentation humaine, animale et les chantillons denvironnement par Raction de Polymrisation en Chane (PCR) en temps rel. Une squence dADN spcifique du genre Salmonella est amplifie et dtecte simultanment grce une sonde fluorescente. Jusqu' 94 chantillons peuvent tre analyss avec un risque minimum de contamination et une procdure facile dutilisation. Lutilisation de ce test est destine au personnel de laboratoire qualifi, dans le cadre de la recherche de Salmonella spp. La mise en oeuvre de ce test permet l'obtention d'un rsultat ds le lendemain de la mise en pr-enrichissement. II. PRINCIPE Ce test repose sur lamplification gnique et la dtection par la technique de PCR en temps rel. Il utilise des amorces et une sonde dADN spcifiques de Salmonella spp. La dtection et lanalyse des rsultats sont optimises pour lutilisation avec un thermocycleur pour la PCR en temps rel Bio-Rad, tel que le Chromo4 et MiniOpticon. Au cours de la raction de PCR, les amorces vont se lier la rgion cible puis, la polymrase catalyse leur extension dans le sens 5-3 en utilisant les dsoxynuclotides triphosphates (dNTPs), crant ainsi une squence complmentaire dADN, appele amplicon. Pendant la PCR, des sondes spcifiques vont shybrider aux amplicons. Ces sondes, marques par des fluorophores, mettent de la fluorescence uniquement quand lhybridation a lieu. La sonde qui se lie la squence cible de Salmonella spp. est marque par le fluorophore FAM. Lintensit de fluorescence augmente proportionnellement laugmentation de la quantit
2008 Bio-Rad 21

des produits damplification dans le tube de PCR. La fluorescence est mesure directement par le module optique du thermocycleur. Le logiciel associ lappareil calcule automatiquement la relation entre lintensit de la fluorescence et le cycle damplification. Cette relation indique la prsence, ou labsence, de Salmonella dans lchantillon. Un ADN synthtique appel Contrle interne est ajout chaque raction. Il est amplifi en mme temps que la squence cible de Salmonella, mais est dtect par une sonde marque avec un deuxime fluorophore. Ce test permet la dtection de Salmonella dans tous les produits dalimentation humaine et animale et les chantillons denvironnement pralablement enrichis en eau peptone tamponne (18h 2h, ou 8h pour viandes crues). La mthode est compose des tapes suivantes :
ENRICHISSEMENT EXTRACTION ADN PCR EN TEMPS REEL ANALYSE & INTERPRETATION

III. COMPOSITION DU KIT

Rfrence A B C D E Ractif Ractif de lyse Sondes fluorescentes Solution damplification Contrle PCR ngatif Contrle PCR positif Volume 1 flacon (20 ml) 1 tube (0,55 ml) 2 tubes (2 x 2,2 ml) 1 tube (0,5 ml) 1 tube (0,25 ml)

Ce kit contient la quantit de ractif ncessaire pour 96 ractions. IV. VALIDIT ET CONSERVATION Ds rception, le kit doit tre conserv entre +2C et +8C. Chaque ractif conserv entre +2C et +8C peut tre utilis jusqu' la date de premption indique sur le tube.

22

2008 Bio-Rad

V. EQUIPEMENTS ET MATERIEL NECESSAIRES NON FOURNIS Equipement Thermocycleur Bio-Rad pour la PCR en temps rel, tel que le Chromo4 et MiniOpticon. Cf. manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pour les kits iQ-Check (Chromo4/MiniOpticon Rf. : 93269, Rev. B - iQ5 Rf. : 93270, Rev. A - iCycler iQ Rf. : 93271, Rev. A). Stomacher, homogniseur ou equivalent Etuve (37C 2C) Bloc chauffant (100C 5C), pour tubes coniques de 1,5 ml et/ou plaque PCR de 96 puits Centrifugeuse de paillasse (max. 10.000 12.000 g, pour tubes 1,5 ml) En option: centrifugeuse avec rotor pour plaque ou barrette (max. 2.000 g) Vortex Agitateur magntique 20 l, 200 l and 1000 l micropipettes Multi-distributeur, tel que combitips pipettes En option pour protocole dextraction Standard II (avec tape de broyage) : - Agitateur vibrant, tel que Disruptor Genie* (Scientific Industries), Rf. Bio-Rad : 359-1456 * Nous consulter pour une information prcise concernant les appareils recommands par nos services techniques. Remarque : Nous recommandons lutilisation dun onduleur lectrique avec le thermocycleur Consommables Pour les plaques et tubes PCR, film et capuchons se reporter au manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pour les kits iQ-Check. En option pour lextraction : - Plaque de 96 puits full-profile, rf. Bio-Rad: 223-9441. - Barrettes de 8 tubes de 200l full-profile, Rf. Bio-Rad: 223-9469 - Barrettes de 8 capuchons optiques plats, pour tubes ou plaques de puits de 0,2 ml, 120 barrettes Rf. Bio-Rad : TCS-0803. Milieu de pr-enrichissement : eau peptone tamponne (Exemple Rf. Bio-Rad: 356-4684 pour 500 g; 355-4179 pour 225 ml x 6 flacons ; 355-5789 pour 2.3 L x 5 poches ; et 355-5790 pour 5 L x 2 poches) Glose RAPIDSalmonella* (Rf Bio-Rad : 356-3961 pour 90 mm x 20 boites ; 356-4705 pour 500 g ; 356-4706 pour 100 g). * Utilisable hors du cadre de la validation AOAC-RI.
2008 Bio-Rad 23

 Billes de lyse (ractif F, pour le Protocole Standard II) Rf. Bio-Rad 357-8136. Sac stomacher avec filtre incorpor. Pipettes de 1 ml et 10 ml Embouts filtre striles, adaptables sur les micropipettes de 20 l, 200 l et 1000 l Tubes vis coniques de 1.5ml, striles, (Exemple Rf. Bio-Rad: 224-0110) Pointes pour Combitip ou multi-distributeur, striles emballage individuel Tubes striles de 2 ml et de 5 ml Gants non poudrs Eau distille strile Eau de javel 5% Agent dcontaminant tel que DNA AWAY ou RNAse AWAY VI. PRECAUTIONS ET RECOMMANDATIONS Cet essai doit tre ralis par des personnes ayant reu une formation adquate. Les chantillons d'aliments et les cultures d'enrichissement doivent tre manipuls comme des matires potentiellement infectieuses et limins selon les rglementations locales. Tous les dchets potentiellement infectieux doivent tre autoclavs avant limination. La qualit des rsultats dpend du respect scrupuleux des Bonnes Pratiques de Laboratoire, en particulier en matire de PCR : - Le matriel (pipettes, tubes etc...) ne doit pas circuler d'un poste l'autre. - Il est indispensable d'utiliser un contrle positif et un contrle ngatif pour chaque srie de ractions d'amplification. - Ne pas utiliser les ractifs au-del de leur date de premption. - Vortexer les ractifs du kit avant leur utilisation pour travailler avec des solutions homognes. - Vrifier l'exactitude et la prcision des pipettes ainsi que le bon fonctionnement des instruments. - Changer de gants rgulirement et ds que vous souponnez quils peuvent tre contamins. - Nettoyer les surfaces de travail rgulirement avec de leau de javel 5% et autre agent tel que DNA AWAY ou RNase AWAY. - Porter des gants non poudrs pour ne pas laisser de traces de doigts sur le film optique utilis pour sceller les microplaques. Ne pas crire sur les bouchons des tubes PCR. Dans les deux cas, lenregistrement des donnes par lappareil peut tre perturb. - Il est recommand aux utilisateurs dtre conforme aux exigences
24 2008 Bio-Rad

gnrales pour la mthode PCR dcrites dans la norme EN ISO 22174 : 2005 Microbiologie des aliments Raction de polymrase en chane (PCR) pour la recherche de micro-organismes pathognes dans les aliments Exigences gnrales et dfinitions. VII. PROTOCOLE Nous vous recommandons vivement de lire l'ensemble du protocole avant de commencer l'essai. Respecter scrupuleusement le protocole propos. Le tableau suivant liste les diffrents protocoles disponibles selon le cadre de validation et lapplication utilis:
Protocole Standard I Simplifi I Standard II Simplifi II Simplifi I Standard II Enrichissement 18h 2h, 37C 21h 1h, 37C 8h , 37C 21h 1h, 37C 21h 1h, 37C 8h, 36C Certification AFNOR VALIDATION AFNOR VALIDATION AFNOR VALIDATION AFNOR VALIDATION AOAC-RI AOAC-RI Domaine Alimentation humaine et animale, et chantillons denvironnement Alimentation humaine et animale, et chantillons denvironnement Viandes crues Viande crue de boeuf * Oeufs, volaille crue, viande crue de boeuf, melon Viande crue de boeuf *

* Protocole galement prconis pour la recherche de E.coli O157 :H7. A. Enrichissement de l'chantillon Les milieux d'enrichissement doivent tre ports la temprature d'incubation approprie avant utilisation. Homogniser 25 g d'chantillon dans 225 ml d'eau peptone tamponne prchauffe dans un sac stomacher avec filtre incorpor. Protocole Standard I - Incuber sans agitation pendant 18h 2h, 37C 1C. Une dcantation naturelle a lieu lors de cette incubation. - Raliser le test iQ-Check sur 1 ml de la suspension enrichie dcante en suivant le protocole Standard I pour lextraction de lADN (Cf. section B).

2008 Bio-Rad

25

Protocole Standard II - Incuber sans agitation pendant 10h 2h, 37C 1C*. Une dcantation naturelle a lieu lors de cette incubation. - Raliser le test iQ-Check sur 1 ml de la suspension enrichie dcante en suivant le protocole Standard II pour lextraction de lADN (Cf. section B). * Dans le cadre de la validation AOAC-RI, une incubation 36C 1C est prconise. Protocoles Simplifi I et II - Incuber sans agitation pendant 21h 1h 37C 1C. Une dcantation naturelle a lieu lors de cette incubation. - Raliser le test iQ-Check sur 100 l de la suspension enrichie dcante en suivant le protocole simplifi pour lextraction de lADN (Cf. section B). Remarque : Ne pas agiter les enrichissements avant de prlever lchantillon pour le test iQ-Check, sauf pour les protocoles Standard II et Simplifi II. Pour ces protocoles agiter les enrichissements et laisser dcanter. En gnral, viter la prise de gros dbris. Pour les aliments prsentant une couche grasse surnageante, prlever juste en dessous de cette couche. B. Extraction des acides nucliques Avant le dbut de l'essai, allumer le bloc chauffant et le rgler 95C 100C.
Pr-chauffer le bloc chauffant Allumer le bloc chauffant et le rgler 95C - 100C Protocoles Standard I et Simplifi I : utiliser le ractif de lyse A tel que. Protocoles Standard II et Simplifi II Reconstituer le ractif de lyse : Verser tout le contenu du ractif F* (billes de lyse) dans le flacon du ractif A (tampon de lyse). Le ractif de lyse mlang avec les billes de lyse (ractifs A + F) peut tre conserv jusqu 6 mois 4C.

Prparer le ractif de lyse

* Ractif F (billes de lyse) est inclus dans les kits iQ-Check E.coli O157:H7 ou il peut tre command sparment.

26

2008 Bio-Rad

Protocole Standard I 1 - Introduire 1 ml de suspension enrichie dans un tube centrifuger vis de 1,5 ml. 2 - Centrifuger 10.000-12.000 g pendant 5 minutes et liminer le surnageant. 3 - Ajouter 200 l du ractif de lyse (ractif A) au culot obtenu, et mlanger par aspiration/refoulement avec la pipette et vortexer. Remarque : Lors du prlvement, le ractif de lyse doit tre homognis vitesse modre au moyen du barreau magntique contenu dans le flacon afin de maintenir le ractif de lyse en suspension. 4 - Incuber le tube dans le bloc chauffant 95C - 100C pendant 10 15 minutes. 5 - Vortexer grande vitesse 6 - Centrifuger 10.000-12.000 g pendant 5 minutes. Protocole Standard II (incluant une tape de broyage) 1 - Introduire 1 ml de suspension enrichie dans un tube centrifuger vis de 1,5 ml. 2 - Centrifuger 10.000-12.000 g pendant 5 minutes et liminer le surnageant. 3 - Ajouter 200 l du ractif de lyse reconstitu (ractifs A + F) au culot obtenu, et mlanger par aspiration/ refoulement avec la pipette Remarque : Agiter doucement le flacon de ractif de lyse la main afin de mettre en suspension les billes. Lors du prlvement, maintenir le ractif de lyse homognis vitesse modre au moyen du barreau magntique contenu dans le flacon.Utiliser des consommables adapts pour un prlvement homogne du ractif de lyse reconstitu. 4 - Agiter 3 min 1min avec lagitateur vibrant tel que le Disruptor Genie. 5 - Incuber le tube dans le bloc chauffant 95C - 100C pendant 10 15 minutes. 6. - Vortexer grande vitesse et centrifuger 10.000-12.000 g pendant 5 minutes.

2008 Bio-Rad

27

Protocole Simplifi I 1 - Pr-rpartir, selon le nombre dchantillons tester, 50 l de ractif de lyse A homognis dans un tube de 1,5 ml ou des barrettes ou une plaque full profile transparentes. Remarque : Lors du prlvement, le ractif de lyse doit tre homognis vitesse modre au moyen du barreau magntique contenu dans le flacon afin de maintenir le ractif de lyse en suspension. 2 - Ajouter 100 l de bouillon enrichi dans chaque tube et mlanger par aspiration/refoulement avec la pipette. 3 - Fermer les tubes utiliss ( laide de barrettes de capuchons si en plaque ou barrette). 4 - Incuber 95C - 100C pendant 10 15 minutes. 5 - Vortexer les tubes grande vitesse. 6 - En barrettes ou plaque laisser refroidir jusqu temprature ambiante, en laissant dcanter 7 - Centrifuger les tubes au moins 2 minutes 10.000-12.000 g ou 1 minute 2000 g si en plaque ou barrette. 8 - Ouvrir les barrettes ou les puits de la plaque un par un, avec prcaution, pour viter les risques de contaminations croises. Protocole Simplifi II (incluant une tape de broyage) 1 - Pr-rpartir, selon le nombre dchantillons tester, 100 l de ractif de lyse reconstitu (ractifs A + F) et homognis dans des tubes centrifuger vis de 1,5 ml. Remarque : Agiter doucement le flacon de ractif de lyse la main afin de mettre en suspension les billes. Lors du prlvement, maintenir le ractif de lyse homognis vitesse modre au moyen du barreau magntique contenu dans le flacon. Utiliser des consommables adapts pour un prlvement homogne du ractif de lyse reconstitu. 2 - Ajouter 100 l de suspension enrichie et mlanger par aspiration/refoulement avec la pipette jusqu homognisation. 3 - Agiter 3 min 1 min avec lagitateur vibrant tel que le Disruptor Genie. 4 - Incuber 95C - 100C pendant 10 15 minutes. 5 - Vortexer grande vitesse quelques secondes. 6 - Centrifuger au minimum 2 minutes 10.000-12.000 g pour faciliter le pipetage du surnageant.
28 2008 Bio-Rad

Pour tous les protocoles : Ouvrir les puits avec prcaution, pour viter les risques de contaminations croises. Utiliser 5 l du surnageant obtenu (contenant l'ADN extrait) pour la raction d'amplification* (ne pas vortexer avant de prlever les 5 l). Le surnageant restant peut tre conserv jusqu un an -20C. Aprs une ventuelle dconglation en vu dune rutilisation du surnageant, toujours centrifuger 5 minutes 10.000-12.000 g. Si vous souhaitez vous arrter dans le protocole, cette tape est la plus approprie. * A cette tape : Pour des chantillons ayant prsent une inhibition lors d'un test prcdent, procder une dilution au 1/10e, en eau distille strile, en utilisant 10 l du surnageant obtenu. 5 l de la dilution approprie seront utiliser pour l'amplification 1.
1

Dans le cas ventuel dchantillons ayant prsent une inhibition avec une dilution au 1/10me de lADN extrait, lors d'un test iQ-Check prcdent, et dans le cadre de la certification AFNOR Validation, il est possible dutiliser un protocole denrichissement modifi afin de prvenir cette inhibition: - Homogniser 25 g d'chantillon dans 225 ml d'eau peptone tamponne. - Incuber sans agitation pendant 18h 1 heures 37C. - Bien agiter le sac, prlever 20 l de la suspension et les rajouter 1 ml d'eau peptone tamponne (prchauff 37C) dans un tube vis de 1,5 ml. - Incuber sans agitation pendant 4h 1 heures 37C. - Raliser le test iQ-Check en centrifugeant directement cet enrichissement secondaire, et en suivant le Protocole dextraction Standard I.

2008 Bio-Rad

29

C. PCR en temps rel 1. Mise en marche appareil PCR Pour la mise en marche et la dfinition des paramtres du logiciel consulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pour les kits iQ-Check. 2. Prparations des ractions PCR 2.1 Prparer le mlange ractionnel PCR en mlangeant la solution damplification (ractif C) et les sondes fluorescentes (ractif B) en fonction du nombre dchantillons et des contrles analyser (au minimum un contrle positif et un contrle ngatif doivent tre utiliss par plaque). Utiliser le tableau de pipetage en annexe A pour connatre les quantits ncessaires de chaque ractif. 2.2 Aprs prparation, le mlange ractionnel (ractif B +C) doit tre utilis immdiatement, ou il peut tre conserv pendant 1h 4C. 2.3 Rpartir 45 l de ce mlange ractionnel par puits, selon le plan de plaque dfini. 2.4 Ajouter 5 l dchantillon ou de ractif D (contrle ngatif) ou de ractif E (contrle positif) et sceller de faon hermtique les puits de la plaque ou des barrettes. Il est important dviter la prsence de bulles au fond des puits en pipetant prcautionneusement. Pour liminer des bulles centrifuger brivement la plaque scelle ou les barrettes PCR. 2.5 Placer la plaque ou les barrettes PCR dans le thermocycleur. Sassurer de leur bonne orientation (puits A1 en haut gauche). Fermer le module ractionnel. 3. Lancement de la raction damplification Pour le lancement de la PCR, consulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pour les kits iQ-Check.

30

2008 Bio-Rad

D. Analyse des donnes Lanalyse des donnes peut tre ralise directement la fin de la raction damplification ou ultrieurement en re-ouvrant le fichier de donnes. Pour ouvrir des fichiers de donnes et rgler les paramtres danalyse consulter le manuel utilisateur du thermocycleur Bio-Rad pour les kits iQ-Check. 1. Interprtation des rsultats : Pour obtenir les rsultats de lanalyse, il suffit de lire les valeurs de Ct (cycle partir duquel la fluorescence slve significativement au-dessus du bruit de fond), une fois rgls les paramtres danalyse. Il est galement possible dutiliser le logiciel iQ-Check Analysis (Rf. 359-3135) pour une interprtation automatise et limpression dun rapport complet (Cf. notice dutilisation de iQ-Check Analysis). Le logiciel Opticon Monitor permet une analyse automatise complte pour les systmes Chromo4 et MiniOpticon (Cf. notice dutilisation du Chromo4 et MiniOpticon pour les kits iQ-Check, Rf. 93269, Rev. B). 1.1 Contrles : Avant linterprtation finale des rsultats il est ncessaire de vrifier les rsultats des contrles ngatifs et positifs. Pour que le test soit valide, les rsultats des contrles ngatifs et positifs doivent tre les suivants :
Dtection de Salmonella (FAM) Contrle ngatif Contrle positif Ct = N/A* 26 Ct 36 Dtection du contrle interne 28 Ct 40 Non significatif

* N/A signifie Not Applicable . Le logiciel indique N/A pour le Ct dun chantillon quand la courbe de fluorescence ne croise pas le seuil.

Si les rsultats des contrles positifs et ngatifs sont diffrents de ceux dcrits dans le tableau ci-dessus, il est ncessaire de recommencer la PCR.

2008 Bio-Rad

31

1.2 Echantillons : Un chantillon est considr positif pour Salmonella si une valeur de Ct 10 est obtenue pour le fluorophore FAM. Si une valeur infrieure 10 est obtenue, vrifier que la courbe en temps que donne brute montre un aspect caractristique damplification exponentielle (ligne de base plate, puis augmentation rgulire de la fluorescence, suivi par un plateau). Si la courbe observe est correcte, on peut considrer lchantillon positif pour la prsence de Salmonella. Si aucune valeur nest obtenue pour le CtFAM (Ct = N/A), ou si la courbe observe nest pas caractristique, linterprtation du rsultat dpend de la valeur du contrle interne : - Un chantillon est considr ngatif pour Salmonella si aucune valeur de Ct nest obtenu pour le fluorophore FAM (CtFAM=N/A) et le Ct pour le contrle interne est suprieur ou gale 28. - Une valeur N/A pour le Ct du contrle interne indique, lorsque son Ct en FAM est galement N/A, quun phnomne dinhibition de la raction de PCR a probablement eu lieu. Dans ce cas, lchantillon dADN doit tre dilu au 1/10e, en eau distille strile, puis soumis une nouvelle PCR. (cf. partie VII.B. Extraction des acides nucliques). - Si le Ct pour le contrle interne est infrieure 28 il nest pas possible dinterprter le rsultat. Vrifier que le seuil a t correctement plac ou que la courbe brute montre un aspect caractristique damplification exponentielle. Si la courbe observe nest pas correcte il sera ncessaire de rpter le test PCR pour cet chantillon. Interprtation des rsultats obtenus sur les chantillons :
Dtection de Salmonella (FAM) Ct 10 Ct = N/A Ct = N/A Dtection du contrle interne Non significatif Ct 28 Ct = N/A Interprtation Positif Ngatif Inhibition*

* : En cas de valeur nulle pour un chantillon et son contrle interne (Ct = N/A), lanalyse doit tre renouvele avec lchantillon dADN dilu au 1/10.

32

2008 Bio-Rad

VIII. CONFIRMATION DES RESULTATS POSITIFS Dans le cadre de la certification AFNOR VALIDATION, tous les rsultats positifs iQ-Check devront tre confirms de l'une des manires suivantes : 1. Mise en uvre des tests classiques dcrits dans les mthodes normalises par le CEN ou l'ISO (en incluant l'tape de purification). Pour effectuer la confirmation, il faut repartir du bouillon d'enrichissement deau peptone tamponne aprs un enrichissement complet de 18h 2h, 37C. 2. Utilisation de toute autre mthode certifie AFNOR VALIDATION de principe diffrent de la PCR utilise par iQ-Check Salmonella II, tel que le milieu chromognique RAPIDSalmonella. Le protocole valid de la seconde mthode devra tre respect dans son ensemble, la confirmation s'effectuera partir du bouillon deau peptone tamponne, cette tape tant commune aux deux mthodes. En cas de rsultats discordants entre iQ-Check Salmonella II et lune des options de confirmation dcrites ci-dessus, le laboratoire devra mettre en uvre les moyens suffisants pour s'assurer de la validit du rsultat rendu. Il est possible de conserver le bouillon deau peptone tamponne entre +2C est +8C pendant 48h maximum suivant la fin de lincubation 37C. Dans le cadre de la validation AOAC-RI, un rsultat positif avec iQ-Check Salmonella II est considr prsomptif et il est recommand de le confirmer par la mthode de rfrence USDA MLG (disponible en ligne http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf) ou la mthode de rfrence FDA BAM (disponible en ligne http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html), selon lchantillon utilis. IX. PROTOCOLE DE CONFIRMATION A PARTIR DE COLONIES ISOLEES Il est possible dutiliser le kit iQ-Check Salmonella II pour la confirmation de colonies isoles sur glose. 1. Piquer une colonie isole, partir dun milieu slectif ou non, laide dun cure-dent ou dune se de 1 l, ou autre consommable adapt (cne pipette par exemple).
2008 Bio-Rad 33

2. Resuspendre la colonie dans 100 l de tryptone sel ou eau distille strile dans un tube de type Eppendorf. Bien homogniser la suspension laide dun vortex. 3. Intgrer 5 l du surnageant dans 45 l du mlange ractionnel PCR (Cf. partie VII.C PCR en temps rel) et suivre le reste de la mthode iQ-Check Salmonella II pour lobtention et linterprtation des rsultats. X. PERFORMANCES DU TEST ET VALIDATIONS Le kit iQ-Check Salmonella II est spcifique pour la dtection de Salmonella spp. Il est possible de dtecter de 1 10 CFU/25 g dchantillon selon lenrichissement recommand. AFNOR VALIDATION iQ-Check Salmonella II est certifi AFNOR VALIDATION comme mthode alternative la norme de rfrence NF EN ISO 6579 (2002), pour la dtection des Salmonella spp. pour tous produits dalimentation humaine et animale ainsi que les chantillons denvironnement. La validation a suivi le protocole de la norme NF EN ISO 16140 : 2003 et inclut lutilisation du Chromo4, MiniOpticon, iQ5 et liCycler iQ. N dattestation : BRD : 07/06 07/04. Fin de validit 01/07/2012.

BRD 07/06 07/04 ALTERNATIVE ANALYSYS METHODS FOR AGRIBUSINESS Certified by AFNOR Certification www.afnor-validation.org

VALIDATION AOAC-RI iQ-Check Salmonella II (protocole Simplifi I) est valid par AOAC-Research Institute selon le programme Performance Tested Method pour la dtection de Salmonella spp. dans les viandes crues de buf, la volaille crue, les ufs, et le melon. Le protocole Standard II est aussi valid par AOAC-RI pour la dtection de E.coli O157:H7 et Salmonella spp. dans le mme chantillon de viande crue de buf. Un rsultat positif avec iQ-Check est considr prsomptif et il est recommand de confirmer le rsultat par les mthodes de rfrences. (cf. 3 et 4, partie XI.). Attestation n 010803.
34 2008 Bio-Rad

X. BIBLIOGRAPHIE 1 - Miras, I., Hermant, N., Arricau, N., and Popoff, M.Y.1995. Nucleotide sequence of iagA and iagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enteritica subsp. Enteritica ser. Typhi. Research in Microbiology. 146. 17-20. 2 - Norme NF EN ISO 6579. Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp. Dcembre 2002. 3 - United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. Microbiology Laboratory Guidebook Chapter 4.03. Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry and Egg Products. October 1, 2004. En ligne http://www.fsis.usda.gov/PDF/MLG_4_03.pdf 4 - United States Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition. Bacteriological Analytical Manual - Chapter 5. Salmonella. June 2006. En ligne http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html

Avis concernant l'acheteur : licence limite Lutilisation de ce produit est couverte par un ou plusieurs des brevets US suivants et les revendications de brevet correspondantes hors Etats-Unis : 5 079 352, 5 789 224, 5 618 711, 6 127 155, 5 677 152 (revendications 1 23 seulement) et 5 773 258 (revendications 1 et 6 seulement) et par les revendications hors Etats-Unis correspondant au brevet US n 4 889 818. Lachat de ce produit comprend une immunit de poursuite restreinte et non transfrable selon les revendications de brevet prcdentes lorsque cette quantit de produit est uniquement utilise des fins danalyse alimentaire, danalyse environnementale et en microbiologie industrielle, y compris la publication des rsultats des activits de lacheteur moyennant paiement ou toute autre contrepartie commerciale, et lorsquelle est galement utilise aux fins des propres recherches de lacheteur. Aucun droit selon une quelconque revendication de brevet (comme les revendications de la mthode 5-nuclase dans les brevets US n 5 210 015 et 5 487 972) nest expressment cd, que ce soit par implication ou par prclusion. De plus amples informations concernant lachat de licences peuvent tre obtenues en contactant le Directeur des Licences, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, Californie, 94404, Etats-Unis.

2008 Bio-Rad

35

ANNEXE A - Tableau de Pipetage Utiliser ce tableau pour trouver les quantits ncessaire de ractif B et ractif C pour prparer le mlange ractionnel. Le nombre dchantillons inclut les contrles positif et ngatif.
Nombre dchantillons 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Sondes uorescentes (l) Ractif B 5 11 16 22 27 32 38 43 49 54 59 65 70 76 81 86 92 97 103 108 113 119 124 130 135 140 146 151 157 162 167 173 178 184 189 194 200 205 211 216 221 227 232 238 243 248 254 259 Mix PCR (l) Ractif C 40 86 130 173 216 259 302 346 389 432 475 518 562 605 648 691 734 778 821 864 907 950 994 1000 1100 1100 1200 1200 1300 1300 1300 1400 1400 1500 1500 1600 1600 1600 1700 1700 1800 1800 1900 1900 1900 2000 2000 2100 Nombre dchantillons 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 Sondes uorescentes (l) Ractif B 265 270 275 281 286 292 297 302 308 313 319 324 329 335 340 346 351 356 362 367 373 378 383 389 394 400 405 410 416 421 427 432 437 443 448 454 459 464 470 475 481 486 491 497 502 508 513 518 Mix PCR (l) Ractif C 2100 2200 2200 2200 2300 2300 2400 2400 2500 2500 2500 2600 2600 2700 2700 2800 2800 2900 2900 2900 3000 3000 3100 3100 3200 3200 3200 3300 3300 3400 3400 3500 3500 3500 3600 3600 3700 3700 3800 3800 3800 3900 3900 4000 4000 4100 4100 4100

36

2008 Bio-Rad

NOTES
........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ...........................................................................................

2008 Bio-Rad

37

NOTES
........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ...........................................................................................

38

2008 Bio-Rad

NOTES
........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ........................................................................................... ...........................................................................................

2008 Bio-Rad

39

Distributed in the U.S. by: Bio-Rad Laboratories 2000 Alfred Nobel Drive Hercules California 94547 Toll-Free Phone: 1-(800) 424-6723 Fax: (510) 741-5800 In the United States, for technical assistance, please call (800) 4BIORAD. Select option 2 for technical support and option 2 again for the Food Science Division. To place an order, please call (800) 4BIORAD and press option 1 for customer service. Orders can also be faxed to (800) 879-2289. Bio-Rad 3, bd Raymond Poincar 92430 Marnes-la-Coquette - France
Tl.: +33 1 47 95 60 00 Fax.: +33 1 47 41 91 33 Rev. B - 12/2008 Code: 808463