Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia de Alimentos

Departamento de Cincia em Alimentos (DTA) TA 514 (D) PROF. GABRIELA MACEDO

AULA 2: Determinao de cidos Nuclicos

Giulia Buendia Braghieri Melina Luvizotto Gonalves Viviane Coelho Teruel

RA 091360 RA 094222 RA 065045

Campinas, 21 de Maro de 2012.

1. Introduo e Reviso Bibliogrfica 1.1. Reviso Bibliogrfica

Os nucleotdeos possuem uma variedade de papis no metabolismo celular. Eles so a moeda energtica nas transaes metablicas; os elos qumicos essenciais na resposta das clulas aos hormnios e outros estmulos extracelulares; e os componentes estruturais de uma coleo de cofatores enzimticos e intermedirios metablicos. E por ltimo, mas no menos importante, eles so os constituintes dos cidos nuclicos: desoxirribonuclico (DNA) e cido ribonuclico (RNA), as molculas repositrias da informao gentica. () A seguir uma tabela comparativa entre os seres vivos e o tipo e quantidade de cidos nuclicos em suas clulas: Tabela 1 Tabela comparativa entre seres vivos e suas quantidades de cidos nuclicos. (1)

TIPO DE CELULA (OU VRUS)

Vrus

Clulas bacterianas

Clulas eucariticas

CARACTERSTICAS Os vrus geralmente contm informaes genticas, consideravelmente, menor que as clulas, porque eles usam os recursos da clula hospedeira para muitos dos processos requeridos para se propagar. Apesar de alguns tipos de vrus apresentarem DNA bastante reduzido quando comparado s demais clulas vivas, quase todos os vrus contm RNA, na maioria das vezes possuem genomas de fita simples de RNA. As bactrias contm muito mais DNA do que os vrus de DNA. Alm do grande DNA cromossmico circular encontrado no nucleide, muitas bactrias contm uma ou mais molculas de DNA circulares que esto livres no citoplasma. Esses elementos extracromossmicos so chamados de plasmdeos. As clulas eucariticas contm mais DNA que as procariticas. Uma observao microscpica dos ncleos nas clulas eucariticas em diviso mostra que o material gentico est subdividido nos cromossomos, sendo que seu nmero diplide depende da espcie do organismo. Uma clula somtica humana, por exemplo, possui 46 cromossomos. Cada cromossomo de

As organelas das clulas eucariticas

uma clula eucaritica contem uma molcula de DNA dplex muito longa, que pode ser de 4 a 100 vezes maior que a de uma clula de uma bactria (E. Coli). Nas clulas eucariticas, um DNA que difere na seqncia de bases do DNA nuclear encontrado nas mitocndrias e nos cloroplastos. Menos de 0,1% de todo o DNA celular est presente nas mitocndrias de uma clula somtica tpica, entretanto, nas clulas do ovo fertilizado e em diviso, em que as mitocndrias so muito mais numerosas, a quantidade total de DNA mitocondrial correspondentemente maior. As mitocndrias e os cloroplastos dividem-se quando a clula se divide. O seu DNA replicado antes e durante a diviso, e as molculas de DNA filhas passam para as organelas filhas.

As principais e mais conhecidas diferenas entre o DNA e RNA esto relacionadas s suas bases pirimdicas, s suas formas e funes. Tais aspectos sero abordados a seguir, porm para compreender melhor tais diferenas ser feita uma breve explicao sobre como estes compostos so formados. Os nucleotdeos possuem componentes caractersticos: uma base nitrogenada, uma pentose e um fosfato. A molcula sem o grupo fosfato chamada nucleosdeo. As bases nitrogenadas so derivadas de dois compostos parentais, pirimidina e purina. (1) A base de um nucleotdeo une-se covalentemente (pelo N-1 das pirimidinas e pelo N-9 das purinas), por meio de uma ligao N--glicosdica, ao carbono-1 [nas pentoses dos nucleosdeos, os nmeros dos carbonos recebem um apstrofo () para distingui-los do nmero dos tomos das bases nitrogenadas] da pentose, e o fosfato est esterificado ao carbono-5. A ligao N--glicosdica formada pela remoo dos elementos da gua (um grupo hidroxila da pentose e o hidrognio da base). (1) Tanto o DNA quanto o RNA contm duas bases purnicas principais, adenina (A) e guanina (G), e duas pirimidnicas principais. Em ambos, DNA e RNA, uma das pirimidinas a citosina (C), mas a segunda a timina (T) no DNA, e uracila no RNA (U). Apenas raramente a timina ocorre no RNA ou a uracila ocorre no DNA. (1) Alm das diferenas entre as bases pirimidinas, eles tambm se diferem quanto a estrutura: No incio da dcada de 50, Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, atravs de difrao de raio X para analisar cristais de DNA, e descobriram, pela anlise de manchas formando uma cruz, que o DNA apresenta uma forma helicoidal. J em 1953, Watson e Crick postularam um modelo tridimensional para a estrutura do DNA. Esse modelo consiste de duas cadeias helicoidais de DNA (fitas) que se enrolam em um mesmo eixo formando uma dupla hlice que

gira no sentido da mo direita. O pareamento das duas fitas cria um sulco principal e um secundrio na superfcie da fita dupla. J o RNA se apresenta na forma de uma fita simples. As fitas simples tendem a assumir uma conformao helicoidal com o sentido da mo direita, que denominada por interaes do tipo empilhamento das bases que so mais fortes entre duas purinas do que entre uma purina e uma pirimidina ou entre duas pirimidinas. (1) Os cidos nucleicos apresentam formas diferentes, mas tambm tm funes distintas: Enquanto o DNA tem como funo o armazenamento e transmisso da informao biolgica, os RNAs possuem uma grande gama de funes: RNAs ribossmicos (rRNA): so componentes estruturais dos ribossomos, os complexos que realizam a sntese de protenas; RNAs mensageiros (mRNA): so intermedirios que transportam a informao gentica de um ou de poucos genes at o ribossomo, no qual as protenas correspondentes podem ser sintetizadas. RNAs de transferncia (tRNA): so molculas adaptadoras que traduzem fielmente a informao presente no mRNA em uma sequncia especfica de aminocidos. Alm dessas classes principais, h uma grande variedade de RNAs com funes especiais. (1) A principal aplicao dos cidos nuclicos na indstria alimentcia como realador de sabor. Os nucleotdeos so produtos da hidrlise enzimtica do RNA de microorganismos, como as leveduras, por exemplo, que contem de 6 a 12% de cidos nuclicos em sua composio. Com a preservao do carter polimrico das cadeias, os cidos nuclicos so fonte de 5-nucleotdeos, dentre os quais guanosina-5-monofosfato (GMP), ou guanilato dissdico, e inosina-5-monofosfato (IMP), ou inosinato dissdico, que so importantes melhoradores de sabor usados hoje em diversos alimentos. (2) Esses nucleotdeos associados ao aminocido glutamato monossdico (MSG) so responsveis por um dos cinco gostos bsicos do paladar humano, o umami, reconhecido pela comunidade cientfica apenas em 2000. Esse gosto no encontrado apenas em alimentos processados, mas tambm em alimentos ricos em protenas, como queijos, carnes, sardinha, leite, tomates e cogumelo. (3) Esses ingredientes tm sido muito utilizados na indstria alimentcia, devido principalmente a atual preocupao com a reduo do sdio nos alimentos. Individualmente ou junto com o glutamato, o IMP e o GMP, realam e melhoram o sabor da comida, mesmo com reduo na quantidade final de sal. (4) Figura 1: Equivalncia entre a intensidade de sabor e o contedo de IMP na mistura de MSG + IMP. (4)

1.2.

Objetivo Obteno de RNA de levedura por hidrlise alcalina e determinao quantitativa de RNA.

2. Materiais e Mtodos 2.1. Materiais

Para a completa realizao do experimento foram necessrios tais materiais: Tubo de centrfuga; Caneta de tinta para escrita em vidros; 2 gramas de levedura de panificao prensada com 70% de umidade; 5 mililitros de NaOH a 0,4%; Panela (com suporte para tubos de ensaio) com gua fervente para banho-maria; Bquer grande com gelo e gua para banho de gelo; Centrfuga; Tubos de ensaio (15 X 150 mm); Fenolftalena 0,5%; cido actico 5%; Pipetas de 2ml e 10 ml; Pra; Filme plstico; gua destilada; Proveta; Espectrofotmetro (incluindo o frasco adequado para insero das amostras na mquina); Papel higinico para limpeza do frasco do espectrofotmetro; Tabela 3 - Curva padro de RNA; Diversos produtos industrializados para verificao de seus ingredientes. Mtodos PARTE (I) EXTRAO DE RNA DE LEVEDURA DE PANIFICAO

2.2. 2.2.1.

O experimento parte de um tubo de centrfuga, contendo 2 g de levedura de panificao prensada (com 70% de umidade) e 5 ml de NaOH 0,4%, que foi previamente incubado em banho-maria em ebulio durante 20 minutos e, posteriormente, resfriado em banho de gelo e identificado com nmero do grupo. O mesmo tubo seguiu para a centrfuga e permaneceu no processo de centrifugao a 3000 rpm (rotaes por minuto) durante 5

minutos, assim separando a mistura em duas fases, sendo que o precipitado obtido foi descartado. O sobrenadante que resultou da centrifugao foi transferido para um tubo de ensaio com dimenses de (15 X 150 mm) e adicionado de 2 gotas de fenolftalena a 0,5%, depois da soluo ser devidamente misturada e homogeneizada foi adicionado, cuidadosamente, com auxlio de uma pipeta de 2 ml e uma pra, algumas gotas de cido actico 5% at atingir o ponto de viragem, ou seja, at que a soluo perdesse a tonalidade rosa choque e adquirisse uma tonalidade rosada bem clara, depois disso o tubo retornou para o banho de gelo. Depois da mistura ser resfriada, foi marcada, no prprio tubo, a altura alcanada pela soluo (Volume 1), assim foi possvel estipular 2 alturas equivalentes, acima da j ocupada, para ser completada de lcool etlico contendo 1% de HCl, ou seja, depois da adio do lcool o volume dentro do tubo triplicou (Volume 2), a comparao de volumes pode ser visualizada atravs de ilustrao abaixo:

Ilustrao 2 Comparao de volumes

O tubo foi tampado com filme plstico e a soluo misturada por inverso, depois de concludo o processo, o tubo seguiu para o banho de gelo. O tubo retornou para a centrfuga por mais 5 minutos a 3000 rpm, e, novamente, o sobrenadante foi descartado, j o precipitado foi ressuspendido (atravs da adio de gua destilada) para um volume final de 30 ml*, tal volume foi medido com uma proveta. Ainda com gua destilada, o precipitado, j ressuspendido, foi diludo nas seguintes propores:

Tabela 2 Propores de diluio Diluio Tubo 1 Diluio Tubo 2 Diluio Tubo 3 1:5 1:10 1:20

Em cada uma das diluies foram realizadas em tubos de ensaios diferentes (devidamente identificados), acima representados como Tubo1, Tubo2, e Tubo3, os trs tubos inicialmente receberam 2 ml de precipitado ressuspendido e, em seguida, adicionados de 10 ml, 20 ml e 40 ml de gua destilada, respectivamente (todas as medidas foram feitas com auxlio de uma pipeta de 10 ml e uma pra). 2.2.2. PARTE (II) DETERMINAO QUANTITATIVA DE RNA (TESTE DE

ORCINOL) Com o auxlio de uma pipeta de 2 ml, foi transferido 2 ml de cada amostra diluda para 3 novos tubos de ensaio (identificados com a diluio realizada e o nmero do grupo), em um quarto tubo foi adicionado o mesmo volume (dois mililitros) de gua destilada, este foi o chamado tubo branco. Os quatro tubos foram levados capela, onde, cuidadosamente, foram adicionados de orcinol (tal operao foi realizada pela PED da matria, com auxlio de uma pra e pipeta). Adicionado o orcinol, todos os tubos foram tampados com filme plstico e levados para o banho-maria em ebulio por 10 minutos. Depois de retirados do banhomaria, os tubos foram resfriados em gua corrente (na torneira), assim as amostras seguiram para o espectrofotmetro II. O aparelho foi calibrado com o contedo do tubo branco, em seguida as demais amostras tiveram suas absorbncias medidas a 600 nm, vale ressaltar que as amostras foram devidamente inseridas no recipiente adequado e este foi limpo e seco com papel antes de ser inserido no espectrofotmetro. Os resultados obtidos foram comparados com os da tabela de Curva padro de RNA cedida pelos tcnicos do laboratrio: Tabela 3 Curva Padro de RNA CURVA PADRO DE RNA ESPECTROFOTMETRO II RNA mg/ml 0.1 0.07 0.06 0.05 0.04 Absorbncia 660 nm 0.583 0.371 0.288 0.219 0.161

0.03 0.02 0.01

0.152 0.086 0.041

Apesar do roteiro sugerir como volume final 20 ml, nosso grupo ressuspendeu o precipitado

at 30 ml. Mas, a mudana de volume foi devidamente considerada e compensada nas posteriores diluies. 2.2.3. Parte (III) Identificao de compostos nucleotdeos acentuadores de sabor Foram cedidos diversos produtos alimentcios industrializados para que seus rtulos fossem lidos e compostos nucleotdeos acentuadores de sabor fossem identificados, tal informao est localizada na embalagem no setor de ingredientes. Os compostos a serem identificados eram: inosina 5monofosfato ou inosinatodissdico (ou seus derivados) e guanosina 5monofosfato ou guanilatodissdico (ou seus derivados).

3. Resultados 3.1. Determinao quantitativa de RNA (Teste de Orcinol)

O grupo 3 deveria fazer uma diluio de 1:10, 1:20 e 1:30 , mas devido ao fato j explicado anteriormente (2.2.2) as propores das diluies foram as seguintes 1:5, 1:10 e 1:20. A partir da Tabela 2, foi possvel obter a Curva Padro de RNA (Abs x MG/mL). Grfico 1 - Absorbncia

Absorbncia (Abs x mg/mL de RNA)

0.6 0.5 Absorbncia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.05 0.1 0.15 mg/mL de RNA
Series2 Series1 Linear (Series1)

y = 5.9382x - 0.0444 R = 0.9767

A equao da reta (linear) obtida foi a seguinte: y = 5,9382x 0,0444 (I) Sabemos que y representa a absorbncia e que ao comparar a Tabela 4 com a Tabela 3: Tabela 4 Absorbncia do Espectofotometro Absorbncia do Volume Espectofotometro destilada II 20 mL 10 mL 5 mL 0,194 0,662 1,372

Percebemos que apenas a absorbncia de 20 mL (0,194) est dentro da faixa da tabela 3, portanto ser o nico valor substitudo na equao I a fim de obter a quantidade de RNA na soluo. Substituindo os valores na equao I tem-se: y = 0,194 = 5,938x 0,0444 x= 0,04 Assim, calcula-se a porcentagem de RNA em levedura de panificao (massa seca): 0,04 x 20 (diluio) = 0,8 0,8 x 30 (diluio feita do precipitado) = 24mg de RNA em 2g de levedura. Transformando em 100g de levedura 24mg 0,024g

0,024g = 2g de levedura t 100g de levedura t = 1,2g

Logo:

Sabendo que a levedura prensada tem 70% de umidade, tem-se que desconsiderar-la. 1,2g de RNA M = 30g de levedura seca 100g de levedura seca

M = 4g de RNA em base seca

3.2.

Produtos Alimentcios acentuadores de sabor

presena

de

compostos

nucleotdeos

Foi apresentada uma relao de produtos para ser avaliada a presena dos seguintes nucleotdeos acentuadores de sabor: Inosina 5monofosfato ou inosinatodissdico (ou seus derivados): ser representado pela abreviao ID Guanosina 5monofosfato ou guanilatodissdico (ou seus derivados): ser representado pela abreviao GD

Tabela 5. Nucleotdeos acentuadores de sabor encontrados em alimentcios Produto Tipos de acentuadores de sabor GD e ID GD e ID GD e ID GD e ID GD e ID GD e ID GD e ID

Doritos (nachos) Ruffles (churrasco) NissinLamen (galinha) Sazn CupNoodles Quick (espinafre) Vono (milho com frango) Quick (batata com carne) Hondashi (tempero oriental) Vanios (sopa individual)

GD e ID

GD e ID

GD e ID

4. Discusso 4.1. Determinao quantitativa de RNA

Comparando os resultados obtidos experimentalmente com os da literatura, temos uma grande diferena. Na literatura encontra-se o valor de 8 a 11 mg de RNA por 100g de levedura (5). Essa diferena pode estar relacionada ao clculo da de porcentagem de RNA em levedura em base seca ou no. Outro fator para essa discrepncia a perda de RNA no precipitado durante a transparncia do sobrenadante para o tubo de ensaio apos a primeira centrifugao, alem

da perda no sobrenadante que desprezado na segunda centrifugao (anterior a diluio). FALO QUE COLOCAMOS AGUA DESTILADA A MAIS??? 4.2. Produtos alimentcios e a presena de acentuadores de sabor

Pode-se perceber ao avaliar os 12 alimentos industrializados que todos continham algum realador de sabor. Que isso mostra? Estes tais realadores so necessrios sensorialmente. O uso de extratos de levedura como fonte de realadores de sabor constitui-se num mercado em expanso, estimulado pela preferncia do consumidor por aditivos naturais. A utilizao de microorganismos para a gerao de produtos de interesse comercial tem recebido crescente ateno por parte por parte da indstria de alimentos. Dentro desse quadro, a produo de extratos de leveduras para uso como realador de sabor em alimentos uma possibilidade extremamente recente. No Brasil, o produto vem sendo fabricado por algumas indstrias a nvel experimental ou industrial, relevando um grande potencial econmico. Um exemplo de empresa de realador de sabor a DVA Brasil. A utilizao de soro de queijo produzido pela indstria de laticnios apresenta um exemplo de uma importante fonte de matria-prima barata para extratos de leveduras, j que este produto muitas vezes descartado. O mercado potencial de extrato de leveduras, com realadores de sabor abrange vrios setores da indstria de alimentos, destacando-se o de embutido, biscoitos, sopas, molhos, derivados de tomate e outros.

5. Concluso

Podemos notar que tanto o guanilato como o inosinato dissdico esto presentes na maior parte dos alimentos que so consumidos no dia-a-dia. A presena de ambos se deve ao realce natural que produz no gosto dos alimentos. Essa presena vem sendo cada vez mais freqente no somente pelo fato de atuar como melhorador de sabor, mas tambm porque a combinao desses nucleotdeos com certos aminocidos produz uma combinao que capaz de reduzir o teor de sdio utilizado em certos alimentos, se tornando ento mais saudvel. No presente trabalho foi verificado o teor de RNA em levedura por meio de hidrlise alcalina. Os resultados obtidos foram diferentes dos encontrados na literatura, mas esses erros puderam ser esclarecidos de forma satisfatria para a produo.

6. Referncias Bibliogrficas (1) NELSON, David L. e COX, Michel M.. Lehninger: Princpios de Bioqumica. 3. Ed. So Paulo: Savier Editora de livros Mdicos LTDA, 2002. (2) BIORIGIN. Perguntas mais frequentes Ingredientes Alimentcios. Disponvel em http://www.biorigin.net/Biorigin/index.asp?Fuseaction=Chamada&Menu=37,43,0,0&Pa rentID=43. Data de acesso: 22/03/2012. (3) AJINOMOTO. Alimentos e Aminocidos Os aminocidos esto presentes em todos os sabores relacionados ao paladar. Disponvel em: http://www.ajinomoto.com.br/enciclopedia/food.html. Data de acesso: 22/03/2012. (4) MALULY, Hellen D. B. Utilizao de aminocidos e nucleotdeos para o controle e reduo do sdio em alimentos. Disponvel em: http://www.ierls.org.br/download.asp?arquivoCaminho=/...g_6_1_354.pdf&arquivoNo me=/files/arq_ptg_6_1_354.pdf. Data de acesso: 22/03/2012. (5) REED, G., NagodaNithana, T.. YestTechonology. New York: Van Nostrand Reinhold, 1991.