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GUA DE LABORATORIO 2 OBSERVACIN DE LA CLULA VIVA Y COLOREADA CON GRAM 1 OBSERVACIN DE LA CLULA VIVA

Las bacterias son microorganismos unicelulares procariticos que no pueden ser apreciados a simple vista. Sin embargo an con la ayuda del microscopio puede resultar difcil su visualizacin, si no se emplean tinciones adecuadas. Cuando las bacterias se encuentran en una solucin acuosa es posible determinar su movimiento; sin embargo es importante diferenciar el movimiento verdadero de movimiento del Browniano o del producido por el desplazamiento del lquido. 1.1 Objetivos

1. Observar la clula bacteriana en fresco 2. Comparar la visualizacin de bacterias con y sin azul de metileno 3. Aprender la tcnica de la coloracin de Gram y sus variantes 4. Reconocer los esquemas de cuantificacin de bacterias al microscopio 1.2 Materiales Encendedor Lpices de cera (Cada estudiante debe traerlo) Frascos con hipoclorito Pedazos de tela Asas de argolla Guantes desechables Lpices de colores

Caldos con cultivos de Staphylococcus aureus y Proteus mirabilis Lminas Portaobjetos Lminas cubre objetos Microscopios Azul de metileno Mecheros de alcohol Pipetas Pasteur 1.3 Mtodo

1. Marque la placa porta objetos limpia. 2. Con una asa de alambre ponga una o dos gotas de la suspensin bacteriana que se le indique sobre uha lmina cubre objetos 3. Colquela de manera invertida sobre una lmina portaobjetos sobre la cual ha puesto previamente un palillo en L, de tal forma que la gota quede suspendida entre la laminilla y la lmina 4. Invierta la lmina y enfoque primero en 10X y luego en 40X. 5. Con una asa de argolla coloque una gota de la misma suspensin bacteriana

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sobre la placa cubreobjetos. 6. Al lado de la gota, coloque una gotita de azul de metileno y mezcle con movimientos circulares empleando una de las esquinas del cubreobjetos. 7. Colquela de manera invertida sobre una lmina portaobjetos sobre la cual ha puesto previamente un palillo en L, de tal forma que la gota quede suspendida entre la laminilla y la lmina 8. Observe al microscopio utilizando primero en 10X y luego en 40X. 1.4 Interpretacin

Si la bacteria es mvil debe presentar desplazamiento a travs del campo en la gota pendiente. Las bacterias con azul de metileno se aprecian ms fcilmente que sin ningn colorante. Observe si hay movimiento. La movilidad es ms activa en las bacterias que no estn con el colorante. 1.5 Preguntas

1. Por qu cree Ud. que la movilidad observada en las preparaciones sin azul de metileno es mayor que la observada en las que no tienen el colorante? 2. En qu consiste el movimiento browniano? 3. Qu otro mtodo se puede emplear para el montaje de la gota pendiente? 4. Qu utilidad tiene la observacin de las bacterias de esta manera? 2 OBSERVACIN DE LA CLULA COLOREADA CON TINCIN DE GRAM

2.1

Introduccin

La coloracin de Gram es una de las tinciones que con mayor frecuencia se emplea en el laboratorio de bacteriologa, fue ideada por el mdico dans Hans Christian Joachim Gram en 1884. sta coloracin permite agrupar a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a la capacidad que tienen o no de retener el colorante Cristal Violeta, respectivamente, despus del proceso de decoloracin. Esta caracterstica se encuentra directamente relacionada con la composicin de su pared celular. Existen bacterias con caractersticas intermedias y se comportan algunas veces como Gram positivas y en otras como Gram negativas por lo que se denominan Gram variables. Las caractersticas de coloracin de las bacterias pueden variar con su edad, por el tratamiento con antibiticos o la presencia de enzimas autolticas. Han sido descritas una serie de modificaciones a la tcnica original, orientadas a resolver problemas especficos y cuyas variaciones radican en la composicin del

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cristal violeta , as como en tipo de solvente orgnico empleado como agente decolorante y el colorante empleado como contraste. En este laboratorio se emplear la tincin de Gram de Hucker modificada. En esta tcnica, se emplean el violeta cristal oxalato como colorante primario, alcohol-acetona (1:1) como decolorante y la safranina, que no tiene afinidad con las bacterias Gram-positivas, como colorante de contraste. En trminos generales la tincin consta de los siguientes pasos: 2.1.1 2.1.2 2.1.3 Tincin primaria con cristal violeta: colorea a todas las bacterias Adicin del mordiente, Lugol: proceso qumico que fija el colorante a la pared bacteriana. Decoloracin con el solvente no polar(alcohol-acetona): acta a nivel de la pared y permite la salida del colorante en las bacterias con membrana externa y capa delgada de peptidoglicano o sea en las Gram negativas Adicin del colorante de contraste: que teir las bacterias decoloradas.

2.1.4

2.2

Objetivos

2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4

Aplicar la tcnica de tincin de Gram. Diferenciar bacterias Gram positivas y Gram negativas. Comprender los principios de tincin de las bacterias. Comprender el mecanismo por el cual las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta.

2.3

Materiales Encendedor Frascos con hipoclorito Aceite de inmersin Pedazos de tela Asas de argolla Guantes desechables (Cada estudiante debe traerlos) Pinzas Hisopos con algodn (Escobillones) Lpices de cera y Lpices de colores (Cada estudiante debe traerlos) Laminillas

Aplicadores sin algodn Caldos con cultivos de Staphylococcus aureus y Proteus mirabilis Gradillas de coloracin Lminas Portaobjetos Mecheros de alcohol Microscopios Reactivos para la coloracin de Gram: Safranina Solucin de Cristal violeta Alcohol- acetona Solucin de Lugol

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2.4

Mtodo*

Antes de realizar la tincin de Gram se deben seguir las siguientes recomendaciones: Las lminas deben ser nuevas, exentas de grasa y estriles.

Esto se puede lograr manteniendo las placas nuevas en un recipiente con alcohol y al momento de usarlas, se cogen con una pinza y se flamean. Despus de este procedimiento, no se deben tocar en el centro con los dedos ni con otro material .
2.4.1 Con el asa de argolla, coloque una gota pequea de la suspensin bacteriana sobre una lmina porta objetos y haga un extendido con movimientos circulares de dentro hacia fuera. Un procedimiento alterno que se hace a partir de colonias crecidas sobre medio slido es el siguiente: Tome la colonia con el asa de argolla y frtela con movimientos circulares de adentro hacia afuera, directamente sobre la lmina Djela secar a temperatura ambiente Fjela, pasndola 2 o 3 veces sobre la llama de un mechero. Para esto tome la lmina con la ayuda de una pinza, orintela en un plano vertical (de canto), psela sobre la llama y cuente un segundo por cada pase Cubra la muestra con cristal violeta por un minuto. Lave con agua corriente Cubra con lugol de gram por un minuto. Lave con agua corriente. Sosteniendo la placa de un extremo, decolore con alcohol-acetona:. Esto es: chorree el alcoholacetona sobre la superficie de la lmina de 1 a 5 segundos. e inmediatamente lave con agua corriente Cubra con safranina por uno o dos minutos.

2.4.2 2.4.3

2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7 2.4.8

2.4.9

2.4.10 Lave con agua corriente Escurra, deje secar a temperatura ambiente y observe al microscopio en aumento de 100 X.

Norma Tcnica Colombiana . NTC 4092.. 2009. Microbiologa de alimentos y productos para alimentacin animal. Requisitos generales y directrices para anlisis microbiolgicos. I.C.S.: 07.100.01
*

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Fugura 1 : Fenmenos que ocurren en las bacterias durante al coloracin de Gram 2.5 Interpretacin

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Examine el portaobjetos bajo el objetivo de inmersin en aceite de un microscopio. Aquellas clulas bacterianas que aparecen azules o violetas son Gram positivas (Gram +); aquellas con color rosa oscuro a rojo son Gram negativas (Gram -). 2.6 Cuantificacin

La evaluacin adecuada de una muestra de un frotis realizado a partir de una muestra clnica teida por la coloracin de Gram permite en muchos casos el diagnstico microbiolgico de una entidad clnica. El esquema que se muestra a continuacin es recomendado para obtener un dato numrico que permite obtener un resultado reproducible de la lectura de de la cantidad de bacterias y clulas en una placa portaobjetos coloreada con Gram Las bacterias son cuantificados como: nmero promedio que se aprecian por campo de inmersin (cuente al menos 10 campos). Nmero de cruces a informar 0 1+ 2+ 3+ 4+ Correspondencia en nmero promedio de bacterias observadas con objetivo 100 X en, al menos, 10 campos no hay bacterias presentes < 1 bacterias presente 1-4 bacterias presentes 5- 30 bacterias presentes 30 ms bacterias presentes

Las clulas son cuantificados como: nmero promedio que se aprecian por campo de inmersin (cuente al menos 10 campos): Nmero de cruces a informar 0 1+ 2+ 3+ 4+ Correspondencia en nmero promedio de bacterias observadas con objetivo 100 X en, al menos, 10 campos no hay clulas presentes < 1 clula presente 1-5 clulas presentes 6- 10 clulas presentes Ms de 10 clulas presentes

Adaptado de : http://www.microrao.com/micronotes/pg/Gram%20stain.pdf: consultado el da 24-03-2012 Nugent R. P ., M.A. Krohn and S.L Hilier. 1991. Realiability of diagnosis bacterial vaginosis is improved by standardized method of Gram stain interpretation. J. Clin. Micribiol. 29:297301. Clinical Microbiology Procedures Handbook. M,D Isenberg. 2da Ed. . 2004 Pg: 3.2.24

Church D, Melnyk E and Unger B. 2000. Quantitative Gram Stain Interpretation Criteria Used by Microbiology Laboratories in Alberta, Canada.. JCM. 38: 4266-4268

2.7

Preguntas y ejercicios

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2.7.1

Construya un cuadro comparativo en el que aparezcan las diferentes modificaciones de la coloracin de Gram, incluyendo la de Hucker, y anote la composicin de cada una de las soluciones empleadas en cada una de ellas. Cmo se hace la coloracin de Gram para tejidos? Qu diferencia se presenta en el proceso de tincin bacteriana, entre un colorante cido y uno bsico? Cmo influye el pH del medio externo en la coloracin de Gram? Qu otro mtodo de fijacin, adems del calor, se puede utilizar en la coloracin de Gram? Cul es el papel del Lugol en esta coloracin? Coloree en el siguiente esquema Bacteria Gram Positiva

2.7.2 2.7.3 2.7.4 2.7.5 2.7.6 2.7.7

Bacteria Gram negativa