Determinacin de las caractersticas analticas de Compost de champin (Agaricus Bisporus) mediante espectroscopa de infrarrojo cercano (NIR).

M. Prez Clavijo Centro Tecnolgico de Investigacin del Champin de La Rioja. Ctra. Clahorra km. 4, 26560 Autol (LA RIOJA) INTRODUCCIN La preparacin del sustrato de champin se basa en el desarrollo de un proceso fermentativo en estado slido en el que tienen lugar importantes cambios fsico-qumicos, bioqumicos y microbiolgicos sobre los materiales de partida y cuyo objetivo es la obtencin de un sustrato en el que se promueve el crecimiento del micelio de champin (Agaricus Bisporus) evitando el crecimiento de microorganismos competidores. En la preparacin de los sustratos de cultivo entran como materias primas una serie de subproductos agrcolas de diversa procedencia y condicin. Principalmente se utiliza paja y gallinaza. Durante la Fase I se produce la fermentacin de la mezcla en la que hay una presencia inicial de microorganismos mesfilos (< 40C) que va disminuyendo a medida que aumenta la temperatura para ser sustituidos por bacterias y hongos termfilos (40 55 C) y en el que intervienen mecanismos de naturaleza qumica a partir de los 60 C. La Fase II se basa en la pasteurizacin y acondicionamiento del compost, con una etapa de eliminacin de competidores, una segunda etapa de eliminacin de restos amoniacales y carbohidratos sencillos, aparicin de flora nutritiva y establecimiento de una proteccin bitica del compost, y una tercera etapa de enfriamiento con la que la flora termfila se inactiva y pasa a ser nutriente para el champin. La selectividad obtenida durante esta etapa deriva de la eliminacin de carbohidratos sencillos que puedan servir como nutrientes a la flora mesfila competidora del micelio de champin. Las caractersticas fsico-qumicas del sustrato en cada una de sus fases es determinante para la productividad que presenta el compost. El conocimiento de las estas caractersticas es necesario para seleccionar el mtodo y el tratamiento (tiempo, humectacin, temperatura y oxigenacin) que debe seguirse en su proceso de compostaje. La productividad, y por tanto la competitividad del sector, dependen fundamentalmente de este proceso Generalmente se utilizan una serie de indicadores clsicos para medir la calidad del compost: humedad, nitrgeno, materia orgnica, cenizas, pH y relacin C/N. Los valores finales ideales del compost estn tericamente definidos aunque no son universalmente aplicables a todo tipo de compost (diferencias en materias primas, procesado y cultivo). Dichos valores se obtienen a travs de unas pocas determinaciones analticas, que son laboriosas y costosas tanto desde el punto de vista econmico, como del tiempo requerido para su realizacin. De esta manera, los resultados son obtenidos a posteriori, lo que impide la aplicacin de la informacin en los mismos procesos de los que proceden los anlisis (correccin). La espectroscopia de Infrarrojo Cercano es una tcnica totalmente desarrollada de gran aplicacin en industria qumica, farmacutica y alimentara como una alternativa a mtodos

tradicionales. Presenta las ventajas de ser un mtodo no destructivo, sin necesidad de preparacin de las muestras y su gran rapidez de medida. En este trabajo se presenta el desarrollo de un mtodo de determinacin mediante infrarrojo cercano (N.I.R.) para muestras de compost en final de Fase II. El desarrollo y la implantacin de este mtodo de anlisis rpido y barato, permite determinar los perfiles analticos del compostaje en los puntos crticos del proceso industrial y en tiempo real. En este trabajo se presenta el desarrollo de la calibracin del mtodo N.I.R. para los parmetros clsicos generalmente determinados en compost: humedad, nitrgeno orgnico, nitrgeno amoniacal, cenizas, pH, conductividad y relacin C/N en muestras de compost de Fase II. Una vez obtenidos los modelos de calibracin es necesario proceder a la validacin del mtodo antes de su aplicacin como anlisis de rutina. Este trabajo se extender posteriormente a muestras de compost de Fase I y materias primas. METODOLOGA La obtencin de los modelos de calibracin se basa en la realizacin del anlisis de las muestras mediante un mtodo de referencia (mtodos clsicos) y as obtener los valores de los parmetros fsico-qumicos. Con estos valores se desarrollan las ecuaciones que relacionan el espectro medido en el equipo NIR de las muestras con los resultados obtenidos. Una vez obtenida la ecuacin de prediccin es necesario validar el modelo. Para realizarlo se obtienen los espectros y valores de referencia de nuevas muestras y se comparan con los obtenidos en la aplicacin de la ecuacin. Este paso permite asegurar la calidad del modelo y la idoneidad de su aplicacin. La metodologa seguida con las muestras es la siguiente: Recogida de muestras de Fase II de las distintas plantas de compostaje de La Rioja Determinacin de parmetros analticos: humedad, nitrgeno orgnico, nitrgeno amoniacal, cenizas, pH, conductividad y relacin C/N Recogida de los espectros N.I.R de todas las muestras

Recogida de muestras de Fase II Se han recogido muestras de compost de 8 plantas de compostaje de La Rioja. En todos los casos, la preparacin del compost se realiza mediante procedimientos similares. Las muestras de Fase II se recogen regularmente y se homogeneizan siendo llevadas al laboratorio para su anlisis en bolsas cerradas. Las plantas que tienen laboratorio propio realizan a su vez dichos anlisis lo que permite la comparacin de resultados con los obtenidos por el sector. La calibracin se ha realizado con un total de 279 muestras distribuidas entre las 8 plantas. Determinacin de parmetros analticos En la figura 1 se muestra el procedimiento seguido con las muestras. Los anlisis de referencia se realizan sobre todas las muestras segn los siguientes mtodos: - Determinaciones sobre la muestra en fresco (sin tratamiento de muestra):

Humedad: medida de la prdida de peso debida a la desecacin total de la muestra. La muestra se deseca en estufa a 107 C durante 16 horas. La prdida de masa es determinada por pesada. Amoniaco: el amoniaco est presente en el compost como NH3 o NH4+ y es destilado cuantitativamente en disoluciones a pH 9.5. El amonaco destilado es recogido sobre cido brico. La posterior valoracin con cido clorhdrico, permite el clculo de la cantidad inicial presente de amoniaco en la muestra. Ph y Conductividad: medida de pH y conductividad en un extracto obtenido a partir de la muestra de compost (relacin 1/5 en agua) mediante agitacin continuada durante hora. - Determinaciones sobre la muestra en seco (muestra desecada): Todas las muestras desecadas son molidas en un molino Tecator con 1 mm de tamiz. Cenizas: medida de la prdida de peso debida a la incineracin total de la muestra a una temperatura de 570 20 C durante 5 horas. La prdida de masa es determinada por pesada. Nitrgeno orgnico: ataque del producto por cido sulfrico concentrado, catalizado por sulfato potsico y sulfato de cobre, en el cual se transforma el nitrgeno orgnico en iones de amonio, que en medio fuertemente bsico, son destilados como amonaco, que es recogido sobre cido brico. La posterior valoracin con cido clorhdrico, permite el clculo de la cantidad inicial presente de nitrgeno en la muestra. Relacin C/N y Materia Orgnica Total: Estos parmetros se obtienen mediante clculo a partir de los valores obtenidos de cenizas y nitrgeno. Recogida de los espectros N.I.R Se recoge el espectro NIR de todas las muestras que se reciben en el laboratorio. Los espectros se obtienen tanto para la muestra en fresco como la muestra desecada y molida. Las muestras se miden en un equipo NIR Foss System 6500. Los espectros son recogidos desde 400 a 2500 nm en intervalos de 2 nm. En la figura 2 se muestra el equipo y las celdas de medida para la muestra en fresco y muestra desecada y molida. La figura 3 muestra el espectro de la muestra en fresco de compost y desecada y molida. Debido a las caractersticas de la muestra, se recogen tres espectros de la muestra en fresco. Se comprueba que la dispersin no supere un determinado valor y se hace la media. Para la muestra molida, debido a su mayor homogeneidad, se recogen solamente dos espectros. Figura 1.- Procedimiento de anlisis de muestras
DETERMINACIONES EN FRESCO: humedad, amoniaco, pH y conductividad Determinaciones en seco: cenizas, nitrgeno, fibras RECEPCIN MUESTRA SECADO Y MOLIDO Espectros NIR molido ESPECTROS EN FRESCO

REGISTRO

Figura 2.- Equipo de medida NIR

Medida fresco

Medida molido

Figura 3.- Espectros NIR de una muestra de compost Fase II. (1) muestra en fresco, (2) muestra desecada y molida

(1)

(2)

RESULTADOS Y DISCUSIN En la tabla 1 se muestra un resumen de las muestras utilizadas para la obtencin de los modelos de calibracin y sus caractersticas analticas. Tabla 1.- Caractersticas analticas de las muestras de calibracin
279 MUESTRAS Humedad (%) Cenizas (% s.m.s) Nitrgeno org. (% s.m.s.) Amoniaco (% N s.m.s.) pH Conductividad (mS/cm) Materia Orgnica (%s.m.s.) Relacin C/N MEDIA 68.3 27.3 2.4 0.033 7.3 6.4 72.0 17.6 D.S 2.66 2.83 0.18 0.046 0.19 0.95 2.91 1.63 MAX 74.2 36.5 2.9 0.28 8.0 9.1 77.1 22.6 MIN 59.4 22.7 1.9 0.01 6.8 3.4 63.0 13.5

Calibracin Una vez realizados los anlisis mediante el mtodo de referencia los valores obtenidos se introducen en el equipo y se desarrollan las ecuaciones de calibracin. El mtodo matemtico utilizado para desarrollar los modelos ha sido PLS (Partial Least Squared) en el que los datos espectrales se reducen a unas pocas combinaciones o nuevas variables que contienen la mayor parte de la informacin espectral y estn relacionadas con los valores de referencia. Se ha utilizado el software WinISI III (Foss) para la obtencin de las ecuaciones. Una vez realizada la seleccin de muestras y eliminacin de puntos anmalos el desarrollo del modelo implica el estudio de tres factores importantes: seleccin del rango de longitudes de onda empleado en el clculo del modelo, correccin de la dispersin de los datos y tratamiento matemtico aplicado a estos datos (derivatizacin y suavizado del espectro). Se han estudiado tres regiones espectrales, 400 1100, 1100 2500 y 400 2500. Para todos los analitos, la calibracin que presenta unos mejores parmetros es la obtenida con el rango de longitudes de onda de 1100 a 2500 nm. En el caso de la calibracin de las muestras en fresco el tratamiento de los datos afecta de manera significativa al modelo final, lo que nos ha obligado a desarrollar distintos modelos de calibracin en los que es necesario aplicar distintos tratamientos para cada grupo de analitos: humedad; cenizas s.m.s; amoniaco s.m.s y conductividad; nitrgeno total s.m.s., nitrgeno orgnico s.m.s., relacin C/N y pH. Los estadsticos de estas calibraciones se presentan en la tabla 2. Todos los analitos, excepto la conductividad, presentan relaciones relativamente buenas entre SEC y SECV y R/SECV y sin embargo en algn caso (pH) los coeficientes de determinacin son demasiado bajos. El resto de analitos presenta coeficientes de determinacin adecuados (prximos a 0.9), lo que garantiza, a priori, la calidad de la prediccin del anlisis.

Tabla 2.- Parmetros de calibracin

Analito Humedad Cenizas s.m.s. Amoniaco s.m.s Conductividad Nitrg. Org. s.m.s. Nitrg. Tot. s.m.s. Rel C/N pH N 83 102 97 34 76 78 78 77 Rango 60.1-74.0 22.0-34.0 0.0-0.164 3.91-9.55 1.90-2.80 1.90-2.80 14.2-22.1 7.0-7.9 SD 3.038 2.664 0.035 0.940 0.195 0.200 1.777 0.204 SEC 0.925 0.867 0.009 0.127 0.083 0.067 0.532 0.074 SECV 1.041 1.267 0.016 0.6423 0.098 0.1101 0.875 0.134 R2 0.9072 0.8941 0.9344 0.9816 0.8989 0.8874 0.9000 0.8502 R/SECV 17.5 12.6 10.2 8.8 11.9 10.9 12.1 10.2

N: nmero de muestras incluidas en el modelo (es distinto en cada caso debido al distinto modelo y puntos anmalos) Rango: rango de las muestras incluido en el modelo SD: desviacin estndar SEC: Error estndar de calibracin SECV: Error estndar en la validacin cruzada R2: Coeficiente de determinacin del modelo R/SECV: relacin intervalo de calibracin error estndar en la validacin cruzada (se considera una calibracin estable con valores > 10)

Cuando se realiza el estudio de calibracin sobre las medidas realizadas en la muestra desecada y molida los analitos que se pueden introducir en los modelos de calibracin son aquellos que se miden en la muestra seca: cenizas s.m.s, nitrgeno orgnico s.m.s, materia orgnica y relacin C/N. Se han realizado los mismos estudios previos para el clculo del modelo con la muestra secada y molida que los realizados anteriormente con la muestra medida en fresco. Debido principalmente a la mayor homogeneidad que presenta la muestra en esta presentacin se obtienen las mismas condiciones de aplicacin para todos los parmetros lo que ha hecho posible que en una sola ecuacin se resuelvan todos los analitos con buenos resultados. Tabla 3.- Parmetros de calibracin Medida muestra molida Analito N Rango SD SEC Cenizas s.m.s. 100 17.7-37.1 3.229 1.001 Nitrg. Org. s.m.s. 99 1.49-3.13 0.274 0.055 Materia orgnica 100 62.9-82.3 3.229 1.001 Rel C/N 97 11.8-23.4 1.931 0.523 SECV 1.340 0.078 1.340 0.697 R2 0.9038 0.9602 0.9038 0.9267 R/SECV 14.5 21.1 14.5 16.6

N: nmero de muestras incluidas en el modelo (es distinto en cada caso debido al distinto modelo y puntos anmalos) Rango: rango de las muestras incluido en el modelo SD: desviacin estndar SEC: Error estndar de calibracin SECV: Error estndar en la validacin cruzada R2: Coeficiente de determinacin del modelo R/SECV: relacin intervalo de calibracin error estndar en la validacin cruzada (se considera una calibracin estable con valores > 10)

En todos los casos los valores de R2 son altos ( 0.9), los valores de SEC y SECV estn dentro del mismo rango de magnitud y la relacin R/SECV es superior a 10 por lo que cabe esperar que las ecuaciones de prediccin sean efectivas. La regresin entre los valores nominales de la calibracin y los calculados a partir del modelo de calibracin presenta valores de coeficientes de determinacin superiores a 0.9 para todos los analitos. Validacin Una vez obtenida la ecuacin de prediccin es necesario validar el modelo. Para realizarlo se obtienen los espectros y valores de referencia de nuevas muestras y se comparan con los obtenidos en la aplicacin de la ecuacin. Este paso permite asegurar la calidad del modelo y la idoneidad de su aplicacin. La validacin se ha realizado con un total de 141 muestras distribuidas entre las plantas. A los espectros obtenidos para cada una de estas muestras se les han aplicado las ecuaciones correspondientes. Los resultados obtenidos para la validacin del modelo para muestras medidas en fresco se muestran en la tabla 4. Tabla 4.- Parmetros de validacin
Analito N Rec (%) D SEP Humedad (%) 139 100.07 1.005 1.293 Cenizas s.m.s. (%) 125 97.58 1.849 2.280 Materia Orgnica 122 101.06 1.788 2.278 Nitrg. Org. s.m.s. 119 99.39 0.137 0.167 Nitrg. Tot. s.m.s. 126 102.11 0.128 0.162 Rel C/N 116 102.25 1.410 1.717 pH 140 88.62 0.255 0.294 Conductividad 140 109.56 0.640 1.372 N: nmero de muestras incluidas en el modelo (es distinto en cada caso debido al rango y puntos anmalos) Rec (%): recuperacin media obtenida D: diferencia media SEP: Error estndar de prediccin

Los parmetros estadsticos obtenidos para los distintos modelos de calibracin permiten asegurar la capacidad predictiva de las ecuaciones para los parmetros de humedad, cenizas, nitrgeno orgnico, nitrgeno total, materia orgnica y relacin C/N. El amoniaco, debido a los valores tan pequeos presentes en las muestras, no permite una buena cuantificacin en todo el rango de aplicacin, aunque si permite obtener datos cuantitativos en los rangos correspondientes a los lmites de aceptacin de dicho parmetro en el compost. Conductividad y pH no presentan unos buenos resultados de prediccin. De manera similar se realiza la validacin de los modelos obtenidos para la muestra desecada y molida. En este caso, para todos los analitos se obtienen mejores estadsticos de prediccin que para las ecuaciones de calibracin sobre muestra fresca, probablemente debido a la mayor homogeneidad en las muestras que se obtiene al someterlas al proceso de molienda. Anlisis de rutina Una vez validados los modelos es posible la utilizacin del sistema N.I.R. para dar servicio analtico, sin embargo, para asegurar aun ms la tcnica y obtener modelos ms robustos, se

realiz la ampliacin de las ecuaciones incluyendo las muestras de validacin como nuevas muestras de calibracin. Inicialmente, el anlisis se realiza sobre las muestras de Fase II sin ningn tipo de tratamiento. Como control del modelo, un 10% de las muestras se siguen realizando mediante los mtodos de referencia. En aquellas muestras que, por las caractersticas del espectro, no permitan la aplicacin de las ecuaciones, as como a las que queden fuera de los rangos de aplicacin de los modelos de calibracin obtenidos para la muestra en fresco, se aplicarn los modelos obtenidos para la muestra desecada y molida. Las muestras a las que no puedan aplicarse ninguno de los modelos se analizarn mediante los mtodos clsicos. En la prctica, la aplicacin de las ecuaciones en el servicio analtico ha presentado dos problemas: - Variacin de los espectros de las muestras en funcin de la temperatura. El cambio verano/invierno modifica los espectros de las muestras de manera que tiene efectos distorsionantes sobre las ecuaciones de calibracin. - Variacin de las caractersticas de las muestras con el cambio de campaa (paja nueva, ciclos nuevos). Los cambios debidos a la temperatura se solucionan de manera matemtica incluyendo en los clculos del modelo de calibracin las variaciones relativas a la temperatura. Los cambios por inicio de campaa solamente pueden solucionarse mediante la adicin de muestras nuevas a la ecuacin. Este hecho debe ser tenido en cuenta en cada campaa, haciendo necesario extender la calibracin anualmente con un nuevo conjunto de muestras. CONCLUSIONES El estudio realizado ha permitido obtener y validar los modelos de calibracin mediante N.I.R. para distintos parmetros del compost en fase II: humedad, cenizas, nitrgeno orgnico, nitrgeno total, amoniaco, materia orgnica y relacin C/N. Los modelos obtenidos presentan capacidad predictiva suficiente para incorporar el anlisis NIR como anlisis de rutina de muestras de compost en Fase II. Es muy importante tener en cuenta la variabilidad de las muestras y su repercusin sobre los modelos obtenidos. Las ecuaciones deben actualizarse cada cierto tiempo mediante la adicin de muestras patrn y se debe realizar siempre un control de calidad para asegurar la exactitud de los resultados.
Bibliografa - Use of near-infrared spectroscopy to predict potencial musrhoom (Agaricus Bisporus) yield of phase II compost. Sharma HSS, Kilpatrick M. Applied Spectroscopy. 54(1): 1-15. 2000. - Mushroom (Agaricus Bisporus) compost quality factors for predicting potencial yield of fruiting bodies. Can. J. Microbiol. 46: 515-519. 2000. - Determination of the constent of water and rice bran in solid media used for mushroom cultivation using nearinfrared spectroscopy. Yano T, Suehara K, Nakano Y. Journal of Fermentation and Bioengineering. 86(5): 472476. 1998.

- Determination of phase II mushroom (Agaricus bisporus) compost quality parameters by near infrared spectroscopy. Sharma HHS, Kilpatrick M and Burns L. Journal of Near Infrared Spectroscopy. 8(1): 11-19. 2000. - NIR-measurements of moisture changes in foods. Wahlby U, Skjoldebrand C. Journal of Food Engineering. 47(4): 303-312. 2001. - Near-infrared analysis of soluble and insoluble dietary fiber fractions of cereal food products. Kays SE, Barton FE. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50(10): 3024-3029. 2002. - Analysis of water in food by near infrared spectroscopy. Buning-Pfaue H. 82(1): 107-115. 2003. - Homogeneity chek of agricultural and food industries samples using near infrared spectroscopy. Lafargue ME, Feinberg MH, Daudin JJ, Rutledge DN. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 375(4): 496-504. 2003. - Partial Least square for discrimination analysis. Barker M, Reyens W. Journal of chemometrics. 17: 166-173. 2003 - Improved Methods for Performing Multivariate Analysis and Deriving Background Spectra in the Atmospheric Open-Path FT-IR Monitoring. DaeWoong H, SeogYeon C. Appl. Spectrosc., 57(3): 299-308. 2003. - Application of Partial Least-Squares Regression to Near-Infrared Reflectance Spectroscopic Determination of Shive Content in Flax. Miryeong S, Barton FE., Appl. Spectrosc., 57 (5): 551-556 2003.