AVALIAO DE APOPTOSE E NECROSE EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE EM FERMENTAES VINRIAS

Vanessa Alexandra Guerreiro Salvador

Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Engenharia Alimentar

Orientador: Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista Co-orientador: Doutora Maria da Conceio da Silva Loureiro Dias
Jri: Presidente: - Doutora Maria da Conceio da Silva Loureiro Dias, Professora Catedrtica Convidada do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa. Vogais: - Doutor Manuel Jos de Carvalho Pimenta Malfeito Ferreira, Professor Auxiliar do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa; - Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista, Investigadora Auxiliar do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Tcnica de Lisboa.

Lisboa, 2009

AGRADECIMENTOS Agora que terminou mais uma etapa da minha formao acadmica, gostaria de agradecer a todos aqueles que de algum modo me ajudaram na realizao deste trabalho: Em primeiro lugar, Professora Doutora Maria da Conceio Loureiro-Dias, por autorizar a realizao deste estgio no seu laboratrio, abrindo deste modo os meus horizontes ajudando-me entender o que na realidade o mundo cientfico e o que implica fazer parte dele. Doutora Catarina Prista que, para alm de ser minha orientadora de estgio, foi a minha mentora que desde o incio me acompanhou e se mostrou disponvel em ajudar a ultrapassar todas as barreiras. Obrigada pela sua ajuda, compreenso e acima de tudo amizade. Aos colegas do laboratrio de Bioenergtica Microbiana do Instituto Superior de Agronomia, que ao longo destes meses demonstraram ser excelentes amigos e companheiros, sempre prontos a ajudar proporcionando-me momentos inesquecveis, nomeadamente: Ana Madeira, ao Tiago Viana (companheiro e amigo dos devaneios volta do mosto), M Jos Leandro, Iliana Pereira e especialmente ao Lus Leito (por toda a fora e apoio nos momentos mais difceis, sempre com uma palavra amiga nas alturas certas). No poderia deixar de agradecer Susana Dias e Joana Moura (equipa da Cooking Lab), que sempre que podiam fizeram de mim cobaia, dando-me a oportunidade de conhecer produtos maravilhosos, adoando sempre um pouco mais o ambiente. Um agradecimento tambm especial aos colegas do laboratrio de Gentica Vegetal do Instituto Superior de Agronomia, que se demonstraram bastante prestveis, sempre que me infiltrei no laboratrio deles, em especial Augusta (sem ela no teria ultrapassado algumas barreiras microscpicas), Edna, ao Miguel, Ana Caperta, Prof. Leonor e Prof. Wanda. Aos meus pais, sem eles eu nunca teria chegado onde cheguei, nem seria quem sou. Obrigada por estarem sempre ao meu lado! minha irm, Lara, companheira de sempre que desde pequenina me mimou e protegeu. Obrigada mana!

E, por ltimo, ao Andr que me apoiou em todos os meus passos e decises (mesmo que isso significasse ficar sem me ver). Obrigada por aguentares todas as minhas crises de falta de segurana e por me teres dado fora para seguir em frente. Obrigada por tudo!

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RESUMO Avaliao de Apoptose e Necrose em Saccharomyces cerevisiae em Fermentaes Vinrias

Durante a fermentao vinria as leveduras so sujeitas a vrias condies de stress que se modificam ao longo da fermentao e alteram o seu estado fisiolgico. Com este trabalho pretendeu-se avaliar a evoluo de diferentes indicadores do estado fisiolgico de uma estirpe industrial de Saccharomyces cerevisiae (ISA1000) durante fermentaes em mosto de uva branca, a 15C e a 30C, simulando as condies em adega. Como indicador do nmero de clulas viveis e de clulas metabolicamente activas, utilizouse a contagem de UFC/mL e de clulas coradas com azul de metileno, respectivamente, verificando-se que, no final da fermentao, cerca de 62% das clulas apresentam capacidade activa de multiplicao a 15C, e a 30C s 51% das clulas so capazes de se multiplicar. Por outro lado, na mesma fase a 15C, 65% das clulas mantm-se metabolicamente activas, enquanto a 30C somente 55% das clulas se encontram nesta condio. Determinou-se a ocorrncia de fenmenos apoptticos e/ou necrticos em clulas cultivadas s duas temperaturas, testando-se marcadores especficos que permitiram visualizar alteraes na morfologia da cromatina, fragmentao de DNA e alteraes na integridade da membrana. Apenas em clulas recolhidas no final da fermentao se observou a presena significativa de clulas em processo apopttico e necrtico.

Palavras-chave: Fermentao vinria, condies de stress, temperatura, Saccharomyces cerevisiae, apoptose e necrose.

*Orientador: Catarina Prista, PhD Instituto Superior de Agronomia; Universidade Tcnica de Lisboa

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ABSTRACT Evaluation of Apoptosis and Necrosis in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentations.

During wine fermentation the yeast cells are affected by several stress conditions in different phases of the fermentation process, which induces deeply changes in yeast cells physiology. The aim of this work was to evaluate different parameters related to the physiological state of an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae (ISA1000), during wine fermentations of white grape must, 15C and 30C, simulating winery conditions. As indicator of the number of viable cells and the number of metabolically active cells, was used the number of CFU/mL and cell counts with methylene blue, respectively, it was found that at the end of fermentation under 15 about 62% of the cells remain viable while under C 30C, only 51% of the cells are viable in this phase, being the percentage of metabolically active cells close to these values (65% at 15 and 55% at 30 C C). To evaluate the presence of apoptotic and/or necrotic phenotypes, in cells grown at the two temperatures (15C and 30C), several apoptotic and necrotic markers were observed, such as chromatin morphology, DNA fragmentation and membrane integrity. A significant presence of cells in apoptotic and necrotic process were observed mainly in cells collected at the end of fermentation.

Key-words: Wine fermentation, stress conditions, temperature, Saccharomyces cerevisiae, apoptosis and necrosis.

*Supervisor: Catarina Prista, PhD Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon

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ABSTRACT

Evaluation of Apoptosis and Necrosis in Saccharomyces cerevisiae during wine fermentations

Wine fermentation is a complex process. During wine making yeasts are subjected to an extremely wide gradient of stress situations. Grape must represents the first stress with a very high sugar concentration, low pH, frequently low concentration of other nutrients, e g, assimilable nitrogen, vitamins. And frequently antimicrobial agents, like residues of Cu2+, sulfur and pesticides. Moreover, sulfur dioxide is routinely added for its antiseptical and antioxidant properties, increasing the stress to yeast. As fermentation proceeds, sugar concentration decreases and ethanol concentration increases, pH decreases and temperature rises potentiating the deleterious effect of the other forms of stress. While fermenting must into wine, the stressing conditions present can dramatically induce multiple intracellular changes in yeast cells, which can affect the biomass yield and its fermentative capacity and the physiological condition of these cells. During early fermentation stages, growth occurs, for about 4 generations. Growth slows down, cells enter a stationary phase, and fermentation proceeds carried out by resting cells. Although there is a large amount of work performed on the behavior of Saccharomyces cerevisiae laboratorial strains under laboratory conditions, being often difficult to extrapolate from these studies useful interpretations to explain yeast performance in the winery. Still a lot of work has to be done on the yeast stress response while fermenting grape must and growth conditions during industrial processes in order to fill the huge gap between laboratory conditions and the real winery conditions. The objective of the present work was to study the behavior of Saccharomyces cerevisiae (ISA 1000) strain during wine fermentation. This strain was isolated from a commercial starter (FERMIVIN) and was grown in white grape must, under experimental conditions simulating a real winery, at 15 and 30C, temperatures commonly used for white wine and red wine production, respectively. More specifically, we aimed to analyze several parameters indicative of the physiological state of yeast cells in order to assess their ability to remain viable and metabolically active in particular during stationary phase. In order to evaluate this, attention was focused on viability of the cells (capacity to form colonies and to oxidize methylene blue) and on the presence of apoptotic and necrotic phenotypes.

Eight different physiological situations were selected for the fermentation performed under 15C: the phase immediately after inoculation, the middle of the lag phase, the beginning, the middle and the final of the exponential growth phase, the begging and the middle stationary growth phase, the end of fermentation (when no sugar was detected by standard methods). An additional sample point was also collected three days after the end of fermentation in order to evaluate the effect of sugar exhaustion. For 30C, eight situations including the phase after inoculation, the acceleration phase, the middle and the final of exponential growth phase, the begging and the middle stationary growth phase, the end of fermentation and the phase after the end of fermentation were selected. The number of viable cells and metabolic active cells were analyzed at both temperatures. At the end of fermentation at 15 about 62% of the cells remain viable while under 30C only C 51% of the cells are viable in this phase, being the percentage of metabolically active cells close to these values (65% at 15 and 55% at 30 C C). The decrease on cell viability was observed at the end of the fermentative processes, reflected the presence of cells without reproductive capacity and metabolic inactive cells. Since during the fermentation process cells are subject to several types of abiotic stresses, these growth conditions can be responsible for the induction of apoptotic and necrotic mechanisms leading to cell damage. In order to evaluate the presence of apoptotic and necrotic phenotypes, several characteristic markers were analyzed, such as Reactive Oxygen Species (ROS) accumulation (by DCFH-DA and DHR123 staining), chromatin condensation (by DAPI staining), DNA fragmentation (by TUNEL assay) and membrane integrity (by annexin V staining co-stained with propidium iodide). A significant presence of cells revealing signs of apoptotic and necrotic processes were observed mainly in cells collected at the end of fermentation, in particular after sugar exhaustion. For cells harvested at 15C, about 29% the cells presented chromatin condensation, with modified nuclear morphology and nuclear fermentation, 28% of them were co-stained with PI indicating a necrotic state. The evaluation of membrane integrity by Annexin-V staining revealed that 23% of cells presented membrane damages, being also co-stained with PI. Also, 19% of cells presented DNA fragmentation and 23% presented ROS accumulation. A similar phenotype was observed for cells grown at 30 Under these conditions, 25% of the cells C. were marked with DAPI staining and 23% were co-stained with PI, 33% of cells presented Annexin-V staining (all co-stained with PI), 17% of the cells presented DNA fragmentation and 23% accumulated ROS. These results were compatible with the data obtained for cell viability and reinforce the idea that the cells responsible for the majority of the fermentation process (resting cells) are metabolically active cells and do not present significant signs of

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apoptosis and necrosis. Results also suggest that the cells in this phase die by programmed necrosis, indicating the existence of a possible overlap between different types of programmed cell death.

Key-words: Wine fermentation, stress conditions, temperature, Saccharomyces cerevisiae, apoptosis and necrosis.

*Supervisor: Catarina Prista, PhD Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon

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NDICE AGRADECIMENTOS ............................................................................................................................ i RESUMO ...............................................................................................................................................iii ABSTRACT.............................................................................................................................................v LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................ xi LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................................... xii LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................................. xiv 1. INTRODUO GERAL ............................................................................................................... 1 1.1. 1.2. 1.3. Apresentao e enquadramento do tema ........................................................................ 1 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................................. 2 Fermentao vinria............................................................................................................. 3 Factores de stress ao longo da fermentao vinria .............................................. 4 Etanol.......................................................................................................................... 4 Temperatura .............................................................................................................. 6 Respostas ao stress ..................................................................................................... 6

1.3.1. 1.3.1.1. 1.3.1.2. 1.3.2. 1.4. 1.4.1.

Morte celular programada ................................................................................................... 8 Vias apoptticas em Saccharomyces cerevisiae......................................................... 8 Factores indutores de apoptose ............................................................................. 9 Mecanismos celulares associados apoptose.................................................. 10 Alteraes fisiolgicas associadas a apoptose em leveduras......................... 14

1.4.1.1. 1.4.1.2. 1.4.1.3. 1.5. 2.

Objectivos da dissertao ................................................................................................. 19

MATERIAIS E MTODOS ........................................................................................................ 20 2.1. 2.2. 2.3. Microrganismo ..................................................................................................................... 20 Meios de cultura.................................................................................................................. 20 Condies de crescimento e recolha de amostras ....................................................... 21 Manuteno das culturas .......................................................................................... 21 Quantificao de biomassa ....................................................................................... 21 Preparao do pr-inculo ........................................................................................ 21 Ensaios em mosto estril .......................................................................................... 21

2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 2.4.

Avaliao dos parmetros de crescimento de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 22 Pontos de amostragem .............................................................................................. 22 Avaliao do nmero de clulas viveis ................................................................. 22

2.4.1. 2.4.2.

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2.4.3. 2.5.

Avaliao do nmero de clulas metabolicamente activas ................................. 23

Determinao dos parmetros fsico-qumicos.............................................................. 23 pH do mosto ................................................................................................................ 23 Determinao da massa volmica do mosto ......................................................... 23 Brix............................................................................................................................... 23 Determinao da saturao de oxignio no mosto ............................................... 23 Fundamentos do mtodo....................................................................................... 23 Procedimento experimental .................................................................................. 24 Determinao do teor em glucose presente no mosto ......................................... 25 Mtodo qualitativo................................................................................................... 25 Mtodo quantitativo ................................................................................................ 25 Procedimento experimental .............................................................................. 26

2.5.1. 2.5.2. 2.5.3. 2.5.4. 2.5.4.1. 2.5.4.2. 2.5.5. 2.5.5.1. 2.5.5.2.

2.5.5.2.1. 2.5.6. 2.5.6.1. 2.6. 2.7.

Determinao do teor em etanol presente no mosto ............................................ 27 Procedimento experimental .................................................................................. 27

Optimizao da obteno de protoplastos ..................................................................... 28 Avaliao de Marcadores Apoptticos ............................................................................ 30 Condensao da cromatina ...................................................................................... 30 Fragmentao do DNA .............................................................................................. 30 Integridade da membrana plasmtica ..................................................................... 31 Formao de espcies reactivas de oxignio ........................................................ 31 Marcao com dihidrorodamina 123 ................................................................... 32 Marcao com diacetato diclorofluorescena ..................................................... 32

2.7.1. 2.7.2. 2.7.3. 2.7.4. 2.7.4.1. 2.7.4.2. 2.8. 3.

Microscopia da Epifluorescncia .................................................................................. 32

RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................................... 33 3.1. Avaliao dos parmetros de crescimento de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 34 Avaliao dos parmetros de crescimento da estirpe a 15C ............................. 34 Avaliao do estado fisiolgico da cultura a 15C............................................. 35 Avaliao dos parmetros fsico-qumicos do mosto........................................ 39 Avaliao de parmetros de crescimento da estirpe a 30C ............................... 43 Avaliao dos parmetros fsico-qumicos ......................................................... 46

3.1.1. 3.1.1.1. 3.1.1.2. 3.1.2. 3.1.2.1. 3.2.

Avaliao de marcadores apoptticos ............................................................................ 50 Formao de espcies reactivas de oxignio ........................................................ 50 Condensao da cromatina ...................................................................................... 54

3.2.1. 3.2.2.

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3.2.3. 3.2.4. 4. 5.

Fragmentao do DNA .............................................................................................. 60 Estudo da integridade da membrana ...................................................................... 66

CONSIDERAES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS .............................................. 70 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................................... 75

ANEXO I............................................................................................................................................... 90 ANEXO II ............................................................................................................................................. 91 ANEXO III ............................................................................................................................................ 93 ANEXO IV ............................................................................................................................................ 94

LISTA DE TABELAS N Legenda

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Morte celular caspase-dependente e caspase-independente (adaptado de Madeo et al., 2009) Factores de diluio utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15C e a (b) 30C Factores de diluio utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15C e a (b) 30C

Pg.
11 26 28 29 29 35 37 41 43 46 48 49 90 93 93 94 95

Quantidade de enzima utilizada para digesto da parede celular em funo da fase de crescimento da cultura em mosto, a 15C.

Quantidade de enzima utilizada para digesto da parede celular em funo da fase de crescimento da cultura em mosto, a 30C. Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentaes conduzidas a 15C.

Variao da viabilidade celular ao longo da fermentao vinria a 15C Teor de glucose e de etanol em fermentaes conduzidas a 15C

Nveis de saturao de oxignio no mosto em fermentaes conduzidas a 30C Caractersticas tcnicas da preparao comercial de levedura seca activa para vinificao FERMIVIN Parmetros fsicos do mosto ao longo da fermentao a 15C Parmetros da fsicos do mosto ao longo da fermentao a 30C Parmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentao vinria a 15C Parmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentao vinria a 30C

Variao da viabilidade celular durante fermentao vinria decorria a 30C Teor de glucose e de etanol em fermentaes conduzidas a 30C

Nveis de saturao de oxignio no mosto em fermentaes conduzidas a 15C

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LISTA DE FIGURAS N
1 2 3 4

Legenda
Representao esquemtica das respostas moleculares e fisiolgicas de uma clula afectada por alteraes ambientais. (Adaptado de Costa & Moradas-Ferreira, 2001) Mecanismos de apoptose em leveduras (adaptado de Madeo et al., 2009) Representao dos cenrios fisiolgicos que podem ocorrer na apoptose em leveduras (adaptado de Bttner et al., 2006) Esquema dos dois cenrios de envelhecimento celular em leveduras. (A) Envelhecimento replicativo: 1) Clula virgem a gemular pela primeira vez; 2 e 3) as cicatrizes das gmulas vo-se acumulando na clula me, cada cicatriz corresponde a uma clula filha; 4) no final da fase replicativa da clula esta deixa de produzir clulas filhas. (B) Envelhecimento cronolgico: 1) as clulas apresentam crescimento sincronizado; 2) o processo de envelhecimento inicia-se com clulas virgens e com clulas que apresentam uma nica cicatriz; 3) as primeiras clulas a apresentarem marcadores de morte celular so as mais velhas; 4 e 5) os processos de apoptose ocorrem levando desintegrao da membrana; 6 e 7) e formao de corpos apoptticos; 8) nova populao formada somente por clulas virgens (adaptado de Rockenfeller et al., 2008) Modelo proposto por Aragon e colaboradores para a diferenciao de clulas em fase estacionria, aps o esgotamento da fonte de carbono no meio (adaptado de Aragon et al., 2008) Esquema de montagem do elctrodo de oxignio e fonte de tenso (Adaptado do sitio informtico www.rankbrothers.co.uk) Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentao de mosto a 15C. Viabilidade celular ao longo do crescimento de S. cerevisiae ISA 1000, em mosto a 15C: a) relao entre D.O. 640nm e UFC/mL; b) relao entre D.O. 640nm, clulas totais e clulas metabolicamente activas. Valores de a) pH extracelular, da b) massa volmica (mg/mL) e do c) Brix do mosto, ao longo de fermentao de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 15C. Consumo de glucose e produo de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentaes de mosto a 15C Nveis de saturao de oxignio no mosto ao longo de fermentaes a 15C Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentao de mosto a 30C. Estudo da viabilidade celular ao longo do crescimento de S. cerevisiae ISA 1000, em mosto a 15C: a) relao entre D.O. 640nm e UFC/mL; b) relao entre D.O. 640nm, clulas totais e clulas metabolicamente activas. Valores de (a) pH extracelular, da (b) massa volmica (mg/mL) e do (c) Brix do mosto, ao longo de fermentao de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30C Consumo de glucose e produo de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentaes de mosto a 30C. Nveis de saturao de oxignio no mosto ao longo de fermentaes a 30C Acumulao de ROS. Marcao com DHR123 e DCFH-DA de clulas incubadas com perxido de hidrognio (clulas em fase exponencial incubadas com 5mM e em fase estacionria com 180 mM), controlo positivo de: a) fermentaes decorridas a 15C; b) fermentaes realizadas a 30C Evoluo da percentagem de clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DHR123 e com DCFH-DA ao longo de fermentaes decorridas a 15C Evoluo da percentagem de clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DHR123 e com DCFH-DA ao longo de fermentaes realizadas a 30C Fragmentao da cromatina. Marcao DAPI em clulas incubadas com cido actico. Controlo positivo, a 15C e 30C, respectivamente: a) e c) clulas em fase exponencial de crescimento (incubadas com 80 mM de cido); b) e d) clulas em fase estacionria (incubadas com 140 mM de cido) Condensao e fragmentao da cromatina, colorao DAPI, co-colorao com PI e representao das clulas em campo claro, em clulas S. cerevisiae ISA 1000 cultivadas em mosto a 15C Evoluo da percentagem de clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DAPI e com PI ao longo de fermentaes decorridas a 15C

Pg.
7 11 14 15

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

17 24 34 36 39 41 43 44 45 47 48 49 52

18 19 20

53 53 55

21 22

56 56

xii

23 24 25 26 27

28

29

30

Condensao e fragmentao da cromatina, colorao DAPI, co-colorao com PI e representao das clulas em campo claro, de clulas S. cerevisiae ISA 1000 nas vrias fases de fermentao vinria a 30C Evoluo da percentagem de clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DAPI e com PI ao longo de fermentaes decorridas a 15C Representao de controlos de fragmentao de DNA de clulas recolhidas a 15C, em fase exponencial e em fase estacionria de crescimento: a) controlo positivo e b) controlo negativo Representao de controlos de fragmentao de DNA de clulas cultivadas a 30C, em fase exponencial e em fase estacionria de crescimento: a) controlo positivo e b) controlo negativo Ensaio TUNEL em clulas de S. cerevisiae ISA 1000 cultivadas a 15C, com cocolorao com DAPI e PI: a) clulas recolhidas aps inoculao (T0), na fase de latncia (TLag) e em fase exponencial de crescimento (T1, T2 e T3); b) clulas recolhidas em fase estacionria (T4, T6 e T7) e 72 h aps o final de fermentao de glucose (T8); c) evoluo da percentagem de clulas que apresentam DNA fragmentado Ensaio TUNEL em clulas de S. cerevisiae ISA 1000 cultivadas a 30C, co-coloradas com DAPI e PI: a) clulas recolhidas aps inoculao (T0), na fase de acelerao (T1) e em fase exponencial de crescimento (T2); b) clulas recolhidas em fase estacionria (T4, T5 e T6) e 24 h aps o esgotamento de glucose (T7); c) evoluo da percentagem de clulas que apresentam DNA fragmentado a) Variao da Integridade da membrana plasmtica ao longo de fermentaes realizadas a 15C, b) visualizao aps marcao com Anexina-V e co-colorao com PI de clulas em fase de latncia (TLag), no final da fase exponencial (T3) e em plena fase estacionria (T5) a) Variao da integridade da membrana plasmtica ao longo de fermentaes de mosto de uva a 30C, b) visualizao aps marcao com Anexina-V e co-colorao com PI de clulas no incio da fase exponencial (T4) e no final de fermentao de glucose (T6)

60 60 62 62 63

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69

xiii

LISTA DE ABREVIATURAS ABREVIATURAS

DCFH-DA DHR 123 C CitC DAPI DCFH DHR123 DIC D.O.640nm EDTA MCP mL PBS PS p/v R123 ROS r.p.m. TCA TdT TE Tmaxf Tmaxi Top Tris TUNEL UFC UV YPD

DESIGNAES COMPLETAS
diacetato de dicloro-dihidrofluorescena dihidrorodamina 123 graus Celsius citocromio c 4,6-diamino-2-fenilindol dicloro-dihidrofluorescena dihidrorodamina 123 differential interference contrast densidade ptica medida a =640nm cido etilenodiamino tetra-actico morte celular programada mililitro phosphate buffered saline fosfatidilserina peso por volume rodamina 123 espcies reactivas de oxignio rotaes por minuto cido tricloro-actico terminal deoxinucleotidil transferase Tris-EDTA temperatura mxima final de crescimento temperatura mxima inicial de crescimento temperatura ptima de crescimento 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol TdT-mediated dUTP nick end labeling unidades formadoras de colnias ultravioleta yeast extract peptone dextrose

xiv

INTRODUO GERAL 1. INTRODUO GERAL 1.1. Apresentao e enquadramento do tema Ao longo do processo de fermentao do mosto de uva com vista produo de vinho, as clulas de levedura sofrem a aco de vrios tipos de factores de stress [Querol et al., 2003; Zuzuarregui & Olmo, 2004], que podem induzir numerosas alteraes do seu estado fisiolgico, ofendendo o crescimento, a capacidade metablica e a viabilidade celular [PrezTorrado et al., 2005]. Os primeiros factores de stress a que as leveduras esto sujeitas resultam das prprias caractersticas do mosto, dado este contar com elevada concentrao de acar (glucose e frutose 200 g/L) o que induz stress osmtico, apresentar um valor de pH baixo, poder ser um meio onde alguns nutrientes so escassos (ex: azoto assimilvel e vitaminas) e poder conter agentes com aco antimicrobiana (SO2, resduos de pesticidas, cobre e enxofre), quer em resultado de tratamentos efectuados ao prprio mosto, com vista sua estabilizao, quer em resultado de tratamentos efectuados quando as uvas se encontram na vinha [Carrasco et al., 2001; Querol et al., 2003; Zuzuarregui & del Olmo, 2004]. Aps esta fase inicial, a fermentao prossegue estando as clulas sujeitas diminuio do teor de acar, reduo do valor do pH do mosto, escassez/depleo de nutrientes, aumento do teor de lcool e de CO2 e frequentemente aumento da temperatura, que s por si constituem factores que afectam a fisiologia de clulas de levedura, quando conjugados podem ter um efeito ainda mais significativo. Estas razes levam a que o estado fisiolgico das clulas se altere, sendo as clulas em fase inicial de fermentao, clulas em fase exponencial, aps o que a taxa de crescimento baixa e a cultura entra em fase estacionria, sendo neste estado que se realiza a maior parte do processo fermentativo (resting cells). A maioria dos estudos realizados, at h poucos anos atrs, sobre o comportamento de levedura Saccharomyces cerevisiae centraram-se essencialmente em 3 aspectos: o estudo de estirpes laboratoriais, em meios ricos (tipo YPD) ou menos definidos (meio mineral) e centraram-se em clulas em fase exponencial de crescimento. Correspondendo a uma situao relativamente distante da situao real em adega durante a fermentao vinria, em que nos encontramos perante estirpes industriais (gentica e fisiologicamente diferentes das estirpes laboratoriais), mosto de uva (meio muito mais complexo que os meios usados habitualmente em laboratrio e com um balano de nutrientes no equilibrado) e a maior parte do perodo em que decorre a fermentao vinria as clulas encontram-se em fase estacionria. Estas diferenas levam a que frequentemente seja difcil de extrapolar os resultados laboratoriais para a situao real em adega de forma a prever e explicar o comportamento de Saccharomyces cerevisiae durante a fermentao de mosto realizada

INTRODUO GERAL em adega. Estudos prvios de fermentao vinria realizados a 25C, no laboratrio de Bioenergtica Microbiana do Instituto Superior de Agronomia, com uma estirpe industrial em mosto de uva branca, permitiram observar que de facto as clulas apresentam um comportamento peculiar, diferente do comportamento da mesma estirpe em meio mineral, e em plena fase exponencial, confirmando a ideia de que as clulas se encontram durante a fermentao vinria num estado fisiolgico diferente daquele em que habitualmente so estudadas em laboratrio. Particularmente interessantes foram os resultados obtidos no final de fermentao onde h uma diminuio no nmero de clulas viveis consistente com o aumento do nmero de clulas com sinais visveis de apoptose e necrose [V. Salvador, 2007], assim como o abaixamento do pH intracelular e o aumento da permeabilidade da membrana a protes nas ltimas fases de fermentao [C. Prista & M.C. Loureiro-Dias, comunicao pessoal]. Em virtude destes resultados, o presente trabalho pretendeu avaliara a performance da estirpe industrial anteriormente usada, em duas situaes de fermentao de mosto de uva mais prximas das situaes em que habitualmente so realizadas as fermentaes vinrias em adega. Neste sentido, escolheram-se duas temperaturas, 15C e 30C, sendo a primeira utilizada na produo de vinho branco ao passo que a segunda se aproxima de condies frequentes em fermentaes para a produo de vinho tinto. Propusemo-nos estudar o comportamento fermentativo da mesma estirpe de S. cerevisiae s temperaturas referidas, analisando vrios parmetros indicadores do estado fisiolgico das clulas de modo a avaliar a capacidade destas se manterem viveis e metabolicamente activas, com particular relevncia para marcadores de fenmenos de apoptose e necrose. 1.2. Saccharomyces cerevisiae A espcie Saccharomyces cerevisiae utilizada h milhares de anos na panificao e na fermentao de bebidas alcolicas, sendo a levedura fermentativa por excelncia, tendo sido utilizada igualmente nos ltimos anos para produo de bioetanol. tambm muito importante como organismo modelo para investigao laboratorial quer na rea da fisiologia e bioqumica quer na biologia celular moderna, sendo o microrganismo eucaritico mais estudado e aquele cujo genoma foi o primeiro a ser sequenciado [Williams, 1996]. Actualmente, este microrganismo frequentemente utilizado para recolher informao sobre as clulas eucarioticas e posteriormente transpor essa informao para a biologia humana [Ostergaard et al., 2000]. Dado o conhecimento ao nvel fisiolgico e molecular que existe sobre Saccharomyces cerevisiae, esta levedura tem sido utilizada nos mais diversos estudos relacionados com fermentao, quer como modelo em estudos fisiolgicos de efeitos de stress osmtico,

INTRODUO GERAL oxidativo, stress provocado pelo etanol e por cidos fracos, entre outros. Em particular, Saccharomyces cerevisiae tem sido no s muito utilizada para estudos das vias de regulao apopttica induzidas por stresses mas tambm como microrganismo para expresso heterloga de genes relacionados com as vias de regulao em mamferos uma vez que existem estirpes o que no possuem mitocndrias o que as torna particularmente interessantes para o estudo da apoptose [Braun et al., 2006]. 1.3. Fermentao vinria A fermentao vinria um processo biotecnolgico bastante complexo e dinmico que envolve frequentemente o desenvolvimento e o desaparecimento sequencial de diferentes espcies de leveduras [Querol et al., 2003]. O processo fermentativo pode ocorrer de forma espontnea (o mosto fermentado pela flora presente na adega e nas uvas) ou pode ser induzido por inoculao de estirpes de leveduras comerciais [Bisson, 2004]. No caso das fermentaes ditas espontneas, as espcies no-Saccharomyces crescem nas etapas iniciais da fermentao, sendo substitudas durante as etapas seguintes por leveduras do gnero Saccharomyces, que so mais tolerantes ao etanol [Fleet & Heard, 1993; Fleet, 2003; Zott et al., 2008]. Dentro do gnero Saccharomyces, a levedura Saccharomyces cerevisiae a principal responsvel pela fermentao alcolica [Pretorius, 2000; Querol et al., 2003]. No entanto, nem todas as estirpes de Saccharomyces cerevisiae so adequadas, uma vez que apresentam diferentes capacidades fisiolgicas e fermentativas, podendo ter impacto directo no produto final. Durante a fermentao, esta levedura converte os acares existentes nas uvas em etanol, dixido de carbono e em menor quantidade noutros metabolitos que iro ser relevantes para o produto final (por exemplo, glicerol, cido actico, acetaldedo) [Querol et al., 1992], quer ao nvel das caractersticas organolpticas quer de estabilidade do vinho. Actualmente, a maioria das fermentaes vinrias inicia-se aps inoculao, no mosto de uva, de uma estirpe de levedura seleccionada. A seleco da cultura depende da casta, da composio do mosto, das condies de fermentao e do produto que se quer obter. Do ponto de vista biotecnolgico, o uso de fermentos induz uma alterao da flora microbiana ao longo do processo fermentativo, visto que a adio de culturas puras faz com que a estirpe inoculada prevalea sobre as estirpes endgenas [Boulton et al., 1996; Beltran et al., 2002; Perez-Gonzalez et al., 1993]. No entanto, nas fases iniciais da fermentao as estirpes naturais desempenham um papel bastante importante pois o seu desempenho pode influenciar as propriedades organolpticas do produto final [Querol et al., 1992]. Deste modo, a utilizao de starters faz parte de uma estratgia que permite diminuir a fase de latncia, minimiza a influncia das estirpes selvagens, assegura a rpida fermentao do

INTRODUO GERAL mosto e fornece as condies necessrias para que se possa reproduzir vinho com a mesma qualidade [Bauer & Pretorius, 2000; Fleet & Heard, 1993]. 1.3.1. Factores de stress ao longo da fermentao vinria Durante a fermentao, as clulas so expostas a vrias situaes de stress, sendo que o mosto constitui a primeira situao de stress quer pela elevada concentrao de acares presentes (elevada presso osmtica), quer pelo baixo valor de pH, quer pela presena de compostos antimicrobianos (SO2 e resduos de pesticidas) e presena de microrganismos competidores (presena de factores killer e de molculas quorum-sensing e influncia da densidade espacial) [Yap et al., 2000; Fleet, 2003; Nissen et al., 2003; Hogan, 2006; PerezNevado et al., 2006]. medida que a fermentao decorre, aumenta a concentrao de etanol e de CO2, frequentemente a temperatura aumenta e ocorre o esgotamento de nutrientes e de O2 [Attfield, 1997; Bauer & Pretorius, 2000]. 1.3.1.1. Etanol

Ao longo da fermentao vinria, o etanol produzido em elevadas concentraes, podendo tornar-se txico para o metabolismo celular, sendo a membrana o primeiro alvo a ser atingido, pois o etanol tem a capacidade de perturbar as protenas [Ingram & Buttke, 1984; Llorente & Sols, 1969; Nagodawithana et al., 1977] e lpidos de membrana [Gurtovenko & Anwar, 2009; McIntosh et al., 1983; Mishra & Prasad, 1989; Rowe, 1987; Simon & McIntosh, 1984; Thomas & Rose, 1979]. A interferncia do etanol na fluidez da membrana tem um papel fundamental [Ingram & Buttke, 1984; Quintas et al., 2000], tendo como consequncia a estimulao do transporte passivo de protes [Leo & van Uden, 1984a], o aumento da sensibilidade temperatura com diminuio da temperatura ptima e mxima de crescimento [van Uden & Duarte, 1981; Loureiro & van Uden, 1982], e a inibio do transporte de acares [Leo & van Uden, 1982a; Loureiro-Dias & Peinado, 1982], amnia [Leo & van Uden, 1984b] e de aminocidos [Leo & van Uden, 1984b]. O etanol inibe o crescimento de Saccharomyces cerevisiae [Casey & Ingledew, 1986; Ingram & Buttke, 1984; Jones et al., 1981; van Uden, 1985] e a sua capacidade fermentativa de um modo no competitivo, ou seja, o etanol reduz as taxas mximas de crescimento e de fermentao sem reduzir a afinidade da levedura para os acares fermentescveis e a outros nutrientes [Leo & van Uden, 1982a]. Para alm disso, foi recentemente descrito por Kitagaki e colaboradores (2007) que o etanol pode induzir apoptose em leveduras na presena de Fis1, protena envolvida na fisso mitocondrial, no entanto, a fragmentao mitocondrial observada por estes autores como resposta s elevadas concentraes de etanol por eles aplicadas (aproximadamente 20% (v/v)), aparentemente no se relaciona com a morte celular [Kitagaki et al., 2007]. Por outro lado, os mesmos autores puderam observar que a

INTRODUO GERAL formao de espcies reactivas de oxignio bastante elevada em mutantes fis1, quando estes so expostos ao etanol [Kitagaki et al., 2007]. A par da aco do etanol, tem sido descrito por vrios autores um efeito sinrgico quando esto presentes em simultneo, estes dois factores de stress, elevadas concentraes de etanol e elevadas temperaturas. Esta sinergia foi descrita pela primeira vez por van Uden e Duarte (1981), ao observarem que em presena de elevadas concentraes de etanol ocorria uma deslocao das temperaturas cardiais (Top, Tmaxf e Tmaxi) para valores de temperatura mais baixo, levando a que nesta situao se observassem fenmenos de morte trmica a temperaturas mais baixas do que na ausncia de etanol, ou seja a presena de etanol induzia um aumento de sensibilidade temperatura [van Uden & Duarte, 1981]. Em termos de processos de vinificao, este efeito particularmente importante, no caso da produo de vinhos tintos, em que frequentemente so atingidos maiores teores em etanol e que decorrem em temperaturas mais altas o que pode estar na origem a amuos de fermentao ocorridos nestas condies. A tolerncia ao etanol depende no s das caractersticas de cada estirpe, resultantes dos seus perfis de expresso e dos seus prprios genomas [Perez-Ortin et al., 2002, Rossignol et al., 2003, Marks et al., 2008, Mira et al., 2009], como da fase de crescimento em que estas se encontram [Varela et al., 2005], estando descrito que clulas em fase exponencial de crescimento so de um modo geral mais sensveis (menos tolerantes) ao etanol do que clulas em fase estacionria, sendo necessrio avaliar em cada caso a sensibilidade das clulas nas condies de vinificao escolhidas. Uma vez que, como factores responsveis pela tolerncia podem citar-se a composio lipdica da membrana plasmtica [Jimenez & Benitez, 1987; Lloyd et al., 1993; Sajbidor, 1997; Chi & Arneborg, 2000; You et al., 2003; Takagi et al., 2005], acumulao de substncias protectoras como a trealose [Lucero et al., 2000], a sntese e acumulao de protenas de choque trmico [Sanchez et al., 1992; Piper, 1995], alterao da capacidade de expulso de protes [Rosa & S-Correia, 1991; Supply et al., 1995; Aguilera et al., 2006] e a estabilidade mitocondrial [Aguilera & Benitez, 1985; Ibeas & Jimenez, 1997]. Takemura e colaboradores (2004), observaram tambm que a localizao de Rat8p/Dbp5p, um factor essencial de exportao de mRNA, sofre alteraes em clulas estimuladas pelo etanol, o que demonstra que existem diferenas, no mecanismo de exportao de mRNA, na resposta ao choque trmico e na resposta ao stress provocado pelo etanol [Takemura et al., 2004].

INTRODUO GERAL 1.3.1.2. Temperatura

A temperatura um dos parmetros ambientais mais importantes para o desempenho das leveduras durante o processo fermentativo [Fleet & Heard, 1993], influenciando o crescimento de diferentes espcies [Torija et al., 2003a], a durao de fermentao [Torija et al., 2001] e o metabolismo das leveduras, nomeadamente a formao de metabolitos secundrios como o glicerol, cido actico, cido succnico, entre outros [Lafon-Lafourcade, 1983]. As clulas em fase exponencial so muito mais termosensveis do que em fase estacionria [Parry et al., 1976; Piper, 1993; Rosenberg & Wood, 1957; Sherman, 1956, 1959; Stell et al., 1994; Werner-Washburne et al., 1993]. As consequncias ao nvel celular da exposio de clulas de S. cerevisiae em fase exponencial a temperaturas superiores temperatura ptima de crescimento fazem-se sentir a diferentes nveis nomeadamente perda rpida de viabilidade [Sanchez & Lindquist, 1990; Schenberg-Fascino & Moustacchi, 1972], induo de sntese de protenas de choque trmico e transposio gradual de clulas para a fase G1 do ciclo celular [Johnston & Singer, 1980], e leses membranares [Walton & Pringle, 1980]. Por outro lado, as clulas em fase estacionria apresentam um fentipo de maior termotolerncia, verificando-se os nveis de protenas de choque trmico so elevados [Boucherie, 1985; Hallberg & Hallberg, 1996; Petko & Lindquist, 1986; Piper, 1993; Steels et al., 1994; Werner-Washburne et al., 1993]. A viabilidade das leveduras diminui medida que a temperatura de crescimento aumenta [Ough, 1966; Nagodawithana et al., 1974; Casey et al., 1984], o que pode ser explicado com base na alterao da estrutura da membrana plasmtica [Lucero et al., 2000] e nos efeitos de uma elevada acumulao de etanol no meio intracelular a elevadas temperaturas, produzindo toxicidade celular [Nagodawithana et al., 1974]. 1.3.2. Respostas ao stress Ao longo da fermentao vinria, as leveduras tem que enfrentar todas as alteraes dos parmetros extracelulares referidas anteriormente, tendo desenvolvido mecanismos de adaptao que lhes permitem detectar os diversos factores ambientais (qumicos e/ou fsicos), seguindo-se uma transmisso de sinal para a induo da transcrio de genes envolvidos em respostas gerais e especficas, que permitem o aumento da tolerncia ao factor de stress, podendo evitar temporariamente a morte celular [Costa & Moradas-Ferreira, 2001; Pretorius, 2000; Querol et al., 2003]. Estes mecanismos moleculares comuns foram identificados como resposta geral ao stress (Figura 1).

INTRODUO GERAL

Figura 1: Representao esquemtica das respostas moleculares e fisiolgicas de uma clula afectada por alteraes ambientais. (Adaptado de Costa & Moradas Ferreira, 2001) Moradas-Ferreira,

O mecanismo de resposta e de adaptao a estas condies de stress ainda no est completamente conhecido [Attfield, 1997; Bauer & Pretorius, 2000; Marks et al., 2008; Pham & Wright, 2008], mas a recente aplicao de tcnicas de gentica funcional em leveduras, cultivadas em condies extremamente relevantes a nvel industrial, permitiu identificar genes implicados na regulao, assim como factores de transcrio que controlam o metabolismo e algumas propriedades tecnolgicas relevantes [Backhus et al 2001; Hauser al., et al., 2001; Rossignol et al., 2003; Rossignol et al., 2006; Varela et al., 2005 ., ., 2005]. Entre os genes activados por este mecanismos, encontram-se os genes HSP que estes se codificam para protenas resistentes a choque trmico que actuam como chaperones, na tentativa remoo e sequestro de protenas danificadas ou incorrectamente conformadas [Lindquist & Craig, 1988; Schlensinger, 1990; Sanchez & Lindquist, 1990] estando a 1990], protena Hsp12 envolvida na proteco contra a desidratao das membranas e contra o stress induzido pelo etanol [Sales et al., 2000]. Por outro lado, foi reportado que a protena cinase TOR ( tado (target-of-rampamycin age em rampamycin) conjunto com outras cinases de resposta a nutrientes, Sch9 e a protena cinase A (PKA), de nutrientes, modo a coordenar a resposta celular a alteraes nos nveis de nutrientes [Kaeberlein et al., 2007]. Uma das funes coordenadas de TOR, Sch9 e PKA regular a resposta geral ao stress controlando a localizao dos factores de transcrio Msn2 e Msn4 [Beck & Hall, 1999; Gorner et al., 1998; Longo, 2003; Smith et al., 1998]. Em condies de elevada , disponibilidade de nutrientes a protena cinase TOR est activa, os factores de transcrio

INTRODUO GERAL Msn2/4 so retidos no citoplasma, onde so incapazes de activar a transcrio de protenas necessrias regulao do stress provocado pelo esgotamento de nutrientes [Beck & Hall, 1999]. Quando ocorre o esgotamento total dos nutrientes, os factores de transcrio Msn2/4 so enviados para o ncleo, resultando desta relocalizao uma maior resistncia celular aos stresses causados por oxidao e por variaes de temperatura. 1.4. Morte celular programada Morte celular programada (MCP) pode ser definida como um processo activo, que caracterizado por um ciclo de eventos moleculares endgenos, que representam uma forma de suicdio celular (a clula desempenha um papel activo na sua morte) [Leist & Jaattela, 2001]. A MCP um mecanismo deveras complexo, que requer a activao coordenada e a execuo de mltiplos mecanismos, que incluem as vias caspase-dependente e caspaseindependente [Madeo et al., 2009; Ludovico et al., 2005]. Este mecanismo definido geneticamente, ditando diferentes fentipos que vo variando de apopttico a necrtico a autofgico, com intermedirios e possveis sobreposies entre as diversas formas [Ludovico et al., 2005]. Ao contrrio da apoptose, os modos no-apoptticos da MCP (que incluem necrose programada, morte celular autofgica e o colapso mitocondrial) s so possveis de definir de forma ambgua, pois ainda no foram devidamente caracterizados [Guimares & Linden, 2004; Okada & Mak, 2004; Proskuryakov et al., 2003]. As clulas que sofrem morte celular por apoptose apresentam caractersticas morfolgicas e bioqumicas especificas que incluem exposio de fosfatidilserina (PS) [Martin et al., 1995], a condensao da cromatina, a fragmentao do DNA genmico e a diviso do citoplasma e do ncleo em corpos apoptticos ligados membrana, contendo ribossomas, mitocndrias intactas e material nuclear [Gross et al., 1999]. Nos mamferos, estes corpos apoptticos so rapidamente reconhecidos e fagocitados por macrfagos ou por clulas epiteliais adjacentes. Nas leveduras, os corpos apoptticos e restantes fragmentos celulares, sofrem ruptura e lise. Designando-se esta fase terminal da morte celular por necrose secundria [Ludovico et al., 2005]. Estes factos podem causar problemas na caracterizao de apoptose em leveduras, pois marcadores de necrose, como a desintegrao da membrana plasmtica, sobrepem-se aos marcadores tpicos de apoptose [Ludovico et al., 2005]. 1.4.1. Vias apoptticas em Saccharomyces cerevisiae Em 1997, Madeo e colaboradores, observaram pela primeira vez apoptose em Saccharomyces cerevisiae, tendo observado que uma mutao no gene CDC48, que codifica para uma protena associada degradao de retculo endoplasmtico em

INTRODUO GERAL vesculas, pode resultar em MCP com caractersticas idnticas s observadas em clulas de mamferos, tais como, a translocao de PS da membrana externa para a membrana interna (passando esta a estar exposta superfcie da clula), a fragmentao do DNA e a condensao da cromatina [Madeo et al., 1997]. Posteriormente, vrios autores se tm debruado sobre este assunto, tendo-se observado MCP em leveduras expostas a diversos compostos dando-se particular relevncia ao perxido de hidrognio [Madeo et al., 1999], ao cido actico [Ludovico et al., 2001], a elevadas concentraes de glucose [Granot et al., 2003] e ao etanol [Kitagaki et al., 2007]. 1.4.1.1. Factores indutores de apoptose

Nos anos que se seguiram a esta descoberta, foram testados diversos compostos exgenos que se pensavam serem capazes de induzir apoptose em Saccharomyces cerevisiae, dando-se destaque a compostos que induzem espcies reactivas de oxignio (ROS) como o perxido de hidrognio (H2O2) [Madeo et al., 1999] e o cido actico [Ludovico et al., 2001, 2002]. Destes estudos, pode-se concluir que baixas concentraes destes compostos podem despoletar mecanismos de apoptose. No caso de clulas expostas a H2O2, concentraes na ordem dos 3-5 mM induzem MCP com caractersticas de clulas apoptticas enquanto clulas expostas a concentraes mais elevadas de H2O2 (180 mM) apresentam fentipos tpicos de necrose. Quando expostas a cido actico, por um lado, clulas que se encontram em fase exponencial de crescimento entram em apoptose aps exposio a concentraes na ordem dos 40-80 mM e, tal como para o perxido de hidrognio, em elevadas concentraes de cido actico (120-160 mM) este tipo de clulas apresentam caractersticas de clulas necrticas [Ludovico et al., 2001], por outro lado, clulas em fase estacionria precisam de concentraes mais elevadas de cido actico para se induzir o mesmo efeito, tendo sido observado por Ludovico e colaboradores (2002) que clulas em fase estacionria somente exibem MCP com fentipos de apoptose na presena de concentraes de 120-140 mM e sofrem necrose quando expostas a concentraes superiores a 200 mM do mesmo cido [Ludovico et al., 2002]. No entanto, tambm foi descrito por estes autores, que a ausncia de ROS ou a hipoxia podem prevenir apoptose em clulas expostas a H2O2, assim como a presena de cicloheximida tanto em clulas expostas a este composto como em clulas expostas a cido actico [Madeo et al., 1999; Ludovico et al., 2001]. Para alm do perxido de hidrognio e do cido actico, outros compostos exgenos conhecidos pela sua capacidade de induzir apoptose em leveduras so o HOCl [King et al., 2003], a aspirina [Balzan et al., 2004], o cido frmico [Du et al., 2008], o NaCl [Huh et al., 2002] e elevadas concentraes de glucose [Granot et al., 2003]. A apoptose em leveduras

INTRODUO GERAL tambm pode ser desencadeada pelo esgotamento da fonte de carbono e energia no meio [Herker et al., 2004] ou esgotamento de aminocidos essenciais como a lisina e a histidina em clulas auxotrficas [Eisler et al., 2004], a deleo do gene SRO7/SOP1 homlogo de um gene que codifica para um supressor de tumor [Wadskog et al., 2004], a deleo ou alterao de genes que codificam para protenas envolvidas na estabilizao do mRNA [Mazzoni et al., 2003] e a comunicao entre clulas [Severin et al., 2002]. Recentemente, Kitagaki e colaboradores, demonstraram que o etanol tambm pode induzir morte celular com caractersticas comuns apoptose, como a condensao e fragmentao da cromatina, a fragmentao do DNA e a necessidade de sntese de protenas de novo [Kitagaki et al., 2007]. 1.4.1.2. Mecanismos celulares associados apoptose

Em virtude destas descobertas, tornou-se importante compreender os mecanismos envolvidos na MCP em Saccharomyces cerevisiae (Figura 2). Desde o incio, a MCP em leveduras foi associada produo de ROS, levando suposio de que estes radicais eram os nicos reguladores da morte celular por apoptose. No entanto, esta suposio foi sempre alvo de grande controvrsia, visto que em Saccharomyces cerevisiae, a acumulao de ROS evidente em quase todos os cenrios de apoptose, mas provavelmente desempenha um papel secundrio, actuando como um mensageiro ou regulador do processo [Ludovico et al., 2005]. Toda esta controvrsia desencadeou a procura de protenas similares s conhecidas nos mamferos, tendo como base a comparao entre sequncias homlogas, o que permitiu a identificao da metacaspase YCA1 em Saccharomyces cerevisiae idntica s caspases dos mamferos [Madeo et al., 2002], e que desempenha um papel central na apoptose em leveduras (via caspase-dependente) [Madeo et al., 2009; Mazzoni & Falcone et al., 2008]. Uma estimativa rude dos artigos publicados sobre os vrios cenrios de apoptose em leveduras aponta que aproximadamente 40% so caspase-dependentes [Madeo et al., 2009]. A tabela 1 mostra os casos em que a supresso da metacaspase YCA1 foi bem sucedida na proteco das clulas (pelo menos em parte ou por um momento de forma dependente), quando estas so expostas a um factor mortal [Liang et al., 2008; Mazzoni & Falcone et al., 2008]. Atravs de estudos de homologia tambm foi possvel detectar a existncia de um factor indutor de apoptose, AIF (Apoptotic Inducing Factor), homlogo ao de mamferos [Wissing et al., 2004]. Este factor normalmente encontra-se na mitocndria e como resposta a estmulos apoptticos translocado para o ncleo (via caspase-independente), sendo o seu modo de

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INTRODUO GERAL actuao em leveduras similar ao observado em mamferos, [Liang et al. 2008; Madeo et al., al., 2009].

Figura 2: Mecanismos de apoptose em leveduras (adaptado de Madeo et al. 2009). al.,

Tabela 1: Morte celular caspase caspase-dependente e caspase-independente independente (adaptado de Madeo et al., 2009).
Cenrios de apoptose Yca1p-dependente Estmulos externos
H2O2

Cenrios de apoptose Yca1p-independente independente Referncias

[Madeo et al., 2002] [Khan et al., 2005] [Ahn et al., 2006] [Guaragnella et al., 2006] [Mazzoni et al., 2005] [Silva et al., 2005] [Wadskog et al., 2004] [Mitsui et al., 2005] [Du et al., 2007] [Liang et al., 2007] [Nargund et al., 2008]

Estmulos externos
cido frmico Cobre Dermasepsinas Esfingolpidos

Referncias
[Du et al., 2008] [Liang et al., 2007] [Morton et al., 2007] [Cheng et al., 2003]

cido Actico NaCl/stress hiperosmtico cido valpric Arsnio Mangans Cdmio

Cenrios fisiolgicos
Envelhecimento cronolgico Toxinas virais killer
[Reiter et al., 2005] [Ivanovska et al., 2005] [Herker et al., 2004]

Cenrios fisiolgicos
Envelhecimento replicativo Diferenciao em colnias
[Madeo et al., 2009] [Vachov et al., 2005]

Mutaes
ubp10 orc2-1 lsm4 1 (envelhevimento) fis1 cit1 (calor, envelhecimento) isc1 (H2O2, envelhecimento)

Processos biolgicos
Desubiquitinao Replicao (DNA) Desnivelamento de mRNA Fisso mitocondrial Metabolismo mitocondrial Metabolismo miticondrial/homeostase
[Mazzoni et al., 2005] [Fannjiang et al., 2004] [Lee et al., 2007] Liang et al., 2007] [Bettiga et al., 2004]

Mutaes/Sobreexpresso
wbp1-1 ost2-3 sr077 (NaCl) NUC1exp (EndoG de leveduras) AIF1exp (AIF de leveduras) Bax, Bid, caspases humanas

Processos biolgicos
N-glicosilao glicosilao N-glicosilao glicosilao Exocitose
[Hauptmann et al., 2006, 2008] [Hauptmann et al., 2006] [Wadskog et al., 2004] [Bttner et al., 2007] [Wissing et al., 2004] [Lisa-Santamaria et al., 2009] [Guscetti et al., 2005]

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INTRODUO GERAL Tal como patente na Figura 2, a mitocndria desempenha um papel crucial na apoptose em leveduras. Para alm de estar implicada na formao de ROS e na libertao de reguladores apoptticos (como por exemplo, Aifp1 e CitC), aparentemente a proliferao mitocondrial (fisso ou fuso) parece ser relevante na morte celular via caspasedependente. Em mamferos, a fragmentao da mitocndria trata-se de um precoce marcador de apoptose. Em leveduras, foi demonstrado que trs genes envolvidos na fisso mitocondrial esto relacionados com a apoptose nestes organismos. Em mutantes que sofreram quer a deleo de DNM1 (homologo de Drp1 em humanos), quer a deleo de MDV1/NET2, aps exposio a stress trmico, tratamento com cido actico ou com perxido de hidrognio, observa-se uma diminuio de morte celular quando se compara com a estirpe selvagem. Por outro lado, existem evidncias de que, em leveduras, a protena Fis1 actua como uma protena anti-apopttica da famlia Bcl-2 [Fannjiang et al., 2004; Reiter et al., 2005]. Verifica-se um aumento da morte celular em mutantes que sofreram deleo de FIS1 e que h uma relao entre a presena ou a ausncia de Yca1p, uma vez que a delao de YCA1 repe os nveis de morte celular igualando-os aos verificados em estirpes selvagens [Fannjiang et al., 2004]. Estudos recentes demonstraram que em clulas estimuladas pela presena de etanol, ocorre fragmentao da mitocndria mediada pela protena Fis1, mas que a fragmentao da mitocndria no se encontra directamente relacionada com a morte celular [Kitagaki et al., 2007]. Kitagaki e colaboradores (2007) propem que quando as mitocndrias so sensibilizadas pela presena do etanol, fragmentam de forma dependente de Fis1. Possivelmente, o etanol induz a formao de ROS, que aparentemente se relaciona com a actividade de Fis1. Por ltimo, as espcies de ROS formadas tm a capacidade de induzir fentipos apoptticos, que incluem a induo da condensao e fragmentao da cromatina e a fragmentao do DNA [Kitagaki et al., 2007]. O citocromo c (CitC) outra molcula implicada na apoptose em leveduras, mas ainda no est claro o seu mecanismo de aco, visto haver evidncias da sua participao em ambas as vias (caspase-dependente e caspase-independente). Yamaki e colaboradores (2001) observaram que a morte celular mediada pela deleo da histona chaperone ASF1/CIA1 encontra-se associada diminuio do potencial de membrana, diminuio da actividade da ATPase mitocndrial e libertao do CitC, fentipo similar apoptose em mamferos [Yamaki et al., 2001]. Pavlov e colaboradores (2001) provaram a existncia de um canal que permite a sada de CitC e de outros factores das mitocndrias; este canal apresenta elevada condutividade, dependente de Bax e foi observado em mitocndrias de mamferos e de leveduras [Pavlov et al., 2001]. Posteriormente, Ludovico e colaboradores (2002) demonstraram que o CitC libertado por estimulao de estirpes selvagens de

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INTRODUO GERAL Saccharomyces cerevisiae por aco do cido actico. A libertao do CitC funciona como um sinal para a apoptose, tendo-se observado que clulas sem a capacidade de produzir CitC e clulas deficientes-respiratrio, quando expostas ao cido actico no revelam marcadores apoptticos [Ludovico et al., 2002]. Por outro lado, como foi referido anteriormente, nem todos os mecanismos de apoptose em leveduras so dependentes da metacaspase YCA1 (Tabela 1). Por exemplo, a morte celular regulada que ocorre durante o desenvolvimento de colnias a longo prazo [Leadsham et al., 2009; Vachova & Palkova, 2005] ou apoptose devida imperfeita N-glicosilao em clulas Ost2p deficientes, homlogo da protena defensora de apoptose-1 (DAD1) em mamferos [Hauptmann et al., 2005], so ambos independentes de YCA1. Para alm disso, em consequncia da deficiente N-glicosilao em mutantes sensveis temperatura wbp1-1 ou aps tratamento com tunamicina, a MCP em leveduras depende da actividade da protease KEX1. Esta protease, recentemente identificada, tambm desempenha um papel na morte celular induzida por cido actico ou por envelhecimento cronolgico [Hauptmann & Lehle, 2008]. Um outro efector de morte celular em leveduras YCA1-independente o factor NUC1 codificado pelo gene NUC1, ortlogo da endonuclease G (EndoG) de mamferos [Bttner et al., 2007a]. Tal como a EndoG de mamferos, Nuc1p que se encontra na mitocndria translocada para o ncleo aps induo de apoptose [Li et al., 2001]. A deleo da sequncia de localizao mitocondrial aumenta a actividade pr-apopttica de Nuc1p. Curiosamente, a morte celular mediada por Nuc1p independente de Aif1p mas requer a presena da carioferina Kap123p (protena homloga de uma protena que funciona como um poro nuclear e que permite transio da EndoG em mamferos) e da fosforilao da histona H2B [Bttner et al., 2007a]. A interrupo de NUC1 leva inibio de apoptose mas s quando a respirao mitocondrial elevada; nas condies em que a fosforilao oxidativa inibida, a interrupo de NUC1 resulta em morte celular por necrose (no programada) [Bttner et al., 2007b]. O ncleo das clulas abriga um forte regulador de apoptose caspase-independente, designado por mediador nuclear de apoptose, Nma111p, cuja sobreexpresso promove o aumento de morte celular aps exposio a elevadas temperaturas ou a H2O2, enquanto a sua eliminao reduz os sinais de apoptose [Fahrenkrog et al., 2004]. A funo letal de Nma111p mediada pela sua actividade de serina e, ao contrrio do que foi observado em mamferos para a protena homloga (HtrA2/Omi), a Nma111p no se localiza na mitocndria mas sim no ncleo [Fahrenkrog et al., 2004]. Uma outra questo interessante prende-se no facto de um dos substratos de Nma111p ser Bir1p, nico inibidor de apoptose

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INTRODUO GERAL conhecido em leveduras [para reviso consultar: Owsianowski et al., 2008]. Como consequncia de stress oxidativo, mutantes de deleo para BIR1 apresentam nveis elevados de apoptose, enquanto a sobreexpresso de Bir1p reduz os nveis de morte celular, um efeito que pode ser antagonizado pela sobreexpresso simultnea de Nma111p [Walter et al., 2006]. Um outro mecanismo de controlo nuclear de apoptose em leveduras, que aparentemente parece ser conservado em mamferos, conhecido por regulao epigentica [Ahn et al., 2005a; Ahn et al., 2006; Cheung et al., 2003], proeminente na via que envolve a cauda Nterminal da histona H2B, que diacetilada a lisina 11 pela histona diacetilase Hos3p e de seguida fosforilada a serina 10 pela cinase Ste20p [Ahn et al., 2006]. A cinase Ste20p igualmente necessria na regulao da apoptose induzida por feromonas em leveduras [Severin & Hyman, 2002]. 1.4.1.3. Alteraes fisiolgicas associadas a apoptose em leveduras

Em leveduras, a morte celular por apoptose tambm tem sido associada a diversos cenrios fisiolgicos (Figura 3), que podem representar uma explicao para este comportamento em organismos unicelulares, como o envelhecimento, o stress replicativo e a produo de toxinas killer [Bttner et al., 2006; Frhlich et al., 2007; Kaeberlein et al., 2007; Laun et al., 2008; Ludovico et al., 2005; Madeo et al., 2004].

Figura 3: Representao dos cenrios fisiolgicos que podem ocorrer na apoptose em leveduras (adaptado de Bttner et al., 2006).

Os primeiros estudos sobre o envelhecimento celular em leveduras foram publicados h 50 anos, e j nessa poca se observou que as leveduras apresentaram uma capacidade finita

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INTRODUO GERAL de replicao [Mortimer & Johnston, 1959]. Mais recentemente, foram descritas duas formas de envelhecimento celular em leveduras (Figura 4) o envelhecimento replicativo (replicative aging) e o envelhecimento cronolgico ( (chronological aging). O envelhecimento replicativo, tambm designado por envelhecimento especfico das clulas me (mother cell specific ageing), pode ser definido como o nmero de divises celulares mother ageing), que uma clula me consegue efectuar antes de morrer [Bitterman et al. 2003]. Este al., processo de envelhecimento no se relaciona com o tempo e ocorre na presena de nutrientes. As clulas me envelhecidas ( (old mother cells), so muito maiores de que as ), clulas jovens, ostentam um ciclo celular mais longo e baixa actividade translacional dos actividade ribossomas, ncleos difusos (i.e., no to bem definidos como os das clulas jovens), as clulas sofrem oxidao interna mesmo na ausncia de stress oxidativo e o citoesqueleto de actina apresenta-se colapsado e agrupado [Breitenbach et al., 2003; Laun et al., 2001; Laun se 3; et al., 2008].

Figura 4: Esquema dos dois cenrios de envelhecimento celular em leveduras. (A) Envelhecimento em replicativo: 1) Clula virgem a gemular pela primeira vez; 2 e 3) as cicatrizes das gmulas vo-se : acumulando na clula me, cada cicatriz corresponde a uma clula filha; 4) no final da fase replicativa da clula esta deixa de produzir clulas filhas. (B) Envelhecimento cronolgico 1) as clulas cronolgico: apresentam crescimento sincronizado; 2) o processo de envelhecimento inicia-se com clulas virgens se e com clulas que apresentam uma nica cicatriz; 3) as primeiras clulas a apresentarem marcadores de morte celular so as mais velhas; 4 e 5) o processos de apoptose ocorre levando os ocorrem desintegrao da membrana; 6 e 7) e formao de corpos apoptticos; 8) nova populao formada rao somente por clulas virgens (adaptado de Rockenfeller et al., 2008).

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INTRODUO GERAL O envelhecimento cronolgico relaciona-se com o tempo que uma clula permanece vivel durante a fase estacionria [Bitterman et al., 2003], mas que, devido falta de nutrientes, passa por um processo de senescncia. Herker e colaboradores (2004) demonstraram que clulas cronologicamente envelhecidas quando morrem exibem fentipos caractersticos de clulas apoptticas, tais como a acumulao de ROS e a activao de caspases. A morte celular provocada pelo envelhecimento pode ser inibida pela expresso de YAP1 [Herker et al., 2004], um regulador a nvel transcricional na resposta ao stress induzido pelo oxignio, e pela interrupo da apoptose atravs da deleo da caspase YCA1 [Madeo et al., 2002]. No entanto, os defeitos na maquinaria apopttica enfraquecem a capacidade de re-crescimento, tendo-se verificado que, em ensaios de longa durao, e as estirpes selvagens (com vias apoptticas funcionais) sobrepem-se s estirpes que apresentam delees em genes apoptticos quando se encontram em competio directa [Herker et al., 2004], o que pode indicar que a apoptose em leveduras pode conferir uma vantagem selectiva e demonstrar que as clulas velhas podem libertar para o meio substncias que estimulam a sobrevivncia da cultura [Fabrizio et al., 2004]. Gourlay e colaboradores (2004) observaram que mutaes que induzem um aumento na dinmica da actina promovem a longevidade das clulas e, por outro lado, a diminuio na dinmica de actina provoca actividade reforada de caspases e a despolarizao da membrana mitocondrial conduziram ao aumento de ROS e de morte celular [Gourlay et al., 2004]. Por outro lado, os mesmos autores referem que o papel da dinmica do citosqueleto de actina na regulao dos processos apoptticos em leveduras, poder indicar que este modo de morte celular pode provavelmente fazer parte dos processos naturais de envelhecimento destas clulas. Para alm do envelhecimento replicativo e cronolgico, vrios autores referem que, de culturas em fase estacionria, podem ser isoladas, por gradiente de densidade, duas populaes de clulas com caractersticas morfolgicas e fisiolgicas completamente distintas [Allen et al., 2006; Aragon et al., 2008]. Uma das populaes que se encontra em fase estacionria constituda pelas clulas filhas resultantes do ltimo ciclo celular da cultura, tendo sido designadas por clulas quiescentes. Esta populao composta por clulas que podem adquirir tempo de vida til atravs de um processo de diferenciao que envolve alteraes na parede celular, na reserva de hidratos de carbono como glucose e trealose, e na quiescncia do genoma, o que se assemelha a um verdadeiro estado G0, uma vez que estas clulas quiescentes podem entrar de forma sincronizada num novo ciclo celular. Em contraste, com estas clulas as clulas da outra populao (clulas no quiescentes) mantm a viabilidade apesar de perderem rapidamente a capacidade de se reproduzirem. Esta populao caracterizada pela existncia de clulas com clulas filhas

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INTRODUO GERAL celulares inacabados. Comparando esta populao omparando aderentes, resultantes de ciclos ce populao descrita anteriormente, aparentemente apresenta menor tempo de vida, mas eventualmente ambas as populaes em tempos de vida muito diferentes entram em apoptose ou necrose (Figura 5 [Allen et al., 2006; Aragon et al., 2008]. 5)

Figura 5: Modelo proposto por Aragon e colaboradores para a diferenciao de clulas em fase estacionria, aps o esgotamento da fonte de carbono no meio (adaptado de Aragon et al., 2008).

se Por outro lado, tem-se observado que tanto em ambiente natural como em laboratrio, Saccharomyces cerevisiae tende a formar comunidades multicelulares para sobreviver escassez de nutrientes no meio [Reynolds & Fink 2001; Zara et al., 2002]. Mas a existncia Fink, ., de um programa de envelhecimento altrustico continua a ser um tema bastante controverso controverso. A grande maioria dos gerontologistas apoia teorias de envelhecimento de carcter no adaptativo e devido aleatria acumulao de danos celulares causada pelo declnio da daptativo ausada fora da seleco natural e, consequentemente, pela diminuio da proteco e da manuteno celular durante o envelhecimento [Longo et al., 2005]. Contudo, e 5]. estudos realizados nos ltimos anos tm vindo a demonstrar que a longevidade determinada geneticamente e que depende de vias evolutivas extremamente conservadas De acordo extremamente conservadas. com os estudos realizados foi possvel definir a teoria da longevidade programada (programmed longevity theory De acordo com esta teoria, o envelhecimen em vez de programmed theory). , envelhecimento depender de danos aleatrios causado pela inactivao geneticamente programada ou pelo declnio de um sistema de reparao ou manuteno que pode controlar o dano celular [Longo et al., 2005]. Em vez disso, a teoria de envelhecimento progra 5]. teoria programado e altrustico (programmed and altruistic aging theory supe a existncia de um programa gentico programmed theory) activado, tendo como objectivo final sacrificar a maioria da populao para a sobrevivncia de alguns organismos adaptados. Segundo esta teoria a seleco natural funciona a nvel seleco de grupo e no a nvel individual. Mais especificamente, quando observado em culturas de

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INTRODUO GERAL clulas provenientes do mesmo progenitor, que so isognicas excepto nas mutaes que sofrem ao longo do tempo, o crescimento adaptativo pode ser visto como uma forma de seleco de parentesco [Longo et al., 2005; Skulachev, 2002]. Um outro cenrio fisiolgico de apoptose em leveduras foi descrito pela primeira vez, em 2002 por Severin e Hyman. Estes autores demonstraram que a exposio de clulas haplides a feromonas (mating factors) pode induzir apoptose em leveduras na ausncia do mating-type complementar, consequentemente h uma passagem do ciclo celular normal para mecanismos de morte celular. Um acasalamento bem sucedido pode prevenir a apoptose, o que sugere que as leveduras utilizam a morte induzida pelo mating factor (factor-) para eliminar clulas infrteis ou danificadas [Severin & Hyman, 2002]. Portanto, a apoptose induzida por feromonas pode assegurar um progresso evolutivo que favorece o estado de diplidia, o que considerado um vantagem adaptativa [Bttner et al., 2006]. Este processo de morte celular induzido por baixas concentraes de feromonas e depende da libertao do CitC e da permeabilizao mitocondrial, ocorrendo a acumulao de ROS e fragmentao do DNA [Severin & Hyman, 2002]. Em contraste, com este processo, Zhang e colaboradores (2006) propuseram trs mecanismos de morte celular, gentica e cronologicamente distintos, no caso de morte causada por elevadas concentraes de feromonas. Neste caso os mecanismos de morte so precedidos por acumulao de ROS, nestas condies no se detecta a fragmentao de DNA mas h permeabilizao da membrana, tendo sido sugerido por estes autores, que a morte celular resultante de acasalamento inadequado de natureza necrtica [Zhang et al., 2006]. No entanto, observou-se tambm que a morte pode ocorrer no s antes mas tambm depois do acasalamento, em acasalamentos bem sucedidos conduzem gerao de clulas diplides, que podem, como consequncia da escassez de nutrientes, sofrer meiose e esporular, tratando-se de uma forma aleatria de remodelar e reorganizar o genoma, com o objectivo de aumentar a diversidade gentica e por conseguinte obter-se uma populao mais adequada s condies do meio. Contudo, nestes casos a meiose est associada a apoptose, observando-se que 20% das clulas cultivadas em meios de esporulao morrem por apoptose, enquanto os 80% que sobrevivem iniciam esporulao, garantido que apenas recombinantes adaptados sobrevivem [Ahn et al., 2005b; Knorre et al., 2005]. A produo e secreo de toxinas (virais), com actividade antimicrobiana, um fenmeno relativamente comum em leveduras. Em Saccharomyces cerevisiae, so conhecidas trs toxinas killer K1, K2 e K28. As leveduras so imunes s protenas citotxicas por elas produzidas [Schmitt & Breinig, 2002]. No entanto, a interaco entre estirpes produtoras de toxinas pode induzir a morte celular em leveduras [Breinig et al., 2006; Ivanovska & Hardwick, 2005; Reiter et al., 2005; Schmitt & Breinig et al., 2006]. Tem sido observado que

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INTRODUO GERAL as toxinas podem desencadear dois mecanismos de morte celular: baixas concentraes podem induzir apoptose enquanto elevadas concentraes podem provocar necrose [Reiter et al., 2005]. 1.5. Objectivos da dissertao Com este trabalho pretendeu-se avaliar a evoluo da viabilidade celular da estirpe Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 ao longo do processo de fermentao vinria, a 15C e a 30C, atravs da avaliao de marcadores de apoptose. Em termos especficos avaliou-se, para ambas as temperaturas: A quantificao de clulas metabolicamente activas por marcao com azul de metileno; A quantificao de clulas viveis por contagem de UFC/mL; Avaliao de marcadores apoptticos, tais como, morfologia da cromatina (colorao com DAPI), estado de fragmentao do DNA (ensaio TUNEL), formao de espcies reactivas de oxignio (colorao com dihidrorodamina 123 e diacetato de diclorodihidrofluorescena), translocao de fosfatidilserina (colorao com Anexina-V) e a diferenciao de clulas necrticas e integridade da membrana (colorao com iodeto de propdio).

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MATERIAIS E MTODOS 2. MATERIAIS E MTODOS 2.1. Microrganismo O microrganismo utilizado neste estudo foi a estirpe ISA 1000 de Saccharomyces cerevisiae, pertencente Coleco de Culturas de Leveduras do Instituto Superior de Agronomia. Esta estirpe foi isolada a partir de uma preparao comercial de levedura seca activa para vinificao, de origem francesa, designada comercialmente por FERMIVIN. 2.2. Meios de cultura O meio de manuteno corrente da cultura de Saccharomyces cerevisiae foi o meio slido YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose), com a seguinte composio: glucose 2% (p/v), peptona 1% (p/v), extracto de levedura 0,5% (p/v), agar 2% (p/v), preparado em gua desmineralizada. Este meio de cultura foi igualmente utilizado para a contagem em placas das unidades formadoras de colnias (UFC). Os ensaios foram realizados em mosto de uva branca proveniente da vinha do Instituto Superior de Agronomia. Nas etapas preliminares de preparao do mosto foi-lhe adicionado 50 mg/L de SO2 (antissptico) e 10 mg/L de enzima clarificante Novoclair Speed. Foi, igualmente, sujeito a um processo de decantao de 2 dias, a 5C, com o objectivo de lhe serem removidos os slidos de maiores dimenses. O processo de conservao e esterilizao do mosto teve como premissa a preservao mxima das suas caractersticas originais, executando procedimentos que visassem a minimizao da alterao por factores de deteriorao, nomeadamente, atravs da minimizao da exposio ao O2, luz e a temperatura elevadas. Foram-nos disponibilizados 100 L de mosto, que foi dividido em alquotas de aproximadamente 1 L, colocadas em sacos de plstico devidamente selados, aos quais foi retirado o O2. Estes sacos foram colocados dentro de outros, de forma a reforar a barreira mosto/O2, bem como a evitar possveis condensaes de gua que alterassem a sua composio e foram congelados na cmara a -80C. Sempre que necessrio procedeu-se descongelao temperatura ambiente, durante a noite e ao abrigo da luz, da fraco de mosto a utilizar. Aps descongelamento, o mosto foi centrifugado (Eppendorf 5810R Centrifuge) a 12000 g durante 3 minutos, a 4C, de forma a remover, tanto quanto possvel, os slidos de maiores dimenses em suspenso, seguindose uma srie de filtraes sucessivas a vcuo com membranas de poros progressivamente menores, comeando por uma membrana de 1,2 m de poro (Whatman GF/C), passando para uma membrana de 0,45 m de poro (Millipore TYPE HA), terminando numa filtrao

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MATERIAIS E MTODOS esterilizante com membrana de 0,22 m de poro (Millipore TYPE GSWP). O mosto estril foi conservado a 4C e protegido da luz at ser utilizado. 2.3. Condies de crescimento e recolha de amostras 2.3.1. Manuteno das culturas As estirpes foram inoculadas em tubos com meio slido inclinado (meio YPD, seco 2.2) e incubadas em estufa, durante 24 a 48h, a 28C, aps o qual foram mantidas a 4C. Executou-se este procedimento em todos os momentos que antecederam os ensaios, de forma a manter a cultura fresca e/ou a obter suficiente biomassa para os inculos necessrios. 2.3.2. Quantificao de biomassa O acompanhamento do crescimento celular realizou-se atravs da leitura da densidade ptica das culturas, a 640 nm (D.O.640nm), utilizando-se um espectrofotmetro Ultrospec 2100 pro (Amersham Biosciences). As amostras foram retiradas em intervalos de tempo adequados e diludas com gua desmineralizada sempre que a D.O.640nm excedeu o valor de 0,45, de forma a assegurar a proporcionalidade entre a D.O.640nm e a biomassa presente. 2.3.3. Preparao do pr-inculo Antes de cada ensaio, preparou-se um pr-inculo com o objectivo de reavivar as clulas e diminuir o choque que lhes causado quando se procede sua transferncia entre meios de cultura com estados fsicos diferentes. A preparao do pr-inculo, foi realizada usando como inculo biomassa fresca, proveniente de um tubo com meio YPD, repicada para um balo de Erlenmeyer de 200 mL, contendo 100 mL de mosto estril. As culturas foram incubadas, com agitao orbital (incubador Shel Lab SI Series), a 130 rpm, a 28C, durante aproximadamente 16h, de modo a manter as clulas em fase exponencial no momento da sua colheita. 2.3.4. Ensaios em mosto estril No que respeita s inoculaes em mosto estril, as clulas do pr-inculo foram previamente contadas em hemocitmetro (aps crescimento do pr-inculo at fase exponencial) e procedeu-se inoculao de 1x106 clulas/mL de mosto (concentrao habitualmente utilizada nas adegas a partir de inculos comerciais), em 800 mL de mosto estril, contidos num balo de Erlenmeyer de 1000 mL, previamente termostatizado temperatura do ensaio a realizar (15C ou 30C). De seguida, incubou-se a cultura a 15C

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MATERIAIS E MTODOS ou 30C, com agitao magntica fraca (130 rpm) e ausncia de arejamento suplementar, durante todo o perodo de fermentao. 2.4. Avaliao dos parmetros de crescimento de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 Com vista determinao da durao da fase de latncia e do tempo de duplicao das culturas em mosto, bem como determinao do perodo de fermentao e seleco dos pontos de amostragem para recolha de clulas usadas nos restantes ensaios, realizaram-se ensaios de avaliao do crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto. 2.4.1. Pontos de amostragem Ao longo dos vrios ensaios realizados em mosto recolheram-se clulas nos seguintes pontos de amostragem: a. Para 15C colheram-se clulas em 10 pontos, correspondentes a 9 fases diferentes de crescimento: aps inoculao (T0), meio da fase de latncia (TLag), incio da fase exponencial (T1), meio da fase exponencial (T2), final da fase de exponencial (T3), incio da fase estacionria (T4), meio da fase estacionria I (T5), meio da fase estacionria II (T6), final de fermentao (T7) e 72h aps final de fermentao (T8). b. Para 30C, dado a quase ausncia de fase de latncia, colheram-se clulas em 8 pontos, correspondentes a 8 fases diferentes de crescimento: aps inoculao (T0), fase de acelerao (T1), meio da fase exponencial (T2), final da fase de exponencial (T3), incio da fase estacionria (T4), meio da fase estacionria (T5), final de fermentao (T6) e 24h aps final de fermentao (T7). 2.4.2. Avaliao do nmero de clulas viveis Para a contagem do nmero de clulas viveis determinou-se o nmero de UFC/mL (determinado atravs do mtodo de espalhamento em placa), procedendo-se ao espalhamento de 100 L de suspenso de clulas em placas de meio YPD e incubao a 28C, durante 48 a 72h. Aps este perodo contou-se o nmero de colnias por placa. Sempre que necessrio foram efectuadas diluies, de forma a garantir que o nmero de colnias se situasse entre as 30-300 colnias/placa. As amostras foram plaqueadas em triplicado.

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MATERIAIS E MTODOS 2.4.3. Avaliao do nmero de clulas metabolicamente activas Para contagem do nmero clulas metabolicamente activas utilizou-se o corante azul de metileno de acordo com o descrito por Kucsera e colaboradores (2000). Prepararam-se diluies da suspenso de clulas de forma a garantir que o nmero de clulas se situasse entre 30-300 clulas/0,1 mm3. Adicionou-se uma parte de uma soluo de azul de metileno (10 mg/mL, Sigma) para uma parte da suspenso celular [Kucsera et al., 2000]. Aps 15 minutos, procedeu-se contagem das clulas metabolicamente activas (no coradas) e das clulas metabolicamente inactivas (coradas), numa cmara de contagem (hemocitmetro). 2.5. Determinao dos parmetros fsico-qumicos Nos ensaios de crescimento em mosto estril, para alm de se ter acompanhado a evoluo das D.O.640nm, retiraram-se amostras para medir igualmente a evoluo de parmetros fsico-qumicos do mosto. 2.5.1. pH do mosto A variao do pH do mosto ao longo da fermentao foi medida por leitura directa de uma amostra no elctrodo de pH (PHM220, Lab pH METER). 2.5.2. Determinao da massa volmica do mosto Determinou-se a variao da massa volmica do mosto ao longo da fermentao, pesandose, em duplicado, volumes rigorosamente conhecidos, 1000 L e 500 L, de sobrenadante recolhido aps centrifugao, 5 minutos a 14000 rpm, de amostra numa centrfuga de bancada. 2.5.3. Brix A variao do Brix ao longo da fermentao, foi monitorizada por medio directa, recorrendo a um refractmetro (Portable Refractometer Brix/ATC). 2.5.4. Determinao da saturao de oxignio no mosto 2.5.4.1. Fundamentos do mtodo

O elctrodo de oxignio, desenvolvido por L.C.Clark, constitudo por um elctrodo de platina (ctodo) e por um elctrodo de prata (nodo) imersos numa soluo de KCl. Este conjunto montado num suporte de resina epxido e revestido com uma membrana de polietileno ou Tfelon, ajustada na extremidade do elctrodo por meio de um anel de borracha. O uso desta membrana impede o contacto directo entre a amostra e o ctodo, evitando assim a deposio de materiais que iriam afectar as caractersticas de resposta ao

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MATERIAIS E MTODOS oxignio (Figura 6). A membrana permevel a O2 e a outros gases, os quais so postos em contacto com o ctodo. Aplicando ao sistema uma voltagem conveniente (0,5 0,8 Volts), o oxignio difundido para o ctodo reduz-se segundo a seguinte reaco:
2 H + 2 e + O2 H2O2 + 2 H + 2 e
+ + -

H2O2 H2O

Enquanto no nodo se d o seguinte processo:

4 Ag + 4 Cl
-

4 AgCl + 4 e

A reaco global :
4 Ag + O2 + 4 Cl + 4 H
+

4 AgCl + 2 H2O

A intensidade da corrente que flui no sistema directamente proporcional quantidade de oxignio que se difunde atravs da membrana, a qual por sua vez proporcional concentrao de oxignio dissolvido na amostra.

Figura 6: Esquema de montagem do elctrodo de oxignio e fonte de tenso

(Adaptado do sitio informtico www.rankbrothers.co.uk). 2.5.4.2. Procedimento experimental

Inicialmente, calibrou-se o elctrodo de oxignio. Para tal, ligou-se a fonte de tenso e ajustou-se a voltagem aplicada a aproximadamente 0,6 v, ligou-se o registador e adicionouse clula cerca de 3 mL de mosto estril. Aplicou-se agitao magntica (130 rpm). De seguida, ajustou-se a posio da caneta no registador com o zero, colocando-a perto da extremidade direita do papel. Ajustou-se a velocidade do papel a 10 mm/min e registou-se durante 1 minuto. Rodou-se o boto do ganho de modo a obter uma posio da caneta junto da extremidade esquerda do papel, registou-se durante 1 minuto. A linha registada corresponde medio do O2 dissolvido numa amostra saturada em ar (a 26C a

24

MATERIAIS E MTODOS concentrao de oxignio aproximadamente 240 M). A distncia entre as duas linhas marcadas corresponde a uma concentrao de O2 de 240 M. Aps calibrao, lavou-se cuidadosamente a clula e o elctrodo com gua destilada. Com o objectivo de se conhecer o consumo de oxignio ao longo das fermentaes, a 15C e a 30C, recolheram-se 3 mL de clulas em cada ponto de amostragem (ver, seco 2.4.1.), que foram introduzidos na clula, aplicou-se agitao magntica (130 rpm) e registou-se. Os ensaios foram feitos em duplicado. 2.5.5. Determinao do teor em glucose presente no mosto 2.5.5.1. Mtodo qualitativo

O teor em glucose no mosto, durante o processo de fermentao, foi seguido qualitativamente recorrendo s tiras-teste DIABUR-TEST 5000. Considerou-se que a fermentao terminou quando se observou o esgotamento da glucose, detectado por ausncia de colorao das tiras. 2.5.5.2. Mtodo quantitativo

A determinao de glucose consumida ao longo das fermentaes vinrias, conduzidas a 15C e 30C, foi realizada pelo mtodo UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM, Roche, cat. 10.716.251.035). Este mtodo baseia-se num conjunto de duas reaces enzimticas: (a) Na primeira, a D-glucose fosforilada, na presena da enzima hexocinase (HK) e de adenosina-5-trifosfato (ATP), a D-glucose-6-fosfato (G-6-P), com consequente formao de adenosina-5-difosfato (ADP).
D-glucose + ATP
HK

G-6-P + ADP

(1)

(b) Na segunda, na presena da enzima glucose-6-fosfato desidrogenase (G6P-DH), a glucose-6-fosfato oxidada pelo dinucleotdeo fosfatado de nicotinamida adenina (NADP) a 6-fosfoglucono--lactona, com formao de dinucleotdeo reduzido de nicotinamida adenina (NADPH).
G-6-P + NADP
+

G6P-DH

6-fosfoglucono--lactona + NADPH + H

(2)

A quantidade de NADPH formada na reaco (2) estequiometricamente equivalente quantidade de D-glucose consumida na reaco (1). O aumento da quantidade de NADPH formada medido atravs da leitura de absorvncia a 340nm.

25

MATERIAIS E MTODOS 2.5.5.2.1. Procedimento experimental

Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes solues:

Soluo 1: 7,2 g de mistura em p (tampo trietanolamina, pH 7,6, NADP, 110 mg; ATP, 260 mg; sulfato de magnsio) com 45 mL de gua redestilada. Soluo 2: 1,1 mL de hexocinase (320 U); glucose-6-fosfato desidrogenase (160 U). 160

Foram pipetados 500L da soluo 1, 50 da amostra, 950L de gua destilada para uma L 50L L cuvete e agitou-se. Aps 3 minutos registou se a absorvncia a 340nm e adicionou se. registou-se adicionou-se 20L da suspenso 2. Agitou-se novamente. Aps 15 minutos leu se novamente a absorvncia. se leu-se Sempre que necessrio diluiu se a amostra, de forma a ficar dentro dos limites do mtodo diluiu-se (Tabela 2).
Tabela 2: Factores de diluio utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15C e a (b) 30C.

A = (A2 - A1)amostra (A2 A1)branco

(3)

onde,
A Variao de absorvncia A1 Primeiras absorvncias lidas da amostra/branco A2 Segundas absorvncias lidas da amostra/branco V. MW ..1000

c=

. A

(4)

onde,
c Concentrao da amostra (g/L) V Volume final: 1,520 mL MW Massa molecular da glucose: 180,16g/mol Coeficiente de extino do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) Volume da amostra: 0,05 mL

26

MATERIAIS E MTODOS 2.5.6. Determinao do teor em etanol presente no mosto A determinao do etanol produzido ao longo das fermentaes vinrias, conduzidas a 15C e 30C, foi realizada pelo mtodo UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM, Roche, cat. 0.176.290). Este mtodo baseia-se num conjunto de duas reaces enzimticas: (a) Na primeira, o etanol oxidado a acetaldedo, atravs da aco do dinucleotdeo de nicotinamida adenina (NAD), na presena da enzima lcool desidrogenase (ADH).
+

Etanol + NAD

ADH

Acetaldedo + NADH + H

(5)

O equilbrio desta reaco tende naturalmente para o 1 membro (etanol e NAD). No entanto, em condies alcalinas o equilbrio pode ser completamente deslocado para o 2 membro. (b) Na segunda, o acetaldedo formado na reaco (6) quantitativamente oxidado a acido actico, na presena da enzima aldedo desidrogenase (Al-DH).
Acetaldedo + NAD + H2O
+

Al-DH

cido actico + NADH + H

(6)

A quantidade de NADH formada na reaco (6) estequiometricamente equivalente quantidade de etanol consumido na reaco (5). O aumento da quantidade de NADH formado medido atravs da leitura de absorvncia a 340 nm. 2.5.6.1. Procedimento experimental

Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes solues:

Mistura 2: Pastilha (NAD, 4 mg; aldedo desidrogenase, 0,8 U) com 3 mL de tampo disulfato de potssio a pH 9. Suspenso 3: ADH, 7000 U.

Foram pipetados 1500 L da mistura 2 e 50 L de amostra para cuvetes, taparam-se com parafilme e agitaram-se. Aps 3 minutos registou-se a absorvncia a 340 nm e adicionaramse 25 L da suspenso 3, tapando e agitando novamente as cuvetes. Aps 10 minutos leuse novamente a absorvncia. Sempre que necessrio diluiu-se a amostra de modo a ficar dentro dos limites do mtodo (Tabela 3).

27

MATERIAIS E MTODOS
Tabela 3: Factores de diluio utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15C e a (b) 30C.

Foram utilizadas as seguintes frmulas:

A = (A2 - A1)amostra (A2 A1)branco

(7)

onde,
A Variao de absorvncia A1 Primeiras absorvncias lidas da amostra/branco A2 Segundas absorvncias lidas da amostra/branco V. MW . . 2 . 1000

c=

. A

(8)

onde,
c Concentrao da amostra (g/L) V Volume final: 1,575 mL MW Massa molecular do etanol: 46,07g/mol coeficiente de extino do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) Volume da amostra: 0,05 mL

2.6. Optimizao da obteno de protoplastos ptimizao Os protoplastos so clulas que sofreram degradao da parede celular, por aco de enzimas lticas, ganhando forma esfrica e tornando tornando-se sensveis a stress osmtico. Em solues hipotnicas as clulas incham devido entrada de H2O [Darling et al., 1969], rebentando ao fim de um determinado tempo, a menos que sejam previamente fixadas. A existncia de variaes na capacidade de degradao da parede pela aco das enzimas lticas foi observada entre diferentes estirpes da mesma espcie e entre as diferentes fases tre do crescimento celular [Eddy & Williamson, 1957; Shahin, 1972]. Devido s passivas variaes na estrutura da parede celular entre estirpe ao longo das estirpes, fases de crescimento e quando cult cultivadas a diferentes temperaturas de crescimento (15C ou 30C), houve necessidade de optimizar o mtodo da preparao de protoplastos. As

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MATERIAIS E MTODOS enzimas utilizadas para a obteno de protoplastos foram a zimoliase 100T (Seikagaku corporation) e a -glucuronidase (Sigma). Para tal, para cada uma das situaes fisiolgicas e de ensaio, prepararam-se protoplastos, variando o tempo de incubao e a concentrao de enzimas. A digesto foi monitorizada por microscopia de contraste de fase. Nas tabelas 4 e 5, apresentam-se as condies finais escolhidas aps os ensaios de optimizao da obteno de protoplastos.

Tabela 4: Quantidade de enzima utilizada para digesto da parede celular em funo da fase de crescimento da cultura em mosto, a 15C.
Sem fixao com Formaldedo Com fixao com Formaldedo Enzima Fase de Crescimento
Aps inoculao Fase de Latncia Inicio da fase exponencial Meio da fase exponencial Incio da desacelerao Incio da fase estacionria Meio da fase estacionrio (203 h) Meio da fase estacionria (265 h) Final da fermentao Aps final da fermentao (376 h)

Zimoliase (1000 U/ml)

40 U 40 U 45 U 50 U 120 U 150 U 250 U 300 U 300 U 400 U

-glucuronidase (94600 U/ml)

20 U 20 U 23 U 23 U 25 U 25 U 25 U 25 U 30 U 35 U

Zimoliase (1000 U/ml)

120 U 120 U 140 U 150 U 170 U 250 U 350 U 400 U 450 U 500 U

-glucuronidase (94600 U/ml)

20 U 20 U 23 U 25 U 25 U 27 U 30 U 30 U 35 U 35 U

Tabela 5: Quantidade de enzima utilizada para digesto da parede celular em funo da fase de crescimento da cultura em mosto, a 30C.
Sem fixao com Formaldedo Com fixao com Formaldedo Enzima Fase de Crescimento
Aps inoculao Fase de Latncia Inicio da fase exponencial Meio da fase exponencial Incio da fase estacionria Meio da fase estacionrio (48 h) Final da fermentao Aps final da fermentao (96 h)

Zimoliase (1000 U/ml)

30 U 30 U 30 U 50 U 70 U 150 U 200 U 300 U

-glucuronidase (94600 U/ml)

15 U 15 U 15 U 20 U 20 U 20 U 25 U 30 U

Zimoliase (1000 U/ml)

100 U 100 U 150 U 200 U 220 U 250 U 300 U 350 U

-glucuronidase (94600 U/ml)

20 U 20 U 25 U 25 U 30 U 30 U 35 U 40 U

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MATERIAIS E MTODOS 2.7. Avaliao de Marcadores Apoptticos 2.7.1. Condensao da cromatina O ncleo das clulas apoptticas apresenta cromatina muito condensada que pode ser corada por 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI), substncia capaz de penetrar as membranas de clulas apotticas e corar a cromatina. Para se efectuar o estudo da condensao da cromatina, procedeu-se de acordo com o descrito por Madeo e colaboradores (1997). A quantidade de clulas utilizadas foi igual a 2x107 clulas/mL. Lavaram-se as clulas com PBS 1x, incubaram-se com 1g/mL de DAPI (Sigma) em PBS durante 10 minutos e lavaram-se 3 vezes com PBS 1x [Madeo et al., 1997]. De seguida, montaram-se as lminas onde se adicionou 2L de iodeto de propdio 0,5g/mL (PI; Sigma). Para realizao do controlo positivo utilizaram-se clulas cultivadas em mosto, s temperaturas de fermentao (15C e 30C). Recolheu-se as clulas nas diferentes fases do processo fermentativo. Lavaram-se as clulas PBS 1x. De seguida, de acordo com o descrito por Ludovico e colaboradores (2001, 2002), incubaram-se as clulas com diferentes concentraes de cido actico: em fase exponencial: concentraes iguais a 40 e 80 mM [Ludovico et al., 2001]; em fase estacionria: concentraes iguais 120 e 140 mM [Ludovico et al., 2002]. 2.7.2. Fragmentao do DNA Para se estudar a fragmentao do DNA recorreu-se a um teste conhecido por TUNEL (In situ Cell Detection Kit, Fluorescein, Roche), que se baseia numa reaco enzimtica, catalisada pela enzima terminal deoxinucleotidil transferase (TdT) que permite a ligao de fluorescena-dUTP s caudas 3-OH livres o que pode ser visualizado por microscopia de epifluorescncia. Aps lavagem das clulas com PBS 10x, fixou-se o metabolismo celular com formaldedo 3,7% (v/v), como descrito por Madeo e colaboradores (1999). De seguida, procedeu-se digesto da parede celular com zimoliase e -glucuronidase durante 1h a 37C, com agitao (ver, seco 2.6.) em 100L de tampo sorbitol (1,2M sorbitol, 0,5mM MgCl2, 35mM fosfato de potssio, pH 7,3) [Kitagaki et al., 2007], centrifugou-se durante 10 minutos a 300 g. Removeu-se o sobrenadante e lavou-se o precipitado com PBS 10x. De modo a permeabilizar as clulas, incubou-se com citrato de sdio 0,1M durante 30 minutos a 70C. Lavou-se as amostras duas vezes com PBS 10x. Incubou-se com 20L da mistura reaccional TUNEL, composta pela enzima terminal deoxinucleotidil transferase e por FITC-

30

MATERIAIS E MTODOS dUTP, durante 1h a 37C no escuro. Lavou-se as amostras com PBS 10x e incubou-se com 50L DAPI (0,3g/mL), durante 10 minutos. Lavou-se as amostras com PBS 1x e incubouse 10 minutos com tampo de equilbrio (SlowFade Antifade Kit, Molecular Probs). Por ltimo, lavou-se as amostras duas vezes com PBS 1x e montaram-se as lminas onde se adicionou uma gota de antifade (SlowFade Antifade Kit, Molecular Probs) e 2L de PI 0,5g/mL (Sigma). Os controlos sofreram fixao e permeabilizao nas mesmas condies que as amostras. O controlo positivo foi incubado com Dnase I (1U/L, Sigma) durante 30 minutos a 37C com agitao. No caso do controlo negativo incubou-se somente com FITC-dUTP. 2.7.3. Integridade da membrana plasmtica A exposio de fosfatidilserina (PS) pode ser facilmente detectada pela Anexina-V, protena de 35,8 kDa que apresenta elevada afinidade para a PS. Trata-se de um mtodo no enzimtico que pode ser detectado por microscopia de fluorescncia. Para a deteco da exposio da PS, utilizou-se a metodologia descrita por Madeo e colaboradores (1999), utilizou-se o kit ApoAlert Annexin V Apoptosis (CLONTECH Laboratories) [Madeo et al., 1999]. As clulas foram recolhidas e lavadas em tampo sorbitol (1,2M sorbitol, 0,5mM MgCl2, 35mM fosfato de potssio, pH 6,8). Procedeu-se digesto da parede celular com zimoliase e -glucuronidase durante 1h a 37C, com agitao (ver seco 2.6.) em 100 L de tampo sorbitol. Lavou-se duas vezes com tampo de ligao (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2; CLONTECH Laboratories) contendo 1,2 M sorbitol. Para 38 L de suspenso celular em tampo de ligao/sorbitol adicionou-se 5 L de Anexina-V (20 g/mL) e 2 L de PI (0,5 g/ mL) e incubou-se durante 20 minutos temperatura ambiente. As clulas foram lavadas e ressuspendidas em tampo de ligao/sorbitol. Por ltimo, montaram-se as lminas com a suspenso celular e observou-se por microscopia de epifluorescncia. Simultaneamente, fez-se uma co-colorao com PI. A utilizao de PI permite discriminar clulas apoptticas de clulas necrticas, e verificar a integridade da membrana pois s cora clulas que apresentam ruptura da membrana plasmtica. 2.7.4. Formao de espcies reactivas de oxignio Os radicais livres podem ser detectados atravs da utilizao de dihidrorodamina 123 (DHR123) ou de diacetato diclorofluorescena (DCFH-DA).

31

MATERIAIS E MTODOS 2.7.4.1. Marcao com dihidrorodamina 123

A DHR123 uma substncia se acumula na clula e oxidada, na presena de ROS, dando origem rodamina 123 (R123), substncia fluorescente. Como descrito por Madeo e colaboradores (1999), adicionou-se 5g de DHR123 por 1 mL de cultura celular, proveniente de 2,5mg/mL de uma soluo stock em etanol, aps 2h de incubao, montaram-se as lminas e observou-se por microscopia de epifluorescncia [Madeo et al., 1999]. 2.7.4.2. Marcao com diacetato diclorofluorescena

O DCFH-DA um composto que diacetilado a diclorodihidrofluorescena, que por sua vez, na presena de ROS, pode ser oxidado a diclorofluorescena. Como descrito por Madeo e colaboradores (1999), adicionou-se 10 g de DCFH-DA por 1 mL de cultura celular, proveniente de 2,5 mg/mL de uma soluo stock em etanol, aps 2h de incubao, montaram-se as lminas e observou-se por microscopia de epifluorescncia [Madeo et al., 1999]. Para realizao do controlo positivo de ambos os fluoroforos, utilizaram-se clulas cultivadas em mosto, s temperaturas de fermentao (15C e 30C). Recolheu-se as clulas nas diferentes fases do processo fermentativo. Lavaram-se as clulas PBS 1x. De seguida, incubaram-se as clulas com diferentes concentraes de perxido de hidrognio: em fase exponencial: concentraes iguais a 3, 5 e 180 mM [Madeo et al., 1999]; em fase estacionria: concentraes iguais 180 mM. 2.8. Microscopia da Epifluorescncia Para visualizao das lminas marcadas com DAPI, marcao com FITC-dUTP (ensaioTUNEL), marcao com Anexina-V, marcao com DHR-123 e com DCFH-DA, por microscopia utilizou-se um microscpio de epifluorescncia (Leitz Wetzlar Germany 513558) equipado com uma lmpada de mercrio (Leitz Wetzlar Germany Type 307148002 514687) e com um bloco de filtros de excitao (BP 340-380; BP 450-490; BP 515560). As imagens foram adquiridas por uma cmara fotogrfica Axiocam Zeiss .

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RESULTADOS E DISCUSSO 3. RESULTADOS E DISCUSSO

O presente trabalho surge na sequncia de um projecto realizado a 25C em que se estudaram vrios parmetros fisiolgicos e bioenergticos de forma a avaliar a performance de uma estirpe vnica de Saccharomyces cerevisiae (ISA 1000) ao longo de fermentao vinria, com particular relevncia avaliao/observao de indicadores de apoptose em clulas recolhidas durante a fermentao [Salvador, 2007]. No seguimento deste estudo pretendeu-se avaliar vrios parmetros indicadores do estado fisiolgico de clulas cultivadas em mosto de uva branca, a temperaturas s quais se realizam fermentaes para produo de vinho branco e tinto, dando-se particular destaque avaliao de clulas viveis (com capacidade activa de multiplicao), de clulas metabolicamente activas e avaliao de marcadores apoptticos e necrticos. Para a prossecuo do trabalho utilizaram-se condies de cultura previamente definidas, procurando-se, tanto quanto possvel, simular em laboratrio condies semelhantes s reais em adega, com vista a uma posterior transposio dos resultados obtidos para os resultados de situao real em adega, com o objectivo de melhorar a produo de vinho nos aspectos que dependem do desempenho da levedura. Com este objectivo, cultivou-se uma estirpe vnica de S. cerevisiae, isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN) e seleccionada pela sua elevada capacidade fermentativa, em mosto estril de uva branca, a 15C e 30C. O mosto utilizado sofreu tratamentos comuns em adega, como a clarificao com enzima clarificante 10 mg/L e a cauo de doseamento de enxofre, de forma a garantir sulfitos livres 50 ppm para estabilizao, sendo posteriormente centrifugado para deposio de materiais em suspenso mais grosseiros e esterilizado por filtraes sucessivas em membranas com poros de dimetro sucessivamente mais pequenos (com presso negativa). A fermentao foi realizada em bales de Erlenmeyer de 1000mL rolhados com rolhas de algodo, com 800mL de mosto, incubados em banhos termostatizados a 15C ou a 30C, com agitao magntica fraca (apenas a suficiente para evitar a deposio celular significativa) e sem arejamento suplementar, durante todo o perodo de fermentao. Embora no tenha sido imposta uma condio de anaerobiose, as condies de fermentao foram condies de baixos teores em O2, no s devido ao facto de se utilizarem bales de Erlenmeyer praticamente cheios como devido ao efeito da produo de CO2. O final de fermentao foi estabelecido como o ponto a partir do qual no se detectou a presena de glucose atravs de mtodos comuns em adega (tiras DiaburTest).

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT 3.1. Avaliao dos parmetros de crescimento de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 Com o objectivo de se avaliar a performance fermentativa de Saccharomyces cerevisiae ISA valiar accharomyces 1000, a 15C e a 30C, e de definir os pontos de amostragem para os ensaios posteriores, foi necessrio proceder a ensaios preliminares de crescimento da estirpe a cada uma destas temperaturas. Procedeu-se ao crescimento de clulas s duas temperaturas de estudo conforme o descrito em 2.3.4 com inoculao de aproximadamente 1x106 clulas/mL 2.3.4., (oriundas de um pr-inculo em fase exponencial (D.O.640nm 1-2), preparado em mosto a inculo , 28C) em 800 mL de mosto estril, em bales de Erlenmeyer de 1000 mL previamente termostatizados temperatura do ensaio, com fraca agitao magntica (130 rpm) e atizados ensaio, ausncia de arejamento suplementar, durante todo o perodo de fermentao. Ao longo da a fermentao foram colhidas amostras, de acordo com o descrito em 2.4.1 Os ensaios de 2.4.1.. crescimento tambm permitiram verificar a evoluo de parmetros fsico fsico-qumicos do mosto (massa volmica, pH extracelular saturao de oxignio, Brix e teor de glucose e de extracelular, etanol) e a evoluo de parmetros de crescimento da estirpe quer por mtodos directos ) quer indirectos (D.O.640nm, UFC/mL clulas totais e clulas metabolicamente activas UFC/mL, activas). 3.1.1. Avaliao dos parmetros de crescimento da estirpe a 15C O crescimento da estirpe S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estril a 15C foi monitorizado atravs da determinao da D.O.640nm (M&M em 2.3.2.), partindo de uma concentrao tindo conhecida de clulas (aprox. 1x106 clulas/mL). Com vista a obter uma viso mais gl aprox. global dos acontecimentos ao longo do processo fermentativo, durante a monitorizao do urante crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 foram recolhidas amostras ao longo de toda a curva de crescimento (Figura 7).

Figura 7: Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentao de mosto a 15C 15C. No grfico, a laranja, esto assinalados os pontos de amostragem escolhidos. ,

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RESULTADOS E DISCUSSO A curva de crescimento obtida durante a fermentao a 15C (Figura 7) permitiu verificar que a cultura apresenta uma fase de latncia de aproximadamente 13 horas, a fase exponencial dura sensivelmente 41 horas (com um tempo de duplicao de cerca de 6h 30m), ao fim de 87 horas a cultura entra em fase estacionria, e ao fim de 304 horas, verificou-se o esgotamento total da glucose e a fermentao de glucose terminou (Anexo III). A partir da curva de crescimento obtida a 15C definiram-se 9 pontos de amostragem (Tabela 6), que englobam o momento em que as clulas so inoculadas no mosto (T0), o meio da fase de latncia (TLag), o incio da fase exponencial (T1), o meio da fase exponencial (T2), o final da fase exponencial/incio da fase de desacelerao (T3), o incio da fase estacionria (T4), plena da fase estacionria (T5 e T6) e o final de fermentao de glucose (T7). O estabelecimento destes pontos de amostragem teve por base o comportamento da levedura e as variaes descritas na literatura ao longo do processo de fermentao [Querol et al., 2003]; coincidindo com alguns dos pontos escolhidos para a monitorizao do transcriptoma de uma estirpe comercial de S. cerevisiae, num estudo realizado em mosto sinttico [Rossignol et al., 2003]. Para alm destes pontos, com o intuito de se estudar e tentar compreender o comportamento de S. cerevisiae ISA 1000 na ausncia de glucose, foi tambm definido um ponto de amostragem 72h aps o esgotamento de glucose (T8).
Tabela 6: Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentaes conduzidas a 15C.
Pontos de amostragem T0 TLag T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Aps inoculao Meio da fase de latncia Incio da fase exponencial Meio da fase exponencial Final da fase exponencial Incio da fase estacionria Meio da fase estacionria I Meio da fase estacionria II Final de fermentao de glucose Aps final de fermentao de glucose Tempo de recolha das clulas (h) 0 6 24 36 65 87 202 265 304 376

3.1.1.1.

Avaliao do estado fisiolgico da cultura a 15C

Com o objectivo de avaliar a viabilidade celular e o nmero de clulas metabolicamente activas ao longo da fermentao vinria, procedeu-se contagem de unidades formadoras de colnias por mL (UFC/mL) e contagem do nmero de clulas totais e dentro destas do nmero de clulas metabolicamente activas (Figura 8).

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RESULTADOS E DISCUSSO

Figura 8: Viabilidade celular ao longo do crescimento de S. cerevisiae ISA 1000, em mosto a 15C: a) relao entre D.O. 640nm e UFC/mL; b) relao entre D.O. 640nm, clulas totais e clulas metabolicamente activas.

Relativamente contagem do nmero de UFC/mL (Anexo IV, Figura 8a), este valor permite determinar o nmero de clulas viveis, ou seja, clulas com capacidade de multiplicao activa. Se tivermos em considerao a Figura 8a, onde se representa a evoluo de biomassa de S. cerevisiae ISA 1000, determinada atravs da leitura da D.O.
640nm,

com a

evoluo do nmero de clulas viveis, constata-se que a populao inicial sofre na fase de latncia um decrscimo atingindo um mnimo ao final de 12-13h. Este decrscimo observado quer ao nvel de D.O.640nm (para as primeiras 2h), quer ao nvel de clulas com capacidade de multiplicao, expresso em nmero de UFC/mL, sem que se verifique um decrscimo do nmero de clulas metabolicamente activas, correspondendo por isso a uma reduo de populao. Aps o perodo inicial de decrscimo de populao, a cultura entra em fase exponencial, constatando-se que sofreu 6 a 7 geraes durante esta fase de crescimento, atingindo uma D.O.640nm de prxima a 8 no final da mesma fase (Figura 8a). Em relao s clulas com capacidade de multiplicao (Figura 8a e Tabela 7), observa-se que no inicio de fermentao cerca de 67% das clulas so capazes de se multiplicar, verificando-se um decrscimo deste nmero ao longo da fase de latncia que poder resultar de 2 factores. Por um lado, a perda de capacidade de multiplicao pode ser devida a choque trmico, uma vez que as clulas sofreram uma passagem de 28C (pr-inculo)

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RESULTADOS E DISCUSSO para 15C. E, por outro lado, no caso do nmero de UFC/mL, este nmero normalmente inferior ao nmero de clulas totais, dado o facto de cada grupo de clulas dar origem a uma colnia o que implica uma reduo no nmero de colnias face ao nmero de clulas totais contadas individualmente ao microscpio. Esta segunda razo pode tambm justificar, a diminuio de percentagem de viabilidade celular observada ao longo da fase exponencial, em que as clulas se encontram em fase de gemulao activa, dando o conjunto megmula apenas origem a uma colnia. Este resultado vem ao encontro das observaes microscpicas efectuadas, que permitiram observar um elevado nmero de grupos com 3 ou mais clulas, com gmulas relativamente pequenas. Com a entrada em fase de desacelerao, verifica-se uma recuperao na percentagem de clulas com capacidade de multiplicao, que poder ser explicada, no s por um aumento efectivo do nmero de clulas individuais com esta capacidade mas tambm pela separao das clulas-me das gmulas, o que coincide com a observao ao microscpio da reduo do nmero de grupos com 3 ou mais clulas, passando as clulas a estar isoladas.

Tabela 7: Viabilidade celular ao longo da fermentao vinria a 15C.

Fase de Crescimento T0 Aps inoculao Tempo (h) 0 2 7 13 27 37 41 65 73 78 84 191 202 209 220 243 265 280 304 Clulas Totais/mL (x106) 1,04 1,80 1,56 2,36 7,00 18,40 33,20 83,80 100,00 220,00 194,00 208,00 208,00 202,00 212,00 222,00 234,00 208,00 142,00 Clulas Viveis/mL (x106) 1,00 1,72 1,40 2,23 6,90 10,80 20,40 53,30 71,00 180,00 154,00 182,00 186,00 160,00 154,00 158,00 161,00 140,00 92,00 Clulas Mortas/mL (x106) 0,04 0,08 0,16 0,13 0,10 7,60 12,80 30,50 29,00 40,00 40,00 26,00 22,00 42,00 58,00 64,00 73,00 68,00 50,00 % Viabilidade (Cl. Viveis/ Cl. Totais) 96,15 95,56 89,74 94,49 98,57 58,70 61,45 63,60 71,00 81,82 79,38 87,50 89,42 79,21 72,64 71,17 68,80 67,31 64,79 UFC/mL (x106) 0,70 0,09 0,40 2,17 2,30 6,27 45,75 143,83 117,67 118,45 100,00 UFC/Cl. Viveis (%) 70,00 5,23 17,94 31,45 21,30 30,74 85,83 93,40 63,26 73,57 UFC/Cl. Totais (%) 67,31 5,00 16,95 31,00 12,50 18,89 54,59 74,14 56,57 50,62 70,42

TLag Meio da fase de latncia T1 Incio da fase exponencial T2 Meio da fase exponencial T3 Final da fase exponencial

T4 Incio da fase estacionria T5 Meio da fase estacionria I

T6 Meio da fase estacionria II T7 Final de fermentao de glucose

A determinao do nmero de UFC/mL d-nos indicao do nmero de clulas com capacidade activa de multiplicao, formando colnias. No entanto, existem casos em que as clulas, muito embora no tenham capacidade para formar colnias mantm activo o seu metabolismo, permanecendo com capacidade para consumir substratos e produzir produtos e alterando significativamente o meio onde se encontram, sem que tenham capacidade para se multiplicar. Este facto leva a que, a par do facto de um grupo dar origem apenas a uma

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RESULTADOS E DISCUSSO colnia, a contagem de UFC/mL subestime o nmero de clulas efectivamente viveis [Furekawa et al., 2004]. Com a finalidade de distinguirem clulas metabolicamente activas (clulas viveis) de clulas capazes de se multiplicar procedeu-se ao ensaio de colorao com azul de metileno e posterior contagem em hemocitmetro. O nmero de clulas no coradas com azul de metileno d informao sobre o estado metablico das clulas uma vez que s as clulas metabolicamente activas so capazes de oxidar o corante, no apresentando por isso colorao, ao passo que as clulas metabolicamente inactivas, perderam essa capacidade e mantm-se coradas de azul [Furekawa et al., 2004; Kucsera et al., 2000]. Ao se observar a evoluo do nmero de clulas metabolicamente activas (Figura 8b), verificou-se que aps entrada em fase exponencial o nmero de clulas viveis tende a aumentar, com uma taxa semelhante da D.O.640nm, mantendo-se aproximadamente constante (isto , na mesma ordem de grandeza) durante a fase estacionria. Este resultado consistente com a hiptese de que a maior parte do processo fermentativo realizado por clulas metabolicamente activas mas sem capacidade para se multiplicar. Para alm disso, observou-se uma certa tendncia para a reduo da percentagem do nmero de clulas viveis face ao nmero de clulas totais. Ao longo da fermentao a viabilidade tende a diminuir, sendo esta diminuio mais acentuada no final da fase estacionria, onde se verificou que cerca de 35% das clulas perdem viabilidade, o que se deve ao aumento da proporo entre o nmero de clulas totais e de clulas com actividade biolgica (Tabela 7). Esta perda de viabilidade pode estar relacionada com o aumento das condies de stress, por um lado devido ao esgotamento de nutrientes, e por outro devido ao aumento da concentrao de etanol no meio. Por outro lado, atendendo evoluo do nmero de clulas totais ao longo da fermentao a 15C (Figura 8b), verificou-se que, tal como esperado, este parmetro acompanhou a evoluo da D.O.640nm, uma vez que ambos os parmetros contabilizam todo o tipo de clulas, independentemente da sua capacidade metablica e de multiplicao e independentemente de estarem mortas ou vivas. Atravs da relao entre o nmero de clulas totais e o nmero de clulas metabolicamente activas (Tabela 7), foi possvel verificar que as clulas metabolicamente activas tendem a aumentar em fase exponencial. No entanto, seria de se esperar um aumento do nmero de clulas metabolicamente activas, aumenta-se pelo menos proporcionalmente ao nmero de clulas totais, o que no aconteceu. Este facto levou a uma diminuio da percentagem de clulas deste tipo face ao nmero total de clulas, o que pode ser atribudo a erros associados ao mtodo, que de acordo com Furekawa e colaboradores (2004) s permite

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RESULTADOS E DISCUSSO obter resultados absolutamente fiveis para percentagens de viabilidade superiores a 90% [Furekawa et al., 2004]. 3.1.1.2. Avaliao dos parmetros fsico-qumicos do mosto

Paralelamente avaliao dos parmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000, procedeu-se tambm avaliao dos parmetros fsico-qumicos do mosto, tendo-se recolhido amostras ao longo da fermentao a 15C, que permitiram averiguar qual foi a evoluo do pH, da massa volmica, do Brix, do teor de glucose e de etanol e dos nveis de saturao de oxignio do mosto, ao longo do processo fermentativo.

a)

b)

c)

Figura 9: Valores de a) pH extracelular, da b) massa volmica (mg/mL) e do c) Brix do mosto, ao longo de fermentao de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 15C.

Por observao dos grficos da Figura 9, foi possvel verificar que: (a) o pH do mosto permaneceu sensivelmente constante ao longo do processo de fermentativo (pH aprox. 3), variando entre 3,04 (pH registado no momento da inoculao), 2,87 (pH registado no incio

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RESULTADOS E DISCUSSO da fase estacionria) e 3,02 (pH registado no final de fermentao); (b) a massa volmica, parmetro que mede essencialmente o consumo de acares fermentescveis, decresceu ao longo da fermentao, partindo de um valor inicial prximo 1074 mg/mL at atingir cerca de 990 mg/mL no final de fermentao; (c) o Brix, parmetro que quantifica os acares solveis no mosto (glucose e frutose), de um modo geral diminuiu ao longo da fermentao, sendo essa diminuio mais acentuada quando a cultura inicia a fase de desacelerao e entra em fase estacionria. Os resultados relativos variao do pH do mosto ao longo da fermentao a 15C permitiram concluir que o mosto um meio que apresenta capacidade tampo, permanecendo o pH relativamente constante durante o processo fermentativo com valores prximos de 3. Quanto massa volmica, convm referir que a avaliao deste parmetro apenas teve como objectivo monitorizar qualitativamente a fermentao vinria a 15C, sendo possvel comprovar que houve uma grande variao nos resultados obtidos para este parmetro, que est certamente relacionada com o facto do mtodo utilizado para a sua determinao no ser o mais rigoroso (ver seco 2.5.2.). No entanto, o valor de massa volmica registado no final de fermentao (990 mg/mL), de acordo com Ribreau-Gayon e colaboradores (2006), encontra-se prximo da gama de valores admissveis para esta fase (991-996 mg/mL). Sendo ainda referido por estes autores que a partir do momento em que os valores da massa volmica diminuem para valores inferiores a 1000 mg/mL, a medio deste parmetro deixa de ser precisa na monitorizao da fermentao, o que pode explicar a grande variabilidade dos valores registados inferiores a este valor [Ribreau-Gayon et al., 2006]. A avaliao do Brix, tal como os parmetros fsico-qumicos mencionados anteriormente, teve como principal objectivo a monitorizao qualitativa do processo fermentativo, constituindo uma metodologia frequentemente utilizada em adega, e que permite quantificar teores de glucose e de frutose ao longo da fermentao. O facto de s se observar a diminuio deste parmetro a partir do momento em que as clulas terminaram a fase exponencial e iniciaram a fase estacionria (Figura 9c), poder ter resultado da sua determinao avaliar simultaneamente o consumo de frutose e de glucose. Sendo o mtodo relativamente pouco sensvel, a existncia de concentraes muito elevadas de acares no incio de fermentao (aprox. 200g acar/L), no permitiu a deteco de pequenas quantidades de glucose consumidas no incio de fermentao. De notar que no ponto em que se determinou o final de fermentao, o Brix apresentado ainda aproximadamente 5. Este facto, indica que a presena de uma percentagem considervel de acar ( 50 g/L),

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RESULTADOS E DISCUSSO neste caso frutose uma vez que a concentrao de glucose neste ponto prxima de zero, permitindo colocar 2 hipteses: primeiro, a fermentao poder ter amuado e segundo, o processo fermentativo no terminou. Estes resultados vm ao encontro dos resultados obtidos para a quantidade de glucose e etanol apresentados na Tabela 8 e na Figura 10. Por comparao dos grficos da evoluo do Brix (Figura 9c) e do consumo de glucose (Figura 10) foi possvel constatar que contrariamente ao observado para o teor de glucose, no final de fermentao, o valor do Brix no foi prximo do nulo, o que se deve ao facto deste parmetro quantificar, ainda que de uma forma pouco sensvel, tanto teores de glucose como teores de frutose, denunciando a presena de frutose no final de fermentao como acar residual, uma vez que S. cerevisiae consome preferencialmente glucose, dando origem a uma discrepncia de consumo destas duas hexoses ao longo da fermentao [Berthels et al., 2004].

Tabela 8: Teor de glucose e de etanol em fermentaes conduzidas a 15C.

Fase de crescimento Inoculao Incio da exponencial Meio da exponencial Final de exponencial Incio de estacionria Meio da estacionria Final de fermentao [glucose] (g/L) 96,50 89,54 81,72 73,46 51,73 2,87 0,03 % consumo [etanol] glucose (g/L) 0,00 0,20 7,21 1,51 15,32 10,02 23,87 16,01 46,40 35,70 97,03 51,25 99,97 74,29 % etanol (v/v) 0,03 0,19 1,27 2,03 4,52 6,49 9,41 % produo etanol 0,27 2,03 13,49 21,55 48,06 68,99 100,00

Figura 10: Consumo de glucose e produo de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentaes de mosto a 15C.

Relativamente concentrao de glucose (Tabela 8, Figura 10), quantificada a partir do mtodo descrito em 2.5.5., possvel afirmar que cerca de 24% de glucose foi consumida entre o momento da inoculao (T0) e o final de fase exponencial (T3), que aproximadamente 23% foi consumida entre o final de fase exponencial (T3) e o incio de fase estacionria (T4) e mais de 50% de glucose foi consumida por clulas em fase

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RESULTADOS E DISCUSSO estacionria (T4). No final de fermentao (T6), as clulas praticamente esgotaram a glucose presente no meio, considerando-se terminada a fermentao. No que diz respeito ao etanol produzido durante a fermentao a 15C (Tabela 8, Figura 10), verificou-se que 21% foi produzido entre o momento da inoculao (T0) e o final de fase exponencial (T3), 27% foi produzido entre o final de fase exponencial (T3) e o incio de fase estacionria (T4) e mais de 50% de etanol foi produzido aps a cultura entrar em fase estacionria (T4), coincidindo com a fase de maior consumo de glucose. Estes resultados esto em concordncia com os resultados obtidos para a viabilidade e so consistentes com a hiptese de que parte considervel do processo fermentativo realizado por clulas metabolicamente activas mas sem capacidade para se multiplicar, indo ao encontro do que foi observado por Rossignol e colaboradores (2003), que verificaram que a maior parte do acar fermentado por resting cells [Rossignol et al., 2003]. Atendendo ao teor de glucose presente no mosto de uva (Tabela 8) e, partindo do pressuposto que glucose e frutose existem no mosto na mesma proporo, o teor de acares existente no mosto usado neste estudo, seria aproximadamente 193 g/L. E, se toda a glucose e frutose consumidas por S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentao, fossem convertidas em etanol, teoricamente teramos um valor volmico final de 11,35% (v/v) de etanol. No entanto, o valor obtido a 15C foi de 9,4% (v/v), por um lado, como foi referido anteriormente, deve ser considerada a possvel existncia de quantidades residuais de frutose no final de fermentao de glucose, que poder continuar a ser fermentada atingindo-se valores finais superiores aos referidos. E, por outro lado, poder ter ocorrido uma evaporao parcial da concentrao de etanol presente nas amostras, quer no momento da recolha quer durante a determinao do etanol (ver seco 2.5.6.), pois tratase de um mtodo que exige preparao prvia das amostras a analisar e tempos de espera para que as reaces enzimticas ocorram. Para alm disso, pode ter ocorrido um desvio da produo de etanol para a produo de produtos secundrios de fermentao, tais como glicerol, substncias de reserva (trealose e glicognio), cidos fracos, que conduzem a um menor rendimento etanol/glucose [Torija et al., 2003b]. Por ltimo, procedeu-se determinao do grau de saturao de oxignio molecular (O2) no mosto de uva branca a 15C, com o intuito de comprovar os nveis de O2 no mosto, uma vez que no foi imposta uma condio de anaerobiose, visto a cultura ter sido incubada com agitao fraca (130 rpm) e em bales rolhados com rolha de algodo. Os resultados obtidos para este parmetro fsico-qumico encontram-se descriminados na Tabela 9. Como se pode verificar pela anlise do grfico da Figura 11, os nveis de O2 diminuram drasticamente ao longo da fermentao de cerca de 181 M, valor registado no incio da fase exponencial,

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT , para concentraes de O2 que oscilam entre 8 e 2 M, quando o nmero de clulas/mL superior.
Tabela 9: Nveis de saturao de oxignio no mosto em fermentaes conduzidas a 15C.
Fase de crescimento Incio da exponencial Meio da exponencial Final de exponencial Incio de estacionria Meio da estacionria I Meio da estacionria II Final de fermentao Aps final de fermentao [O2] (M) 181,2 38,4 4,8 6,0 8,4 6,0 4,1 2,4

Figura 11: Nveis de saturao de oxignio no mosto veis ao longo de fermentaes a 15C 15C.

Como tem sido descrito por diversos autores, o oxignio molecular essencial para uma srie de vias biossintticas, tais como a sntese de esteris [Rosenfeld & Beauvoit, 2003 de Rosenfeld 2003], cidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006 de pirimidinas [Nagy et al., 1992] e de Snoek 2006], Nagy desoxirribonucletidos [Chabes et al., 2000], que por sua vez so essenciais para o Chabes crescimento celular. Em particular, durante a fermentao de mosto de uva, a biossntese de . ergosterol parece ser essencial para a tolerncia ao etanol [Shobayashi et al., 2005], Shobayashi estando a eficincia fermentativa e a resistncia ao etanol geralmente associadas a um aumento na razo ergosterol/fosfolpido e a um decrscimo do ndice de saturao de cidos gordos nas clulas de levedura [Chi & Arneborg, 1999; Sajbidor et al., 1995], [Chi podendo estar na origem de entrada em fase estacionria de crescimento. Est bem patente no grfico da Figura 11, que o final da fase exponencial coincide com a altura em que a concentrao de O2 pode ser considerada residual, mantendo se praticamente constante at mantendo-se ao final do processo fermentativo, o que nos pode levar a colocar a hiptese de que enquanto as clulas dispuseram de O2 no meio foram capazes de manter um crescimento e exponencial, ou seja mantiveram se aptas a sintetizar de modo equilibrado as protenas e os mantiveram-se lpidos necessrios para a evoluo exponencial da cultura. 3.1.2. Avaliao de parmetros de crescimento da estirpe a 30C Aps monitorizao do crescimento atravs de leitura da D.O.640nm de amostras colhidas ao longo da fermentao, obteve obteve-se a curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 a 30C (Figura 12), determinando-se igualmente o nmero de clulas viveis, expresso em se

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RESULTADOS E DISCUSSO UFC/mL, o nmero de clulas totais e dentro destas o nmero de clulas metabolicamente activas (Figura 13).

Figura 12: Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentao de mosto a 30C. Com um crculo laranja esto assinalados os pontos de amostragem.

Nas fermentaes a 30C, considerando as leituras de D.O.640nm, possvel verificar que a cultura no apresenta uma fase de latncia, registando uma fase de acelerao, que comea imediatamente aps a inoculao, que dura sensivelmente 2 horas, atingindo-se uma taxa de crescimento mxima (mx) aps este perodo. Aps esta fase inicial de crescimento, a cultura entra em fase estacionria ao fim de 24 horas, e s 71 horas verificase um esgotamento total da glucose (Anexo II). A partir da curva de crescimento obtida a 30C (Figura 12) e atendendo a razes idnticas s referidas para a fermentao a 15C, definiram-se 8 pontos de amostragem que englobam o momento em que as clulas so inoculadas no mosto (T0, s 0 horas), a fase de acelerao (T1, s 2 horas), meio da fase exponencial (T2, aprox. s 5 horas), o final da fase exponencial (T3, aprox. s 9 horas), o incio da fase estacionria (T4, s 24 horas), meio da estacionria (T5, s 48 horas), o final da fermentao de glucose (T6, s 71 horas) e aps o final de fermentao de glucose (T7, s 96 horas). No entanto, quando se compara a leitura de D.O.640nm com as contagens de UFC/mL (Figura 12, Anexo IV), possvel verificar que na fase de acelerao (T1) h uma diminuio significativa do nmero de clulas viveis, que se traduz na reduo da populao para um dcimo da populao inicial, apesar do aumento observado de D.O.640nm. Constatou-se, portanto, que ocorreu uma perda de viabilidade inicial, que no pode ser atribuda ligeira variao da temperatura de crescimento, uma vez que a inoculao das clulas foi realizada a partir de um pr-inculo (28C) no mosto a 30C (temperatura de fermentao). Por outro lado, considerando que as determinaes da D.O.640nm englobam clulas totais (mortas e vivas) existentes em suspenso, enquanto as contagens de UFC/mL apenas abrangem

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RESULTADOS E DISCUSSO clulas com capacidade activa de multiplicao, natural que o aumento observado nos valores de D.O.640nm possa ter sido resultado da cultura ter comeado a multiplicar-se no incio de fermentao, traduzindo-se numa contagem inferior de UFC/mL, comparativamente D.O.640nm lida.

Figura 13: Estudo da viabilidade celular ao longo do crescimento de S. cerevisiae ISA 1000, em mosto a 15C: a) relao entre D.O. 640nm e UFC/mL; b) relao entre D.O. 640nm, clulas totais e clulas metabolicamente activas.

Da anlise da relao entre D.O.

640nm

e UFC/mL foi ainda possvel verificar que, a 30C,

ocorreram 3 a 4 geraes durante a fase exponencial de crescimento, atingindo uma D.O.640nm de aproximadamente 2,5 no final da mesma fase (Figura 13a). Comparativamente com o nmero de duplicaes da cultura a 15C (6 a 7 duplicaes), a cultura a 30C sofreu menos 2 a 3 duplicaes, durante a mesma fase de crescimento, o que se traduz como evidente na entrada em fase de desacelerao para valores D.O. mais baixos do que os observados a 15C. A evoluo do nmero de clulas totais durante a fermentao a 30C (Figura 13b) acompanhou, tal como esperado, a evoluo da D.O.640nm, uma vez que ambos os mtodos permitem contabilizar o nmero total de clulas. Relativamente ao nmero de clulas metabolicamente activas, pela anlise da Figura 13b e Tabela 10, constatou-se que aps entrada em fase exponencial o nmero de clulas viveis

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RESULTADOS E DISCUSSO tende a aumentar, acompanhando a evoluo do nmero de clulas totais e mantendo-se a percentagem de viabilidade celular expressa em clulas metabolicamente activas/clulas totais. Aps entrada em fase estacionria o nmero de clulas com actividade biolgica mantm-se constante at ao fim de fermentao de glucose, registando-se uma diminuio da percentagem de clulas metabolicamente activas/clulas totais em resultado do aumento do nmero total de clulas. No final de fermentao somente 55% das clulas apresentam actividade biolgica. Esta perda de viabilidade pode dever-se ao aumento do teor alcolico, que est descrito como potenciador de morte celular [Kitagaki et al., 2007]. Quando se analisa os resultados registados aps esgotamento de glucose (T7), verifica-se uma reduo de aproximadamente 9% na viabilidade celular, ao fim de 24h aps o esgotamento de glucose.

Tabela 10: Variao da viabilidade celular durante fermentao vinria decorria a 30C.
Fase de Crescimento T0 T1 T2 T3 Aps inoculao Fase de acelerao Meio da fase exponencial Final da fase exponencial Tempo (h) 0 2 5 7 9 13 17 23 24 28 38 42 48 71 79 88 99 Clulas Totais/mL (x106) 1,20 3,20 13,8 20,80 45,00 68,00 102,00 178,00 154,00 164,00 174,00 208,00 194,00 231,00 234,00 208,00 208,00 Clulas Viveis/mL (x106) 1,02 2,60 12,40 19,40 36,80 58,00 90,00 152,00 122,00 120,00 112,00 118,00 116,00 127,00 128,00 96,00 96,00 Clulas Mortas/mL (x106) 0,18 0,60 1,40 1,40 8,20 10,00 12,00 26,00 32,00 44,00 62,00 90,00 78,00 104,00 106,00 112,00 112,00 % Viabilidade (Cl. Viveis/ Cl. Totais) 85,00 81,25 89,86 93,27 81,78 85,29 88,24 85,39 79,22 73,17 64,37 56,73 59,79 54,98 54,70 46,15 46,15 UFC/mL (x106) 1,02 0,23 2,29 6,50 14,53 23,26 39,90 103,57 95,07 107,68 99,27 116,67 67,00 72,07 87,80 UFC/Cl. Viveis (%) 100 8,85 18,47 33,51 39,48 40,10 44,33 68,14 77,93 89,73 85,58 91,87 52,34 75,07 91,56 UFC/Cl. Totais (%) 85,00 7,19 16,59 31,25 32,29 58,97 39,12 58,19 61,73 65,66 51,17 50,51 28,63 34,65 42,21

T4

Incio da fase estacionria

T5 T6

Meio da fase estacionria Final de fermentao de glucose

T7

Aps final de fermentao de glucose

3.1.2.1.

Avaliao dos parmetros fsico-qumicos

Analogamente ao que foi efectuado a 15C, para alm da avaliao dos parmetros de crescimento, procedeu-se avaliao dos parmetros fsico-qumicos do mosto ao longo do processo fermentativo a 30C. Para tal, recolheram-se amostras, que permitiram examinar a evoluo do pH, da massa volmica, do Brix, do teor de glucose e de etanol, assim como a saturao de O2 do mosto, ao longo da fermentao decorrida a 30C. Analisando os dados obtidos na Figura 14 (Anexo III, Tabela 14), foi possvel verificar: (a) o pH do mosto manteve-se sensivelmente constante ao longo do processo fermentativo, decrescendo somente de 3,0 para 2,6, durante a fase exponencial de crescimento, estabilizando a 2,8 at ao final do processo; (b) a massa volmica do mosto decresceu ao longo da fermentao, partindo de um valor prximo de 1058 mg/mL at atingir cerca de 948 mg/mL, no final de fermentao; (c) o Brix diminuiu ao longo da fermentao, sendo esse

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RESULTADOS E DISCUSSO decrscimo mais acentuado quando a cultura entra em fase de desacelerao pronunciando-se com a entrada em fase estacionria.

a)

b)

c)

Figura 14: Valores de (a) pH extracelular, da (b) massa volmica (mg/mL) e do (c) Brix do mosto, ao longo de fermentao de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30C.

No que respeita ao pH, os resultados obtidos a 30C vm confirmar o que fora referido a 15C quanto ao mosto ser um meio com capacidade tampo, mantendo-se constante ao longo da fermentao, com valores prximos de 3. Os resultados relativos variao da massa volmica demonstraram que, a 30C, somente se verificou uma diminuio significativa deste parmetro a partir do final da fase exponencial de crescimento. Ao contrrio do observado em fermentaes decorridas a 15C, esta diminuio coincidiu com a diminuio do Brix, o que refora a ideia de que a variao da massa volmica pode reproduzir a diminuio dos teores de glucose e de frutose e, por conseguinte, a produo de etanol e de CO2 ao longo da fermentao. Relativamente aos teores de glucose determinados nas fermentaes a 30C (Tabela 11, Figura 15), possvel afirmar que cerca de 20% de glucose foi consumida entre o momento

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT da inoculao (T0) e o final de fase exponencial (T2), aproximadamente 40% foi consumida entre o final da fase exponencial (T2) e o incio da fase estacionria (T3) e que cerca de 40% foi consumida a partir do incio da fase estacionria (T3). No ltimo ponto de o amostragem (T5), as clulas praticamente esgotaram a glucose presente no meio, , considerando-se terminada a fermentao deste acar. Por comparao dos grficos d se . de Brix (Figura 14c) e de consumo de glucose ( (Figura 15), foi possvel observar que, tal como se constatou a 15C, o valor do Brix registado no final de fermentao n foi prximo de fermentao no zero, verificando-se novamente uma possvel disparidade entre o consumo de glucose e o se consumo de frutose, indiciando a presena de quantidades ainda significativas de frutose no momento em que se observa o esgotamento de glucose.

Tabela 11: Teor de glucose e de etanol em fermentaes conduzidas a 30C 30C.

Fase de crescimento Inoculao Meio da exponencial Final de exponencial Incio de estacionria Meio da estacionria Final de fermentao [glucose] (g/L) 96,50 83,89 80,41 40,42 4,26 0,05 % consumo glucose 0,00 13,06 16,67 45,59 87,21 93,82 [etanol] (g/L) 0,20 1,84 6,45 39,16 43,19 56,44 % etanol (v/v) 0,03 0,23 0,82 4,96 5,47 7,15 % produo etanol 0,35 3,27 11,43 69,39 76,53 100,00

Figura 15: Consumo de glucose e produo de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentaes de mosto a 30C.

Quanto ao etanol produzido durante a fermentao a 30C (Tabela 11, Figura 15), verificouTabela se que cerca de 11% foi produzido entre o momento da inoculao (T0) e o final de fase produzido exponencial (T2), aproximadamente 58% foi produzido entre o final de fase exponencial (T2) e o incio de fase estacionria (T3) (coincidindo com a fase de maior consumo de glucose) e 31% de etanol foi produzido aps a cultura entrar em fase estacionria (T3). (T3 Consubstanciando, a transio entre o final da fase exponencial e o incio da fase estacionria a 30C, evidenciou se como sendo o perodo de fermentao no qual ocorreu evidenciou-se

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT traduziu-se na fase grande parte do consumo de glucose (aprox. 40%) e consequentemente traduziu onde se verificou a maior parte da produo de etanol (aprox. 58%). Tal como foi mencionado a 15C, a 30C poder ter do ter-se tambm subestimado o valor de concentrao de etanol nas amostras colhidas ao longo da fermentao, o que se poder amostras dever metodologia utilizada para determinao da concentrao de etanol e a possveis desvios da produo de etanol para a produo de produtos secundrios de fermentao. produtos Por sua vez, estes desvios pod podem ser responsveis pelo menor rendimento etanol/glucose observado durante a fase estacionria e pelo baixo teor em etanol registado no final de fermentao a 30C (7,15% (v/v)), significativamente mais baixo do que seria de prever rmentao atendendo ao Brix inicial do mosto. al Relativamente determinao d nveis de O2 no mosto de uva branca a 30C (Tabela 12, dos Figura 16), constatou-se, tal como a 15C, uma diminuio drstica nos valores de se, concentrao de oxignio ao longo da fermentao, de cerca de 110 M no i M incio da fase exponencial para concentraes de O2 que rondam 10 M no incio da fas estacionria, at fase se registarem valores prximos de 7 M aps o final de fermentao. Estando bem evidente no grfico da Figura 16, que o final da fase exponencial coincide com a altura em que a , concentrao de O2 pode ser considerada residual. Destes resultados tambm se pode aferir que culturas cultivadas em mosto de uva branca a 30C a concentrao de O2 atinge valores muito baixos para D.O. menores que a 15C, o que leva a colocar a hiptese de o O2 ser um dos factores que podem determinar a desacelerao da curva de crescimento em mosto a esta temperatura, registando sempre concentraes de etanol inferiores (6,45g/L de etanol no final de exponencial a 30C e 16g/L de etanol a 15C lidar na mesma fase) fase).
Tabela 12: Nveis de saturao de oxignio no mosto em fermentaes conduzidas a 30C.
Fase de crescimento Incio da exponencial Final de exponencial Incio de estacionria Meio da estacionria Final de fermentao Aps final de fermentao [O2] (M) 110,4 13,2 9,6 7,4 7,2 7,2

Figura 16: Nveis de saturao de oxignio no mosto ao longo de fermentaes a 30C.

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RESULTADOS E DISCUSSO 3.2. Avaliao de marcadores apoptticos Nos ltimos anos, tm sido realizados vrios estudos que visam a existncia de diferenas fisiolgicas entre as clulas nas vrias fases do processo fermentativo, nomeadamente entre as clulas em crescimento exponencial e clulas em fase estacionria [Rossignol et al., 2003, 2009; Varela et al., 2005]. Em fase estacionria, as clulas deparam-se com diversas situaes pouco favorveis sua manuteno/sobrevivncia, nomeadamente, tem que lidar com o esgotamento da fonte de carbono e azoto e com o aumento progressivo das concentraes de etanol no meio [Bisson, 2004; Fleet & Heard, 1993; Querol et al., 2003; Zuzuarregui et al., 2006]. Os resultados obtidos nos ensaios de avaliao dos parmetros de crescimento realizados a 15C e a 30C, tal como os resultados previamente obtidos a 25C, apontaram no sentido da manuteno de uma elevada percentagem de clulas nas etapas finais de fermentao, tendo-se obtido percentagens de viabilidade celular que rondam os 69% a 15C e valores prximos de 55% a 30C. Para alm disso, verificou-se que o nmero de clulas metabolicamente activas foi superior ao nmero de clulas com capacidade de multiplicao (expresso em UFC/mL). Estes resultados, a par de outros obtidos para o pH intracelular de clulas em fase estacionria cultivadas nas mesmas condies (T. Viana, 2009) levaram necessidade de um estudo mais aprofundado do estado fisiolgico das clulas, nomeadamente no que se refere ocorrncia de fenmenos de apoptose e/ou necrose. Considerando que as alteraes ocorridas ao longo da fermentao vinria podem contribuir para as variaes observadas nos parmetros de crescimento, nomeadamente na variao da viabilidade celular no decorrer das fermentaes, a 15C e a 30C, e na tentativa de se revelar que estas alteraes podem induzir morte celular em Saccharomyces cerevisiae ISA 1000, resultante de fenmenos de apoptose e/ou necrose, procedeu-se ao estudo da morfologia da cromatina, da fragmentao do DNA, da integridade da membrana e da formao de espcies reactivas de oxignio, nos pontos de amostragem definidos para as duas situaes em estudo. 3.2.1. Formao de espcies reactivas de oxignio A apoptose em leveduras associada em muitos casos, gerao e acumulao de espcies reactivas de oxignio (ROS). As clulas de levedura apresentam uma variada gama de respostas face presena de ROS que dependem da dose [Perrone et al., 2008; Temple et al., 2005]. Com doses muito baixas, as clulas podem adaptar-se, tornando-se mais resistentes a uma exposio subsequente [Collinson & Dawes, 1992; Jamieson, 1992]. Com doses mais elevadas as clulas activam funes antioxidantes que incluem alterao

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RESULTADOS E DISCUSSO na expresso gnica mediada por diferentes factores de transcrio, como Yap1p e msn2,4p [Gasch et al., 2000] e um atraso no ciclo de diviso celular [Flatterry-OBrien & Dawes, 1998; Lee et al., 1996]. At que com doses ainda superiores, ocorre a morte de uma poro de clulas da populao, inicialmente por morte celular com fentipos caractersticos de apoptose (como fragmentao nuclear, acumulao de DNA fragmentado e inverso da membrana plasmtica), caspase-dependentes [Madeo et al., 2002]. Este fenmeno ocorre normalmente em clulas expostas a stress oxidativo, pela presena de H2O2 ou outros indutores de ROS, cido actico e em certas condies fisiolgicas como o caso do esgotamento de nutrientes (starvation) [Ludovico et al., 2001]. medida que o stress aumenta, as clulas sofrem necrose [Ludovico et al., 2001]. A produo e acumulao de ROS podem ser avaliadas pelo uso de fluorocromos como o dihidroetdio, que moderadamente especfico para o anio superxido, ou como a dihidrorodamina 123 ou o diacetato diclorodihidrofluorescena, que so oxidados por uma gama mais ampla de ROS. Para a avaliao da formao e acumulao de espcies reactivas de oxignio em clulas de S. cerevisiae ISA 1000 durante a fermentao vinria de mosto de uva branca a 15C e a 30C, procedeu-se como descrito por Madeo e colaboradores (1999), tendo-se optado por utilizar como marcadores de ROS, dihidrorodamina 123 (DHR123) e diacetato diclorofluorescena (DCFH-DA), oxidados pela clula na presena de ROS (a DHR123 oxidada a rodamina 123 num nico passo, enquanto o DCFH-DA diacetilado a diclorodihidrofluorescena, que por sua vez, na presena de ROS, oxidada a diclorofluorescena). Clulas com acumulao de ROS apresentam-se coradas de vermelho (DHR123) ou verde (DCFH-DA) podendo esta colorao abranger a clula toda ou localizarse apenas nas mitocndrias. Como controlo negativo utilizaram-se clulas no marcadas para eliminar fenmenos de autofluorescncia. Como controlo positivo de marcao utilizaram-se clulas cultivadas em mosto, s temperaturas de fermentao anteriormente referidas, que foram recolhidas nas diferentes fases do processo fermentativo, e posteriormente incubadas em concentraes de perxido de hidrognio (H2O2), conhecidas por induzirem apoptose em leveduras. H2O2 3-5 mM no caso de clulas em fase exponencial [Madeo et al., 1999] e H2O2 180 mM em fase estacionria [V. Salvador].

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT

a)

b)

Figura 17: Acumulao de ROS Marcao com DHR123 e DCFH-DA de cl ROS. clulas incubadas com perxido de hidrognio (clulas e fase exponencial incubadas em H2O2 5mM e em fase estacionria em em H2O2 180 mM), controlo positivo de: a) fermentaes decorridas a 15C; b) fermentaes realizadas a 30C.

Utilizando estas concentraes de H2O2 foi possvel induzir acumulao de ROS observvel ossvel por marcao com DHR123 e DCFH DCFH-DA em clulas recolhidas em fase exponencial de ulas crescimento (Figura 17), confirmando assim a exequibilidade da marcao com estes ), fluorocromos, nestas clulas. Por outro lado, no caso das clulas recolhidas em fase estacionria, para ambas as temperaturas, e incubadas com H2O2 180 mM durante 2h, verificou-se que no caso da se marcao com DHR123 apenas 34% e 23% (respectivamente para fermentao a 15C e a 30C) apresentaram marcao positiva, com DCFH-DA o nmero de clulas marcadas foi DA ainda mais reduzido (< a 1% e 13%, a 15C e a 30C respectivamente), a tentativa de subir a concentrao de H2O2 foi tambm realizada infrutiferamente visto que para concentraes superiores a 180 mM as clulas se apresentaram num estado muito danificado aps s incubao. Estes resultados obtidos para os controlos indicam que no caso de clulas em fase estacionria no possvel utilizar a marcao com DHR123 ou DCFH-DA para deteco DCFHde ROS, inviabilizando desta forma qualquer concluso fivel para clulas recolhidas nesta do fase. Estas observaes vm ao encontro dos resultados obtidos por Herker e colaboradores (2004) que observaram que as clulas em fase estacionria so muito mais

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT difceis de marcar, o que se poder dever a diferenas fisiolgicas das clulas, quer ao nvel da parede (mais espessa), da bicamada lipdica (mais impermevel) ou existncia de protenas tipo MDR capazes de expulsar o fluorocromo impedindo assim a marcao e deteco correctas de ROS por este mtodo. as

Figura 18: Evoluo da percentagem de voluo clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DHR123 e com DCFH DCFH-DA ao longo de fermentaes decorridas a 15C.

Figura 19: Evoluo da percentagem de voluo clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DHR123 e com DCFH-DA ao longo de DA fermentaes realizadas a 30C.

Relativamente evoluo do nmero de clulas marcadas com DHR123 e DCFH DCFH-DA em fermentaes decorridas a 15C, como evidente na Figura 18, de um modo geral observou-se que aps inoculao no mosto (T0), em fase de latncia (TLag) e no incio da fase exponencial de crescimento (T1), sensivelmente 95% das clulas formam e acumulam (T1), ROS, a meio da fase exponencial (T2), regista-se uma diminuio no nmero de cl se clulas com acumulao de ROS (46% de clulas marcadas com DHR123 e 32% com DCFH DCFH-DA). Com entrada em fase de desacelerao (final da fase exponencial, T3), regista regista-se uma nova diminuio no nmero de clulas marcadas com DHR123 e com DCFH com DCFH-DA, para respectivamente 28% e 24%. Tendo em conta que para clulas em fase exponencial o mtodo aplicvel, dado ser possvel induzir nas clulas acumulao de ROS positivamente marcado por qualquer dos fluorocromos, os resultados obtidos correspondem s obtidos percentagens efectivas de clulas com acumulao se ROS. Se tivermos em considerao que a existncia de ROS depende da presena de O2 e que esta consideravelmente baixa para o mosto a partir do incio da fase estacionria poder p se a hiptese de esta pr-se reduo se dever diminuio nos nveis de O2 disponveis. No caso de clulas recolhidas

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RESULTADOS E DISCUSSO em fase estacionria, no foi possvel obter marcao com qualquer dos fluorocromos o que se poder atribuir a problemas metodolgicos j patentes nos controlos positivos. Por um lado, o crescimento estritamente anaerbio pode prevenir a morte celular acompanhada de fentipos de apoptose, demonstrando que os radicais no so um subproduto mas sim um promotor de apoptose [Madeo et al., 1999]. Por outro lado, tem sido demonstrado que clulas envelhecidas quer cronologicamente quer replicativamente acumulam ROS submetendo-se a morte celular por apoptose [Fabrizio et al., 2004; Laun et al., 2001], indicando que os mecanismos de defesa celular contra o stress oxidativo desempenham um papel importante no controlo do envelhecimento celular e consequentemente na morte celular a ele associada [Breitenbach et al., 2004; Longo et al., 2005; Perrone et al., 2008]. No que diz respeito s fermentaes conduzidas a 30C, a evoluo do nmero de clulas com capacidade de oxidar DHR123 e DCFH-DA encontra-se registada no grfico da Figura 19. Tendo-se observado que aps inoculao no mosto (T0) aproximadamente 80% das clulas tem capacidade para oxidar ambos os compostos. Em fase de acelerao (T1) o nmero de clulas capazes de oxidar estes compostos diminui para valores prximos de 60%. E, em plena fase exponencial (T2), enquanto as clulas conseguem oxidar DCFH-DA registando-se um aumento no nmero de clulas marcadas com este composto para 89%. Com entrada em fase de desacelerao (final da fase exponencial, T3), o nmero de clulas com capacidade para oxidar estes compostos mantm-se relativamente constante (77% de clulas marcadas com DHR123 e 88% marcadas com DCFH-DA), diminuindo de modo bastante acentuado aps entrada em fase estacionria (T4), para 21% no caso das clulas marcadas com DHR123 e para 32% no caso de clulas marcadas com DCFH-DA, provavelmente devido a problemas metodolgicos encontrados para clulas recolhidas nesta fase. 3.2.2. Condensao da cromatina A avaliao da condensao e fragmentao da cromatina trata-se de um tpico marcador apopttico, frequentemente observado em leveduras expostas a diversos estmulos [Bttner et al., 2006; Frhlich et al., 2007; Ludovico et al. 2005]. O ncleo das clulas apoptticas apresenta cromatina muito condensada que pode ser corada por um composto capaz de penetrar as membranas de clulas apotticas, o 4,6diamino-2-fenilindol (DAPI). Este mtodo um mtodo subjectivo porque no h uma fronteira explcita entre clulas normais e clulas apoptticas, uma situao onde se verifica a existncia de fronteira entre clulas normais e clulas apoptticas corresponde situao

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT em que os ncleos se encontram em repous (fase G0) [Allen et al., 2006 Yang et al., repouso , 2006, 2006]. Para efectuar o estudo da condensao da cromatina, procedeu se de acordo com o procedeu-se descrito por Madeo e colaboradores (1997). A quantidade de clulas utilizadas foi igual a 2x107 clulas/mL, incubou-se com 1 g/mL de DAPI durante 10 minutos [Madeo et al., se 1997]. Paralelamente ao ensaio DAPI, realizou realizou-se uma co-colorao com iodeto de propdio colorao (PI), o que possvel visto estes compostos apresentarem comprimentos de onda de excitao e de emisso de fluorescncia distintos, como descrito na seco 2.8.. O PI s o penetra significativamente nas clulas quando a membrana celular se encontra danificada, o que normalmente acontece em clulas necrticas. Tendo em conta o que foi descrito, esta co-colorao permite distinguir clulas necrticas de clulas apoptticas. colorao

Figura 20: Fragmentao da cromatina. Marcao DAPI em clulas incubadas com cido actico. Controlo positivo, a 15C e 30C, respectivamente: a) e c) clulas em fase exponencial de crescimento (incubadas com 80 mM de cido); b) e d) clulas em fase estacionria (incubadas com 140 mM de cido).

Como controlo positivo foram utilizadas clulas cultivadas em mosto, s temperaturas de , fermentao (15C e 30C), recolhidas nas diferentes fases do processo fermentativo, e colhidas posteriormente incubadas em concentraes de cido actico de acordo com as concentraes descritas na literatura, aplicadas quando se pretende induzir apoptose em leveduras pela utilizao deste composto. Para tal, utilizaram se concentraes de cido o utilizaram-se actico 40-80 mM no caso de clulas em fase exponencial [Ludovico et al. 2001] e cido al., actico 120-140 mM no caso de clulas em fase estacionria [Ludovico et al., 2002]. 140 Particularmente, no caso das fermentaes conduzidas a 15C, quando as clulas foram o submetidas a concentraes de cido actico na ordem dos 80 mM, cerca de 8 80% das clulas em fase exponencial, apresentam intensa fluorescncia concentrada no n ncleo correspondente a fragmenta da cromatina (Figura 20a), e em fase exponencial quando ao as clulas so expostas a concentraes de cido iguais a 140 mM 70% d destas clulas apresentam fluorescncia nuclear (Figura 20b). Nas fermentaes conduzidas a 30C, utilizaram-se as mesmas concentraes, tendo se verificado que 90% das clulas do mas tendo-se controlo positivo em fase exponencial apresentam fluorescncia centrada no ncleo (Figura

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT c), 20c), e em fase estacionria cerca de 65% das clulas tem fluorescncia localizada no ncleo (Figura 20d). Assim, em qualquer dos casos, clulas em fase exponencial ou em fase estacionria, o mtodo aplicvel e fivel. Como controlo negativo utilizaram utilizaram-se clulas que cresceram em mosto s mesmas temperaturas, recolhidas nas mesmas fases de crescimento mas no foram incubadas com DAPI, a fluorescncia registada corresponde a auto-fluorescncia.

Figura 21: Condensao e fragmentao da cromatina, colorao DAPI, co-colorao com PI e corepresentao das clulas em campo claro, em cl clulas S. cerevisiae ISA 1000 cultivadas em mosto a 15C.

Figura 22: Evoluo da percentagem de clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DAPI e com PI ao longo de fermentaes decorridas a 15C.

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RESULTADOS E DISCUSSO A Figura 21 representa um exemplo de clulas recolhidas nas diferentes fases do processo fermentativo, decorrido a 15C. Por microscopia de fluorescncia foi possvel determinar a condensao da cromatina nos pontos de amostragem definidos (Figura 21 e 22), constatando-se, atravs da anlise do grfico da Figura 22 que, aps inoculao (T0), aproximadamente 20% das clulas apresentam fluorescncia quando incubadas com DAPI e que cerca de 4% das clulas tambm exibem marcao com PI. Nas clulas recolhidas durante a fase de latncia (TLag) observou-se uma diminuio para cerca de metade na percentagem de clulas marcadas com DAPI e um aumento para o dobro na percentagem de clulas co-marcadas com PI, registando-se valores que rondam respectivamente 11% e 8%, que se mantm constantes at ao final da fase exponencial. No incio da fase de desacelerao (T3) verifica-se um aumento significativo na percentagem de clulas marcadas tanto com DAPI (30%) como de clulas simultaneamente marcadas com PI (24%), que sofre um aumento lento e progressivo at ao final da fermentao de glucose, quer no caso de marcao com DAPI quer com PI, verificando-se que neste ponto aproximadamente 28-29% das clulas encontram-se simultaneamente marcadas com DAPI e com PI. de se salientar que 72h aps o esgotamento de glucose (T8) foi possvel visualizar alteraes na morfologia da cromatina em cerca de 47% das clulas, acompanhada por marcao com PI em 41% das clulas. Atravs da anlise das imagens adquiridas por microscopia de fluorescncia (Figura 21), tambm foi possvel constatar uma evoluo no padro de condensao da cromatina ao longo das vrias fases do processo fermentativo, observando-se de um modo geral em todas as fases de crescimento, que parte das clulas apresentou um semi-anel de DNA que fluoresce com pouca intensidade, sendo possvel visualizar em algumas clulas o aparecimento de fluorescncia centrada num nico ponto redondo correspondente ao ncleo, o que indica que a cromatina se encontra condensada nesse local [Madeo et al., 1997, 1999]. Particularizando, aps inoculao (T0), na fase de latncia (TLag) e em fase exponencial (T1 e T2), para alm de colorao localizada num nico ponto correspondente a marcao nuclear, foi possvel observar pequenos pontos que se encontram na periferia da clula e que fluorescem com muito menos intensidade do que os ncleos ou fragmentos nucleares. Segundo Madeo e colaboradores (1997 e 1999), estes pequenos pontos podem corresponder a mitocndrias [Madeo et al., 1997, 1999]. Por norma, no incio e no decorrer da fase exponencial (T1, T2 e T3), por comparao com as observaes efectuadas por microscopia de contraste de fase, verificou-se que as clulas que no apresentaram fluorescncia foram clulas individualizadas que no se encontravam a gemular. No entanto, pode-se ainda observar, nestas condies fisiolgicas, duas situaes distintas. Por um lado, observou-se que as clulas com o semi-anel de DNA se

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RESULTADOS E DISCUSSO tratam de clulas em diviso e em alguns casos o ncleo ainda se situa entre me e gmula (filha). Estas observaes vo ao encontro do que foi descrito por Yang e colaboradores (2006), que referem marcao DAPI positiva em clulas em diviso celular, tendo sido sugerido por estes autores que a condensao da cromatina se deve ao facto das clulas encontrarem em profase meitica [Yang et al., 2006]. Por outro lado, clulas co-marcadas com PI (Figura 21, T0, TLag, T1 e T2) so clulas que fluorescem intensamente, no se encontram em processo de diviso celular e so morfologicamente diferentes das outras clulas, apresentando parede celular visivelmente mais fina e no apresentavam vacolos no citosol [Allen et al., 2006]. No final de fermentao de glucose (T7), as clulas fluorescem de modo intenso, estando a cromatina espalhada de modo aleatrio pela clula em alguns casos. Este tipo de alterao na morfologia da cromatina muito mais evidente em clulas recolhidas aps o esgotamento de glucose (T8), que apresentam fluorescncia muito mais intensa e espalhada, correspondendo provavelmente a fragmentos de cromatina aparentemente ligados por microtubulos ou simplesmente espalhados de modo aleatrio pela clula como descrito por Madeo e colaboradores (1997). Nos casos em que se observou este tipo de colorao as clulas apresentaram-se tambm coradas com PI com fluorescncia difusa, o que pode indicar que as clulas esto a sofrer morte celular por mecanismos associados a necrose. Por comparao das imagens obtidas por microscopia de fluorescncia com as recolhidas por microscopia de contraste de fase, comprovou-se que clulas que no apresentam qualquer tipo de marcao so clulas-filhas, pequenas com forma oval e sem parede muito grossa, que so muito refrcteis enquanto as clulas que fluorescem so clulas maiores do que as outras, granuladas, com parede menos espessa e com aspecto degradado (Figura 21, T8). Esta observao indica-nos a possibilidade de estarmos perante duas populaes diferentes, o que vai ao encontro do que foi descrito por Allen e colaboradores (2006). Estes investigadores observaram a existncia de duas populaes de clulas na fase estacionria separveis por gradiente de densidades, com caractersticas morfolgicas e fisiolgicas distintas, atribuindo esse facto existncia de dois tipos de clulas, um correspondente a clulas quiescentes (clulas mais refrcteis, que mantm a viabilidade celular, mais resistentes a stress) e outro correspondente a clulas no quiescentes (clulas menos refrcteis, sem capacidade reprodutora e menos resistentes a stress) que apresentam sinais de apoptose [Allen et al., 2006]. A existncia de clulas quiescentes e no quiescentes tambm foi observada por microscopia electrnica em culturas no fracionadas de clulas em fase estacionria tardia [Yang et al., 2006]. Relativamente evoluo das alteraes na morfologia da cromatina durante fermentaes conduzidas a 30C, por microscopia de fluorescncia (Figura 23), observou-se que, tal como o que se verificou em clulas cultivadas a 15C, em todas as fases de crescimento, parte

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RESULTADOS E DISCUSSO das clulas marcadas com DAPI apresentam um semi-anel de DNA que fluoresce com pouca intensidade e em algumas clulas possvel visualizar fluorescncia centrada num nico ponto correspondente ao ncleo. Por anlise do grfico representado na Figura 24, constatou-se que aps inoculao (T0) aproximadamente 19% das clulas apresentam fluorescncia quando incubadas com DAPI e que cerca de 12% das clulas tambm exibem marcao com PI, percentagens que quase no variam em fase de acelerao (T1), diminuindo ao longo da fase exponencial e atingindo um valor mnimo no final desta fase quer no caso de marcao com DAPI quer no de marcao com PI. A diferena entre T1 e fase exponencial pode ser explicada pelo facto das clulas em T1 corresponderem a clulas acabadas de ser inoculadas no mosto, encontrando-se em fase de acelerao, durante a qual esto num perodo de adaptao s condies de stress presentes no mosto. Por esta razo podero existir clulas com sinais de apoptose que provavelmente j no sero capazes de retomar o crescimento, arrancando a fase exponencial com uma populao de clulas inferior ao inculo inicial. Estes resultados vm ao encontro do observado para o nmero de clulas com capacidade de multiplicao que diminui aps inoculao das clulas em mosto (Figura15). Pelo contrrio, na fase T2 as clulas encontram-se em plena fase exponencial sendo de esperar que praticamente todas as clulas sejam capazes de multiplicao activa no apresentando por isso sinais de morte celular, podendo-se mesmo concluir, por comparao das imagens adquiridas por microscopia de fluorescncia e as captadas em contraste de fase (Figura 23, T2) que as clulas parte das clulas que apresentam condensao da cromatina nesta fase so clulas em diviso em que nalguns casos o ncleo ainda se dispe entre me e gmula, indo ao encontro do que foi descrito por Yang e colaboradores (2006), que observaram marcao DAPI positiva em clulas em profase meitica [Yang et al., 2006]. Ao longo da fase estacionria, observou-se um aumento significativo do nmero de clulas que apresentam marcao com DAPI e um aumento embora no to acentuado das clulas marcadas com PI, levando a que cerca mais de 50% do total de clulas marcadas apresentando sinais de condensao de cromatina no apresentem co-colorao com PI. Esta diferena esbate-se tornando-se praticamente nula a partir de meio da fase estacionria, verificando-se um aumento simultneo, gradual e equivalente das clulas marcadas com DAPI e PI, at ao final de fermentao de glucose, que se mantm para l deste ponto. Aps o esgotamento de glucose (T7) foi possvel visualizar alteraes na morfologia da cromatina em cerca de 36% das clulas, acompanhada por co-marcao com PI, o que pode indicar que as clulas esto a sofrer morte celular por mecanismos associados a necrose.

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT Comparando as imagens obtidas por microscopia de fluorescncia com as recolhidas por microscopia de contraste de fase, pensa se que, tal como o que fora observado a 15C em pensa-se clulas fase estacionria, que clulas sem qualquer tipo de marcao podero ser clulas stacionria, quiescentes e, por outro lado, as clulas marcadas podero corresponder a clulas no quiescentes [Allen et al., 2006; Yang et al., 2006].

Figura 23: Condensao e fragmentao da cromatina, colorao DAPI, co-colorao com PI e corepresentao das clulas em campo claro, de clulas S. cerevisiae ISA 1000 nas vrias fases de fermentao vinria a 30C.

Figura 24: Evoluo da percentagem de clulas de S. cerevisiae ISA 1000 marcadas com DAPI e ercentagem com PI ao longo de fermentaes decorridas a 30C.

3.2.3. Fragmentao do DNA A extensa fragmentao do DNA uma caracterstica que ocorre freque frequentemente nos primeiros passos de apoptose, tratando se de um passo irreversvel que conduz morte tratando-se

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RESULTADOS E DISCUSSO celular. Esta degradao pode originar fragmentos de DNA em cadeia dupla, fragmentos de DNA de baixo peso molecular (mononucleossomas e oligonucleossomas) ou pode originar quebras numa s cadeia (nicks) no DNA de elevado peso molecular [Ribeiro et al., 2006]. A fragmentao do DNA pode ser visualizada por vrios mtodos, tais como electroforese simples em gel de agarose, electroforese em campo pulsado (PFGE) e ensaio TUNEL [Ribeiro et al., 2006]. O ensaio TUNEL um mtodo rpido e de elevada sensibilidade, que possibilita visualizar a quantidade de DNA fragmentado clula-a-clula, enquanto os dois primeiro mtodos permitem a anlise da populao global. A fragmentao do DNA provocada por MCP envolvendo fentipos caractersticos de clulas apoptticas pode produzir caudas 3-OH livres, que podem ser detectadas por marcao com nucleotdos modificados (FITC-dUTP), numa reaco catalisada pela enzima terminal deoxinucleotidil transferase. [Ribeiro et al., 2006]. Uma vez que as clulas de levedura so clulas com parede, necessrio remove-la previamente para se poder realizar o ensaio TUNEL. No entanto, a parede das clulas apresenta variaes na sua estrutura ao longo das fases de crescimento, para as duas temperaturas de ensaio (15C e 30C), sendo mais resistente e espessa em clulas em fase estacionria do que em clulas em fase exponencial de crescimento [Allen et al., 2006]. Em virtude destas variaes foi necessrio proceder optimizao do processo de obteno de protoplastos (ver seco 2.6.), tendo sido necessrio incubar as clulas por um perodo mais longo e com uma quantidade de superior de enzimas de forma a remover a parede.Por observao microscpica foi possvel verificar que o tratamento efectuado permite a obteno de aproximadamente 100% de protoplastos. Para realizao do ensaio de TUNEL tambm necessrio permeabilizar as clulas. Como os mecanismos de morte celular so processos rpidos e dinmicos foi necessrio antes de obter protoplastos e permeabilizar as clulas, fixar o metabolismo celular [Madeo et al., 1997]. Paralelamente ao ensaio TUNEL, realizou-se co-colorao com DAPI e com PI. Este tipo de co-colorao exequvel, dado que os comprimentos de onda de excitao e emisso da fluorescena (FITC-dUTP), do DAPI e do PI diferem entre si (ver M&M, 2.8.). Como estamos perante clulas permeabilizadas, tanto o DAPI como o PI penetram indiscriminadamente nas clulas. No entanto, o DAPI continua a marcar ncleos que apresentem cromatina condensada servindo exclusivamente para se confirmar se os nveis de fragmentao da cromatina condizem com os de DNA fragmentado, enquanto o PI se liga indiscriminadamente ao DNA independentemente deste estar ou no fragmentado. Como controlo positivo efectuou-se o tratamento prvio das clulas com DNase I, tendo estas sido depois incubadas com a mistura reaccional, e como controlo negativo utilizaram-

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT se as mesmas clulas incubadas com FITC dUTP na ausncia de enzim As Figuras 25 e FITC-dUTP enzima. 26 representam um exemplo de marcao positiva e negativa de clulas em fase exponencial e em fase estacionria de crescimento, cultivadas s temperaturas de estudo. Tal como se pode observar as clulas do controlo positivo (Figura 25a e 26a), exibem pontos de intensa fluorescncia em toda a clula indicando que o DNA est fragmentado, a marcao alaranjada deve-se a interferncias com o PI. As clulas do controlo negativo se (Figura 25b e 26b), apresentam marcao bastante difusa no citosol (a verde) e marcao , nuclear (a laranja) devida a interferncias com o PI, que se liga ao DNA que se encontra PI, concentrado no ncleo.

a)

b)

Figura 25: Representao de controlos de f fragmentao de DNA de clulas recolhidas a 15C, em fase exponencial e em fase estacionria de crescimento: a) controlo positivo e b) controlo negativo.

a)

b)

Figura 26: Representao de controlos de f fragmentao de DNA de clulas cultivadas a 30C, em fase exponencial e em fase estacionria de crescimento: a) controlo positivo e b) controlo negativo.

Na Figura 27 (a e b) apresenta se um exemplo de clulas recolhidas em diferentes fases da apresenta-se fermentao decorrida a 15C, coradas pelo ensaio TUNEL e co coradas com DAPI e PI. o co-coradas

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT Aps inoculao das clulas no mosto (T0), verificou se que grande parte das clulas verificou-se apresenta marcao difusa como a presenciada no controlo negativo (Figura 25b) o que 25b), indica que apesar de haver entrada de FITC a FITC-dUTP devido permeabilizao das clulas, eabilizao estes no se ligam porque o DNA no est fragmentado. Por outro lado, no caso da colorao com PI, devido ao facto das clulas estarem permeabilizadas observa observa-se entrada de parte deste composto, verificando verificando-se tal como esperado marcao nuclear do DNA cao cromossmico e marcao difusa no citosol. No entanto, nesta situao fisiolgica foi possvel observar em 15% clulas fluorescncia idntica registada no controlo positivo (Figura 27c). Em clulas recolhidas entre TLag e T2 os resultados para o ensaio TUNEL resultados foram semelhantes, com percentagens de clulas marcadas positivamente que variam entre 4 e 8% (Figura 27c).

a)

b)

c)

Figura 27: Ensaio TUNEL em clulas de S. cerevisiae ISA 1000 cultivadas a 15C, com co cocolorao com DAPI e PI: a) clulas recolhidas aps inoculao (T0), na fase de latncia (TLag) e em fase exponencial de crescimento (T1, T2 e T3); b) clulas recolhidas em fase estacionria (T4, T6 e T7) e 72 h aps o final de fermentao de glucose (T8); c) evoluo da percentagem de inal clulas que apresentam DNA fragmentado.

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RESULTADOS E DISCUSSO No caso de clulas recolhidas no incio e no final da fase de desacelerao (Figura 27a, T3 e Figura 27b, T4), pode-se verificar uma alterao no padro de marcao no ensaio TUNEL, tendo-se observado que embora haja marcao no ensaio TUNEL esta deixou de ser nuclear, indicando que o DNA cromossmico est fragmentado. No entanto, quando se tem em conta a marcao DAPI, verifica-se que a marcao difusa, estes resultados podem ser indicativos de que os mecanismos de morte celular accionados pelas clulas esto eventualmente associados a processos de necrose ou que haja uma sobreposio entre os fentipos apoptticos e necrticos [Ludovico et al., 2005]. Em fase de desacelerao h um aumento no nmero de clulas marcadas, de 15% das clulas no incio desta fase para aproximadamente 24% no incio da fase estacionria (Figura 24c). Em plena fase estacionria (Figura 27b, T6), os padres de marcao permanecem idnticos aos observados na condio fisiolgica anterior, observando-se um aumento na intensidade da marcao embora se registe uma diminuio na percentagem de clulas marcadas para valores que rondam os 12% (Figura 27c). Estes valores so ainda menores no caso de clulas aps o esgotamento de glucose. Relativamente s clulas recolhidas no final da fermentao de glucose, pode-se observar duas situaes distintas: casos em que h colorao simultnea com TUNEL e PI e casos em que s se observa colorao com TUNEL coincidente com a colorao com DAPI. Nos primeiros casos, as clulas apresentaram marcao TUNEL e co-colorao com PI. No segundo caso, a marcao TUNEL muito intensa em toda a clula, lembrando o tipo de marcao mencionado em clulas que se encontram em fase exponencial de crescimento. Nestes casos no se regista colorao com PI e a marcao com DAPI nuclear, indicando que a cromatina est condensada, e que se est perante uma clula com sinais de apoptose. A ocorrncia destas duas situaes em simultneo no final do processo fermentativo, vm evidenciar o facto de podermos estar perante uma situao de sobreposio dos marcadores de necrose aos marcadores tpicos de apoptose caracterstico de uma situao de necrose secundria, descrita por Ludovico e colaboradores (2005) e que segundo estes autores corresponde ao culminar do processo apopttico em leveduras [Ludovico et al., 2005]. Esta hiptese corroborada pelo decrscimo do nmero de clulas marcadas com FITC-dUTPs que coincide com a fase em que se observa co-colorao DAPI/PI em clulas inteiras tambm indicativo de necrose celular e que poder ser responsvel pelo decrscimo observado no nmero de clulas totais nas fermentaes a ambas as temperaturas. Ao todo, no final da fermentao de glucose, como se pode observar no grfico da Figura 27c, aproximadamente 19% das clulas apresenta DNA fragmentado. No entanto, 72h aps esgotamento de glucose registou-se uma diminuio bastante acentuada no nmero de clulas que apresentam o DNA fragmentado, para valores prximos dos 4%.

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT Quanto ao ensaio realizado a 30 alizado 30C (Figura 28a), foi possvel verificar que 2h aps inoculao das clulas no mos mosto (T1), cerca de 46% das clulas foram marcadas T1), positivamente com FITC-dUTPs, este nmero reduziu se significativamente em plena fase dUTPs, reduziu-se exponencial de crescimento ( xponencial (T2), para valores prximos de 3%, o que coincide , qualitativamente com a observao efectuada na mesma fase para clulas coradas com DAPI. Com a entrada de fase estacion estacionria, houve um aumento no nmero de clulas com , DNA fragmentado registando registando-se nesta fase valores que rondam os 18% que se manteve 18%, at prximo do final da fermentao de glucose altura em que o nmero de clulas o marcadas com TUNEL voltou a di diminuir para aproximadamente 17%.

a)

b)

c)

Figura 28: Ensaio TUNEL em clulas de S. cerevisiae ISA 1000 cultivadas a 30C, co co-coloradas com DAPI e PI: a) clulas recolhidas aps inoculao (T0), na fase de acelerao (T1) e em fase exponencial de crescimento (T2); b) clulas recolhidas em fase estacionria (T4, T5 e T6) e 24 h aps o esgotamento de glucose (T7); c) evoluo da percentagem de clulas que apresentam DNA fragmentado.

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RESULTADOS E DISCUSSO As Figuras 28b e 28c representam um exemplo de fotografias de clulas recolhidas nas diferentes fases de fermentao a 30C, coradas com FITC-dUTP, DAPI e PI. Tal como se pode observar, ao longo do processo fermentativo houve uma evoluo no padro de marcao do DNA fragmentado: em T0 e T1, os resultados para o ensaio TUNEL, assim como os resultados de DAPI e PI, foram semelhantes, observando-se intensa fluorescncia em toda a clula (TUNEL e PI), indicando que o DNA est fragmentado, no caso da marcao com DAPI observaram-se pontos de intensa fluorescncia correspondentes a condensao e fragmentao da cromatina na zona nuclear. Estas observaes permitem afirmar que estes casos correspondem a situaes de apoptose. No caso das clulas T2 (em plena fase exponencial), poucas foram as clulas marcadas com TUNEL (no est representado na figura), observando-se em quase todas as clulas uma marcao difusa mas mais intensa do que a registada no controlo negativo (Figura 28b). Na Figura 28b s se encontra registado os poucos casos em que a marcao TUNEL foi positiva, mas atendendo marcao com DAPI e tendo em conta tudo o que foi referido em relao s caractersticas das clulas que apresentaram condensao da cromatina em fase exponencial, pensa-se que a fragmentao do DNA nestes casos pode se dever ao facto das clulas se encontrarem em multiplicao [Madeo et al.,1997] Aps entrada em fase estacionria (Figura 28c, T4) e ao longo desta fase (Figura 28c, T5, T6 e T7), pode-se observar colorao simultnea com FITC-dUTPs e PI similar das condies fisiolgicas descritas anteriormente, no entanto a marcao DAPI nessas clulas bastante difusa e pouco intensa, o que pode ser interpretado como marcao caracterstica de necrose ou como sobreposio destes marcadores aos marcadores tpicos de apoptose, descrito por Ludovico e colaboradores (2005) [Ludovico et al., 2005]. 3.2.4. Estudo da integridade da membrana Nas clulas dos mamferos, a fosfatidilserina (PS) encontra-se preferencialmente no folheto interno da membrana plasmtica e quando os mecanismos de apoptose so induzidos esta translocada para o folheto externo [Martin et al., 1995]. A externalizao da PS trata-se de um marcador de estdios iniciais de apoptose, que pode ser detectado por marcao com Anexina-V, que se liga fosfatidilserina com alta afinidade na presena de Ca2+. Tal como as clulas de mamfero, as clulas de Saccharomyces cerevisiae tambm apresentam distribuio assimtrica de PS na membrana citoplasmtica, onde em clulas no apoptticas 90% da PS se encontra orientada para o citoplasma [Cerbn & Caldron, 1991]. Para deteco da exposio de PS, removeu-se a parede celular por digesto com zimoliase e -glucuronidase, e os protoplastos foram incubados com Anexina-V. Para verificao da integridade da membrana procedeu-se simultaneamente marcao com

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RESULTADOS E DISCUSSO Anexina-V e com iodeto de propdio, que s penetra significativamente nas clulas quando a membrana celular se encontra danificada. O que permite em conjugao com a Anexina-V distinguir clulas apoptticas de clulas necrticas. Relativamente variao da integridade da membrana ao longo de fermentaes realizadas a 15C (Figura 29a), foi possvel observar que aps inoculao das clulas no mosto (T0) somente um nmero muito reduzido de clulas apresentava marcao com Anexina-V (2%), indicando a ausncia de translocao de PS. A observao de uma percentagem superior a 2% de clulas marcadas com PI (7%), indica por outro lado a existncia de clulas com a membrana danificada, o que pode indicar existncia de clulas necrticas ou, por outro lado, pode ser explicado pelo facto dos protoplastos serem bastante sensveis e durante os processos de lavagem ter ocorrido danificao da membrana. A percentagem de clulas marcadas com Anexina-V embora sendo da mesma ordem de grandeza no entanto inferior ao que havia sido determinado atravs de colorao com DAPI e pelo ensaio TUNEL, indicando que o nmero de clulas nas quais se detectou translocao da PS poder estar subestimado. Cerca de 10 horas depois do incio da fermentao (TLag) a percentagem de clulas marcadas com Anexina-V aumentou significativamente passando para 22%. Este aumento pode ser justificado com base no stress sofrido pelas clulas devido sua transferncia para uma temperatura mais baixa (15C) e diluio sofrida quando so inoculadas no mosto. Aps este aumento, com entrada em plena fase exponencial, observa-se uma diminuio gradual no nmero de clulas marcadas de 14% at atingir um valor mnimo de 8% a meio da fase exponencial de crescimento (T2), seguido de um aumento significativo do nmero de clulas marcadas registado nas clulas recolhidas na fase de desacelerao (T3, 40%) que coincide com a fase em que se registou tambm um aumento do nmero de clulas marcado com DAPI e com FICT-dUTPs (Figuras 29 e 30). Com entrada em fase estacionria (fase de desacelerao, T4), houve uma diminuio no nmero de clulas que apresentam exteriorizao de PS, registando-se nesta fase valores que rondam os 17%. Quanto marcao com PI, embora se tenha verificado tambm uma diminuio no nmero de clulas marcadas com este composto (20%), quando se compara com o nmero de clulas marcadas com Anexina-V verifica-se que este valor superior, o que pode indicar que essa diferena se deve ao facto de existirem nesta fase clulas necrticas. Este padro de marcao manteve-se at ao final da fermentao da glucose (23% de clulas marcadas com Anexina-V). No entanto, 72h aps esgotamento de glucose registou-se uma diminuio bastante acentuada no nmero de clulas que apresentam alteraes a nvel membranar, para valores prximos dos 4% em relao marcao com Anexina-V e 7% em relao colorao com PI, podendo indicar que uma fraco da populao se encontrava

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT efectivamente morta, podendo inclusive ter rebentado (so clulas permeabilizadas), o que levaria no deteco da translocao da PS.

a)

b)

Figura 29: a) Variao da Integridade da membrana plasmtica ao longo de fermentaes realizadas a 15C, b) visualizao aps marcao com Anexina e co-colorao com PI de clulas Anexina-V colorao em fase de latncia (TLag), no final da fase exponencial (T3) e em plena fase estacionria (T5). estacionria

Na Figura 29b esto representados exemplos de clulas recolhidas em trs fases distintas da fermentao de mosto a 15C, fase de latncia (TLag), incio da fase de desacelerao (T3) e plena fase estacionria (T5), coradas com Anexina-V e com PI. Considerando V Considerando-se que foram estas fases que registaram os picos de colorao com estes dois marcadores, visto que nas outras condies fisiolgicas a maioria das clulas registou marcao difusa na presena de Anexina-V e de PI, esco V escolheram-se estes estdios do crescimento para se exemplificar 3 situaes diferentes que foram frequentemente observadas na realizao do estudo da integridade da membrana em clulas cultivadas a esta temperatura. Uma primeira situao em que se observa um anel nitidamente marcado (que se pode observar em TLag anel e em T3). Muito embora este caso apresente fluorescncia alaranjada e no verde dever corresponder a marcao com Anexina Anexina-V devendo-se a alterao da cor a possveis se interferncias com o PI. O segundo caso corresponde a clulas que apresentam colorao caso difusa com PI, no se observando um ncleo definido (T3 e T5). Isto poder indicar a existncia de fenmenos associados a necrose. A terceira situao observada corresponde a clulas que apresentam um ncleo nitidamente corado com PI e com forma muito definida ncleo indicando que a membrana nuclear est intacta. Neste caso, podero ter ocorrido danos na membrana durante a preparao de protoplastos, pelo que seria de esperar a observao simultnea de uma colorao verde difusa em toda a clula com Anexina-V. o Anexina-

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RESULTADOS E DISCUSSO RESULT

a)

b)

Figura 30: a) Variao da integridade da membrana plasmtica ao longo de fermentaes de mosto de uva a 30C, b) visualizao aps marcao com Anexina e co-colorao com PI de clulas no Anexina-V colorao incio da fase exponencial (T4) e no final de fermentao de glucose (T6).

Pela anlise do grfico da Figura 30a, foi possvel observar que durante o processo a, fermentativo a 30C a evoluo do nmero de clulas que deixaram de ter a membrana ntegra, isto que apresentaram marcao simultnea com Anexina V e com PI, foi sempre Anexina-V aumentado progressivamente. Em fase de acelerao de crescimento (T1) observou de observou-se que um nmero muito reduzido de protoplastos se encontrava marcado com Anexina (7%) e Anexina-V com PI (5%), indicando que embora as clulas estejam sob stress osmtico poucas foram as que apresentaram modificaes a nvel membranar, mais especificamente exposio de nvel PS. Em plena em fase exponencial (T2), observa se um ligeiro aumento no nmero de observa-se clulas marcadas com Anexina e co-coloradas com PI (aproximadamente 11%). No inicio Anexina-V coloradas e a meio da fase estacionria (T4 e T5), registaram valores prximos no nmero de clulas T5), marcadas com ambos os marcadores celulares (Anexina V e PI), 17 e 20% (Anexina-V respectivamente, observando se um aumento mais acentuado no final de fermentao de observando-se glucose tendo-se registado que aproximadamente 33% das clulas apresentam exposio se de PS no folheto externo da membrana plasmtica juntamente com marcao com PI, 24h aps o esgotamento de glucose constatou se que 36% das clulas estavam marcadas em constatou-se simultneo com Anexina-V e com PI. Perante as evidncias, sobre marcao das clulas V evidncias, com Anexina-V coincidente com a marcao com PI (Figura 30b), podemos reafirmar a V b), existncia de possveis sobreposies entre fenmenos de apoptose e de necrose, ao longo de fermentaes realizadas a esta temperatura.

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PERSPECTIVAS FUTURAS 4. CONSIDERAES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS

Saccharomyces cerevisiae desde sempre foi a levedura de eleio em estudos fisiolgicos e moleculares. No entanto, a maior parte destes estudos tm sido realizados em estirpes laboratoriais de Saccharomyces cerevisiae e em condies laboratoriais controladas, habitualmente com clulas cultivadas em meio mineral e recolhidas na fase exponencial de crescimento. Durante a fermentao vinria, quer as estirpes quer o contexto em que estas se encontram so significativamente diferentes. Por um lado, enquanto as estirpes laboratoriais so normalmente estirpes haplides e bem caracterizadas fisiolgica e molecularmente, as estirpes habitualmente usadas como starters na vinificao so muitas vezes estirpes diplides ou mesmo poliplides sobre as quais o conhecimento escasso. Por outro lado, enquanto as condies laboratoriais e estado fisiolgico das clulas so definidas, no caso da fermentao vinria a levedura enfrenta uma gama muito variada de condies de stress que se modificam ao longo do processo fermentativo, tais como baixo pH, a presena de agentes antimicrobianos, elevadas osmoralidades iniciais e baixas osmoralidades finais, esgotamento de nutrientes e aumento da concentrao de etanol e o estado fisiolgico das leveduras altera-se profundamente durante o processo [Querol et al., 2003]. Devido a estas diferenas, no possvel extrapolar directamente o conhecimento de estirpes laboratoriais em condies laboratoriais controladas para explicar o desempenho de leveduras comerciais em condies de fermentao do mosto. Por esta razo, no estudo da fisiologia e biologia molecular de Saccharomyces cerevisiae durante a fermentao vinria, dever-se- ter em conta a definio de condies sob as quais as clulas so estudadas, procurando aproximar o mais possvel o estudo em condies laboratoriais da condio real em adega. A elaborao do estudos fisiolgicos e moleculares em estirpes no laboratoriais em condies que simulam tanto quanto possvel as condies reais, como o mosto estril de uva branca, permite tirar ilaes sobre os processos de fermentao industriais, dando uma noo muito mais aproximada do que realmente acontece e permitindo extrapolar os resultados obtidos para a situao real em adega de forma mais fivel, que os resultados obtidos em estudos elaborados em meios laboratoriais controlados com estirpes laboratoriais.

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PERSPECTIVAS FUTURAS Tendo em conta o que foi referido anteriormente, no presente trabalho procurou-se aproximar o mais possvel as condies de trabalho das condies em adega. Assim, foram impostas algumas condies, tais como a utilizao de mosto estril de uva branca previamente sujeito ao mesmo tipo de tratamentos utilizados na preparao do mosto em adega, temperatura constante a 15C ou a 30C (temperaturas nas quais so realizadas as fermentaes de vinhos brancos e tintos, respectivamente), agitao magntica fraca, ausncia de arejamento suplementar e bales rolhados com rolhas de algodo. Utilizou-se como inculo uma estirpe industrial Saccharomyces cerevisiae ISA 1000, isolada a partir de um fermento comercial habitualmente usado na fermentao vnica em Portugal (FERMIVIN). Durante o estudo da fisiologia de ISA 1000 ao longo da curva de fermentao, determinouse o pH intracelular nos pontos definidos para cada temperatura e verificou-se um abaixamento acentuado deste valor em clulas em fase estacionria [C. Prista e T. Viana, comunicao pessoal]. Este facto levou a procurar razes que justificassem o valor observado no final do processo fermentativo, pondo-se a hiptese de este se dever h existncia de um elevado nmero de clulas mortas ou metabolicamente inactivas. Com vista a esclarecer esta questo numa primeira abordagem determinou-se a evoluo do nmero de clulas com capacidade de formar colnias (UFC/ml), nmero de clulas totais e o nmero de clulas metabolicamente activas uma vez nem sempre as clulas metabolicamente activas so capazes de formar colnias. Durante estes ensaios foi possvel constatar que as clulas de S. cerevisiae que se encontravam nas fases finais de fermentao exibiram um comportamento fisiolgico peculiar e diferente do comportamento descrito em estirpes laboratoriais sob a aco de concentraes elevadas de etanol como aquelas que so habitualmente encontradas no vinho, pois no s foram capazes de manter a sua actividade metablica, como apresentaram igualmente capacidade de sobreviver face s condies de stress existentes e caractersticas dessas fases. As leveduras so organismos unicelulares, sendo que todos os seus processos de diferenciao ocorrem a nvel celular. Pouco se sabe como que as leveduras como organismos individuais determinam qual o caminho que vo seguir face s condies de encontradas em fase estacionria. razovel especular que as clulas me envelhecidas [Laun et al., 2001], ou as clulas cronologicamente envelhecidas [Herker et al., 2004], entrem em apoptose para salvaguardar os recursos limitados ou para estimular a sobrevivncia das clulas mais jovens. A idade das clulas pode tambm afectar a meiose [Esposito & Klapholz, 1981]. O estudo realizado por Yang e colaboradores (2006) sugere que a cromatina ou a estrutura dos cromossomas tambm podem desempenhar um papel importante na diferenciao celular em clulas de levedura em fase estacionria [Yang et

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PERSPECTIVAS FUTURAS al., 2006]. Estes autores ainda referiram que, em fase estacionria, clulas em diviso apresentam cromossomas condensados no ncleo, antes da profase meitica, o que pode ser determinante no destino que as clulas podem seguir, se entram em meiose ou num estado quiescente (fase G0), que por sua vez pode levar apoptose [Allen et al., 2006; Aragon et al., 2008; Yang et al., 2006]. Em fase estacionria, a meiose pode ser vista como a melhor forma das clulas escaparem ao esgotamento total de nutrientes, enquanto a apoptose pode ser considerada uma forma das clulas preservarem os recursos limitados para outras clulas [Herker et al., 2004]. Por outro lado, o estado quiescente pode ser visto como um estado reversvel, i.e. se os nutrientes ficarem novamente disponveis no meio as clulas tm a capacidade de sair do estado de quiescncia, no entanto se continuarem em starvation, as clulas quiescentes provavelmente morrem via apoptose [Allen et al., 2006; Yang et al., 2006]. Entre os vrios tipos de fenmenos indicadores de apoptose que podem ocorrer por aco de stresses ambientais como os presentes ao longo da fermentao vinria, destaca-se a fragmentao do DNA e condensao da cromatina [Allen et al., 2006; Katagaki et al. 2007; Ludovico et al., 2001; Madeo et al., 1999; Ribeiro et al., 2006] induzidos por cido actico, stress hiperosmtico, esgotamento de nutrientes e entrada em fase estacionria e elevadas concentraes de etanol; a translocao da fosfatidilserina para o folheto externo da membrana plasmtica [Allen et al., 2006; Katagaki et al. 2007; Ludovico et al., 2001; Madeo et al., 1999] induzido por cido actico, esgotamento de nutrientes e entrada em fase estacionria e elevadas concentraes de etanol; alteraes morfolgicas da mitocndria que podem conduzir libertao de CitC e degradao da mitocndria induzidas por cido actico e etanol [Katagaki et al. 2007; Ludovico et al., 2002]. Para alm da observao destes fenmenos, no caso especfico do etanol, os dados da anlise transcriptmica de clulas sujeitas a concentraes de etanol semelhantes s encontradas no final da fermentao, confirmam a induo de genes que codificam para protenas de defesa contra o stress oxidativo e protenas de resposta geral ao stress [Alexandre et al., 2001; Rossignol et al., 2003]. Adicionalmente aos fenmenos de apoptose, quer o esgotamento de nutrientes quer a presena de cido actico podem induzir fenmenos de necrose [Allen et al., 2006; Ludovico et al., 2001]. Apesar das semelhanas entre os efeitos dos stresses descritos pelos autores acima referidos e os resultados observados no final de fermentao, de realar que no caso da fermentao vinria muitos destes stresses aparecem numa fase muito anterior, pelo que seria de esperar que se observassem processos apoptticos pelo menos a partir da entrada

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PERSPECTIVAS FUTURAS em fase estacionria, quando se observa o esgotamento de nutrientes essenciais e nveis de cido actico e etanol elevados. A no observao de apoptose e/ou a observao de nveis de apoptose significativamente inferiores aos descritos pelos autores anteriormente referidos, poder estar relacionada com dois factores distintos, por um lado, com o facto de neste trabalho se utilizarem condies de cultura muito diferentes das condies laboratoriais por eles utilizadas e por outro com o facto da estirpe estudada ser uma estirpe comercial, seleccionada a partir de leveduras vnicas, que poder apresentar caractersticas de resistncia muito diferentes das estirpes laboratoriais habitualmente utilizadas por estes autores. No sentido de clarificar algumas das questes levantadas no presente trabalho, existem vrios ensaios que podero ser realizados, quer a mais curto quer a mais longo prazo. A curto prazo, dever-se-ia determinar outros marcadores apoptticos, nomeadamente indicadores de integridade/alterao da estrutura das mitocndrias e procurar optimizar um mtodo que permitisse a avaliao da acumulao de ROS em clulas em fase estacionria. A longo prazo seria interessante estudar mais profundamente as clulas em fase estacionria. Em relao a estas clulas, a assumpo de que a maioria das clulas em fase estacionria so clulas quiescentes tem vindo a ser questionada luz dos novos conceitos sobre a apoptose relacionada com envelhecimento cronolgico [Herker et al., 2004]. Para alm disso, podendo a estirpe utilizada ser uma estirpe diplide ou poliplide (facto frequente em estirpes industriais), as suas clulas uma vez sofrendo escassez de um nutriente essencial podero sofrer processos meiticos. Este fenmeno foi j descrito por vrios autores que referem a entrada em meiose por parte de clulas sujeitas a starvation [Simchen & Kassir,1989; Kron & Gow, 1995]. A longo prazo, seria interessante avaliar se durante a fase estacionria a populao de clulas presente corresponder efectivamente a clulas quiescentes (resting cells) ou corresponder a uma populao mais heterognea em que coexistem clulas quiescentes, clulas apoptticas e clulas meiticas, no sentido de esclarecer que clulas efectivamente contribuem para a fermentao do mosto nesta fase e de que forma o fazem. Paralelamente, seria tambm interessante realizar estudos moleculares, com recurso a tcnicas de PCR em Tempo Real no sentido de avaliar a expresso de genes prapoptticos nas clulas recolhidas nas vrias fases da fermentao, de forma a descriminar quais das vrias vias indutoras de apoptose podero estar implicadas na induo da apoptose observada nestas clulas. Para alm disso, e uma vez que em fase estacionria as clulas parecem desenvolver mecanismos que lhes permitem sobreviver e manter-se metabolicamente activas em condies de stress, seria interessante observar o

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PERSPECTIVAS FUTURAS envolvimento de vias de proteco de apoptose, j descritas em mamferos, nomeadamente atravs da avaliao nestas clulas da expresso de genes anti-apoptticos e de genes que codificam para protenas de defesa contra o stress oxidativo e stress pelo etanol que tm sido descritos por vrios autores [Dihn et al., 2009; Teixeira et al., 2009; Zhao & Bai, 2009]. Estes resultados permitiriam a longo prazo a possvel construo de estirpes mais resistentes (por eliminao de genes pr-apoptticos e/ou sobrexpresso de genes antiapoptticos) capazes de realizar a fermentao sem perda parcial da viabilidade e da capacidade metablica o que permitiria fermentaes mais rpidas e mais eficientes. .

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88

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89

ANEXOS

ANEXO I .
Tabela 13: Caractersticas tcnicas da preparao comercial de levedura seca activa para vinificao FERMIVIN

Aplicao

FERMIVIN

uma preparao comercial de levedura que se

responsabiliza pelo processo de fermentao de qualquer tipo de vinho. Cinticas de fermentao Rendimento acar/lcool 16,5 g de acar para 1% lcool. Temperaturas ptimas: 15 35C Caractersticas tcnicas Tolerncia ao lcool: 14% em condies standard e 16% na presena de nutrientes (incluindo azoto). Resistncia ao SO2 livre: 50 mg/L. Baixa produo de espuma. Curta fase de latncia e crescimento rpido.

Qualidades do starter para vinificao

Caractersticas metablicas

Mdia de produo de glicerol: 6 8 g/L. Baixa produo de acidez voltil (< 0,15 g/L). Baixa produo de acetaldedo (< 20 mg/L). Baixa produo de H2S. Baixa produo de SO2 (< 10 mg/L). Baixa produo de lcoois superiores. Degrada parcialmente o cido mlico (20 a 30%), Outras caractersticas estimulando malolctica. Boa capacidade de fermentar mosto clarificado. Fentipo: neutro ao factor killer. o arranque da fermentao

90

ANEXOS ANEXO II Para a preparao do meio K, descrito por van Uden (1967), utilizaram-se as seguintes solues: (a) Meio base:
(NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O 0,50% (p/v) 0,50% (p/v) 0,05% (p/v) 0,015% (p/v)

em 900 mL de gua desmineralizada

Acertou-se o pH do meio a 4,5, utilizando pastilhas de NaOH. Esterilizou-se por autoclavagem (121C, 20 minutos, 1 atm). (b) Soluo de oligoelementos A (Cfinal 0,5 g/L):
H3BO3 KI NaMoO4.2H2O 0,18% (p/v) 0,02% (p/v) 0,04% (p/v)

(c)

Soluo de oligoelementos B (Cfinal 0,5 g/L), pH 3,5:

CuSO4.5H2O FeCl3.6H2O MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O gua desmineralizada q.b. 0,08% (p/v) 0,04% (p/v) 0,08% (p/v) 0,08% (p/v)

(d)

Soluo de vitaminas (Cfinal 0,5 g/L):

Biotina Pantotenato de clcio Mio-inositol Niacina Piridoxina (HCl) Tiamina (HCl) gua desmineralizada q.b. 0,001% (p/v) 0,08% (p/v) 4,00% (p/v) 0,16% (p/v) 0,16% (p/v) 0,16% (p/v)

91

ANEXOS (e) Fonte de carbono e energia (Cfinal 20 g/L):

D(+)-Glucose gua desmineralizada q.b. 20% (p/v)

A soluo de glucose foi preparada numa concentrao 10 vezes superior concentrao final pretendida no meio de cultura (2%). As solues referidas (soluo de glucose, solues de oligoelementos A e B, soluo de vitaminas) foram esterilizadas por filtrao a vcuo com membranas Millipore TYPE GSWP de porosidade 0,22 m. As vrias solues foram misturadas assepticamente para a obteno do meio completo, constitudo por 2% (p/v) glucose, 0,05% (v/v) de oligoelementos A e B e 0,05% (v/v) de vitaminas. Para a preparao do meio necessrio ao crescimento da estirpe auxotrfica Saccharomyces cerevisiae W-303 foi utilizado meio K indicado anteriormente, suplementado com os seguintes compostos (de acordo com as marcas auxotrficas da estirpe):
Histidina Adenina Uracilo Leucina Triptofano 0,08 g/L 0,08 g/L 0,08 g/L 0,16 g/L 0,32 g/L

Os produtos qumicos utilizados pertencem s marcas BDH, Merck e Sigma.

92

ANEXOS ANEXO III Parmetros fsicos do mosto

Tabela 14: Parmetros fsicos do mosto ao longo da fermentao a 15C.

Fase de crescimento Incio de fermentao (T0) Incio de exponencial (T1) Meio de exponencial (T2) Final de exponencial (T3) Incio de estacionria (T4) Meio de estacionria (T5) Final de fermentao (T6) pH Massa volmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)

3,04 2,88 2,87 2,80 2,87 2,97 2,93

1,074 1,061 1,037 1,033 1,036 0,996 0,980

96,50 89,54 81,72 73,46 51,73 2,87 0,03

0,20 1,51 10,02 16,01 35,70 51,25 74,29

Tabela 15: Parmetros fsicos do mosto ao longo da fermentao a 30C.

Fase de crescimento Incio de fermentao (T0) Meio de exponencial (T1) Final de exponencial (T2) Incio de estacionria (T3) Meio de estacionria (T4) Final de fermentao (T5) pH Massa volmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)

2,91 2,87 2,79 2,70 2,75 2,74

1,056 1,060 1,054 1,018 0,995

96,50 83,89 80,41 40,42 4,26 0,05

0,20 1,84 6,45 39,16 43,19 56,44

93

ANEXOS ANEXO IV

Tabela 16: Parmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentao vinria a 15C.
Fase de Tempo crescimento (h) Inc. ferm. 0,0 2,0 7,0 10,0 13,0 17,0 21,3 Inc. exp. 24,0 25,0 27,0 30,0 33,3 36,0 37,3 Meio expo. 41,0 45,3 48,3 49,0 51,0 54,3 59,0 61,0 Final exp. 65,0 69,0 72,0 73,0 75,0 78,2 81,3 84,0 Inc. est. 87,0 93,0 97,0 98,0 104,0 D.O.
640nm

UFC/ mL (x10 ) 0,70 0,69 0,48 0,40 2,97 2,17 8,78 8,53 2,80 3,03 2,30 6,27 2,94 6,60 11,00 44,80 42,00 32,60 45,75 65,00 99,38 67,47 126,83 138,33 143,83 94,40 366,05 108,33 152,25
6

Peso Seco
(mg/mL)

Fase de Tempo crescimento (h) () 108,0 111,0 119,4 122,0 130,4 134,8 143,8 145,8 154,8 165,0 176,0 184,0 191,0 195,0 Meio est. 202,0 208,8 215,1 219,8 226,1 232,4 239,1 243,4 250,1 256,3 263,0 267,3 274,0 280,0 287,3 291,0 299,0 Final ferm. 304,0 311,0 315,0 322,0

D.O.
640nm

UFC/ mL (x10 )
6

Peso Seco
(mg/mL)

0,066 0,057 0,069 0,086 0,098 0,103 0,265 0,366 0,346 0,470 0,875 1,255 1,505 1,330 2,360 3,340 4,960 5,300 5,940 6,040 8,600 8,100 12,000 11,000 9,400 13,000 13,900 12,400 17,800 16,300 14,700 15,400 17,700 16,900

0,25 0,35 0,25 0,26 0,52 0,85 0,61 1,26 2,00 2,53 2,98 3,18 3,18 4,55 5,08 4,95 5,45 6,03 -

18,200 15,500 15,900 19,200 19,400 21,300 21,500 20,200 20,000 18,400 18,800 18,000 20,100 16,900 15,800 17,500 17,300 17,200 18,300 18,200 16,900 17,100 18,000 17,600 16,700 18,100 17,400 16,900 17,300 24,300 17,400 17,300

161,45 108,15 113,00 124,40 149,33 117,92 126,13 128,50 151,38 144,00 112,50 104,53 145,20 117,67 107,70 109,05 125,92 103,92 129,13 117,45 112,78 118,45 107,00 119,00 106,93 102,60 146,50 100,10 129,07 124,33

6,53 5,20 5,33 5,83 5,90 5,95 5,58 6,40 5,65 5,60 4,93 5,50 5,13 5,50 5,70 5,90 5,80 6,40 6,60 5,85 6,50 6,05 6,40 5,80 5,85 6,20 5,50 6,00 5,50 6,00 5,60 5,90 5,05

()

94

ANEXOS
Tabela 17: Parmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentao vinria a 30C.

Fase de Tempo crescimento (h) Inc. ferm. 0,0 1,0 2,0 2,1 3,0 4,0 Meio expo. 5,3 6,0 7,0 8,0 Final exp. 9,1 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,1 17,0 18,0 20,0 21,0 22,0

D.O.
640nm

UFC/ mL (x10 ) 1,02 1,49 0,23 0,12 0,38 1,89 2,29 2,07 6,50 9,73 14,53 17,30 16,40 25,00 23,26 38,04 39,90 60,88 65,33 82,47 87,45
6

Peso Seco
(mg/mL)

Fase de crescimento

Tempo (h)

D.O.
640nm

UFC/ mL (x10 )
6

Peso Seco
(mg/mL)

0,044 0,059 0,085 0,123 0,181 0,307 0,660 1,110 1,670 2,510 4,550 4,030 5,600 5,600 6,500 7,300 8,000 8,300 9,100

0,18 0,22 0,22 0,39 0,77 1,47 2,06 1,95 1,92 2,65 3,53 3,48

()
23,0 Inc. est. 24,0 26,0 28,0 31,0 33,0 35,0 38,2 41,0 42,0 44,0 Meio est. 48,0 49,2 52,0 56,0 59,0 62,0 65,0 68,0 Final ferm. 71,0 73,0 79,0 88,4 99,4 9,400 11,100 11,000 11,500 12,900 12,800 11,900 15,700 14,400 15,600 15,200 15,200 17,200 15,600 16,000 15,100 15,000 16,100 16,400 17,700 14,700 15,200 17,000 15,400 103,57 95,07 75,55 107,68 93,70 107,33 106,60 126,48 124,18 107,70 99,27 126,62 97,28 129,53 100,27 93,42 81,73 96,22 116,67 85,20 67,00 72,07 87,80 4,38 4,35 5,43 5,28 4,50 4,80 5,63 5,55 5,45 5,60 5,50 5,08 4,88

()

95