Propagacin de plantas superiores__________

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OBTENCIN DE PATRONES O PLANTAS COMPLETAS POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS in vitro. Definicin.

La tcnica de cultivo de vegetales in vitro consiste, muy esquemticamente, en el cultivo dirigido de porciones de tejido ( clulas aisladas u otras estructuras, tales como granos de polen, embriones, meristemos, etc. ) en condiciones aspticas y en ambientales controladas. Esto significa que hay que proporcionar al explanto ( estructura o porcin del vegetal que se introduce en los recipientes de cultivo ) objeto del cultivo una serie de condiciones que aseguren el xito de la operacin, entre las que cabe destacar: Un medio de cultivo adecuado, que proporcione a dicho explanto los nutrientes y metabolitos que la planta madre le suministrara. Unas condiciones de aspsia adecuadas, que aseguren la no contaminacin del medio de cultivo durante el cultivo. Unas condiciones ambientales ( temperatura, iluminacin y fotoperiodo ) que promuevan el desarrollo de los explantos. Unas buenas condiciones para la aclimatacin de las plantas obtenidas para su posterior crianza en condiciones ms o menos normales . De todas las fases del cultivo, la menos espectacular pero la ms importante es la ltima, ya que significa el paso de condiciones ms que ptimas a otras ms duras. 5.2 Instalaciones necesarias. Un vivero ( o parte de un vivero ) que se dedique a la obtencin de plantas in vitro suele constar de las siguientes instalaciones: Oficinas, para el control administrativo. Almacn de utensilios y materias primas. Cocina, donde se preparan los medios de cultivo. Sala de siembra. Sala de cultivo. Invernaderos, para la aclimatacin de las plantas. Vamos a describir estas instalaciones y los detalles correspondientes. 5.2.1 Medios de cultivo: Los medios de cultivo se componen de: Sales minerales; macro y microelementos, dosificados en diferentes proporciones, pero siempre asegurando su correcta disolucin y asimilabilidad. Hidratos de Carbono, como fuente de energa, fcilmente asimilable. Se suele usar Sacarosa y/o Glucosa. Vitaminas hidrosolubles, tales como cido Ascrbico, cido Nicotnico, etc. Y otras, como el Sorbitol, de efectos antioxidantes. Hormonas de los grupos Auxna, Giberelinas y Citoquininas. Esta se dosifican en diferentes equilibrios, segn la direccin que queramos en que se desarrolle el cultivo. Concretamente: La Auxina promueve la formacin de callos. Las Giberelinas favorecen el alargamiento de brotes. Las Citoquininas diferencian nuevos brotes. El medio de cultivo se gelifica usando, normalmente, Agar. Estos medios de cultivo se preparan en la cocina, lugar del laboratorio dotada de los elementos necesarios. La preparacin de los medios se hace segn una receta: Dilucin de la sales minerales, a partir de soluciones madre previamente preparadas y conservadas en cmaras frigorficas, con agua bidestilada. Adicin, en fro, de: Hidratos de Carbono, Vitaminas y Hormonas, por este orden. Comprobacin y ajuste, en su caso, del pH del medio, con cido Clorhdrico o Hidrxido Potsico ( 1 N ) hasta alcanzar valores de 5,0-5,5. Calentamiento de las soluciones hasta 45-50 C y adicin del Agar, hasta que desaparece la turbidez. Una vez preparadas, y todava en caliente, se reparte en los recipientes de cultivo, que pueden ser de vidrio o de plstico termoestable. En viveros comerciales se emplean francos de

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vidrio de los usados por la industria conservera mientras que en laboratorios de investigacin es frecuente el uso de tubos de ensayo de vidrio especial. 5.2.2 Condiciones de aspsia: Los medios de cultivo son, adems de idneos para el desarrollo de los explantos, ptimos para el desarrollo de patgenos ( Bacterias y Hongos ), por lo que hay que asegurar su ausencia en el interior de los frascos, en el propio explanto, as como en los utensilios que se emplean en la manipulacin de los mismos. Para resolver este problema se recurre a las siguientes soluciones: Esterilizacin, en autoclave, de los medios de cultivo, una vez entubados. Se suelen utilizar temperaturas de 120-121 C, durante 10-15 minutos. Este calentamiento degrada las vitaminas y hormonas. Cuando es imprescindible el uso de sustancias muy termolbiles, como el AIA, se aaden a los medios de cultivo cuando estn a punto de gelificarse mediante microfiltros microbianos. Desinfeccin del material vegetal: cuando se hacen cultivos sucesivos, procedentes de cultivos anteriores no es preciso desinfectarlos, pero cuando se inicia un cultivo, a partir de plantas cultivadas en condiciones normales ( are libre o invernadero ) es necesario desinfectar la superficie del material ( brotes, por ejemplo ), para lo cual se usa Hipoclorito Clcico o Sdico o Cloruro de Mercurio ( solo para semillas ). Una vez mantenidos durante 15-20 minutos en soluciones de estos productos se lavan tres veces con agua bidestilada previamente esterilizada , para eliminar restos de los mismos. Aspsia durante la manipulacin: con las precauciones anteriormente descritas tendremos tanto en interior de los frascos de cultivo como el material suficientemente limpio. Pero como durante las operaciones de siembra, troceado, repicados, etc. pueden producirse contaminaciones ( procedentes del are, ropas, etc. ) dichas operaciones hay que realizarlas en unas salas especiales ( salas de siembra ) en las cuales: Se realizan desinfecciones peridicas con leja en techos, paredes y suelos. Antes de comenzar el trabajo se desinfectan con tubos fluorescentes de rayos UVA germicidas. El personal utiliza ropas y calzado esterilizado. La manipulacin se realiza en mesas de cultivo de flujo laminar. Los utensilios ( pinzas, escalpelos, etc. ) se esterilizan y flamean antes de ponerse en contacto con los explantos. 5.2.3 Condiciones ambientales: En las cmaras de cultivo, donde se introducen los frascos una vez sembrados, consisten en habitaciones aisladas trmicamente, ms o menos grandes, segn la cantidad de material a cultivar, dotadas de los siguientes elementos: Estanteras para la colocacin de los frascos. Equipo de climatizacin, fro-calor, capaz de mantener durante todo el ao temperaturas del orden de 25 C. Bateras de iluminacin, a base de tubos fluorescentes de luz blanca o del tipo Growth Lux, dispuestos en cantidad, separacin y altura suficientes para asegurar una iluminacin homognea de intensidades entre 2.000 y 4.000 luxes. Programadores para efectuar un fotoperiodo intermitente; normalmente se utilizan ciclos de 16/8 horas de luz-oscuridad. En estas condiciones, un ciclo de cultivo suele durar alrededor de 30 das, durante los cuales los explantos habrn evolucionado y estn en condiciones de iniciar otro nuevo ciclo, debiendo ser repicados a un medio fresco o bien pueden conservarse durante semanas en frigorfico, si no interesa seguir en este momento con el cultivo. 5.2.4 Condiciones para la aclimatacin: Si el paso de las condiciones de cultivo dentro de las cmaras a las de campo no son graduales para que las nuevas plantas se vayan aclimatando poco a poco, las prdidas son elevadsimas y ponen en peligro el xito tcnico y econmico del vivero. Esta aclimatacin supone: Para evitar contaminaciones posteriores a las nuevas plantas se les eliminan los restos del medio de cultivo, lavndolas en agua corriente.

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Se dan tratamientos preventivos contra bacterias y hongos, sumergindolas plantas en soluciones fungicidas y/o con estreptomicina. Se usan substratos esterilizados en autoclave o por medio de vapor de agua. Se utilizan recipientes nuevos que, en el caso de que sean bandejas multipot de plstico termoformado, al haber sido fabricadas en caliente, suelen estar limpias. No obstante, se pueden lavar previamente con leja. El paso de las condiciones de iluminacin en las cmaras de cultivo ( iluminaciones bastante bajas ) a las normales de los climas mediterrneos ( muy altas ) se hace utilizando mallas de sombreo de porcentajes altos ( 80-90 % de sombra ) que se van retirando gradualmente a medida que se avanzando el periodo de endurecimiento. El paso de las condiciones trmicas iniciales a las del interior de un invernadero ( con saltos trmicos diarios importantes ) se consigue con el uso de calefaccin, normalmente basal. Por ltimo, para pasar de las condiciones de humedad del interior de los frascos ( cercanas al 100% ) a las del are ms o menos libre se utilizan tneles de plstico, el cual se va retirando poco a poco, para que las plantas se vayan acostumbrando.

La utilidad de las tcnicas de cultivo in vitro es mltiple. Tan solo citaremos las que pueden resultar de inters prctico en viveros comerciales: Produccin rpida de grandes cantidades de plantas. Existe un parmetro importante, el ndice de multiplicacin, que expresa el nmero de explantos resultantes tras un ciclo de cultivo. Este ndice varia bastante de unas especies y/o variedades a otras, pero en aquellas en que el material responde normalmente suele estar comprendido entre 5 y 15. Si tomamos el ejemplo de un ndice de valor 10 y un periodo de cultivo de un mes, partiendo de un solo explanto ya establecido se obtendra, tras un ao de cultivos, 1012 nuevas plantas, es decir, 1.000.000.000.000, de idntico genotipo ( en principio ) y con igual grado de desarrollo. Si se comparan estas cifras con las correspondientes a cualquier sistema clsico de multiplicacin ( con las cuales se precisaran decenas de aos ), se comprender la ventaja que supone disponer de una tcnica que permite, una vez comprobadas las caractersticas agronmicas de una nueva variedad o patrn, poder introducirla en el mercado en tan poco tiempo. Eliminacin de patgenos no curables: mediante el cultivo de meristemos ( a veces combinando la tcnica con la de la termoterapia ) se pueden obtener ejemplares limpios a partir de plantas contaminadas, por ejemplo, con virus. Esto es posible porque, utilizando porciones muy pequeas de tejidos del meristemo terminal, o alguno de los axilares, de la zona indiferenciada, donde todava no se han formado nuevos vasos conductores, aunque el resto de la planta est contaminada en dicha zona no pueden llegar los virus por falta de comunicacin. Cuando se realizan cultivos con este fin, una vez obtenidas las nuevas plantas hay que comprobar dos puntos fundamentales: Que, efectivamente, se ha conseguido la eliminacin del patgeno. Esto se comprueba mediante test inmunolgicos ( Test E.L.I.S.A. ). Que no se han producido mutaciones que alteren las caractersticas agronmicas de la variedad ( ms frecuentes en cultivo in vitro que en otras tcnicas de propagacin vegetativa ). Para ello hay que comprobar dichas caractersticas antes de poner en el mercado los nuevos ejemplares. Si por suerte las caractersticas producidas por la mutacin ( color de la flor, por ejemplo, en cultivos para flor cortada como el Clavel ) son de inters comercial podrn ser aprovechadas, y registradas como nuevas. Como ejemplos prcticas de aplicaciones de esa tcnica, vamos a detallar tres casos, en los cuales se utiliza la tcnica in vitro de forma muy diferente: RESUMEN Recordar que: Utilizando un medio de cultivo artificial, estril y en un ambiente controlado, se pueden cultivar porciones de tejido vegetal y obtener nuevos ejemplares, en muy poco tiempo y en grandes cantidades. Es imprescindible utilizar el equilibrio hormonal adecuado. La fase de aclimatacin es la ms importante de todas.

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Esta tcnica tambin sirve para eliminar virus de plantas contaminadas. Cuando se trata de eliminar patgenos, hay que comprobar el xito de la operacin con los tests correspondientes.

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