Microbiologa General Esperanza Martnez-Romero Centro de Investigacin sobre Fijacin de Nitrgeno, UNAM. Apdo. postal 565-A. Cuernavaca, Mor.

emartine@cifn.unam.mx Introduccin a los microorganismos La vida en este planeta comenz hace tal vez 4 mil millones de aos con microorganismos y probablemente stos sern los ltimos sobrevivientes. Actualmente, la mayora de los seres vivos son microorganismos(43)y tambin son los ms diversos. Desconocemos la mayor parte de ellos. Los microorganismos habitan hasta en ambientes extremos de temperatura, de pH y presin donde otros seres vivos no pueden vivir, como los hipertermfilos que crecen a 110C(19)o los psicrfilos con temperaturas ptimas de cerca de 15C. Otros como Deinococcus radioduransson altamente resistentes a las radiaciones. Muchos microorganismos son habitantes naturales de otros seres vivos, y en general se localizan dentro de sus cavidades, sobre epitelios o en el lumen de rganos. Dentro de las plantas, se encuentran numerosas bacterias, incluyendo enterobacterias, que no les causan dao. Hay un milln de Escherichia colipor gramo de colon en nuestros intestinos y se estima que en el ser humano existen muchas y variadas clulas de microorganismos. En casos excepcionales los microorganismos se localizan intracelularmente (dentro de clulas) como Rhizobium (simbionte de plantas, no patgeno), Brucella, Rickettsia, micoplasmas (todos stos patgenos). Tambin dentro de algunos hongos de la micorriza, que se asocia a las races de las plantas, se encuentran bacterias intracelularmente, estas bacterias son viables, no cultivables y se consideran simbiontes(2).Nuestras mitocondrias algn da fueron bacterias que entraron a otras clulas cuando surgieron los eucariontes(25,64)y los cloroplastos de algunas plantas tuvieron su origen en cianobacterias. Histricamente la designacin de microbios se bas en el tamao. Los ms pequeos de todos los microbios son los virus. Mientras que las bacterias se pueden ver al microscopio ptico aunque ciertamente se ven mejor con el microscopio electrnico, los virus slo se ven al microscopio electrnico y, si bien hay filtros que retienen a casi todas las bacterias, los virus pasan a travs de ellos. Los virus no se pueden crecer en cajas petri con medio de cultivo, requieren otras clulas eucariontes o procariontes para infectarlas y proliferar dentro de ellas. Los virus de las bacterias se designan bacterifagos. Los virus no tienen citoplasma, ni vas metablicas y no son sensibles a los antibiticos. Es un error mdico frecuente el administrar antibiticos en el caso de infecciones virales. Ciertamente los patgenos han dado muy mala reputacin a los microbios. Algunos microorganismos patgenos han matado ms seres humanos que todas las guerras, y la mortalidad infantil elevada se ha debido en gran medida a enfermedades infecciosas. Los grandes azotes del pasado como la lepra, la peste o el tifo fueron causados por las bacterias Mycobacterium leprae, Yersinia pestis y Rickettsia typhi o prowasekii. Fue en el afn de descubrir los agentes causantes de enfermedades que surgieron los cazadores de microbios en el siglo pasado(35);generaciones de microbilogos se han inspirado en ellos. Los microbios siguen siendo noticia de primera plana, no slo el virus del SIDA, el hantavirus, el Ebola, sino tambin las bacterias devoradoras de carne o las bacterias de la guerra microbiolgica. Existe la sospecha que en la guerra del Golfo Prsico en 1991 se utilizaron bacterias como Brucella. Un tipo de ezquizofrenia en humanos

puede estar ligado al virus Borna transmitido por gatos. Algunos cnceres en humano son causados por bacterias como Helicobacter pylori o por virus como papillomavirus. Las infecciones por el virus papillomavirus son muy comunes en las mujeres en Mxico y se correlacionan con el cncer crvico uterino. Sin embargo, los patgenos no son la mayora de los microorganismos existentes, los ms son inocuos o benficos y necesarios para los ciclos biogeoqumicos. Es a partir de microorganismos que se obtuvieron (y aun se obtienen) los antibiticos que revolucionaron la medicina moderna y el estudio de algunos modelos de entre ellos (vg. Escherichia coli) ha permitido descifrar los mecanismos de la vida. Algunos microorganismos benficos no patgenos como Rhizobiumy gneros relacionados se utilizan como biofertilizantes desde hace 105 aos o como promotores del crecimiento de plantas; otras bacterias sirven como probiticos en la alimentacin humana y animal, en biorremediacin o en la produccin de vitaminas o compuestos farmacuticos. La vitamina B12 slo se sintetiza por microorganismos(14)y la fijacin de nitrgeno, el proceso equivalente a la fotosntesis en el ciclo del nitrgeno, es propiedad exclusiva de bacterias y de un grupo de arqueas(47).Se estima que si se suspendiera el proceso de la fijacin biolgica de nitrgeno todo el nitrgeno de la bisfera regresara a la atmsfera. Las bacterias del suelo junto con hongos degradan y procesan la basura del planeta. Las polimerasas ms ampliamente utilizadas en todos los laboratorios de biologa y microbiologa del mundo para sintetizar fragmentos especficos de ADN in vitro, a partir de cantidades minsculas de este material, en la reaccin de polimerasa en cadena conocida como PCR (por sus siglas en ingls), provienen de bacterias Thermus aquaticus (la polimerasa Taq) o de Pyroccocus woesei, la polimerasa PWO. Los microorganismos tambin han influido la vida del ser humano al ser responsables de la fermentacin de bebidas alcohlicas y de diversos alimentos. Las bacterias ayudan en la germinacin de las semillas. Algunos compuestos tiles como el taxol (anticarcingeno) que originalmente se presuma era de origen vegetal es producido por un hongo asociado ntimamente a la planta(71).Es ms, se ha cuestionado si las llamadas "hormonas vegetales" del tipo citoquininas son realmente producto de la planta o de las bacterias asociadas(29). Los microorganismos en el rbol universal de la vida

Los microorganismos se clasificaron por su aspecto al microscopio, por el tipo de colonias al crecer en medios de cultivo, por los nutrientes que utilizan o por su tincin con colorantes (reactivos como el Gram). Al surgir la bioqumica otros criterios, como la presencia o ausencia de vas biosintticas, el tipo de cidos grasos o de algunas protenas, como ubiquinonas, permitieron reconocer grupos de bacterias(8).Sin embargo la identificacin fenotpica mencionada no permite determinar con certeza el parentesco entre microorganismos, slo entre las ms cercanamente relacionadas. La biologa molecular ha revolucionado nuestra manera de ver a los microorganismos(21),ya desde 1965 Linus Pauling supuso que las molculas contienen la historia evolutiva de los seres vivos(89).As el anlisis y comparacin de secuencias de aminocidos de protenas o la comparacin de las secuencias nucleotdicas

de genes permiten no slo identificar, sino clasificar y establecer las relaciones filogenticas entre organismos o microorganismos(21,64,70). La base del agrupamiento es lgica, organismos ms cercanos tendrn secuencias ms semejantes que los ms lejanamente emparentados. Los catlogos de secuencias del gen del ARN de la subunidad pequea del ribosoma (SSU rARN o 16S en bacterias) obtenidos por Woese y colaboradores son los ms extensos que existen para un solo gen y abarcan todo tipo de organismos excepto virus, que obviamente carecen de estos genes por no poseer una maquinaria propia para la sntesis de protenas; para hacer filogenias de los virus, se requieren las secuencias de genes virales. Cada gen ribosomal consta de aproximadamente 1500 bases o letras (A,T,C,G,) que pueden variar en cada posicin del gen. Cada especie tiene una secuencia propia y caracterstica de este gen. Si las secuencias de estos genes se alinean una tras otra se pueden identificar regiones conservadas y variables. En grupos cercanos de microorganismos se pueden reconocer firmas o regiones caractersticas. El anlisis de la informacin de este gen u otros de un gran nmero de organismos sera imposible sin las computadoras y por ello diferentes algoritmos de agrupamiento se han desarrollado. Finalmente, el resultado de estos anlisis permite generar rboles genealgicos o filogenticos de todos los seres vivos y as con base en la secuencia del SSU rARN, se estableci el rbol de la vida en el que se reconocen tres dominios(86),Bacteria, Archeae y EukaryaFigura 1.Tabla 1 A las Archaeas en un principio se design Arqueobacterias y a las bacterias se les llam en un momento Eubacterias. Los dos primeros dominios estn constituidos slo por microorganismos y en el tercero existen algunos microorganismos pero tambin incluye a todos los seres pluricelulares como el hombre. En algunas Archaeas se han encontrado genes que se asemejan ms a genes de eucaryotes que a genes de bacteria(6). En bacterias, se identifican diferentes grupos, como las bacterias prpuras o Proteobacterias (,, ,), las Gram+, las cianobacterias, flavobacterium/bacteroides entre otras (53).Es de notar que la clasificacin molecular coincide con la clasificacin fenotpica en muchos casos pero no en todos. El rbol universal de la vida (generado a partir de secuencias del ARN de la subunidad pequea del ribosoma) ha sido criticado y su validez cuestionada(55).Esto ha sido porque los rboles filogenticos generados en base a las secuencias de algunas protenas no son similares a ste, con diferencias importantes(42).Sin embargo se ha analizado que en las protenas existe un limitado nmero de sitios filogenticamente significativos, pues son menos conservadas, tal vez por tener menor compromiso estructural excepto en los sitios activos(20).Esto significa que las letras en cada sitio en las protenas varan ampliamente an en grupos limitados, y por tanto, no existe un consenso para un grupo, que sea un buen marcador, para compararlo con el sitio equivalente en otro grupo de microorganismos. Por esto tambin se cuestionan las filogenias basadas en genes de protenas. Por otro lado tambin se ha reconocido que puede existir recombinacin en el gen del ARN ribosomal(17,46)y por tanto una distorsin de la tasa de evolucin de este gen. Tambin se ha observado que en algunas bacterias, en las que existen varias copias de los genes de RNA ribosomales, cada copia puede tener una secuencia diferente(79). Cuando se secuenci el genoma completo de Thermotoga maritima(51)se encontr que parte de su genoma se asemejaba a ciertos microorganismos mientras que otra parte se asemejaba a otros pertenecientes a las Archaeas, que no se encuentran cercanos en el rbol de la vida. De este anlisis surgi la pregunta si un gen (como el 16S ARNr) refleja todo un genoma para describir su historia evolutiva. En rescate del rbol universal de la vida surgi un reporte con un enfoque novedoso donde se comparan los proteomas inferidos de los genomas completamente secuenciados de 20 microorganismos(76).Con base en esta comparacin se gener un rbol semejante al del ARN ribosomal. Tambin los rboles filogenticos obtenidos con el 50% de

las protenas de los genomas que se han secuenciado completamente o con el gene del ARN de la subunidad grande del ribosoma (23S en bacterias) son muy similares al rbol universal de la vida(41).El gen 23S ribosomal es un gen de mayor tamao y por lo tanto con mayor informacin para establecer filogenias. Las filogenias en protozoarios eucariontes o en hongos basadas en genes ribosomales han arrojado luz en cuanto a sus relaciones entre ellos y con otros organismosFigura 2.

En eucariontes, los organelos y sus genes tienen una historia evolutiva diferente del resto del genoma, por lo que son quimeras genticas. En bacterias tambin es muy factible que diferentes partes del genoma tengan diferentes orgenes porque se hayan adquirido por transferencia lateral de genes(49). Diversidad Microbiana Dentro de algunas especies de bacterias, sus individuos difieren mucho unos de otros. Esta gran divergencia se ha explicado al considerar una gran antigedad de estos linajes bacterianos(58),que se supone se han expandido acumulando diferencias. Adems se ha sugerido que la extincin de clonas es menos frecuente que la generacin de diversidad en bacterias(16).Se ha aludido tambin a la recombinacin o el intercambio de informacin gentica entre bacterias para explicar nuevos genotipos, ms diversos. Dentro de algunas especies de bacterias, la distancia gentica es tanta como la que se encuentra entre el hombre y la gallina. Parece que en algunas bacterias, el genoma total de una especie no se encuentra en un solo individuo sino repartido en diferentes individuos o cepas. Esta informacin puede ser transferida de una bacteria a otra (ver ms adelante) y las bacterias que comparten esta poza o reservorio gentico se consideran que pertenecen a una misma genoespecie(32). En otras especies se ha encontrado una diversidad limitada, por ejemplo en patgenos como Brucella abortus, Salmonella typhi, Legionella(45).La limitada diversidad de estas bacterias se ha atribuido a que surgieron ms recientemente cuando aparecieron sus hospederos humanos o mamferos. Se estima que conocemos un nmero muy pequeo de las especies existentes de microorganismos(78)y que no ser posible describir toda su diversidad. Sin embargo el nmero de especies estar en funcin de la definicin de especie y de los lmites que se establezcan entre especies(16). Microoganismos no cultivables El enfoque molecular ha permitido reconocer claramente la existencia de microorganismos "no cultivables"(30,40).De muestras ambientales, de diferentes suelos o del interior de plantas, se puede aislar ADN o en los casos en los que es posible, (como del ocano) se recuperan bacterias de las que se extrae ADN sin pasar por un paso de cultivo. El ADN se usa como molde para la sntesis de los genes ribosomales existentes en la muestra. Esto se logra con una polimerasa y oligonuclotidos dirigidos a las regiones que se encuentran conservadas de los genes ribosomales en todas las bacterias (oligonuclotidos universales). Los fragmentos as sintetizados se clonan en vectores y la secuencia nucleotdica se determina. Esta metodologa se ha optimizado y es posible gracias a que el protocolo de secuencia de nucletidos se volvi simple. Ahora existen secuenciadores automticos o se pueden pagar los servicios de secuencia a compaas especializadas. Las secuencias obtenidas de los genes del ARN ribosomal se comparan con las existentes en

los bancos de datos, hay ms de 5000 existentes de un nmero casi igual de especies bacterianas. Con este enfoque se ha revelado una diversidad que no se detecta con los mtodos de microbiologa tradicional(87). Existen programas para verificar que las secuencias obtenidas de ADN ambientales no sean artefactos o quimeras, hbridos de genes de diferentes microorganismos(34).Si las secuencias no se parecen a la de ningn microorganismo existente en ms de un 97% es posible que se trate de una bacteria nueva, tal vez no cultivada. La secuencia obtenida permite tambin identificar aquellos fragmentos de secuencia exclusivos de ella, esto es que no se encuentran en ninguna otra especie reportada. Fragmentos correspondientes a estas secuencias particulares se sintetizan en mquinas sintetizadoras de oligos, marcados con nucletidos fluorescentes y se utilizan en las muestras originales (del ambiente) para visualizar por microscopa el tipo de bacteria que corresponde a los genes en cuestin, de preferencia en microscopios confocales. El visualizar a las bacterias es un paso hacia su aislamiento, pero el cultivar a muchas de las bacterias que han sido detectadas de este modo no siempre ha sido posible. En ocasiones se ha podido "resucitar" a bacterias como Vibrio de un estado no cultivable y este proceso se inhibe con nutrientes(85),sin embargo recientemente se ha cuestionado la viabilidad de algunos "no cultivables" y tambin la resucitacin de Vibrio(4). Se logr crecer un Bacillus de unas esporas de tal vez 250 millones de aos(81).El encontrar las condiciones para cultivar bacterias no cultivables es un reto para los microbilogos(27). Se ha acordado que a las bacterias "no cultivables" detectadas slo por su secuencia de genes ribosomales se les designe "candidatos". Algunos ejemplos de estas son las bacterias de gran tamao, magnetotcticas acuticas (obtenidas de un lago en Alemania) que se pegan a imanes, designadas "Magnetobacterium bavaricum"(69)o candidatus "Liberobacter" un patgeno de ctricos(31)que es cercano a bacterias simbiontes benficas del gnero Mesorhizobiumque crecen con facilidad en el laboratorio. La posicin filogentica de algunas de estas bacterias no cultivables se sita en ramas aisladas de otros microorganismos en el rbol universal. No slo se han detectado bacterias no cultivables sino tambin hongos, en particular los que forman endomicorrizas asociadas a muchas plantas no se han podido crecer en medios de cultivo. Existen diversas opiniones en torno al problema de no poder cultivar microorganismos de los que se ha documentado su existencia. Se ha pensado que stos pueden requerir nutrientes particulares que slo se encuentran en condiciones naturales. Algunos nutrientes tal vez sean proporcionados por microorganismos asociados. En la naturaleza, es comn encontrar comunidades bacterianas en las que coexisten varias especies y gneros de bacterias. En estas comunidades pueden existir dependencias metablicas complejas. El enfoque de microbiologa tradicional tiene como primer paso el obtener cultivos puros de bacterias y tal vez esto ocasiona que slo se cultive parte de los miembros de la comunidad. Otra posibilidad es que los medios tpicos de crecimiento sean demasiado ricos, an los medios mnimos tienen un exceso de carbono o de nitrgeno o de fsforo, e inhiban el crecimiento de microorganismos que en condiciones naturales, en general, viven precariamente. A este tipo de microorganismos se les ha designado oligtrofos, los microrganismos con comportamiento opuesto que pueden vivir en medio ricos, se designan copitrofos. En hongos y bacterias se han identificado oligtrofos(1,37,83);estos poseen sistemas de transporte de nutrientes de alta afinidad que les permiten tomarlos del medio en concentraciones muy bajas, prcticamente sin nutrientes. As, estos microorganismos pueden crecer sobre vidrio, en agua, en plsticos, tomando las trazas de compuestos voltiles del ambiente. En Pseudomonas, Flavobacterium y en otros gneros se han identificado oligtrofos(83).Las bacterias fijadoras de nitrgeno pueden crecer en ausencia + total de nitrgeno, porque convierten el nitrgeno gaseoso de la atmsfera en NH 4 . Una manera de

identificar fijadores de nitrgeno es por su crecimiento en medios libres de tal elemento, sin embargo en estas condiciones tambin se aslan falsos positivas que son bacterias oligtrofas que toman el amonio de la atmsfera pero no fijan nitrgeno. Se ha calculado que en los laboratorios y hospitales existen concentraciones de amonio suficientes para mantener el crecimiento de oligtrofos. Tal vez debieran considerarse oligtrofos en biorremediacin, ya que un problema que se ha observado con algunas bacterias es que una vez que los contaminantes alcanzan concentraciones bajas, las bacterias ya no los toman ni los degradan. Los oligtrofos con alta afinidad tal vez pudieran participar para finalizar la limpieza Intercambio de informacin gentica entre organismos Existen bacterias naturalmente competentes, que toman ADN del medio. El tomar ADN exgeno (transformacin) puede tener como consecuencia una alta tasa de recombinacin gentica. Este tipo de comportamiento gentico se ha designado panmtico que es el extremo opuesto del comportamiento clonal. Este ltimo se refiere a aquellas bacterias que se mantienen como clonas o duplicados exactos de sus progenitores y que no adquieren o intercambian informacin gentica con otras bacterias. Se piensa que la mayora de las bacterias se comportan entre los dos extremos, lo que significa que intercambian en cierta medida informacin gentica(48). Por conjugacin (sexo entre las bacterias) se transfieren fragmentos de cromosomas(67)o plsmidos entre microbios relacionados(52)Figura 3Animacin 1.

Estos fragmentos, por recombinacin homloga con el ADN residente en el receptor, generan nuevas secuencias si ambas no son idnticas. Cuando se analizaron con cuidado las secuencias de un gen de varias cepas de E. coli se encontr que este gen pareca un mosaico de pequeos fragmentos, sugiriendo recombinacin frecuente, sin embargo en general se considera E. coli como una bacteria clonal. Las tasas de recombinacin homloga dependen de la similitud entre las secuencias y disminuyen considerablemente si los ADNs difieren ms del 10%(82),sin embargo en cepas con mutaciones en genes de recombinacin, puede ocurrir recombinacin aun cuando el porcentaje de diferencia entre ADNs sea ms alto (incluso hasta un 20%). Plsmidos, fagos e islas genmicas, son mediadores de la transferencia lateral, se movilizan hasta gneros y especies distantemente relacionados(52).Los plsmidos se han considerado como elementos accesorios de las bacterias y esto es porque en general, si se eliminan los plsmidos, las bacterias pueden sobrevivir. Sin embargo, en otras bacterias, la prdida de plsmidos (curacin) conlleva prdida de la viabilidad de la bacteria o de su capacidad para crecer(23). Algunos plsmidos bacterianos se hicieron famosos porque acarrean y dispersan genes de resistencia a antibiticos, lo que ha ocurrido ms frecuentemente con el uso extensivo de antibiticos. Estos plsmidos son conjugativos y se transfieren fcilmente entre bacterias. A estos plsmidos pueden brincar elementos transponibles del genoma llamados transposones que lleven resistencias adicionales y de esta manera se han generado plsmidos con resistencia a mltiples antibiticos(75).Estos genes de resistencia a antibiticos codifican para enzimas que degradan o inactivan a los antibiticos al modificarlos.

En aos recientes se ha reconocido un nuevo mecanismo de resistencia a mltiples antibiticos(39).En las bacterias que poseen este mecanismo existen bombas o transportadores que eliminan al exterior de las bacterias los antibiticos y as stos no ejercen sus efectos dentro de las bacterias. Los genes involucrados que codifican para estas bombas de extrusin en general se localizan en cromosoma, la excepcin es una bomba en una bacteria benfica de plantas (Rhizobium etli) que le confiere resistencia a los compuestos antimicrobianos (fitoalexinas) de las plantas y que est codificada en un plsmido(24) Figura 4. Como no es factible reconocer un evento de transferencia gentica en la naturaleza en el momento que ocurre, se deduce su existencia de diferentes maneras. Cuando un gen o un grupo de genes tienen un contenido de GC muy diferente al del resto del genoma se ha propuesto que este gen o genes provienen de otro microorganismo. Este tambin sera el caso, si por la secuencia de un gen se reconoce un parentesco con bacterias alejadas a la bacteria en la que se encuentra el gen. Esto se correlaciona con que filogenia del gen transferido es incongruente con las filogenias de otros marcadores como los genes ribosomales. La existencia de elementos asociados con transposicin o vestigios de fagos tambin sugieren transferencia lateral. De E. coli se han estudiado un vasto nmero de cepas de todo el mundo mediante la movilidad de sus enzimas en geles(62,68).En esta metodologa el extracto celular de la bacteria se coloca en un extremo del gel y se hace migrar dentro del mismo mediante electricidad. Las protenas ms pequeas migran ms rpido y las variantes de cada enzima se distinguen como bandas diferentes al revelar su actividad con reactivos coloridos. Algunas enzimas tienen la misma movilidad, en todas las cepas de E. coli por lo que se designan enzimas monomrficas (una sola forma de enzima). La enzima ms variable (polimrfica) fue la fosfogluconato deshidrogenasa que vara casi de cepa a cepa. El gen responsable que codifica para esta enzima fue clonado y secuenciado de varias cepas(3)y se encontr que este gene se encuentra contiguo a genes de lipopolisacridos (LPS). En bacterias los genes de LPS son hipervariables. Esta gran variabilidad de los LPS y la del gen gndque codifica para la fosfogluconato deshidrogenasa pueden explicarse por recombinacin de genes de diferentes cepas. La variacin en los genes de LPS permite a las bacterias evadir los anticuerpos del hospedero. Los fagos en suelo se han propuesto como los mediadores principales de la transferencia de informacin gentica entre bacterias y los virus se han propuesto como mediadores de informacin gentica entre otros organismos(60).Sin embargo, a pesar de que existen fagos transductantes, la evidencia de que esta transferencia se de en la naturaleza no es contundente. En el laboratorio existe la transduccin generalizada o especfica. En el primer caso, en los fagos se encapsulan fragmentos del genoma de la bacteria sustituyendo al material gentico del virus y ste al entrar a otra bacteria transfiere una parte del genoma de la bacteria que haba infectado previamente. En el segundo caso los fagos que se insertan en sitios preferenciales del genoma al salir de la bacteria, si se escinden de manera imperfecta, se llevan parte del genoma bacteriano en el que se encontraban integrados. Estos fagos al entrar a otra bacteria le proveern de material gentico nuevo. En Nueva Zelanda se introdujeron al suelo bacterias benficas que forman ndulos fijadores de nitrgeno en las races de las plantas. En el suelo no existan bacterias capaces de formar ndulos. Al recuperar las cepas de los ndulos de las plantas se encontr un hallazgo interesante, las bacterias no eran las que se haban introducido, eran bacterias del suelo a las que se les haba transferido la informacin gentica para nodular y fijar nitrgeno de la bacteria introducida(72,73).La informacin gentica transferida fue un fragmento del cromosoma que se designa "isla de simbiosis". En patgenos se han descrito "islas de patogenicidad" que

tambin se transfieren entre bacterias. La isla de simbiosis se encuentra bordeada por un sitio de insercin de fago pero no se ha involucrado al fago en la transferencia. En Mxico, se domestic el frijol y su bacteria asociada (Rhizobium etli), que seguramente coevolucion con l. El frijol fue introducido a Europa despus de la conquista de Mxico y pensamos que en las semillas se llev a la bacteria(56).Sin embargo slo en ciertos sitios la bacteria permaneci y en otros creemos que el plsmido simbitico se transfiri a las bacterias residentes. En estos casos el plsmido es muy semejante y el fondo gentico es diferente. En Rhizobium, la informacin para simbiosis se encuentra en plsmidos mientras que en las bacterias relacionadas como Mesorhizobium del caso anterior de Nueva Zelanda o Bradyrhizobium, esta informacin se localiza en el cromosoma. De Rhizobium se pueden transferir los plsmidos simbiticos a Agrobacterium convirtiendo as a un patgeno en simbionte(44). Existe un caso extraordinario de transferencia de material gentico de bacterias a plantas. Las bacterias son del gnero Agrobacterium recientemente reclasificados como gnero Rhizobium por el gran parentesco entre ambos(88).Las plantas receptoras son un gran nmero de dicotiledonas y el mecanismo es semejante al que usa la bacteria en conjugacin con otra bacteria. Este proceso natural se ha aprovechado en la generacin de plantas transgnicas y por tanto ha sido estudiado en gran detalle. Cuando la bacteria entra en contacto con la planta, productos de sta ltima son seales que la bacteria reconoce y se activa la expresin de genes bacterianos de virulencia. Estos genes codifican para una especie de tubo (por el que se transfiere el ADN y protenas asociadas) que conectar a la bacteria con la clula de la planta. Los genes de virulencia y el ADN que se transfiere se encuentran localizados en un plsmido de tumorognesis Fig 5 Animacin 2.

Un fragmento del ADN transferido conocido como T-DNA o R-DNA, dependiendo del tipo de cepa del que provenga, se integra en el genoma de las plantas en sitios no especficos. Este fragmento porta genes que se expresan en plantas y que codifican para enzimas que sintetizan fitohormonas (auxinas y citocininas) y derivados de aminocidos (opinas). Las clulas vegetales empiezan a proliferar por el efecto de las hormonas y producen opinas que las bacterias en cuestin, pero no otras, pueden utilizar para su crecimiento. Este proceso culmina en la formacin de tumores o proliferacin de races, en las plantas. Si se eliminan los genes de fitohormonas y de opinas y en su lugar se colocan genes de inters, por ejemplo de resistencia a condiciones adversas o que produzcan bio-insecticidas u otros compuestos, stos se integrarn por el mecanismo descrito al ADN de la planta y no ocasionarn la aparicin de tumores sino efectos benficos en las plantas, de este modo se construyen las plantas transgnicas. El mismo proceso tambin puede ser utilizado de manera diferente en el estudio de plantas al provocar mutaciones, si el T-ADN o el R-ADN se integra en una secuencia de inters. Esto provocara una mutante con un elemento insertado al que se le pudo integrar previamente un gen reportero (que produzca un color o una fluorescencia). El contar con un inserto (etiqueta conocida como Tag en ingls) permite la identificacin del gen mutado y su anlisis.

Se ha facilitado enormemente el estudio y existe un mayor conocimiento de las bacterias en las que se puede mutagenizar con fragmentos que transponen en el ADN, denominados transposones (semejante al caso anterior descritos para plantas). En bacterias, la mutagnesis al azar (en realidad no es tan al azar como se cree, pues hay algunos sitios preferenciales y otros refractarios) se realiza al transferir un plsmido suicida de una bacteria (e.g. E. coli) a otra en conjugacin. El plsmido transferido, al no poder replicarse se pierde, pero el transposn se puede movilizar. Si el transposn se transfiere a cualquier parte del genoma de la bacteria receptora, se mantendr la resistencia que codifica; si se inserta en un gen, provocar una mutacin. As se pueden seleccionar mutantes de la bacteria receptora en diferentes genes y construir bancos de mutantes. Otra manera de generar mutantes en bacterias es introduciendo genes de resistencia o genes reporteros (conocidos como cassettes) en sitios especficos en secuencias de inters. De esta manera al abolir su funcin se puede tratar de entender para qu sirve ese gene. Los genomas de los microbios Se conocen las secuencias completas o casi completas de los genomas de ms de 100 microorganismos entre los que destacan Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma genitalium, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Rickettsia prowazekii, cianobacterias como Synechocystis sp. y Nostoc, la arquea Methanobacterium thermoautotrophicum y la levadura Saccharomyces cerevisiae. Existen en curso proyectos genmicos en ms de un centenar de microorganismos y este nmero parece estar en aumento. Tambin se han reportado secuencias de muchos plsmidos y virus. Se ha publicado la secuencia de una bacteria no cultivable, Buchnera sp. que es un endosimbionte obligado de fidos(66).Buchnera es una bacteria relacionada con E. coli y con Haemophilus influenzae, pero con un genoma muy reducido que parecera un subconjunto del genoma de E. coli y se piensa que se trata de evolucin de reduccin del genoma. En Buchneraslo hay dos genes para la sntesis de lipopolisacridos; no hay genes para la sntesis de aminocidos no esenciales, ni fosfolpidos; slo hay genes para dos enzimas del ciclo de Krebs y no hay gen de recA. Esta capacidad biosinttica tan reducida explica que no se pueda cultivar en medios de cultivo y que dependa de su hospedero para crecer y estar protegidos. En otros casos la determinacin de la secuencia genmica de otros microorganismos no cultivables podra explicar por qu no se pueden cultivar. En las anotaciones de los genomas se agrupan los genes por funciones, sin embargo un porcentaje muy alto de los genes potenciales (ORFs) no se parecen a nada reportado(7,12y otros muchos), lo que indica que existe un gran campo de exploracin en microbiologa y el lmite es la capacidad del investigador para imaginar funciones de los microorganismos codificadas por estos ORFs. Los microorganismos como modelos en evolucin experimental Por sus tiempos de generacin de algunas horas, los microorganismos tanto virus(28)como bacterias constituyen modelos con los que se pueden realizar experimentos de evolucin experimental. Se ha utilizado Escherichia coli (18,38)y Myxococcus xanthus(80)y se piensa que la levadura Saccharomyces cereviceae, sera un buen modelo. En E. coli se han seguido hasta 20 000 generaciones (que equivalen a 500 000 aos en generaciones de humanos, si se consideran 4 generaciones en 100 aos) a partir de cultivos de una clula progenitora y se han seleccionado variantes ms adaptadas que la cepa original a las condiciones

de medios definidos. Los resultados ms sobresalientes son que los linajes siguen caminos evolutivos diferentes; esto es, en cada cultivo ocurren diferentes mutaciones para adaptarse al mismo medio. Estos cambios ocurren despus de pocas generaciones y se ven propiciados porque primero mutan genes "mutadores" lo que ocasiona mayor tasa de cambio(54).En M. xanthusse ha contraseleccionado la informacin gentica para formar agregados y cuerpos fructferos al crecer a estas bacterias continuamente en medios con agitacin que favorecen a las clulas independientes(80). Se ha considerado que no hay evolucin sin transferencia lateral de informacin gentica(13)y este factor no ha sido incluido en los experimentos reportados. Agregados de microorganismos En una colonia a partir de una sola bacteria se pueden distinguir sectores y diferentes estados metablicos(65).En la naturaleza los microorganismos frecuentemente existen como biopelculas(50,59,61)y matas. Lo ms notable es que las biopelculas son muy resistentes a antibiticos y que ocasionan graves problemas mdicos. Dentro de las biopelculas existen flujos o canales de nutrientes, gradientes de oxgeno y estratos de bacterias. Los exopolisacridos de las bacterias juegan un papel importante en la formacin de las biopelculas. Es comn que estos agregados no estn constituidos slo por una especie microbiana. Obviamente los consorcios de diferentes especies bacterianas son ms complejos. Mtodos espectroqumicos, electroqumicos y microscopa confocal se estn utilizando en el estudio de los biofilms(36,50). Perspectivas de investigacin en microbiologa Existen cazadores de microbios modernos que en ambientes exticos, por ejemplo en un mercado en Colombia de una lagaa de un perro callejero, aslan bacterias nuevas, no descritas. Si consideramos que se desconoce ms del 95% de las bacterias, el describir bacterias nuevas parecera una actividad sin fin. Cules son los lmites de esta actividad? Cules son las bacterias que el ser humano deber conocer? Hay microorganismos en extincin? Se estn gestando microbios patgenos en el ambiente con los cambios climticos? Se ha dicho que en un gramo de suelo existe una riqueza enorme de microorganismos(26,57)y tal vez algunos pudieran resolver problemas del ser humano. Cmo identificar y cultivar este microorganismo? Cmo preservar su existencia hasta que alguien lo analice? Desconocemos los efectos que la actividad humana tiene sobre los microorganismos. La devastacin de selvas y bosques seguramente tienen efectos drsticos sobre los microbios. Las comunidades de bacterias son diferentes en un sitio cultivado y un sitio de la selva en el Amazonas(5).Los fertilizantes qumicos alteran las poblaciones de bacterias fijadoras de nitrgeno(9)y el uso de antibiticos ha favorecido la proliferacin de las resistentes. En un enfoque muy diferente, compaas farmacuticas y otros investigadores han emprendido la cacera de genes del ambiente(11).Aqu no importa el microorganismo del que provenga el gen. La meta es expresarlo en alguna bacteria conocida y obtener un producto novedoso que pueda probarse como frmaco, insecticida o promotor del crecimiento. Esta tarea parece titnica pero factible. La secuenciacin de genomas completos ha mostrado la existencia de enormes cantidades de genes potenciales (marcos abiertos de lectura, ORFs en ingls) cuya funcin se desconoce(7,12y otros muchos). Una manera de avanzar hacia descifrar su funcin es eliminarla de las clulas por mutacin. Podemos prever

que el futuro de la investigacin en microbiologa requerir de la generacin de un enorme nmero de mutantes en muchos ORFs de diferentes especies Por otro lado, existe una metodologa nueva, an en fase de estandarizacin, que permite reconocer todos los genes u ORFs que se expresan concertadamente en una condicin ambiental, de nutrientes, o de temperatura. En su fase ms sofisticada, un robot coloca en una laminilla de vidrio, de las utilizadas en los microscopios pticos, gotas con cantidades minsculas de los productos de PCR de cada uno de los genes u ORFs de un organismo. La placa se utiliza para hibridar con el ADN complementario (ADNc) sintetizado del ARN mensajero de bacterias de diferentes condiciones definidas. Estas condiciones pueden ser diferentes fases del crecimiento, fase exponencial versus fase estacionaria(33),medio rico versus medio mnimo(74)presencia o ausencia de diferentes nutrientes, o de otras clulas, diferente pH u osmolaridad. Los ADNc de cada condicin se sintetizan con precursores fluorescentes de diferente color. Los colores en cada gen u ORF permiten reconocer si este gen se expresa en ambas condiciones en las que se creci la bacteria o slo en una de ellas. En algunos casos el problema que se ha encontrado es la falta de reproductividad sobre todo en los genes en que su expresin se induce slo unas cuantas veces arriba del control. A este anlisis se le ha llamado microarreglos (microarrays en ingls). Los macroarreglos se pueden preparar manualmente en filtros con fragmentos de PCR de cada ORF o gen. Diferentes filtros se hibridan con cDNA marcado de cada condiciones. Todos los ORFs marcados son los que se encuentran sus ARN mensajeros en un momento dado. Se propone que estos enfoques, junto con otros como hibridacin substractiva despliegue o (display) diferencial, ayudarn a definir funciones en genes desconocidos. Otro enfoque ingenioso con perspectivas a futuro es de la "evolucin in vitro". Aqu se mezclan genes de diferentes vas inclusive de vas metablicas no relacionadas y tambin se pueden incluir genes mutados al azar o por recombinacin. El objetivo es obtener sntesis de enzimas, protenas, compuestos novedosos y esta estrategia ya se ha utilizado con xito en la sntesis de nuevos carotenoides(63).Mediante manipulaciones genticas ms tradicionales de ingeniera gentica se han logrado microorganismos sobreproductores de diferentes compuestos. Hay bacterias que producen cantidades prodigiosas de riboflavina (vitamina B2), hasta 5 g por litro(14)o se ha cambiado la especificidad de una enzima en otra, una lactato deshidrogenasa se convirti en malato deshidrogenasa(84). En microbiologa, como en toda la biologa, se han seleccionado modelos de estudio(22)y algunos de stos se han analizado con gran profundidad. Esto se ve reflejado en el nmero de publicaciones por microorganismo(22) Figura 6. Por ejemplo, E. coli es la bacteria en la que ms investigacin se hace y entre los hongos ms estudiados se encuentra Saccharomyces. Sin embargo, una vez que se detecta un microorganismo de inters se puede avanzar muy rpido en su conocimiento basado en lo que se sabe en otros microorganismos. Esto ha sido el caso del virus del SIDA y en Helicobacter pylori. De este ltimo por su importancia mdica se secuenciaron dos cepas(15,77),se han secuenciado las islas de patogenicidad de muchas cepas y se han implementado experimentos de citoxicidad en diferentes lneas celulares de humano. En microbiologa parecen vlidos los enfoques extensivos que iluminan sobre la diversidad y abren nuevos horizontes y los intensivos sobre un microorganismo en particular. Es de notar que de un alto porcentaje de gneros bacterianos no se publica prcticamente ningn artculo. La identificacin de los organismos causantes de brotes infecciosos es posible gracias al uso de tcnicas moleculares que permiten rastrear, a manera de detectives, la fuente de la contaminacin. As por ejemplo muy recientemente, las diarreas de unas pocas personas en ciudades alejadas en EE.UU. se atribuyeron a

que el perejil que fue adquirido por algunos restaurantes llevaba Shigella sonneipor haber sido regado con agua contaminada. La rapidez en la deteccin evit que otras personas enfermasen, se estima que si se hubiera podido realizar este tipo de rastreo en aos anteriores, como en 1993, se hubieran podido prevenir algunos de los decesos causados por las E. coli enteropatgenas de las hamburguesas(10). Los esfuerzos de la investigacin en microbiologa no han sido en vano, del conocimiento se han desprendido las herramientas para combatirlos y tambin para utilizarlos. Qu no se podra lograr si supiramos ms!

El Ultimo Ancestro Comn Antonio Lazcano Araujo

Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, E-mail: alar@hp.fciencias.unam.mx

1. Introduccin Aunque Charles Darwin afirm en 1859 "es probable que todos los seres vivos que hay en la Tierra desciendan de un mismo ancestro", no di muchos detalles sobre cules podran ser las caractersticas de ese ancestro cuya existencia era necesario reconocer como parte de su esquema evolutivo. Uno de los primeros en emprender esta tarea fue Ernst Haeckel, un naturalista alemn cuya devocin por la obra de Darwin corra paralela a su preocupacin por romper con el esquema taxonmico tradicional que divida a los seres vivos en plantas y animales. Convencido de que los microorganismos formaban un grupo aparte de donde haban surgido tanto el Reino Animal como el Vegetal, Haeckel no slo formaliz en 1866 su propuesta de un tercer reino, el de los Protista (cuyas fronteras, hay que decirlo, modific varias veces a lo largo de su carrera, pero siempre dejando dentro a las bacterias) sino que tambin afirm que los ancestros de plantas y animales haban sido microorganismos como las euglenas, pequeos protistas que en presencia de la luz llevan a cabo la fotosntesis y en la obscuridad son hetertrofas (Figura 1); es decir, se comportan a veces como plantas, a veces como animales. No fue sino hasta 1925 cuando Edouard Chatton, un microbiolgo francs que una a su profundo conocimiento de los protistas una sensibilidad considerable hacia los estudios de la bioqumica, comenz a hablar de las bacterias y cianobacterias como grupo particular de microorganismos, al que llam protistas procariontes, y que separ de las algas, los protistas y los hongos, a los que bautiz como protistas eucariontes. Atrs de la nomenclatura que propuso Chatton, que muy pronto se simplific, subyaca una barrera biolgica mucho mas profunda que la que separa a las plantas de los animales o a los microbios de los organismos visibles a simple vista: los procariontes, que se definen como aqullos organismos que carecen de ncleo, y los eucariontes, que presentan al menos una membrana nuclear bien definida (Figura 2) (Margulis y Schwartz, 1985). De donde surgieron las dos clases de organismos? Al igual que Haeckel, muchos bilogos suponan que los procariontes eran los organismos ms antiguos, pero no fue sino hasta 1967 cuando Lynn Margulis propuso que las clulas eucariontes eran en realidad minsculas comunidades microbianas que haban resultado de una serie de eventos endosimbiticos, es decir, que las clulas nucleadas haban sido precedidas por procariontes que luego se asociaron simbiticamente. Aunque la idea de que mitocondrias y cloroplastos eran descendientes de bacterias de vida libre haba circulado en algunos medios cientficos desde finales del siglo XIX, Margulis (1993) no slo revivi en forma independiente la teora endosimbitica, sino que la articul y apoy con una serie de evidencias morfolgicas, bioqumicas, genticas e incluso geolgicas tan contundentes, que sus puntos de vista terminaron por ser aceptados incluso por sus crticos mas severos. Cuando Margulis propuso por primera vez su teora endosimbitica no estaba clara la naturaleza biolgica del hospedero que haba alojado a las las bacterias que luego se convirtieron en mitocondrias, cloroplastos y undulipodia, es decir, no se tena una idea precisa sobre el origen del nucleocitoplasma. Los micoplasma, que son parsitos que carecen de pared celular, parecan ser buenos candidatos, debido a que su metabolismo es estrictamente fermentativo (como es el del citoplasma eucarionte), ya que la ausencia de pared hubiera facilitado el ingreso de los endosimbiontes. La idea de la endosimbiosis fue ganando cada vez ms adeptos, y muy pronto se

convirti en una de las bases de la clasificacin de los seres vivos en cinco grandes reinos. As, a pesar de que para entonces era cada vez ms evidente la existencia de algunas diferencias en los procesos de replicacin y expresin gentica entre los procariontes y los eucariontes, hacia mediados de la dcada de los 1970's la mayora de los bilogos pensaban que todos los componentes de las clulas nucleadas provenan de un mismo linaje bacteriano (Figura 3). Como veremos mas adelante, el estudio de la estructura y evolucin de los ribosomas cambi radicalmente sta situacin, abriendo un debate cuyo final no es fcil adivinar. II. Los grandes linajes celulares En 1904 George H. F. Nutall, un destacado fisilogo britnico de origen estadounidense public un libro en donde resuma aos de trabajo durante los cuales haba comparado las reacciones inmunolgicas entre los sueros sanguneos de distintas especies animales, con el propsito de construir rboles evolutivos basados no en informacin paleontolgica o anatmica sino molecular. Sin embargo, no fue sino hasta 1965 cuando Emile Zuckerkandl y Linus Pauling publicaron un trabajo en donde describan con todo cuidado como la comparacin de secuencias de aminocidos o de nucletidos permita no slo la construccin de filogenias moleculares, sino tambin datar los procesos de especiacin incluso en ausencia de informacin paleontolgica. Durante cerca de diez aos este enfoque permiti no solamente comparar protenas como las hemoglobinas, el citocromo C, las ferrodoxinas y otras ms, sino tambin construir rboles evolutivos que podan incluir organismos tan distintos entre s como las bacterias, los hongos y los mamferos marinos, lo cual hubiera sido imposible con los criterios morfolgicos tradicionales. En 1977 Carl R. Woese y algunos de sus colaboradores de la Universidad de Illinois, en los EEUU, publicaron un trabajo que resuma el resultado de las comparaciones de fragmentos del ARN de la subunidad pequea de los ribosomas de diez especies de metangenas, pequeos procariontes estrictamente anaerobios y sin citocromos que, como su nombre lo indica, liberan metano como resultado de un proceso quimiosinttico que les permite formar compuestos orgnicos a partir de dixido de carbono. Al fragmentar el ARN ribosomal de las metangenas con enzimas que partan la molecula y comparar los trozos resultantes con los de Bacillus, enterobacterias, y cianobacterias (que son tres tipos de bacterias bastante distantes entre s) el grupo de Woese descubri, para su sorpresa, que la distancia evolutiva entre estos tres grupos de bacterias era mnima respecto a la que las separaba del conjunto de las metangenas. Es decir, la comparacin de los fragmentos del ARN ribosomal permita deducir la existencia de una divergencia biolgica extraordinariamente antigua que divida a los procariontes en dos grupos alejados entre s. Pocos meses mas tarde Woese y George E. Fox, otro de sus colaboradores, publicaron un trabajo adicional que no slo confirmaba los resultados anteriores, sino que mostraba tambin como la comparacin de los ARN ribosomales de distintos eucariontes (conocidos como ARNr 18s, por sus dimensiones) con los del ARNr 16S de las metangenas, por una parte, y bacterias como Escherichia coli y Bacillus firmus por otra (Figura 4). Es decir, la comparacin de los fragmentos del ARNr 16/18S mostraba que los organismos estudiados, lejos de dividirse en plantas y animales o en procariontes y eucariontes, en realidad se agrupaban en tres grandes linajes o reinos primarios que divergan de un ancestro comn (Woese y Fox, 1977). Qu ocurri durante la historia temprana de la vida, que llev a la separacin de los seres vivos en stos tres grandes lneas evolutivas? Cmo conciliar stos rboles evolutivos con los esquemas taxonmicos tradicionales? Cul era la naturaleza de los ancestros de estos tres grandes grupos de organismos? Cando y dnde vivieron stos ancestros? III. La bsqueda del progenote Aunque al principio la mayora de los microbilogos pareci no prestar atencin a los resultados obtenidos por el grupo de Woese, ste comenz a estudiar otros procariontes extremfilos, como las halfilas, que viven en medios aerobios de una enorme salinidad, y otros como Sulfolobus y

Thermoplasma, que viven a temperaturas elevadas y condiciones muy cidas. El anlisis del ARN
ribosomal, que para entonces ya se poda llevar a cabo comparando con precisin y rapidez todos y cada uno de los monmeros que forman stas molculas, mostr que ambos grupos pertenecan al mismo linaje que las metangenas (que fue bautizado como el grupo de las arqueobacterias, para distinguirlas de las procariontes con los que estamos familiarizados, o eubacterias) lo que vino a reforzar la hiptesis de que los seres vivos estaban divididos en tres grandes reinos primarios que haban divergido en pocas muy tempranas. Como argumentaron Woese y Fox desde 1977, es evidente que aunque los tres linajes celulares estn separados por una enorme distancia evolutiva, todos ellos provienen de un ancestro comn -pero la existencia de diferencias nada desdeables, por ejemplo, en las modificaciones que sufren las bases de los ARNr y ARNt en cada uno de estos tres linajes les llev a sugerir que el ancestro comn era una entidad mucho mas simple que cualquier procarionte actual, en donde operaba una versin an rudimentaria de la expresin de la informacin gentica. Es decir, Woese y Fox supusieron que en el punto la trifurcacin de los tres linajes celulares haba existido una entidad biolgica hipottica a la que llamaron progenote y en la cual, a diferencia de lo que ocurre con los organismos contemporneos, la separacin evolutiva entre genotipo y fenotipo an no se haba completado del todo. No era fcil aceptar sta idea. Es evidente que los organismos contemporneos debieron haber sido precedidos por sistemas mucho ms simples, pero la probabilidad de que el ltimo ancestro comn de las eubacteria, las arqueobacterias y el nucleocitoplasma de los eucariontes fuera un progenote resultaba difcil de conciliar con la complejidad de los procesos moleculares bsicos de cada uno de los linajes. Por otro lado, aunque se pueden proponer esquemas evolutivos que conduzcan a la separacin simultnea de tres o mas linajes, los eventos de especiacin suelen ser dicotmicos, es decir, de un grupo ancestral se derivan dos. Por ltimo, el grupo de Wolfram Zillig, un bilogo molecular alemn, demostr mediante reacciones inmunolgicas cruzadas no slo que las ARN polimerasas de los eucariontes eran mas parecidas en nmero y estructura a las de las arqueobacterias, que cualquiera de ellas a la de las eubacterias. Ello sugera la existencia de una afinidad evolutiva entre arqueobacterias y el nucleocitoplasma, es decir, que ambos provinieran de una misma rama. Sin embargo, el rbol de los ARNr 16/18S obtenido por Woese y Fox carece de raz, es decir, no posee una polaridad que nos indique el orden temporal en que divergieron los tres linajes. En otras palabras, la representacin grfica de las relaciones entre las secuencias de los ARNr no permite deducir cul de los tres fenotipos es el ms antiguo. La biologa evolutiva es hija de la biologa comparada. Es decir, la comparacin de las diferencias y similitudes que existen entre los tres linajes permite, en principio, conocer no slo la relacin evolutiva que guardan entre ellos, sino tambin las caractersticas de su ancestro, al que Walter Fitsch design como cenancestro, un neologismo acuado haciendo uso de un prefijo griego derivado de la palabra koin, que quiere decir comn. Aunque hace una dcada las bases de datos no posean la riqueza de las de nuestros das posean la informacin suficiente para intentar asomarse a los rasgos del ltimo ancestro comn a las arqueobacterias, eubacterias y eucariontes. A pesar de las limitaciones de sta metodologa (y que incluyen, en forma destacada, el problema del transporte horizontal de genes), los resultados fueron notables: todo indicaba que el cenancestro posea, entre otros, (a) un sistema de transcripcin y traduccin de tipo moderno, que inclua ribosomas con protenas, factores de transcripcin y una ARN polimerasa ADN-dependiente oligomrica; (b) metabolismo energtico dependiente de ATPasas asociadas a membranas; (c) biosntesis de aminocidos, nucletidos, y coenzimas; y (d) presencia de un genoma de ADN (Lazcano et al., 1992). Todo indica que el ltimo ancestro comn a los tres linajes celulares (y, por lo tanto, a los todos los seres vivos) tena la complejidad equivalente a la de cualquier procarionte contemporneo, y no era un progenote.

IV Un ancestro hipertermfilo? Un rbol evolutivo sin raz, como el que resulta de la comparacin de las secuencias de ribonucletidos de los ARNr 16/18S, no permite ni deducir el orden temporal en que han ocurrido los cambios evolutivos, ni cual de los tres linajes es el ms antiguo. Estas preguntas pueden encontrar respuesta si se encuentra un organismo adicional que, por no pertenecer a ninguno de los tres linajes, se constituya en un grupo externo que permita deducir la polaridad de los procesos evolutivos. Sin embargo, todos los organismos conocidos pertenecen a alguno de los tres grandes reinos primarios, como los llamaron Woese y Fox, por lo cual no es posible establecer comparaciones con grupos externos. La solucin a ste problema estaba disponible desde hace unos cuarenta aos, cuando Margaret Dayhoff hizo notar que un rbol de genes se puede enraizar con sus homlogos siempre y cuando las secuencias que lo componen sean un subconjunto que haya resultado de una duplicacin gnica que haya tenido lugar antes de la divergencia de los componentes del rbol. Es decir, mientras que hay genes, a los que llamamos ortlogos, que han ido divergiendo como resultado de los procesos de especiacin de los organismos que los portan (como ocurre, por ejemplo, con el citocromo C), otros ms, llamados parlogos, divergen luego de una duplicacin de genes que no coincide con un evento de especiacin. Debido a que los genes del 16/18S ARN ribosomal son ortlogos, ninguno de ellos sirve como grupo externo para enraizar un rbol construdos con stas secuencias. (En realidad, se conoce una excepcin, los plasmodia, eucariontes unicelulares patgenos, pero la similitud entre las secuencias es tal que no permite resolver en detalle la posicin de la raz del rbol). Sin embargo, hace ms de diez aos dos grupos de investigadores, uno estadounidense (Gogarten et al., 1989) y otro japons (Iwabe et al., 1989) se percataron de manera independiente y simultnea que existan dos conjuntos de genes parlogos que eran el resultado de un proceso de duplicacin y divergencia que se haban dado antes de la separacin del cenancestro en los tres grandes linajes. Estos genes parlogos son, por una parte, los de las dos subunidades hidroflicas ( y ) de las ATPasas, que fueron estudiadas por Gogarten et al., y por otra los dos factores de elongacin (EF-Tu y EF-G), que participan en la sntesis de protenas y que fueron analizados por el grupo de Iwabe et al. (1989). Los rboles construdos con los dos tipos de secuencias de las ATPasas mostraban que las arqueobacterias y los eucariontes eran grupos hermanos, y lo mismo ocurre con las filogenias construdas con los factores de elongacin. La consistencia entre ambos rboles permita concluir que de los tres linajes celulares las bacterias eran el grupo ms antiguo, mientras que los eucariontes y las arqueobacterias formaban una rama que mostraba su cercana filogentica (Figura 5). Estos resultados, que corroboraban la relacin entre el nucleocitoplasma, eucariontes y las arqueobacetrias que Zillig y otros haban propuesto desde tiempo atrs, parecieron resolver el problema de la naturaleza del cenancestro: se trataba, claramente, de una eubacteria. Sin embargo, la disponibilidad de los rboles enraizados inaugur dos controversias igualmente estridentes sobre la evolucin celular que persisten hasta nuestros das. Uno de estos debates tiene que ver con las grandes categoras taxonmicas en las que podemos agrupar a los seres vivos: si bien es cierto que la teora endosimbitica sobre el origen de los eucariontes permite reconstruir sin problema las fronteras que separan a los cinco grandes reinos de la vida segn el esquema que propuso Whittaker y desarrollaron Margulis y Schwartz (1985), no era fcil conciliar esta visin de la bisfera con el esquema de los tres linajes celulares que se deduce del estudio del ARNr 16/18S. Al aceptar el enraizamiento del rbol universal, Woese, Khandler y Wheelis (1990) decidieron abandonar las taxonomas tradicionales y adoptar una visin nueva que separaba a los seres vivos en tres grandes dominios: las Archaea (las arqueobacterias), las Bacteria (formado por las eubacterias), y los Eucarya (constitudo por todos los organismos con clulas nucleadas). El trabajo

de Woese, Kandler y Wheelis fue de inmediato rechazado por Lynn Margulis, Ernst Mayr y otros evolucionistas y taxnomos, que sealaron no solamente su caracter reduccionista, sino tambin las dificultades para conciliar esta visin de la bisfera con el transporte horizontal de genes, la nomenclatura tradicional, y los niveles de organizacin biolgica que hacen de una clula eucarionte, por ejemplo, un sistema mucho ms complejo que un procarionte. El otro gran debate abierto por el enraizamiento del rbol del ARNr muy pronto se extendi a los estudios sobre el origen de la vida misma. Si bien es cierto que ya Woese y algunos de sus colaboradores haban sealado que en las filogenias del ARNr 16/18S los organismos termfilos e hipertermfilos se colocaban en la parte inferior de las ramas de las eubacterias y las arqueobacterias, la posicin basal de los hipertermfilos se hizo perfectamente evidente en el rbol propuesto por Gogarten, Iwabe y sus colegas (Figura 5). La interpretacin ms sencilla (pero no necesariamente correcta) de la distribucin filogentica de los hipertermfilos era que el cenancestro tambin haba sido uno de ellos. Ms an, la extrapolacin del estilo de vida hipertermfilo a lo largo del tronco del rbol ha llevado a algunos a afirmar que el origen de la vida mismo debe haber tenido lugar en ambientes extremos como los que existen en las chimeneas submarinas o en la cercana de los volcanes. Sin embargo, existen interpretaciones alternativas: en primer lugar, aunque no tenemos evidencia alguna del ambiente en el que surgi la vida, es evidente que en un ambiente caliente los compuestos orgnicos que eventualmente dieron origen a los primeros seres vivos hubieran tenido vidas medias muy cortas; en segundo lugar, los hipertermfilos son organismos antiguos, no primitivos; es decir, a nivel molecular sus procesos esenciales son bsicamente los mismos que los de los mesfilos, lo que abre la posibilidad de que la hipertermofilia sea una adaptacin secundaria. Y, por ltimo, no hay que olvidar que mientras que las filogenias moleculares estn basadas en secuencias de aminocidos o nucletidos, los primeros seres vivos seguramente carecan de protenas, ribosomas, y de muchas ms de las estructuras cuyos componentes macromoleculares aparecieron en el curso de la evolucin biolgica; es decir, son productos de un regimen evolutivo en el que operan mecanismos darwinistas totalmente distintos a los que operaran en el mundo fisicoqumico de las molculas sintetizadas abiticamente, en donde la persistencia (o no) de los compuestos depende nicamente de su estabilidad (Miller y Lazcano, 1995). Uno de los argumentos ms slidos en contra de la naturaleza hipertermfilica del ltimo ancestro comn, empero, proviene de un modelo de evolucin molecular desarrollado por Nicolas Galtier y sus colegas de las universidades de Montpellier y de Lyon. Aunque todas las filogenias moleculares estn construdas con algoritmos que suponen que la probabilidad de substitucin de los nucletidos es esencialmente la misma, Galtier y sus colaborados hicieron uso de anlisis estadsticos muchos ms refinados y supusieron un proceso en donde en cada rama de cada linaje las substituciones son variables. Por otra parte, este grupo francs ya se haba percatado de que el ARNr de los hipertermfilos es mucho ms rico en enlaces G:C, que forman tres puentes de hidrgeno, que en el parejas A:U, en donde slo hay dos puentes de hidrgeno. Al analizar sus bases de datos extrapolando al pasado con su modelo de substitucin de ribonucletidos, pudieron reconstruir una secuencia ancestral de ARNr 16S para el ltimo ancestro comn que tena valores de G:C tpicamente mesfilos. V. Genmica comparada y la bsqueda del cenancestro La reconstruccin de estadios ancestrales ha adquirido una perspectiva totalmente novedosa con la disponibilidad, a partir de 1995, de un nmero creciente de genomas celulares completamente secuenciados. Como haban afirmado desde 1965 Zuckerkandl y Pauling, la historia evolutiva de un organismo est contenida en su genoma --pero a menudo esta informacin es difcil de interpretar, debido a una serie de fenmenos biolgicos que van desde la falta de preservacin de la estructura

primaria de los genes, hasta la existencia de niveles de redundancia de las secuencias cuya naturaleza no entendemos del todo, pasando por el transporte horizontal, una de las peores pesadillas que pueden enfrentar los bilogos. Como se observa en la Figura 6, los genes del cenancestro estaran definidos por el conjunto de secuencias presentes en la interseccin de los conjuntos que representan los genomas de las Archaea, las Bacteria y los Eucarya. Sin embargo, en la prctica esta reconstruccin se ha visto limitada por (a) el hecho de que los genomas secuenciados no representan la diversidad biolgica real; (b) los distintos niveles de conservacin de los genes, que distan mucho de ser los mismos para todas las secuencias; (c) los problemas para anotar, es decir, identificar a las secuencias presentes en las bases de datos; (d) la presencia de secuencias altamente conservadas cuya funcin es an completamente desconocida por no disponer de datos experimentales; (e) la prdida polifiltica independiente de secuencias, funciones y rutas metablicas que han sufrido diversos organismos, sobre todo parsitos y simbiontes; y (f) el movimiento lateral de los genes, que en algunos casos pueden traspasar las fronteras que separan a los grandes dominios. Ante un inventario de dificultades como ste parecera ser imposible definir con precisin los rasgos del cenancestro; sin embargo, los resultados son alentadores. Por ejemplo, el transporte horizontal de secuencias es un fenmeno real (que subyace, por ejemplo, la bien conocida resistencia a antibiticos que se observa con una frecuencia cada vez ms alarmante entre muchos patgenos de humanos y animales) que puede obscurecer la reconstruccin del pasado evolutivo. Sabemos, por ejemplo, que incluso los operones del ARNr pueden llegar a sufrir este fenmeno, pero el hecho de que se mantenga la identidad de los grupos de microorganismos (es decir, las espiroquetas siguen siendo indentificables como tales, no hay bacterias Gram positivas que se hayan transformado en Gram negativas, etc.) sugiere que existen limitaciones biolgicas al intercambio de genes. En 1999, por ejemplo, tres grupos de trabajo demostraron, en forma independiente, que la representacin grfica del contenido total de secuencias (es decir, fenogramas) en los genomas secuenciados (Figura 7) mostraba como, a pesar del transporte horizontal, no slo los tres dominios, sino incluso las distintas lneas biolgicas que las constituyen, se pueden identificar sin problemas (Snel et al., 1999; Tekaia et al., 1999a; Fitz-Gibbon y House, 1999)). Es decir, a pesar de la promiscuidad con la que los seres vivos han intercambiado genes a lo largo de la evolucin, la reconstruccin del pasado es posible. Claro que los resultados no siempre son del todo compatibles. Al comparar las secuencias de los tres dominios resulta sorprendente la falta de conservacin de los distintos tipos de ADN polimerasas (sobre todo si tenemos presentes que uno de los rasgos que solemos definir como esenciales en la caracterizacin de los seres vivos es la reproduccin, que a nivel molecular depende precisamente de la actividad enzimtica de estas enzimas) y su distribucin biolgica. Ello ha llevado al grupo de Arkadi Koonin, del National Institute of Health de los EEUU, por ejemplo, a sostener que el ltimo ancestro comn posea un genoma de ARN, o tal vez de ARN/ADN, mientras que Patrick Forterre, de la Universit de Paris-Sud, en Francia, propone un complejo esquema de transporte lateral de genes que involucra a los tres linajes y a sus virus. En cambio, un grupo de la Facultad de Ciencias de la UNAM, que ha podido identificar la presencia de dominios catalticos de distintas ADN polimerasas en los tres linajes, cree haber identicado partes de la ADN polimerasa ancestral, que probablemente se deriv, como lo sugiere su homologa con algunas ARN polimerasas, de una molcula que originalmente estaba involucrada en la replicacin de genomas de ARN que posean clulas ms sencillas que precedieron al cenancestro mismo. Estas conclusiones, de hecho, son congruentes con los resultados preliminares obtenidos por Fredj Tekaia, Bernard Dujo, y Antonio Lazcano, que muestran que las secuencias ms conservadas comunes a los genomas celulares disponibles codifican para secuencias que sintetizan, degradan o interaccionan con ARN --es decir, que se pueden reconocer, al menos en parte, evidencias de un pasado biolgico anterior a la aparicin del ADN mismo.

VI. Conclusiones Al igual que ocurre con otras reas del conocimiento, pocas tareas resultan tan complejas y difciles en las ciencias biolgicas como la reconstruccin del pasado. Si bien es cierto que en el marco de la teora evolutiva es fcil aceptar la existencia de sistemas ancestrales ms simples de los cuales descendemos los organismos actuales, su estudio no es una tarea fcil, sobre todo si, como ocurre con el caso del cenancestro, hay que remontarse a pocas precmbricas. La reconstruccin de estadios ancestrales es una tarea multi e interdisciplinario que tiene que recurrir, necesariamente, a actitudes eclcticas que apelen a metodologas que incluyen desde las discusiones sobre el medio ambiente primitivo, hasta la anotacin automatizada de las secuencias de genomas completos. Los resultados pueden ser a veces confusos. Por ejemplo, la conservacin de las secuencias de las ATPasas implica la existencia de membranas de lpidos y fosfolpidos, aunque desconocemos cual era la naturaleza qumica de stas ltimas. A pesar de stas dificultades, resulta asombroso que, por otro lado, existan secuencias, estructuras y funciones, como las que participan en lectura y expresin de la informacin gentica, que parecen haberse conservado a lo largo de miles de millones de aos. La lectura de stas crnicas moleculares que se han mantenido desde pocas Precmbricas nos permite asomarnos, aunque sea en forma limitada, al interior de los procesos biolgicos de los microorganismos que antecedieron a todas las formas de vida que existen hoy en nuestro planeta, aunque no nos permiten predecir hacia donde va la bisfera. Despus de todo, no hay que olvidar que los evolucionistas somos como el ave goofus que describi Jorge Luis Borges, y que vuela con la cabeza hacia atrs, porque no le interesa saber hacia donde va, sino de donde viene.