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A produo de insulina humana por

Pesquisa

ENGENHARIA GENTICA
Bactria transgnica produz insulina humana
uma vantagem considervel em relao aos processos clssicos de produo. A extrao de protenas eucariticas, como a insulina, requer grandes quantidades de matria-prima (pncreas suno e bovino), que nem sempre esto disponveis e so, geralmente, de elevado custo. Isso torna o processo extrativo cada vez mais oneroso. Nesse contexto, o emprego de tcnicas mais eficientes, como a do DNA recombinante, abriu novas perspectivas de produo. Diabetes mellitus

Beatriz Dolabela de Lima

Professora Adjunta - Departamento de Biologia Celular Universidade de Braslia bdlima@unb.br

A engenharia gentica e a biotecnologia moderna A tecnologia do DNA recombinante possibilita a obteno de organismos com caractersticas novas ou no encontradas na natureza, o que permite uma nova alternativa para o melhoramento gentico de espcies de valor biotecnolgico. Desse modo, clulas de bactrias, leveduras e mesmo eucariontes superiores como plantas podem ser programadas com genes exgenos, abrindo a perspectiva de produo nestes organismos de polipeptdeos de interesse, como o interferon, o hormnio de crescimento, a insulina entre outros. A utilizao de microrganismos engenheirados, capazes de sintetizar protenas em grande quantidade, apresenta, sob o ponto de vista econmico,

O diabetes mellitus um grupo de doenas causadas pela deficincia na secreo ou na ao do hormnio pancretico insulina, o que produz profundas anormalidades no metabolismo. H duas classes principais de diabetes: o juvenil e o adulto. No primeiro, a doena comea cedo, tornando-se severa e, no ltimo, lento para se desenvolver, moderado e, freqentemente, no reconhecido. Os sintomas caractersticos do diabetes so sede excessiva e frequente mico, levando injesto de grandes volumes de gua. Essas alteraes so devidas excreo de grandes quantidades Figura 1: Estrutura da insulina humana: pr-insulina de glicose na urina (cadeias B, C e A) e insulina (cadeias B e A). Setas (glicosria). O granpretas indicam o ponto de clivagem para a retirada da de volume de urina cadeia C da pr-insulina, originando a insulina ativa. no diabetes reflete a Cadeia B, em rosa, cadeia C, em azul, e cadeia A, em necessidade do rim de excretar uma ceramarelo ta quantidade de
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gua junto com a glicose, pois a capacidade do rim de concentrar os solutos na urina tem um limite mximo. Outro sintoma o nvel da glicose sangunea e como a resposta ingesto da glicose. Quando a concentrao da glicose no sangue significativamente alta chamada de hiperglicemia. O pH do plasma sanguneo de pessoas severamente diabticas freqentemente menor que o valor normal 7,4, condio esta chamada de acidose. causada pela superproduo de cidos metablicos e o pH do sangue pode cair a 6,8 ou abaixo, e levar a leses irreparveis nos tecidos, e morte. Esse aumento da acidez um indicativo de alteraes profundas no balano cido-base do organismo. A acidez aumentada devido extensa formao de corpos cetnicos no fgado e sua liberao no sangue. Como os tecidos no conseguem utilizar a glicose sangunea, o fgado tenta compensar essa deficincia aumentando a utilizao dos cidos graxos como combustvel, mas isso provoca a superproduo de corpos cetnicos, alm da capacidade dos tecidos em oxid-los. A atividade de glicoquinase est diminuda no diabetes j que a insulina que estimula a biossntese dessa enzima. Como conseqncia, forma-se pouco glicognio. Como os carboidratos no esto sendo utilizados, as protenas do organismo so usadas como combustveis. Os aminocidos sofrem perda dos seus grupos amino e os acetocidos formados podem sofrer oxidao em dixido de carbono e gua, em parte pela via do ciclo do cido ctrico. A administrao de insulina para corrigir a deficincia endcrina e a administrao de bicarbonato de sdio para corrigir a perda, tanto do sdio como da capacidade do tampo bicarbonato, podem trazer toda a qumica do organismo de volta para um balano quase normal dentro de 12 a 24 horas. Para seguir o curso de tal tratamento, as dosagens de glicose, pH e CO2 sangu-

indesejada nos mRNAs transcritos a serem produzidos a partir destes genes, o que poderia afetar sua expresso. Para facilitar a clonagem, esse gene sinttico para a pr-insulina humana foi predito contendo um stio para a Insulina humana enzima de restrio Eco RI no incio do gene, seguido A insulina humana de um cdon para produzida nas clulas metionina (ATG), da repancreticas, localizadas gio codante para a cadeia dentro dos conjuntos de B, cadeia C e cadeia A, Figura 2: Comparao entre a seqncia nucleotdica do clulas de 100 a 200 m nesta ordem, do cdon de conhecidos como Ilhotas trmino (TAA), e finalmengene sinttico (Ec gene) e do cDNA para a pr-insulina de Langerhans. Essas esto te, de um stio para a enzima humana (Hs cDNA). Protein: seqncia protica da prdispersas pelo pncreas de de restrio Bam HI. Ouinsulina muitos vertebrados superitros stios para enzimas de ores, constituindo cerca de restrio foram adiciona1% da massa do orgo (Steiner et al., Construo do gene sinttico dos internamente no gene de modo a 1985). A insulina tem sido isolada de para a insulina humana facilitar modificaes posteriores. uma grande variedade de espcies de Aps a definio da estrutura do gene vertebrados, sendo que, em todas elas, a Dentre as vrias maneiras pelas quais sinttico, foi realizada a sua montagem molcula composta de duas cadeias um gene eucaritico pode ser obtido conforme a estratgia mostrada na figura polipeptdicas (A e B) ligadas por pontes para a expresso em procariotos, a sn3. Quatro oligonucleotdeos foram sintetidissulfdricas. tese qumica oferece as seguintes vantazados para a cadeia B, quatro para a A insulina humana, como muitos gens: fornece diretamente a seqncia cadeia C e dois para a cadeia A. Esses hormnios proticos, sintetizada como exata desejada; as seqncias oligos foram anelados em pares para a uma protena precursora maior, seguida codificadoras e no codificadoras poformao da fita dupla de DNA e foram de uma clivagem proteoltica, para gerar dem ser desenhadas para a expresso ligados entre si, em duas etapas. Na o hormnio ativo (Wang & Tsou, 1991). procaritica; stios de restrio podem primeira, foram montadas as cadeias B e Desse modo, a insulina produzida sob ser removidos ou adicionados, ntrons C e, na segunda, montado o gene da pra forma de um nico polipeptdeo, a prretirados; no h necessidade da etapa insulina, sendo que nesta ordem: cadeia pr-insulina, com uma cadeia de 110 de isolamento do mRNA ou DNA B, C e A. Esse gene foi clonado em um aminocidos. Os vinte e quatro primeigenmico e permite a alterao do gene vetor para a realizao do seqenciamento ros aminocidos formam o peptdeo de forma mais simples. de DNA e a confirmao da seqncia sinal ou seqncia pr da protena e tm Desse modo, a construo do gene nucleotdica correta do gene. a funo de facilitar a entrada da mesma sinttico para a pr-insulina humana foi no retculo endoperiplasmtico. Durante iniciada a partir da seqncia de Construo de um vetor de esse processo, o peptdeo sinal separaaminocidos dessa protena descrita por hiper-expresso para E. coli do da protena, resultando na formao Sures et al. (1980). Utilizando-se os da pr-insulina (figura 1). Essa molcula cdons genticos preferenciais para Nos ltimos anos, muitos vetores para resultante, na qual as cadeias A (21 Escherichia coli (De Boer & Katelein, E. coli tm sido construdos com diversas aminocidos) e B (30 aminocidos) es1986) para a otimizao da expresso do finalidades, entre essas, a clonagem de to ligadas pelo peptdeo conectante C gene nessa bactria, foi montado um cDNAs, de fragmentos de DNA amplifica(35 aminocidos), a precursora da gene codificando a protena humana. A dos por PCR, transcrio in vitro e para a insulina. Ela adquire sua conformao figura 2 mostra a comparao da seexpresso e produo de protenas com a formao de duas pontes qncia de bases na fase de leitura do heterlogas. Para cada finalidade, o vetor dissulfdricas e transportada para o cDNA da pr-insulina humana (Bell et ter que apresentar determinadas caracteaparelho de Golgi, onde vai ser empacoal., 1979; Sures et al., 1980) com o gene rsticas para otimizar sua utilizao. Desse tada em grnulos de estoque. Durante a sinttico montado nesse trabalho. Esse modo, para a construo de um sistema formao e maturao dos grnulos gene contm 18,6 % de bases substitude expresso de protenas em E. coli, seis secretrios, a pr-insulina clivada por das, sendo 16,27 %, na terceira base, 1,16 elementos bsicos so necessrios: enzimas proteolticas do tipo da tripsina, %, na segunda base, e 1,16 %, na primei- uma regio necessria para replicao resultando na liberao do peptdeo C. ra base dos cdons. Nenhuma das moestvel e controle do nmero de cpias; Desse modo, as duas cadeias A e B esto dificaes feitas nos cdons alterou o - um marcador seletivo, como um ligadas entre si por pontes dissulfdricas, aminocido de correspondncia. Aps gene conferindo resistncia a antibitico tendo uma outra ponte interna na cadeia anlise computacional, a presena de para a hospedeira; A, formando a molcula de insulina seqncias repetitivas, diretas ou inver- um promotor para iniciao da trans(figura 1) (Steiner et al., 1985). sas, maiores do que oito nucleotdeos crio e seu controle; no foi encontrada, evitando assim uma - uma regio terminadora da transcripossvel estrutura secundria local o;
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neos so realizadas frequentemente. Desse modo, o diabetes juvenil requer terapia com insulina e um cuidadoso controle, por toda a vida, do balano entre a ingesto de glicose e a dose de insulina injetada (Lehninger, 1984).

Figura 3: Estratgia utilizada para a construo dos genes para a prinsulina humana para a expresso na bactria E. coli
- um stio de ligao de ribossomas para a iniciao da traduo em uma trinca ATG apropriada; - e uma regio de stios apropriados para enzimas de restrio, para utilizao nas clonagens dos genes a serem expressos. Seguindo esses requisitos para a construo do vetor de expresso pLMT8.5 (figura 4), utilizamos a origem de replicao do plasmdeo pUC8, o gene de resistncia tetraciclina do plasmdeo RP4, o promotor pL isolado do fago Lambda, a regio Shine Dalgarno sinttica do fago T7, terminador de transcrio Rho-independente sinttico, e uma regio de mltiplos stios nicos para enzimas de restrio (figura 4). Para a regio de replicao estvel e de controle do nmero de cpias do plasmdeo foi escolhida a origem de replicao do plasmdeo pUC8. Essa origem derivada do plasmdeo pMB1 (ou ColE1) onde mutaes e delees foram introduzidas de modo a aumentar o nmero de cpias do plasmdeo dentro da clula. Esses plasmdeos podem estar presentes em mais de 500 cpias por clula. O gene de resistncia tetraciclina foi escolhido e utilizado porque este permite que, alm da seleo das bactrias recombinantes, o antibitico tetraciclina estar constantemente fazendo presso seletiva durante a fermentao. A resistncia tetraciclina consiste de uma protena que bombeia o antibitico para fora da clula, no permitindo sua atuao na inibio da sntese protica no interior da bactria. Isso tem como conseqncia, em uma fermentao industrial, que se utilizem menores quantidades do antibitico, pois este no ser inativado pela bactria resistente e estar constantemente presente na fermentao. Assim, a produtividade no bioreator

Figura 4: Mapa do vetor de expresso pLMT8.5 contrudo para a produo da pr-insulina humana em E. coli. TetR: gene de resistncia a tetraciclina; ori: origem de replicao; MCS: regio de stios nicos para enzimas de restrio; pL: promotor pL; SD: seqncia ShineDalgarno; e TT: regio de terminao de transcrio

no ser afetada devido ao acmulo de bactrias sem plasmdeos. Esse fenmeno de acmulo de bactrias sem plasmdeos foi observado por muitos pesquisadores e responsvel por dificuldades no escalonamento requerido para a comercializao de produtos recombinantes (Kumar et al., 1991). Para a iniciao da transcrio foi escolhido o promotor pL do bacterifago Lambda. Este um promotor forte e regulado negativamente pelo repressor codificado pelo gene cI. A mutao cI857 tornou o repressor sensvel temperatura, funcional a 28oC e no funcional a 42oC. Assim, a expresso de seqncias codantes sob o controle desses promotores e pelo repressor cI857 pode ser ativada simplesmente por uma mudana na temperatura da cultura, o que, principalmente em escala industrial, simplifica e barateia o processo. A partir de um promotor e de um incio de transcrio, a RNA polimerase transcreve o RNA at o reconhecimento de um stio de terminao, que funciona como um sinal para o trmino da transcrio. Dois tipos diferentes de terminadores so encontrados: terminadores simples ou Rho-independentes e terminadores Rho-dependentes (dependentes da protena Rho). Os terminadores Rho-independentes possuem duas caractersticas: uma estrutura em forma de grampo, gerada por pareamento entre repeties invertidas, contendo uma regio rica em pares G-C na base do grampo, separadas por uma curta distncia, e outra, subseqente da primeira, que contm uma regio de, aproximadamente, seis resduos de uridina no final da unidade. Esses terminadores parecem ter alguma funo na proteo do mRNA, pela sua capacidade de formar uma estrutura em grampo, provavelmente fornecendo uma barreira contra a ao de uma exonuclease 3' (Brawerman, 1987), e no dependem de um fator protico, proporcionando uma efetiva finalizao da transcrio no vetor de expresso. A etapa mais limitante na sntese protica a ligao dos ribossomas s molculas de mRNA. Desde que o nmero de ribosomas na clula exceda a classe de mensageiros, uma maneira de aumentar a expresso de um gene clonado aumentar o nmero dos transcritos correspondentes. Para tal, a maneira mais simples clonar o gene de interesse em um plasmdeo com grande nmero de cpias. As duas caractersticas dos mRNAs de E. coli , que determinam onde e qual a eficincia do processo de reconheci-

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Figura 5: Anlise da expresso em diferentes tempos de induo da pr-insulina em E. coli. Gel desnaturante (SDS-PAGE) a 15% dos lisados proticos totais das culturas, contendo o plasmdeo pLMT8.5 e o plasmdeo pPTA1 (pLMT8.5 + gene da pr-insulina)

sistema de produo de insulina est patenteado nos Estados Unidos (patentes nos. 6068993, 30/05/2000, e 6281329B1, 28/08/2001) e com pedido de patente no INPI, Brasil. Bibliografia Bell, G.I.; Swain, W.F.; Pictet, R.; Cordell, B.; Tischer, E. & Goodman, H.M. 1979. Nucleotide sequence of a cDNA clone encoding human preproinsulin. Nature, 282, 525-7. Brawerman, G. 1987. Determinants of messenger RNA stability. Cell, 48: 5-6. De Boer, H.A. & Kastelein, R.A. 1986. Biased codon usage: an exploration of its role in optimization of translation. In: Maximizing gene expression; Reznikoff, W. & Gold, L.; eds. Butterworth Publishers, Stoneham, USA. Dreyfus, M. 1988. What constitutes the signal for the initiation of protein synthesis on Escherichia coli mRNAs? J. Mol. Biol., 204: 79-94. Kumar, P.K.P.; Maschke, H.E.; Friehs, K. & Schugerl, K. 1991. Strategies for improving plasmid stability in genetically modified bacteria in bioreactors. Tibtech, 9: 279-84. Lehninger, A.L. 1984. Princpios de Bioqumica. So Paulo, Savier. Olins, P.O.; Devine, C.S.; Rangwala, S.H. & Kavka, K.S. 1988. The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosomebinding site that dramatically enhances the expression of foreign genes in Escherichia coli. Gene, 73: 227-35. Shine, J. & Dalgarno, L. 1974. The 3terminal sequence of E. coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71: 1342-6. Shultzaberger R.K., Bucheimer R.E., Rudd K.E. & Schneider T.D. 2001. Anatomy of Escherichia coli Ribosome Binding Sites. Journal of Molecular Biology, 313: 215-28. Steiner, D.F.; Chan, S.J.; Welsh, J.M. & Kwow, S.C.M. 1985. Structure and evolution of the insulin gene. Ann. Rev. Genet., 19: 463-84. Sures, I.; Goeddel, D.V.; Gray, A. & Ullrich, A. 1980. Nucleotide sequence of human preproinsulin complementary DNA. Science, 208: 57-9. Wang, C.C. & Tsou, C.-L. 1991. The insulin A and B chains contain sufficient structural information to form the native molecule. TIBS, 16: 279-81.
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mento ribosoma-mRNA, so o cdon de iniciao, geralmente AUG ou GUG, e a regio Shine Dalgarno (SD), ou stio de ligao de ribossomas (RBS). Essa regio complementar ao final 3' do RNA ribosomal 16S (Shine & Dalgarno, 1974; Shultzaberger et al., 2001). O SD tem tipicamente de trs a seis nucleotdeos de tamanho e est localizado quatro a quinze nucleotdeos antes do cdon de iniciao. Essa regio tem a funo de guiar o ribossoma para o ponto de incio correto (Dreyfus, 1988). Olins et al. (1988) descreveram uma regio SD a montante do gene 10 do bacterifago T7 (g 10-L). Esse gene codifica para a protena da capa, que a protena mais sintetizada aps a infeco do fago T7. Essa regio SD possui um grande potencial para otimizar a eficincia da traduo de genes homlogos e heterlogos clonados em E. coli. Para facilitar a clonagem de genes para a expresso no vetor, uma regio apropriada de stios nicos para enzimas de restrio foi adicionada entre a regio promotora e o SD, e a regio terminadora da transcrio, onde temos o stio para a enzima de restrio NcoI contendo o cdon ATG de incio de traduo (figura 4). Produo da pr-insulina humana Para a produo da pr-insulina, o gene sinttico da pr-insulina foi subclonado no vetor de expresso pLMT8.5 e o plasmdeo recombinante foi denominado de pPTA1. Esse plasmdeo foi utilizado para a transformao da cepa E. coli N4830-1, pois essa possui o repressor cI termossensvel. A cepa E. coli N4830-1 transformada

com o plasmdeo pPTA1, foi utilizada para a induo trmica da Pr-insulina. Como controle, foi utilizadas cultura da cepa contendo o plasmdeo pLMT8.5 sem o gene clonado. As protenas induzidas esto mostradas na figura 5. Verifica-se a induo de uma protena de, aproximadamente, 10.000 dltons, que corresponde Pr-insulina na cultura do recombinante pPTA1. Essa protena corresponde a 20% das protenas totais da bactria. Nas amostras com o plasmdeo pLMT8.5, no observamos essa protena induzida. Podemos concluir portanto, que ocorreu uma hiperexpresso da Pr-insulina a partir do gene clonado no plasmdeo pLMT8.5 construdo. Verificou-se tambm que ocorreu formao de corpos de incluso da protena recombinante produzida, o que auxilia a proteo contra protelise e facilita sua purificao. Eles so formados como agregados citoplasmticos que podem ser purificados aps a lise da clula, centrifugao e solubilizao das protenas com, por exemplo, uria ou guanidina. A perspectiva de produo a partir dessas bactrias recombinantes, obtidas nesse trabalho, nas condies de cultura utilizadas, de 1 g de pr-insulina para cada 17 litros de cultura, com uma densidade celular de 109 clulas por ml. Consideraes finais Esse trabalho foi realizado dentro do Projeto Produo de insulina humana atravs de precursores recombinantes em Escherichia coli, coordenado pelo Prof. Spartaco Astolfi Filho, com financiamento da Biobrs e PADCT/FINEP, dentro do Convnio UnB/Biobrs. Esse

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