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Modificar genes escolhidos, substituindo-os por fragmentos de material gentico externo ou inativando-os para que as protenas deles derivadas no sejam produzidas, hoje uma das estratgias mais promissoras da pesquisa biolgica. Os animais, em especial camundongos, em que essas mutaes so induzidas permitem estudos que podem revolucionar o tratamento de doenas humanas e abrem caminho para outros avanos, como os transplantes entre espcies diferentes e a produo de animais ou vegetais mais adequados para consumo e de crescimento mais rpido

Animais tran
O objetivo das cincias biolgicas, desde seus primrdios, entender como funcionam os seres vivos, sejam unicelulares como as bactrias ou multicelulares como ns mesmos. Para isso, usamos o mtodo cientfico: estudamos partes isoladas de um dado sistema (variveis) e tentamos deduzir suas possveis funes no sistema como um todo. Essa metodologia, apesar de suas limitaes no estudo de sistemas complexos, como os biolgicos, foi responsvel pela revoluo cientfica. Nas cincias biomdicas, em um primeiro momento, buscava-se compreender a funo de determinado tecido ou rgo, removendo-o ou inativando-o em animais de experimentao e observando as alteraes que o organismo sofria. Demonstrouse assim, por exemplo, o papel do pncreas na regulao do nvel de glicose no sangue atravs da produo de insulina, cuja deficincia caracteriza o diabetes mellitus. Quando o cdigo gentico foi decifrado, ficou claro que o DNA de cada clula um banco de

solues para mu

Antonio Jos Oliveira-dos-Santos Amgen Institute, Ontario Cancer Institute eDepartment of Immunology, University of Toronto (Canada)
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nsgnicos e nocautes sgnicos

dados bioqumico: ele armazena a informao gentica e permite seu uso e sua transmisso prole. O DNA (cido desoxirribonuclico) composto por quatro subunidades (bases nucleotdicas) encadeadas em duas longas seqncias (fitas), unidas por interaes qumicas entre bases situadas em fitas opostas (figura 1). As interaes qumicas entre fitas opostas formam sempre os mesmos pares de bases nucleotdicas (figura 2). Se cada base for tomada como uma letra, a combinao de trs bases em uma das fitas corresponde a uma palavra (cdon), e cada gene pode ser visto como uma frase do cdigo gentico. O genoma humano conjunto de genes presentes no ncleo de cada uma de nossas clulas corresponde a um banco de dados com cerca de trs bilhes de bases (ou letras). A informao contida em cada gene reproduzida (transcrio) em cadeias intermedirias de nucleotdeos (RNA), que funcionam como moldes para a sntese de protenas (traduo). As prote-

uitos enigmas

Figura 1. Parte da estrutura de fita dupla de DNA (vista lateralmente), com os tomos que formam a molcula representados por pequenas esferas
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Figura 2. As bases nucleotdicas de fitas opostas de DNA unem-se sempre formando os mesmos pares: adenina com timina e citosina com guanina

nas tambm so compostas pelo encadeamento de subunidades (aminocidos), e cada cdon em um gene corresponde a um aminocido em uma protena. H portanto uma equivalncia: um gene uma protena. Esse fato fez as cincias biomdicas mudarem seu foco inicial (rgos, tecidos e clulas) para as protenas. No entanto, avaliar a funo de protenas em mamferos vivos sempre foi um desafio. A descoberta de drogas que ativam ou inibem protenas permitiu desvendar a funo de algumas, e a identificao de pessoas com doenas genticas (alteraes na seqncia de bases do DNA) tornou possvel entender como a ausncia ou disfuno de certas protenas afeta o organismo como um todo. Por analogia, animais com doenas genticas similares s humanas tornaram-se modelos valiosos no estudo de tais enfermidades e na busca de novos tratamentos.

O surgimento de uma tecnologia

O aprimoramento e a automao de tcnicas de biologia molecular vm permitindo identificar e seqenciar (ler a ordem das bases) um nmero crescente de genes e protenas, em velocidade inimaginvel h poucos anos. A seqncia completa do DNA da nossa espcie deve ser conhecida pelo projeto Genoma Humano na primeira dcada do sculo 21. Decifrar um gene, porm, apenas o primeiro passo. Compreender a funo de uma protena tarefa muito mais longa e complexa.
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Uma alternativa para isso seria induzir uma alterao (mutao) em uma base ou um cdon de um gene, alterando assim a protena equivalente. Isso permitiria obter animais geneticamente modificados, permitindo estudar os efeitos das mutaes (ausncia ou disfuno de uma protena) sobre a fisiologia do organismo. O mtodo tradicional para estudar a funo de um gene baseado na identificao de variedades (alelos) desse gene entre indivduos de uma espcie. Na maioria das vezes, isso significa trabalhar com grande nmero de indivduos. No caso de seres unicelulares, como bactrias e fungos, possvel estudar no s variedades naturais como mutaes induzidas por drogas (mutagnese qumica), que danificam um ou mais genes, dependendo da droga e da dose. Em grandes populaes de bactrias, possvel selecionar as que tm mutaes em um gene especfico e mant-las em cultura, criando uma linhagem mutante para o estudo desse gene. Estratgia semelhante usada com seres multicelulares, como Caenorhabditis elegans, verme minsculo do solo, ou Drosophila melanogaster, a mosca-das-frutas. No entanto, mesmo em animais simples, o estudo gentico atravs de mutagnese qumica apresenta dificuldades crescentes, comeando pelo tamanho dos genomas. A bactria Escherichia coli contm trs mil genes, enquanto a mosca-das-frutas tem cerca de 20 mil e o camundongo carrega um conjunto estimado em 200 mil genes. Outro problema o trabalho com grandes populaes: quanto maior o genoma, maior a populao necessria. O exame de um bilho de bactrias relativamente simples, mas isso impensvel com moscas. Nesse caso, 100 mil indivduos j um grande experimento. Com camundongos, tal limite estaria em torno de mil indivduos. Alm disso, a maioria dos seres multicelulares herda duas cpias de cada gene, um alelo de cada progenitor, e a mutao de apenas um desses alelos no altera muito o organismo. Assim, preciso um longo e caro trabalho de cruzamento e seleo de descendentes at obter indivduos com dois alelos mutantes. Camundongos esto separados dos homens por milhes de anos de evoluo, mas estima-se que 99% dos seus genes sejam similares e exeram a mesma funo. Por isso, experimentos de manipulao gentica em camundongos permitem estudar in vivo genes humanos hoje identificados em ritmo acelerado cuja funo ainda desconhecida em nosso organismo. Assim, induzir a mutao especfica de um gene em camundongos nos daria uma chance rara de estudar seus efeitos. Embora a idia fosse bastante atrativa, foi necessrio superar vrios obstculos tcnicos tarefa a

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que vrios grupos de geneticistas, embriologistas, bioqumicos e bilogos moleculares se dedicaram a partir dos anos 70 (figura 3) antes de torn-la realidade. Hoje possvel alterar de modo especfico o DNA de camundongos, plantas e, recentemente, bovinos. Este artigo discute os principais passos no desenvolvimento de animais transgnicos e nocautes, os tipos de organismos geneticamente modificados e o impacto dessa tecnologia em diversas atividades humanas. Mas o que so animais transgnicos e nocautes? Em resumo, um transgene um fragmento de DNA, em geral a seqncia completa de um gene, artificialmente introduzido no genoma de outro organismo, enquanto nocautear um gene provocar nele uma mutao especfica, que leva sua inativao.

A expresso artificial de um gene

Em espcies de reproduo sexuada, a obteno de linhagens com alteraes genticas depende da induo de mutaes em clulas sexuais (gametas), para que sejam transmitidas prole. relativamente simples obter mutaes aleatrias em clulas somticas (j diferenciadas) de mamferos mantidas em cultura, mas o grande obstculo obter mutaes especficas em clulas sexuais de um animal vivo. O embrio de um camundongo desenvolve-se a partir da fecundao do vulo por um espermatozide, no oviduto da fmea. Segue-se a formao do ovo, que passa por sucessivas divises celulares at tornar-se ANO AVANO blastocisto (ou blstula), estgio em que as clulas embrion1968 Camundongos quimricos via injeo de rias dispem-se em torno de uma clulas embrionrias em blastocistos cavidade cheia de lquido (seme1974 Injeo de DNA viral em blastocistos de lhante a um cisto). J em 1968, camundongos e sua deteco em filhotes Richard L. Gardner havia isolado 1975 Embries infectados com retrovrus tm clulas de um embrio de camunseqncias de DNA viral integrado ao genoma dongo (embrio A) e injetado em 1976 Transmisso hereditria de um transgene blastocistos (embrio B). Implan1980 Injeo de DNA viral em embries no estgio tados no tero de fmeas prenhas, de uma clula, gerando animais transgnicos estes geraram camundongos com clulas vindas dos dois embries (quimeras). Usando progenitores com alelos diferentes para certo gene (marcador gentico), foi possvel distinguir no filhote as clulas vindas do embrio A (injetadas) e as originadas do embrio B (blastocisto). Em meados dos anos 70, Rudolf Jaenisch e Beatrice Mintz 1981 1981 1986 1987 1989 Integrao e expresso de transgenes Obteno de clulas embrinicas totipotentes (clulas ES) Camundongos quimricos obtidos a partir de clulas ES Recombinao homloga em clulas ES Obteno de camundongos nocautes

detectaram, nos filhotes gerados, DNA estranho (de vrus, por exemplo) injetado em blastocistos de camundongos. Conceitualmente, nascia o primeiro camundongo transgnico. Logo aps, infectaram embries com um retrovrus de rato e mostraram que seqncias do DNA viral integravam-se de modo estvel ao genoma do animal. Alm disso, os filhotes transgnicos transmitiram tais seqncias s suas futuras proles, revelando que clulas embrionrias infectadas de modo aleatrio podiam gerar clulas sexuais tambm transgnicas. Mas ainda era um desafio introduzir em animais um gene especfico, em vez de uma seqncia viral sem funo. A soluo foi obtida em 1980 por Jon W. Gordon e colegas. Seu mtodo (figura 4), to eficiente que continua em uso, emprega embries ainda no estgio de uma clula, quando se pode identificar o grande pr-ncleo. Com agulhas de vidro microscpicas, operadas por equipamentos ultra-sensveis, injetam-se vrias cpias da seqncia de DNA (transgene) que se quer integrar ao genoma. J no ano seguinte diversos grupos produziram camundongos contendo transgenes funcionais, que expressavam as protenas associadas em clulas especficas. Para obter um organismo transgnico, primeiro o gene de interesse identificado e isolado (clonagem gnica). Depois preciso montar o transgene, porque nem todo gene expresso (levando a clula a produzir protena) em todos os tecidos. S os glbulos vermelhos do sangue, por exemplo, expressam a hemoglobina, protena que transporta

Figura 3. Evoluo tecnolgica rumo a camundongos transgnicos e nocautes

AUTORES

Gardner Jaenisch e Mintz Jaenisch e colegas Jaenisch Gordon e colegas Brinster e colegas; Constantini e Lacy Evans e Kaufman; Martin Gossler e colegas Thomas e Capecchi Schwartzberg e colegas; Thompson e colegas

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so de qualquer transgene na pele. Esse o truque usado para dirigir a expresso de um transgene para determinadas clulas de um camundongo. Preparado o conjunto promotor-transgene, o passo seguinte injet-lo em pr-ncleos de embries. Estes so transferidos para o tero de fmeas receptivas (em estado de falsa-prenhez, induzi2. O vetor transgene do pelo cruzamento com machos injetado em embries vasectomizados). Os filhotes nasno estgio de uma clula, obtidos de fmeas cem em 20 dias, mas ainda nede camundongos cessrio examinar o DNA para recm-fecundadas. confirmar se tm o transgene e selecionar os positivos (transgnicos). Por ltimo, a protena associada ao transgene identificada nos filhotes e seu nvel de expresso medido em clulas especficas. Uma linhagem de camundongos transgnicos com freqncia uma ferramenta poderosa para o estudo in vivo de processos biolgicos. Podem-se reproduzir doenas humanas (cncer, diabetes, imunodeficincias e outras) ou alterar vias metablicas especficas e avaliar em detalhe a atuao celular. Esses animais permitiram grandes avanos 3. Uma vez no ncleo, o fragmento Tg 4. Embries com Tg integrado ao genoma so implantados de DNA localizado pela maquinaria em fmeas receptivas (prenhez induzida). A gestao gera em reas como imunologia, neucelular e integrado aleatoriamente camundongos transgnicos, que permitem estudar as funes rologia, biologia celular e outras. em um dos cromossomos. da protena correspondente ao gene Tg. Na imunologia, ajudaram a esclarecer a formao e a atuaFigura 4. o dos linfcitos, uma das clulas de defesa do o oxignio aos tecidos. Alm disso, a expresso dos O desenvolvimento genes em cada clula varia de acordo com o estado organismo. A reao dos linfcitos contra as infecde camungondos es ocorre quando receptores situados em sua funcional da mesma. transgnicos superfcie reconhecem antgenos protenas ou Mas como montar um transgene? A expresso fragmentos do invasor (bactria, vrus ou parasignica depende de uma intricada rede de controle, ta). Em geral, cada linfcito expressa um receptor baseada, entre outras coisas, no reconhecimento de diferente, o que permite identificar variados agenseqncias de DNA denominadas promotores. A tes infecciosos. Essencial ao sistema de defesa, essa presena de certo promotor junto a um gene dirige multiplicidade de receptores um obstculo ao sua expresso para determinado tipo de clula. estudo dos linfcitos. O problema foi superado por Como os promotores no codificam protenas, so camundongos com um transgene de receptor analvos preferenciais para manipulao. tignico. A expresso artificial desse receptor im possvel usar enzimas de restrio para cortar pede a dos demais. Os linfcitos do animal modio DNA em locais especficos (stios de restrio), ficado s tm um tipo de receptor, situao ideal definidos por seqncias de bases que cada enzima para a pesquisa. reconhece, e tambm emendar fragmentos de DNA Embora seja um grande avano tecnolgico, a com outras enzimas. Isso levou idia de ligar um gerao de animais transgnicos tem limitaes. promotor de funo bem conhecida a um transgene. Por ser aleatria, a integrao do transgene ao DNA Em tese, um promotor que coordene a expresso do pode resultar na mutao de outro gene (e no do gene de uma protena da pele pode induzir a expres1. Cpias do gene Tg (hipottico), previamente clonado, so transformadas em vetor transgene em laboratrio. Isso feito preparando uma seqncia desse gene apenas com seus exons (regies que codificam partes da protena em estudo), e ligando um promotor a uma das extremidades, para garantir a expresso do gene Tg somente em um tipo de tecido. 2 0 C I N C I A H O J E v o l . 2 5 n 1 46

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gene-alvo). Tambm h variaes no nmero de cpias integradas e no nvel de expresso do transgene, ou seja, na quantidade produzida da protena correspondente. Alm disso, como o gene-alvo continua intacto, no se sabe a priori como sua expresso ser afetada pelo transgene. Isso exige a gerao de vrias linhagens independentes de animais com o mesmo transgene, para comparar o efeito no organismo de diferentes doses da protena em estudo.

Figura 5. Mutao dirigida de um gene

1. Cpias do gene KO (hipottico), previamente clonado, so transformadas em vetor nocaute em laboratrio. Para isso, usa-se enzimas de restrio e a bactria E. coli, substituindo-se parte do gene-alvo (os exons 2 e 3) pelo gene neor, que confere resistncia droga neomicina, e adicionando-se a uma extremidade do fragmento o gene tk, que confere sensibilidade droga ganciclovir.

Como nocautear um gene

Enquanto os primeiros camundongos transgnicos eram desenvolvidos, outros pesquisadores isolaram clulas embrionrias capazes de gerar qualquer tipo de tecido em um embrio as clulas ES (do ingls embrionic stem cell). Em cultura, tais clulas multiplicam-se indefinidamente, mas sua injeo em blastocistos d origem a quimeras, permitindo a transmisso para o organismo de mutaes aleatrias induzidas no perodo de cultura ou de transgenes introduzidos nas clulas ES. Assim, em meados dos anos 80 o desafio da mutagnese induzida e especfica de um s gene permanecia de p. O ideal seria poder escolher um gene e mut-lo, eliminando algumas bases nucleotdeas para que o camundongo no produzisse a protena associada. Mas como fazer isso? Estudando a integrao de transgenes ao genoma de clulas de mamferos mantidas em cultura, Mario Capecchi observou que, ao injetar cpias de um mesmo vetor transgene (VT) em um ncleo celular, vrias delas eram ligadas entre si, em cadeia (VT-VT-VT...), com as seqncias de bases sempre na mesma orientao. Aparentemente, a clula dispunha de um mecanismo para organizar mais de uma cpia desse vetor em uma certa ordem antes da sua integrao aleatria. Com base nessas evidncias, o grupo de Capecchi investigou e descreveu o processo, batizado de recombinao homloga, mostrando que podia ser usado para induzir mutaes especficas em clulas ES em cultura. Em geral, a recombinao homloga envolve seqncias de DNA virtualmente idnticas: o vetor nocaute injetado tem suas extremidades alinhadas a regies semelhantes no DNA do ncleo, as quais so cortadas, e em seguida acontece a troca dos pedaos, com a religao das extremidades. O reconhecimento dessas extremidades to preciso que nenhuma alterao ocorre na seqncia das bases nucleotdicas nos stios de ligao. Sabendo disso, o passo seguinte seria mutar um gene especfico e obter animais contendo essa mutao. Essa conquista a gerao dos primeiros camundongos nocautes foi tornada pblica em 1989.
2. Clulas ES previamente obtidas de embries no estgio de blastocisto e mantidas em cultura so incubadas com o vetor nocaute e submetidas a eletroporao (rpido choque eltrico que as faz captar fragmentos de DNA). Em seguida, as clulas so novamente colocadas em cultura. 3a. No ncleo, a maquinaria celular localiza o vetor nocaute. Se houver o alinhamento correto entre vetor e gene-alvo, acontece a recombinao homloga. Com isso, parte do gene-alvo substituda pelo marcador gentico neor (que confere resistncia droga neomicina). Nesse caso o marcador tk, exterior s regies comuns do vetor e do gene-alvo, no ser integrado ao genoma da clula, que assim continua insensvel ao ganciclovir. As clulas ES nocautes, que tm o gene-alvo mutado e so resistentes neomicina, sobrevivero se essa droga

3b. Em muitas clulas, o vetor integra-se de modo aleatrio a um cromossomo, sem substituir o gene-alvo. Nesse caso as clulas sobrevivem neomicina (porque tm o marcador neor), mas morrem quando aplicada o ganciclovir (porque tambm tm o marcador tk). J as clulas que no sofreram mutao so mortas pela neomicina (no tm o marcador neor).

3c. Assim, aps a aplicao das duas drogas restaro na cultura apenas as clulas em que houve a recombinao homloga desejada (alterao do genealvo).

4. A mutao dirigida do gene-alvo confirmada pela anlise de uma amostra do DNA das clulas KO, que agora carregam um alelo mutante e no-funcional, alm do alelo selvagem.

5. Com agulhas especiais as clulas KO so injetadas em blastocistos (de camundongos pretos) e estes enxertados em fmeas pseudoprenhas. A gestao d origem a animais quimricos, formados por clulas derivadas tanto do blastocisto quando das clulas KO.

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1. Camundongos quimeras obtidos pela tcnica de mutao dirigida de um gene so cruzados com animais de plo preto (no-agouti).

3. O cruzamento de camundongos com um alelo mutante permite obter alguns filhotes normais (WT-WT), alguns heterozigotos (WT-KO) e alguns nocautes, com dois alelos mutantes (KOKO). Nos ltimos, o gene-alvo no expresso, permitindo o estudo dos efeitos no organismo da mutao KO.

Figura 6. Obteno de camundongos nocautes

2. A prole ter camundongos tanto pretos quanto marrons. Os marrons tm o gene agouti, herdado do gameta da quimera derivada das clulas ES mutadas. A anlise do DNA revela quais deles tm um alelo mutante (KO) do gene-alvo (WT).

Como nos animais transgnicos, a deteco e o seqenciamento do gene de interesse o passo inicial (figura 5). Em seguida, altera-se em laboratrio a seqncia de uma regio desse gene, mantendo intactas as extremidades (stios de reconhecimento, corte e ligao). O fragmento alterado de DNA o vetor a ser usado na mutao dirigida. Injetado no ncleo de clulas ES, o vetor forma um complexo com as protenas nucleares responsveis pela recombinao homloga. Esse complexo percorre todo o genoma da clula at achar uma seqncia-alvo similar ao vetor. Mas a etapa final do processo (recombinao homloga, ou seja, alinhamento e troca) s acontece em uma taxa muito baixa: uma em cada milho de clulas. Alm de no se integrar, o vetor pode ainda se integrar aleatoriamente, como um transgene comum, sem reconhecer a seqncia-alvo. Como, ento, identificar as clulas com as mutaes corretas? A soluo foi o uso de marcadores genticos que permitem selecionar as clulas em que houve recombinao. O marcador, em geral um gene que confere resistncia ao antibitico neomicina (neor ), inserido no vetor a ser injetado em clulas ES.
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Aps a multiplicao celular, aplica-se neomicina na cultura. A grande maioria das clulas, nas quais no houve integrao do vetor (aleatria ou por recombinao homloga), continua sensvel droga e morre. Mas as que adquiriram o vetor e expressam o gene neor so resistentes droga e permanecem vivas (seleo positiva). Tambm se pode ligar a uma extremidade do vetor outro marcador, como o gene da timidinaquinase (tk), enzima do vrus da herpes. Quando ocorre a recombinao homloga, o gene tk no se integra ao DNA celular, por estar fora da seqncia similar que orienta o alinhamento entre o vetor e seu alvo. Mas se a integrao aleatria as clulas recebem o vetor inteiro. Nesse caso, a aplicao da droga ganciclovir mortal para clulas que expressam o gene tk (seleo negativa). Com os dois marcadores (neor e tk), possvel selecionar clulas que em sua maioria apresentam a recombinao homloga desejada. Obtm-se, assim, a mutao especfica e controlada do gene escolhido, confirmada pela anlise de uma amostra do DNA das clulas. Tais clulas ES mutantes podem ser transferidas para blastocistos, visando a gerao de camundongos quimricos. Camundongos com clulas ES mutantes so facilmente identificados pela cor do plo. Isso porque tais clulas so obtidas de camundongos de plo marrom (com duas cpias do gene agouti), enquanto os blastocistos vm de fmeas de camundongos de plo preto (com duas cpias defeituosas desse gene). Assim, quando as clulas ES injetadas em blastocistos geram embries normais, nascem camundongos quimricos, com diferentes propores de plos claros por causa do gene agouti mesmo uma s cpia desse gene leva deposio de pigmento amarelo, alm do preto, nos plos. Essas quimeras, acasaladas com camundongos pretos normais, geram filhotes tanto pretos quanto marrons (figura 6) os ltimos tm uma cpia do gene agouti, que s pode vir de gametas das quimeras derivadas das clulas ES mutantes. A anlise do DNA dos animais marrons identifica os que tm no genoma a mutao especfica induzida nas clulas ES em cultura. Os animais heterozigotos (com uma cpia mutante e outra selvagem de um gene) so

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presso de um gene apresenta gradaes: o nvel de em geral sadios, pois uma cpia selvagem do gene uma dada protena presente em uma clula varia em estudo suficiente para o funcionamento do em funo do seu estado funcional. Em alguns organismo. casos, silenciar um gene em um momento especO cruzamento desses camundongos heterozigofico da vida do camundongo, de forma gradativa e tos permitir obter alguns filhotes com duas cpias reversvel, seria muito mais informativo. mutantes do gene (homozigotos), que no expressaro a protena associada ao gene nocauteado. Anormalidades funcionais e/ou anatmicas nesses animais revelam em que funes orgnicas o gene Novos caminhos nocauteado est envolvido. Hoje, o nmero de e muitas aplicaes genes nocauteados em camundongos aproxima-se de mil, e cresce continuamente. A tcnica, alm de Os problemas ainda existentes nessa rea exigem ajudar a entender processos fisiolgicos, abre um um refinamento dos mtodos de mutagnese. Uma caminho para investigar doenas humanas que opo atraente o transgene induzvel, que deainda no tinham modelos animais. penderia de um promotor controlado por uma droNa oncologia, os camundongos mutantes garantiga. Nesse caso, a administrao ou no da droga ao ram grandes avanos no estudo de genes supressocamundongo ligaria ou desligaria a expresso da res de tumores genes cuja inativao contribui protena associada ao transgene. para o surgimento ou a progresso de tumores. Na Ainda mais interessante induzir mutaes em ltima dcada, mutaes de grande nmero de um dado tecido ou rgo. Para isso um gene derivagenes foram associadas a tumores humanos, embodo de bactria (recombinase cre), ligado a um prora muitas vezes ainda no se conheam as funes motor especfico para determinado tecido, intedas protenas correspondentes a tais genes. A mugrado ao genoma do camundongo como um transtao do supressor tumoral p53, por exemplo, ocorgene. Ao mesmo tempo, obtm-se outras linhagens re em diversos cnceres humanos. O estudo de cade camundongos contendo pequenas seqncias mundongos nocautes com mutaes do gene p53 sinalizadoras (loxP) nas extremidades do gene em mostrou que ele atua como um mecanismo de estudo (introduzidas por recombinao homloga), segurana, evitando que defeitos no DNA (que sem alterar sua expresso. podem levar a crescimento anormal e cncer) seO cruzamento das duas linhagens gera animais jam transmitidos durante a duplicao das clulas. em que a recombinase cre, expressa apenas em tePortanto, p53 protege o organismo contra mutacidos especificados pelo promotor, reconhece as es perigosas, muitas causadas por agentes amseqncias loxP junto ao gene-alvo e o elimina bientais, como radiao e toxinas presentes em apenas nas clulas desses tecidos. Assim, ao conalimentos ou drogas (o tabaco, por exemplo). REA USO POTENCIAL Como era de se esperar, mutar um gene especfico no resolve Cincias biolgicas 4Identificar a funo de genes e protenas tudo. Se o gene inativado est correspondentes em animais e vegetais envolvido na formao do organismo na fase embrionria, a inativao pode ser letal, impedindo o nascimento das crias. Alm disso, com freqncia vrias protenas com funes semelhantes participam do controle de processos biolgicos. A redundncia vantajosa para o organismo, que pode substituir a protena em caso de falha, mas significa que nocautear um gene s revela suas funes no-redundantes. Finalmente, esse tipo de mutao induzida resulta na ausncia total e irreversvel da protena estudada, mas em geral a ex-

Figura 7. Usos potenciais da tecnologia de manipulao gentica

4Desenvolver modelos animais de doenas humanas, permitindo seu estudo e a busca de novas terapias Medicina 4Produo de protenas de interesse mdico atravs de animais transgnicos que expressem genes humanos 4Introduo de transgenes em tecidos ou rgos humanos para tratar doenas genticas 4Desenvolvimento de animais transgnicos para doao de tecidos ou rgos para transplante em humanos Agropecuria 4Desenvolvimento de raas de animais transgnicos, mais saudveis para consumo e de crescimento rpido 4Desenvolvimento de vegetais mais resistentes a pragas ou melhor adaptados ao solo e ao clima de uma regio

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Sugestes para leitura

ALBERTS, B., BRAY, D., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., & WATSON, J.D. Molecular biology of the cell, New York, Garland Publishing, 1994. VEGA, M.A. Gene Targeting, Boca Raton, CRC Press, 1995. MAK, T.W., PENNINGER, J., RODER, J., ROSSANT, J., & SAUNDERS, M. The gene knockout factsbook, Londres, Academic Press, 1998. HOUDEBINE, L.M. Transgenic animals: generation and use, Amsterd, Harwood Academic Publishers, 1997. (INTERNET) http:// www.biomednet.com/ db/mkmd

trrio dos nocautes tradicionais, esses animais apresentam deficincia da protena estudada s no tecido visado nico modo de investigar genes com funes diversas em tecidos diferentes. A recombinao homloga pode ser usada para inativar totalmente um gene ou para eliminar ou substituir uma ou mais bases (processo chamado de knock in, em oposio a knock out). Nesse caso, so obtidas protenas com alteraes de funo. A tcnica tambm permite investigar a questo da redundncia de protenas, atravs da gerao de linhagens independentes de camundongos nocautes para diferentes genes envolvidos em um mesmo processo biolgico e do cruzamento de tais linhagens para obter animais com diferentes combinaes de mutaes. Os animais transgnicos e nocautes tm permitido avanos sem precedentes no conhecimento biolgico, mas isso no tudo. A lista de aplicaes da nova tecnologia (figura 7) est em expanso, e os primeiros produtos dela derivados j alcanam o mercado. Na rea mdica, muitas doenas humanas decorrem da ausncia de certas protenas ou de mutaes que alteram suas funes normais. Nos hemoflicos, por exemplo, mutaes nos genes responsveis pela produo de fatores da coagulao sangnea criam o risco de hemorragias difceis de estancar e s vezes fatais. Transfuses de sangue regulares repem as protenas ausentes, mas envolvem riscos como a transmisso de doenas infecciosas (Aids, hepatite B, doena de Chagas e outras). Assim, apesar do esforo dos doadores, seria muito til a produo segura, barata e em grande escala de fatores de coagulao. A introduo de um transgene humano em outro mamfero criaria uma fbrica da protena humana correspondente, idia j testada com sucesso em camundongos. Hoje, vrios grupos de pesquisa buscam criar vacas ou cabras transgnicas para fatores de coagulao humanos. Para isso, usam transgenes ligados a promotores que regulam a expresso dos genes das protenas do leite, de onde o fator de coagulao poder ser retirado. Em tese, essa estratgia permite produzir qualquer protena de interesse mdico, o que revolucionaria o controle de inmeras doenas. Outra opo, aplicvel a muitas doenas genticas, a substituio, em clulas do paciente, do gene mutante causador do problema por um gene funcional a terapia gnica. Nesse caso, um transgene introduzido em tecidos especficos ou uma mutao knock in regulariza a expresso dos genes originalmente no-funcionais. Nos ltimos anos,

pacientes com vrias doenas genticas vm sendo submetidos a esse tipo de terapia experimental. Tambm promissor o transplante de tecidos ou rgos de uma espcie para outra (xenotransplante). No caso do transplante de corao, por exemplo, uma opo perseguida h dcadas o uso do rgo de um animal (o porco a escolha mais adequada, pelas caractersticas fsicas do corao). Mas preciso superar a rejeio, processo em que o organismo do receptor reconhece e ataca protenas das clulas do rgo transplantado, diferentes das suas prprias. Criar porcos em cujos coraes as protenas responsveis pela rejeio tenham sido substitudas por protenas humanas seria uma alternativa. Os xenotransplantes, usando rgos de animais geneticamente modificados, talvez sejam possveis em alguns anos. Na agroindstria, conceitualmente possvel desenvolver raas de animais que cresam mais rpido ou tenham menor percentual de gordura (ou outro componente) na carne, no leite ou em ovos. Tambm se podem obter animais mais resistentes a doenas, reduzindo gastos com drogas e o risco de intoxicaes causadas por elas. Os mesmos princpios, aplicados a vegetais, gerariam plantas resistentes a pragas ou mais bem adaptadas ao clima e solo de uma regio. Tudo isso poderia aumentar a produtividade na agroindstria mundial, ajudando a combater o flagelo da fome. Como todo avano tecnolgico, a manipulao gentica de seres vivos traz, ao lado dos benefcios, alguns riscos potenciais, nem sempre percebidos com facilidade. A riqueza de opes torna necessrio analisar caso a caso o uso da nova tecnologia. Alm disso, para seres sociais, as mudanas, sejam no comportamento ou no modo como garantem sua sobrevivncia, esto sempre associadas a julgamentos ticos. Portanto, cabe a cada sociedade discutir o assunto e decidir racionalmente quais tipos de tecnologia so ou no aceitveis para uso entre seus integrantes. O Brasil tambm precisa discutir a questo do uso de tcnicas de manipulao gentica, como vem ocorrendo h anos em vrios outros pases. fundamental que o pas no perca as oportunidades reais de melhorar suas condies de vida, nem aceite a imposio de decises tomadas por outras sociedades, sem discutir sua adequao realidade brasileira. n

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