Tese Micro Pred

VERNICA ORTIZ ALVARENGA
Engenheira de Alimentos

Orientadora: Prof Pilar Rodriguez de Massaguer, PhD

Campinas SP
8 de julho de 2008
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
DEPARTAMENTO DE CINCIA DE ALIMENTOS

Modelagem preditiva do crescimento/morte de
Saccharomyces cerevisiae em co-cultura com
Lactobacillus fermentum em mosto de caldo de cana-
de-acar

Dissertao apresentada Faculdade de Engenharia de Alimentos
da Universidade Estadual de Campinas para obteno do grau de
Mestre em Cincia de Alimentos

ii

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FEA UNICAMP

Titulo em ingls: Predictive modeling growth/death of Saccharomyces cerevisae in coculture
with Lactobacillus fermentum in sugar cane must
Palavras-chave em ingls (Keywords): Saccharomyces cerevisae, Lactobacillus
fermentum,Alcoholic fermentation, Predictive
microbiology, Coculture
Titulao: Mestre Cincia de Alimentos
Banca examinadora: Pilar Rodriguez de Massaguer
Fumio Yokoya
Glucia Maria Falco Arago
Data de defesa: 08/07/2008
Programa de Ps Graduao: Programa em Cincia de Alimentos

Alvarenga, Vernica Ortiz
Al86 Modelagem preditiva do crescimento/morte de Saccharomyces
cerevsiae em co-cultura com Lactobacillus fermentum em mosto de
caldo de cana-de-aucar / Vernica Ortiz Alvarenga. -- Campinas, SP:
[s.n.], 2008.

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer
Dissertao (mestrado) Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Engenharia de Alimentos

1. Saccharomyces cerevsiae. 2. Lactobacillus fermentum. 3.
Fermentao alcolica. 4. Microbiologia preditiva. 5. Co-cultura.
I. Rodriguez de Massaguer, Pilar. II. Universidade Estadual de
Campinas.Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Ttulo.

(cars/fea)
iii
BANCA EXAMINADORA

Prof Pilar Rodriguez de Massaguer, PhD (FEA/UNICAMP)
orientadora

Prof. Dr. Fumyo Yokoya (FEA/UNICAMP)
membro

Prof. Dr. Glucia Maria Falco Arago (UFSC)
membro

Prof. Dr. Wilmer Edgard Luera Pea (CCA/UFES)
suplente

Prof. Dr. Lcia Regina Durrant (FEA/UNICAMP)
suplente

iv

A minha famlia dedico
v

ACASO

"Cada um que passa em nossa vida,
passa sozinho, pois cada pessoa nica
e nenhuma substitui outra.
Cada um que passa em nossa vida,
passa sozinho, mas no vai s
nem nos deixa ss.
Leva um pouco de ns mesmos,
deixa um pouco de si mesmo.
H os que levam muito,
mas h os que no levam nada.
Essa a maior responsabilidade de nossa vida,
e a prova de que duas almas
no se encontram ao acaso. "
(Antoine de Saint-Exupry)
" Tu te tornas eternamente responsvel por aquilo que cativas"
(Antoine de Saint-Exupry)

vi
Agradecimentos

A Deus pela onipotncia.
Aos meus pais, Wenner e Marina, pelo dom da vida, pois sem vocs no estaria
aqui hoje.
Aos meus irmos, Neto e Ana Luisa, pela alegria da convivncia, com vocs
aprendo a cada dia.
Aos meus avs, Washington e Longina (In memorian), vocs que sempre
acreditaram e me incentivaram, e que hoje no esto aqui presentes fisicamente,
mas partilham desta vitria.
minha av Izabel Cristina, no tenho palavras para agradecer os seus
ensinamentos durante toda a minha vida escolar, e hoje vov a senhora pode
compartilhar este momento comigo, pois sem a senhora no estaria aqui.
Ao tio Dcio, muito obrigada por acretidar em mim.
Tio Nestor e tia Solange, vocs so muitos importantes para mim, e podem hoje
compartilhar de mais esta vitria comigo, sem vocs no estaria aqui.
voc Vnicius, tenho imensa gratido, pois voc aceitou a nossa distncia em
funo do meu sonho, hoje o destino nos separou, jamais esquecerei a sua
dedicao e carinho para comigo durante os nossos anos de convivncia. Hoje
Deus nos reservou caminhos diferentes, mas estes caminhos so para a nossa
felicidade. A voc muito obrigada!
A minha eterna mestre Valria, pois foi voc que me ensinou os primeiros passos
da microbiologia, desta forma, aprendi a amar esta cincia.
A Professora Pilar, minha gratido, pelo seu voto de confiana, espero que tenha
correspondido as suas expectativas.
A Cllia pelo incentivo e credibilidade nos meus anos de graduao, muito
obrigada.
vii
A Patricia pelo incentivo.
As minhas professoras da graduao, Maria Isabel e Rosrio, pelo incentivo e pela
amizade durante os anos da faculdade.
A Luciana, minha companheira de repblica e amiga de todas as horas, que nos
adotamos como irms, com voc passei muitos momentos de alegria e tristeza,
todos eles especiais!!!
A Alessandra me, como o prprio apelido diz, me adotou. A voc Ale no tenho
palavras para agradecer!!!!
A Ana e o Zedu, hoje tambm a Las, meus grandes amigos, como vocs foram
importantes durante este perodo. Os momentos porpetagem dos fins de semana,
os passeios e as escapadinhas depois do trabalho para uma cervejinha, vocs
s tenho a agradecer!!! Sero para sempre meus amigos!!!
Ao Anderson, meu companheiro de trabalho dos fins de semana e meu grande
amigo, como eram engraadas e produtivas nossas longas conversas!!! Muito
obrigada pela oportunidade de conviver com voc!!
A minha amiga Fran, com o nosso pouco tempo de convivncia, voc se tornou
essencial para os meus dias de trabalho!!!!
A minha amiga Andria, sem voc boa parte dos meus experimentos no teria
dado certo!!! Ao nosso companherismo dos finais de semana, das nossas aulas de
ingls e de tudo que passamos neste tempo de convivncia.
Ao Sal voc sempre com a sua implicncia, tornave os meus dias de trabalho mais
divertidos!!! Muito Obrigada.
A Maricy pela nossa convivncia, com voc aprendi muitas coisas!!
Aos meus companheiros de laboratrio, Cristiana, Mrcio, Aline, Alline, Ana
Paula, Emerson, Cristina, Fernanda, Rafael e Kethlen.
Ao Jonas pelo fornecimento da matria-prima para os experimentos, e tambm,
pelas dicas sobre fermentao alcolica.

viii
Ao Wilmer pelos primeiros ensinamentos de microbiologia preditiva, e hoje pelo
prazer de t-lo em minha banca examinadora.
A Aninha, voc sempre brava, porm disposta a nos ajudar!!!
A Eli sem voc o nosso trabalho seria impossvel!!! Voc sempre disposta a nos
ajudar!!!
A Norma muito obrigada pelos emprstimos, que eram essenciais para o nosso
trabalho.
Ao professor Jos Luiz, pelos emprstimos dos equipamentos. E tambm pelas
boas risadas durante o estgio docente!!! Foi de grande valia esta experincia.
A professora Lcia Durrant, pelo emprstimo do cromatografo, e por ter me
acolhido em seu laboratrio.
A Camila, foi um anjo, que Deus colocou em meu caminho.
A Fapesp pelo bolsa concedida.
A Danisco pela doao do Natamax.
A professora Glucia Arago e o professor Fumio, membros da banca
examinadora, pelas correes e sugestes.
Ao Alysson pelos ensinamentos sobre Matlab, e pela pacincia.
A todos que no foram citados, porm esto guardados em minha mente e meu
corao.
Aos que de alguma forma criaram empecilhos e dificuldades, fizeram crticas
durante a confeco deste trabalho, a vocs s tenho a agradecer, pois me
fizeram crescer e superar vrios obstculos me tornando uma pessoa mais forte.

ix
SMARIO

Resumo.................................................................................................................xxi
Abstract ............................................................................................................... xxiv
INTRODUO........................................................................................................ 1
2. Objetivos .......................................................................................................... 3
3. Reviso de literatura ........................................................................................ 5
3.1. Aspectos mercadolgicos ......................................................................... 5
3.2. Caractersticas das leveduras................................................................. 13
3.3. Fermentao alcolica............................................................................ 18
3.4. Contaminantes do processo de produo de etanol ............................... 21
3.5. Caractersticas morfolgicas e citolgicas de Lactobacillus fermentum.. 24
3.6. Influncia dos contaminantes no processo de fermentao alcolcia .... 26
3.7. Modelagem do crescimento da levedura em bioprocessos .................... 30
3.8. Microbiologia preditiva ............................................................................ 32
3.9. Planejamento experimental para modelagem preditiva .......................... 32
3.9.1. Desenho composto central .................................................................. 34
3.10. Coleta de dados experimentais para a construo dos modelos
preditivos ........................................................................................................... 34
3.11. Influncia do inculo nos parmetros de crescimento dos
microrganismos ................................................................................................. 36
3.12. Modelagem matemtica ...................................................................... 38
3.12.1. Parmetros de crescimento............................................................. 39
3.12.1.1. Tempo de adaptao ( ).................................................................. 39
3.12.1.2. Taxa especfica de crescimento () ................................................. 40
3.12.1.3. Populao mxima (Rg) .................................................................. 41
3.13. Modelagem primria............................................................................ 41
3.13.1. Modelo de Gompertz Modificado ..................................................... 42
3.13.2. Modelo de Baranyi ........................................................................... 43
3.14. Modelagem preditiva em co-cultura..................................................... 45
3.15. Modelo Quase-qumico ....................................................................... 48

x
3.16. MODELAGEM SECUNDRIA............................................................. 51
3.17. Validao de modelos ......................................................................... 53
3.17.1. Fator de bias.................................................................................... 53
3.17.2. Fator de exatido............................................................................. 54
3.17.3. Erro do quadrado mdio (MSE) ....................................................... 54
4. MATERIAL E MTODOS............................................................................... 56
4.1. Seleo das linhagens............................................................................ 56
4.2. Delineamento experimental .................................................................... 56
4.2.1. Variveis de controle do processo fermentativo.................................. 58
4.2.1.1. Temperatura do processo fermentativo ........................................... 58
4.2.1.2. Nvel de inculo de Lactobacillus fermentum................................... 59
4.3. Inoculao............................................................................................... 59
4.4. Preparo do inculo.................................................................................. 60
4.4.1. Pr-inculo da levedura (Saccharomyces cerevisiae)......................... 60
4.4.2. Pr-inculo do lactobacilo (Lactobacillus fermentum) ......................... 61
4.4.3. Ajuste do inculo da levedura ............................................................. 62
4.4.4. Ajuste do inculo do lactobacilo .......................................................... 63
4.5. Coleta de amostras do processo fermentativo........................................ 64
4.6. Avaliao da viabilidade das clulas de levedura................................... 65
4.7. Avaliao do crescimento ....................................................................... 66
4.7.1. Contagem das clulas da S. cerevisiae............................................... 66
4.7.2. Contagem das clulas do L. fermentum.............................................. 66
4.8. Medio do pH do mosto ........................................................................ 67
4.9. Avaliao da concentrao de cido lctico, cido actico, etanol, frutose,
glicose, glicerol .................................................................................................. 67
4.9.1. Preparo da fase mvel ........................................................................ 68
4.9.2. Condicionamento da coluna................................................................ 69
4.9.3. Curva padro da glicose...................................................................... 69
4.9.4. Curva padro frutose........................................................................... 69
4.9.5. Curva padro etanol ............................................................................ 70
4.9.6. Curva padro glicerol .......................................................................... 70
xi
4.9.7. Curva padro cido lctico.................................................................. 70
4.9.8. Curva padro cido cetico................................................................. 71
4.9.9. Anlise das amostras .......................................................................... 71
4.10. Modelagem preditiva ........................................................................... 72
4.10.1. Modelagem primria ........................................................................ 72
4.10.2. Modelo quase-qumico..................................................................... 72
4.10.3. Modelagem secundrio.................................................................... 73
4.10.3.1. Modelagem de superficie de resposta ............................................. 73
4.10.3.2. Modelo de Davey (1989) e Raz quadrada ..................................... 74
5. Resultados e Discusso................................................................................. 75
5.1. Curvas experimentais de crescimento e declino de Saccharomyces
cerevisiae e Lactobacillus fermentum................................................................ 75
5.2. Modelagem primria ............................................................................... 77
5.3. ndice de viabilidade da levedura (IV) ..................................................... 97
5.3.1 Efeitos da temperatrura de fermentao e nvel de inculo de L.
fermentum no ndice de viabilidade da levedura em cultura mista .................. 101
5.4. Modelagem quase qumica................................................................... 103
5.5. Modelagem secundria......................................................................... 114
5.5.1 Efeitos da temperatura e nvel de inculo de L. fermentum sobre a
concentrao mxima de etanol ...................................................................... 114
5.5.2 Efeito da temperatura e nvel de inculo de L. fermentum , e Rg. 116
5.5.3 Anlises da produo de metablitos (etanol, glicerol, cido lctico e
cido actico) e acares (glicose).................................................................. 120
6. Concluses .................................................................................................. 122
7. Referncias bibliogrficas ............................................................................ 124
Anexo A............................................................................................................... 141
Anexo B............................................................................................................... 147
Anexo C .............................................................................................................. 149
Curvas de crescimento/declnio geradas pelo modelo quase-qumico................ 152
Anexo D .............................................................................................................. 196
Anexo E............................................................................................................... 199

xii
Lista de figuras

Figura 1. Seqncia de reaes enzimticas pela fermentao alcolica de
carboidratos endgenos (glicognio e trealose) ou exgenos (sacarose e
maltose), conduzida por Saccharomyces cerevisiae (Lima et al, 2001)......... 19
Figura 2. Curva padro do crescimento bacteriano a temperatura constante....... 35
Figura 3. Quadrado Mdio da Cmara de Neubauer e sentido de contagem dos
quadrados mdios.......................................................................................... 62
Figura 4. Determinao da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno.
As clulas coradas de azul so clulas mortas, enquanto as incolores so
clulas viveis................................................................................................ 65
Figura 5. Sistema de filtrao a vcuo para a fase mvel. .................................... 68
Figura 6. Curvas experimentais de crescimento para o experimento 04 (31S6L7),
para as culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum em mosto de
cana-de-acar. ............................................................................................. 76
Figura 7. Curvas de crescimento experimento 01(25S6L3) de L.fermentum e S.
cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas. ........................................... 79
Figura 8. Curvas de crescimento experimento 02 (31S6L3) de L.fermentum e S.
cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas............................................. 81
Figura 10. Curvas de crescimento experimento 04 (31S6L7) L.fermentum e S.
Figura 13. Curvas de crescimento do experimento 07 (28S6L1) de L.fermentum e
S. cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas. ...................................... 87
S. cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas. ....................................... 89
xiii
Figura 16. ndice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum
experimento 07(28S6L1), 08 (28S6L8) e 09 (28S6L5) e levedura em cultura
pura (28S6L0). ............................................................................................... 98
Figura 17. ndice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum
para o experimento 01 (25S6L3) e 03 (25S6L7) e levedura em cultura pura
(25S6L0). ....................................................................................................... 99
Figura 18. ndice de viabilidade de S. cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum
para o experimento 02(31S6L3) e 04(31S6L7) e levedura em cultura
(31S6L0). ....................................................................................................... 99
Figura 19. ndice de viabilidade de S. cerevisiae, em cultura pura em diferentes
temperaturas para os experimentos 01 (25S6L0), 02(31S6L0),05(24S6L0),
06(32S6L0), 09(28S6L0).............................................................................. 100
Figura 20. Efeitos da temperatura de fermentao e nvel de inculo de L.
fermentum no ndice de viabilidade da levedura em cultura mista............... 102
Figura 21. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura pura para o
experimento 05 ............................................................................................ 105
Figura 22. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura pura para o
experimento 07 ............................................................................................ 105
Figura 23. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura pura para
experimento 08 ............................................................................................ 106
Figura 24. Modelo quase-qumico para o experimento 09, L.fermentum em cultura
pura.............................................................................................................. 107
Figura 25. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura pura(28S6L0)
..................................................................................................................... 108
Figura 26. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura (31S6L0) ..... 109
Figura 27. Modelo quase-qumico para o S. cerevisiae em cultura mista (31S6L7)
..................................................................................................................... 110
Figura 28. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura mista (28S6L1)
..................................................................................................................... 110

xiv
Figura 29. Efeito da temperatura e concentrao de L. fermentum sobre a
concentrao mxima de etanol em funo da temperatura e nvel e inculo
..................................................................................................................... 116
Figura 30. Efeito da temperatura de fermentao e nvel de inculo de L.
fermentum sobre o logartmo da populao mxima do lactobacilo em cultura
mista............................................................................................................. 119
Figura 31. Curva de evoluo da produo de etanol, cido lctico, cido actico e
glicerol; consumo de glicose; curva de crescimento do lactobacilo e levedura
em cultura mista para o experimento 07 (28S6L1). ..................................... 120
Figura 32. Curva de crescimento para o experimento 01 (25S6L3), para as
culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum. ............................. 141
Figura 33.Curva de crescimento para o experimento 02 (31S6L3) para as culturas
mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum .......................................... 142
Figura 34. Curva de crescimento experimento 03 (25S6L7), para as culturas
mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum ........................................... 142
Figura 35.Curva de crescimento experimento 05 (24S6L5), para as culturas mistas
e puras de S. cerevisiae e L.fermentum....................................................... 143
Figura 36.Curva de crescimento experimento 06(32S6L5), para as culturas mistas
e puras de S. cerevisiae e L.fermentum...................................................... 143
mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum ........................................... 144
mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum .......................................... 145
e puras de S. cerevisiae e L.fermentum....................................................... 145
Figura 42. Modelo quase-qumico para o L.fermentum cultura pura experimento 01
(25S0L3) ...................................................................................................... 152
xv
Figura 43. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura pura
experimento 02 (31S0L3)............................................................................. 153
experimento 03 (25S0L7)............................................................................. 154
experimento 04 (31S0L7)............................................................................. 155
experimento 05 (24S0L5)............................................................................. 156
experimento 06 (32S0L5)............................................................................. 157
experimento 07 (28S0L1)............................................................................. 158
experimento 08 (28S0L8)............................................................................. 159
experimento 09 (28S0L5)............................................................................. 160
experimento 10 (28S0L5)............................................................................. 161
experimento 11 (28S0L5)............................................................................. 162
Figura 53. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura pura
experimento 01 (25S6L0)............................................................................. 163
experimento 02 (31S6L0)............................................................................. 164
Figura 55. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura puraexperimento
03 (25S6L0) ................................................................................................. 165
experimento 04 (31S6L0)............................................................................. 166
experimento 05 (24S6L0)............................................................................. 167

xvi
experimento 06 (32S6L0)............................................................................. 168
experimento 07 (28S6L0)............................................................................. 169
experimento 08 (28S6L0)............................................................................. 170
experimento 09 (28S6L0)............................................................................. 171
experimento 10 (28S6L0)............................................................................. 172
experimento 11 (28S6L0)............................................................................. 173
Figura 64. Modelo quase-qumico para a L.fermentum em cultura mista
experimento 01 (25S6L3)............................................................................. 174
Figura 65. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura mista
experimento 01 (25S6L3)............................................................................. 175
experimento 02 (31S6L3)............................................................................. 176
experimento 02 (31S6L3)............................................................................. 177
experimento 03 (31S6L3)............................................................................. 178
experimento 03 (31S6L3)............................................................................. 179
experimento 04 (31S6L7)............................................................................. 180
experimento 04 (31S6L7)............................................................................. 181
experimento 05 (24S6L5)............................................................................. 182
xvii
experimento 05 (24S6L5)............................................................................. 183
experimento 06 (32S6L5)............................................................................. 184
experimento 06 (32S6L5)............................................................................. 185
experimento 07 (28S6L1)............................................................................. 186
experimento 07 (28S6L1)............................................................................. 187
experimento 08 (285S6L8)........................................................................... 188
experimento 08 (28S6L8)............................................................................. 189
experimento 09 (28S6L5)............................................................................. 190
experimento 09 (28S6L5)............................................................................. 191
experimento 10 (28S6L5)............................................................................. 192
experimento 10 (28S6L5)............................................................................. 193
experimento 11 (28S6L5)............................................................................. 194
experimento 09 (28S6L5)............................................................................. 195
Figura 86. Curva padro para a frutose .............................................................. 196
Figura 87. Curva padro para a glicose .............................................................. 196
Figura 88. Curva padro para o etanol................................................................ 197
Figura 89. Curva padro para o glicerol .............................................................. 197
Figura 90. Curva padro para o cido lctico...................................................... 198

xviii
Figura 91. Curva padro para o cido cetico..................................................... 198
xix
Lista de tabelas
Tabela 1. Desempenho do setor sucroalcooleiro no perodo de 2000 a 2007 ...... 10
Tabela 2.Exportaes brasileiras de etanol .......................................................... 11
Tabela 3. Composio mdia da cana-de-acar ................................................. 11
Tabela 4. Principais constituintes de cana-de-acar ........................................... 12
Tabela 5. Resumo do mecanismo e das equaes para o modelo quase-qumico
....................................................................................................................... 50
Tabela 6. Desenho do planejamento experimental com valores codificados e
(reais). ............................................................................................................ 58
Tabela 7.Equivalncia dos padres McFarland.................................................... 63
Tabela 8. Resultados do teste Tukey para os parmetros de crescimento do L.
fermentum e S. cerevisiae gerados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994).
....................................................................................................................... 92
Tabela 9. Parmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e
Lactobacillus fermentum em cultura pura, estimados pelo de Baranyi e
Roberts (1994) ............................................................................................... 93
Lactobacillus fermentum em cultura mista, estimados pelo modelo de Baranyi
e Roberts (1994) ............................................................................................ 94
Lactobacillus fermentum em cultura mista, estimados pelo modelo de
Gompertz modificado (Zwietering et al, 1991)................................................ 95
Lactobacillus fermentum em cultura pura, estimados pelo modelo de
Gompertz modificado (Zwietering et al 1991)................................................. 96
Tabela 13. Efeitos da temperatura de fermentao e nvel de inculo de L.
fermentum no ndice de viabilidade da levedura em cultura mista............... 101
Tabela 14. Parmetros gerados pelo modelo quase-qumico para as culturas puras
de S. cerevisiae e L.fermentum.................................................................... 112
Tabela 15. Parmetros gerados pelo modelo quase-qumico para as culturas
mistas de S. cerevisiae e L.fermentum........................................................ 113

xx
Tabela 16. Efeitos da temperatura e nvel de inculo para a concentrao mxima
de etanol em cultura mista ........................................................................... 115
Tabela 17. Comparao dos ndices de validao dos modelos secundrios para a
S.cerevisiae e L. fermentum para os parmetros , e Rg........................ 117
Tabela 18. Efeitos da temperatura e nvel de inculo para a populao mxima do
lactobacilo em cultura mista......................................................................... 118
Tabela 19. ndice de viabilidade para a levedura em cultura mista e pura a 28
o
C
..................................................................................................................... 199
o
C
..................................................................................................................... 200
o
C
..................................................................................................................... 201
Tabela 22. ndice de viabilidade para a levedura em cultura pura em diferentes
temperaturas ................................................................................................ 202
xxi
RESUMO
No Brasil e em outros pases, a fermentao alcolica realizada sem
esterilizao do caldo de cana-de-acar que constitui um timo substrato para o
crescimento microbiano tornando-se, assim, inevitvel presena de
contaminantes. Estes apresentam-se como os principais responsveis pela
reduo no rendimento e produtividade da fermentao. Esta pesquisa teve por
objetivo predizer os parmetros de crescimento (taxa de crescimento (), tempo
de adaptao () e populao mxima (Rg)) da Saccharomyces cerevisiae e
Lactobacillus fermentum, quando cultivados individualmente ou em co-cultura
atravs da aplicao dos modelos primrios de crescimento de Baranyi & Roberts
(1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al, 1991). Em funo de variaes de
temperatura (28 32C) e concentrao de inculo de L. fermentum (10
1
-10
8

UFC/mL), mantendo-se fixo o nvel de inculo de S. cerevisiae em 10
6
UFC/mL.
Para a modelagem primria foi ajustado, tambm, o modelo quase-qumico. Para
a construo deste modelo, foi utilizado o software Matlab verso 7.5. A
inoculao das culturas foi realizada em mosto de cana-de-acar clarificado
industrialmente, e ajustado a 21.5Brix. O material foi tratado termicamente a
121C por 40 minutos e mantido congelado a 20C at a realizao dos ensaios.
Foram adicionados 200 mL de mosto, em elernmeyeres de 500mL esterilizados.
Para o ajuste do inculo da levedura foi realizada a contagem da suspenso em
Cmara de Neubauer e para o lactobacilo o ajuste foi realizado com o auxlio do
Densimat (BioMrieux, S.A., France). Os ensaios de fermentao foram
conduzidos em incubadora com agitao contnua de 120 rpm (New Brunswick

xxii
Scientific, Model G-27, U.S.A.) e temperatura controlada. Para cada ensaio
realizado com a cultura mista, foram conduzidos outros dois ensaios da mesma
forma e com o mesmo substrato para as culturas puras de S.cerevisiae e L.
fermentum. Os dados obtidos foram ajustados com o software DmFit para os
modelos de Baranyi e Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al
1991). No houve diferena significativa (p<0,10) para , e Rg da levedura e
para e . No entanto, para Rg do lactobacilo houve diferena significativa entre a
cultura pura e mista. Quando a levedura atinge a fase estacionria o lactobacilo
teve sua taxa de crescimento incrementada de sua populao mxima aumentou
relevantemente no final da fase estacionria da levedura. O modelo de Baranyi e
Roberts descreveu melhor a fase de adaptao dos microrganismos. J o modelo
quase-qumico apesar de descrever crescimento/declnio no modela
adequadamente o plateau da fase estacionria, quando ele acontece. O modelo
secundrio da populao mxima do lactobacilo em funo da temperatura de
fermentao e nvel de inculo demonstrou que o nvel de inculo e sua interao
com a temperatura foram significativos ao nvel de 10% de significncia. O indice
de viabilidade da levedura pura foi afetada por mudanas na temperatura. Porm,
para a cultura mista, com o tempo de fermentao fixo (21 horas) o nvel de
contaminaao pelo lactobacilo foi altamente significante. O melhor indice de
viabilidade foi observado para L=10
3
UFC/mL e temperatura de fermentao a
25
o
C. Nas condies estudadas foi observado um mximo na produo de etanol
quando a temperatura de fermentao foi 28
o
C e o nvel de inculo de lactobacilo
de 10
5
UFC/mL. O efeito quadrtico da temperatura de fermentao foi mais
xxiii
significativo (p<0,10) que o nvel de contaminao do lactobacilo na produao
mxima de etanol. Os modelos determinados neste estudo podero servir para
posterior otimizao de processos fermentativos na indstria sucroalcooleira.

xxiv
ABSTRACT
In Brazil and other countries around the World, the sugar cane must fermentation
for alcohol production is carried out without sterilization of the sugar cane juice,
being an excellent medium for the multiplication of undesirable contaminants.
Among the contaminants of sugar cane must, Lactobacillus fermentum can be
considered one of the most relevant being able to cause the flocculation of yeasts
and to reduce ethanol yield and productivity of the fermentation. This research
aimed to predict the growth parameters lag time (), specific growth rate () and
maximum population (Rg) of Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus
fermentum in individual and cocultures. Predictive modeling of microorganisms
growth in co-culture and pure culture was done through the application of primary
growth models of Baranyi and modified Gompertz, varying temperature (24
32C) and inoculum concentration of L. fermentum (10
1
10
8
CFU/mL) with a fixed
inoculums level of S. cerevisiae (10
6
CFU/mL). For the primary modeling it was
also, adjusted the quase-chemical model for the construction of this model Matlab
software version 7.5 was used. The inoculation of the cultures was carried out in
sugar cane must industrially clarified and adjusted to 21.5Brix, heat treated must
(121C per 40 minutes) were inoculated with the yeast and lactobacilli, the
adjustment of the inoculum was done respectively by counting the suspension in
Neubauer chamber and Densimat (BioMrieux, S.a., France). For each assay
carried out with the mixed culture, two others tests with pure culture were done for
comparison of growth parameters. The fermentation assays were conducted in an
incubator with continuous agitation (120rpm) (New Brunswick Scientific, Model G-
xxv
27, U.S.A.) and controlled temperature. From the data obtained, the growth
parameters were determined through the adjustment of the data with DMFIT
software for Baranyi and Roberts and Modified Gompertz. No siginificant diference
(p<0.10) was found for , and Rg for the yeast in pure culture neither for and
for Lactobacillus fermentum, but for lactobacilli Rg was significantly different for
pure a coculture. When the yeast reached the stationary phase the lactobacilli
growth rate was increased and its stationary phase it was observed after ward.
Baranyi and Robertss model best described lag phase was expected. The quasi-
chemical model even though it describes growth/decline it does not model the
stationary plateau. The secondary model for the maximum population of the
lactobacilli as function of fermentation temperature and inocullum level showed that
this last variable was significant and its interaction with temperature (p< 0.10). For
the pure culture temperature was significant on the viability index. But for mixed
culture for a fixed fermentation time (21h) the lactobacilli level of contamination
was highly significant. Best IV was observed for L=10
3
UFC/mL and T=25
o
C. When
the maximum ethanol production was modeled for T, L independent variables. The
temperature was significant a maximum was observed at T=28
o
C, L=10
5
UFC/mL.
These two models are practical application for the alcoholic fermentation industry.

1
INTRODUO
O Brasil , mundialmente, o pas com a maior tecnologia de processo da
fermentao alcolica para produo de bioetanol e o produto possui mercado
interno garantido, devido ao lcool anidro adicionado gasolina, ser obrigatrio
por lei nacional em substituio ao chumbo, ou hidratado como combustvel. Um
dos desafios atuais do pas aumentar a oferta de lcool combustvel, pois a
agroindstria alcooleira, juntamente com a aguardente, representa um
considervel gerador econmico que movimenta 2% do Produto Interno Bruto
(PIB), algo em torno de 39 bilhes de reais por ano (Oliveira & Vasconcelos,
2006).
Com a crise do petrleo nos anos 70, o governo brasileiro desenvolveu o
Programa Nacional do lcool (Prolcool), como forma alternativa substituio da
gasolina (Andrietta et al, 2006), assim sendo o Brasil tornou-se o primeiro pas do
mundo a desenvolver um programa de combustvel alternativo. Nasceu ento o
bioetanol, um combustvel obtido a partir da fermentao do caldo de cana-de-
acar, melao ou ambos (Andrietta et al, 2006).
Como toda a produo de lcool ocorre por via fermentativa,
fundamental, o conhecimento do processo, que tem sido constantemente
aprimorado (Nobre, 2005).
Os processos industriais de produo de lcool existentes no Brasil
reutilizam o fermento em ciclos fermentativos consecutivos. Durante o processo de
centrifugao, os microrganismos contaminates tambm so reciclados

2
juntamente com o fermento e agravam os problemas associados com a
contaminao bacteriana (Cherubin, 2003).
Dependendo do nvel de contaminao bacteriana podem ser ocasionados
problemas como: deteriorao do mosto, aumento da floculao, reduo da
viabilidade da levedura, reduo na massa do fermento e a formao de produtos
indesejveis que ocasionam consumo de sacarose e de outros nutrientes
presentes no mosto. Nveis elevados de contaminao tambm provocam muitos
inconvenientes como a dificuldade de centrifugao, aumento do uso de cido no
tratamento, aumento do tempo de fermentao e elevao de acares no
fermentados que levam a redues no rendimento da fermentao alcolica.
Em levantamento realizado em usinas do estado de So Paulo, houve
predominncia de presena de bactrias lcticas como contaminates da
fermentao alcolica. Estas bactrias so encontradas em diversos nichos
ecolgicos, sendo bem resistentes a meios cidos, especialmente os
Lactobacillus. Em diversos habitats, naturais e artificiais, se destacam aqueles em
que as bactrias convivem com leveduras em condies de fermentao
anaerbica, como no caso da fermentao alcolica. Como causam prejuzos
considerveis ao processo, essa contaminao bacteriana deve ser monitorada e
os teores de cido lctico poderiam ser utilizados para determinar o nvel desta
contaminao (Costa, 2006).

3
2. OBJETIVOS
Os objetivos da presente pesquisa foram:

Construir das curvas experimentais de crescimento e declnio da
Saccaharomyces cerevisae e Lactobacillus fermentum;
Avaliar a influncia do cultivo do Lactobacillus fermentum quando
em co-cultura com Saccharomyces cerevisae, sobre os
parmetros de crescimento, tanto da levedura quanto do
lactobacilo;
Ajustar os dados de crescimento dos microrganismos em culturas
pura e co-cultura, pelo modelo de crescimento de Baranyi e
Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al 1991),
calculando tempo de adaptao, velocidade de crescimento,
populao mxima e tempo de gerao;
Avaliar o efeito da temperatura e do nvel de inculo de
lactobacilo no ndice de viabilidade da levedura;
Ajuste do modelo Quase-Qumico aos dados experimentais de
crescimento/declnio dos microrganismos;
Quantificar dos compostos (cido lctico, glicerol e etanol)
excretados pelos microrganismos;
Quantificar dos acares presentes no mosto de cana-de-acar
(frutose e glicose);

4
Construo de modelos secundrios para descrever o efeito da
temperatura e nvel de inculo nos parmetros primrios de
crescimento dos microrganismos (S. cerevisiae e L. fermentum).
5
3. REVISO DE LITERATURA
PARTE I: FERMENTAO ALCOLICA
3.1. Aspectos mercadolgicos
Durante milhes de anos, o etanol tem sido produzido para o consumo
humano, alm de bebidas alcolicas concentradas mediante destilao. O lcool
para uso como matria-prima qumica produzido por fermentao, desde o incio
da microbiologia industrial. No entanto, era obtido durante muitos anos atravs de
procedimentos qumicos, como na hidratao cataltica do etileno (Crueger &
Cureger, 1993).
No Brasil, as indstrias de acar e de lcool estiveram sempre
intimamente ligadas, desde o tempo do descobrimento. Deduz-se que a produo
de lcool iniciou na Capitania de So Vicente, porque nela foi montado o primeiro
engenho de acar do Pas, aps a vinda das primeiras mudas de cana-de-
acar, trazidas da ilha da Madeira, em 1532. Certamente, transformava-se o
melao residual da fabricao do acar em cachaa e, diretamente da garapa
fermentada produzia-se a aguardente. Por sculos, as bebidas destiladas foram o
nico lcool produzido. A indstria de lcool industrial desenvolveu-se na Europa,
em meados do sculo XIX; no ltimo quarto desse sculo iniciou-se a produo de
etanol no Brasil, com as sobras de melao da indstria de acar, que ampliava
sua capacidade produtiva (Lima, 2001).
Em 1929, a grande crise internacional colocou em xeque as economias de
todos os pases e, no Brasil, a indstria aucareira no ficou a salvo. Sobrava
acar e cana e faltavam divisas para a aquisio de combustvel lquido. A

6
primeira destilaria de lcool anidro foi instalada e o Governo Federal, em 1931,
estabeleceu a obrigatoriedade da mistura de 5% de etanol gasolina (Decreto
19.717), como medida de economia na importao de combustvel e para amparar
a lavoura canavieira. Por muitos anos, no houve lcool suficiente para misturar a
todo o combustvel consumido. Durante a guerra de 1939 a 1945, faltou gasolina e
fez-se necessrio substitu-lo por gasognio ou lcool. Terminada a guerra, voltou
a importao de gasolina e o combustvel alternativo perdeu sua importncia.
Entretanto, continuou-se a misturar o etanol gasolina em larga escala (Lima,
2001).
At os anos de 1975, quase no se moia cana para a produo de lcool,
este era elaborado nas destilarias anexas de forma secundria nesse complexo
agroindustrial. Muitas vezes, era prefervel produzir melao e comercializ-lo a
produzir lcool (Ramos & Souza,2005).
A importncia do etanol, nessa cadeia produtiva, cresceu com o Programa
Nacional do lcool (Prolcool), que lhe garantiu preo e mercado. O Prolcool
surge para a economia nacional, como uma proposta energtica aos derivados de
petrleo e, no plano setorial, como uma alternativa aos empresrios que haviam
aumentado a capacidade das unidades produtivas.
Isso ocorreu devido crise internacional do petrleo que se deflagrou em
1974, fazendo com que se iniciasse, no Brasil, uma nova fase na produo de
lcool. Na busca de alternativas para combustvel lquido, o lcool adquiriu uma
importncia sem paralelo. Dos 700 milhes de litros por ano, em pouco tempo, a
indstria passou a produzir 15 bilhes de litros, para abastecer uma frota de mais
de 4 milhes de automveis, que se movem com lcool puro e tambm, para
7
misturar-se com a gasolina usada no Pas. Com a utilizao desse combustvel
alternativo, ampliou-se o parque canavieiro, fez-se a modernizao das destilarias,
a instalao de unidades autnomas, a criao de grande nmero de empregos
diretos e indiretos e uma rpida e importante evoluo na construo de motores
para esse combustvel. O plano de desenvolvimento da produo de lcool no
Brasil, denominado de Prolcool, no foi uma soluo improvisada para a crise de
combustveis; no foi mais do que a continuidade e evoluo de um programa de
uso do lcool como combustvel, iniciado em 1931 (Lima, 2001).
A iniciativa da implantao por parte do Estado de um programa de
preveno de crise no setor aucareiro partiu em junho de 1975 dos Ministrios da
Indstria e do Comrcio e de Minas e Energia. No centro da proposta conjunta
est a proteo do setor aucareiro de novas quedas nos preos, a manuteno
da ocupao da mo-de-obra no campo e a utilizao produtiva dos altos
investimentos de expanso e da correspondente produo de equipamentos. Os
aspectos de poltica energtica ainda desempenhavam um papel secundrio, na
medida em que o lcool de cana s deveria ser produzido para ser adicionado
gasolina em maior escala quando os preos do acar estivessem baixos. O
objetivo da proposta era, portanto, em primeiro lugar o aproveitamento da
capacidade produtiva existente, ou seja, das destilarias, dos equipamentos para a
produo de lcool, cuja capacidade produtiva estava sendo aproveitada em
apenas 50%, e dos equipamentos para a produo de acar atravs da
construo de instalaes anexas para a produo de lcool (Borges, 1988).
Com a implantao do Prolcool o Brasil aumentou a capacidade dos
equipamentos e dos rendimentos, possibilitou maior aproveitamento de produtos e

8
subprodutos da cana-de-acar, alm do fato da usina de acar e lcool ganhar
a definio de uma unidade produtora de energia e alimentos, sendo que existem
usinas que j oferecem produtos como: gros, sementes de soja, acar, acar
lquido, lcool hidratado, lcool anidro, leo fsel, bagao, metano, eletricidade. O
setor sucroalcooeiro viveu em 1998 um ano tumultuado de sua histria. Comeou
a safra carregando estoques de lcool, da ordem de 2 bilhes de litros,
concentrados em So Paulo, considerado o maior produtor do pas e contando
com o maior nmero de destilarias modernas. O tumulto aumentou quando o
governo adiou at o ms de novembro a liberao dos preos do lcool hidratado
e da cana, antes prevista para maio desse mesmo ano. Isso ocorreu depois de
vrias usinas, na iminncia da desregularizao do mercado, terem contratado a
venda de lcool com as distribuidoras, para entrega futura, a preos inferiores aos
de tabela que estava em vigor (Globo, rural, 1998).
A evoluo na produo da cana-de-acar e do etanol no Brasil no perodo
de 2000 a 2007 est apresentada na tabela 1. Neste perodo, a produo passou
326,1 toneladas para aproximadamente 456 toneladas em 2007, representando
um aumento 40% na produo de cana-de-acar, e conseqente aumento na
produo de etanol. Na safra 2007/08, h previso de aumento de 16% na
quantidade da cana-de-acar a ser destinada produo de etanol, em relao
safra de 2006/07 (Strapasson, 2007). Esta indstria ostenta um dos maiores
ndices de empregabilidade nacional, o setor absorve um contingente de mo-de-
obra que se aproxima de 1,5 milhes de pessoas e movimenta R$12,7 bilhes por
ano, entre faturamentos diretos e indiretos, o que corresponde a 2,3% do PIB
brasileiro (Cobra, 2001).
9
O panorama internacional ressalta os ganhos de competitividade da
produo brasileira no mercado mundial, pois nos Estados Unidos o gasto de
produo de um galo de lcool vai de US$1,05 a US$1,20, na Europa de
US$2,00 a US$2,20 enquanto no Brasil fica entre US$0,57 a US$0,64 (Porto,
2005). O objetivo do governo brasileiro transformar o etanol em uma grande
commodity internacional, em conjunto com outros pases (Stapasson, 2007). Na
tabela 02 est apresenta o panorama de exportao do bioetanol no perodo de
1997 a 2006.

10
Tabela 1. Desempenho do setor sucroalcooleiro no perodo de 2000 a 2007
ANO - SAFRA 2000/01 2001/02 2002/03 2003/04 2004/05 2005/06 2006/07*

PRODUO DE CANA PARA TODOS OS USOS
(em mihes de ton) (1)
326,1 344,3 363,7 389,9 416,6 421,8 456,0
REA PLANTADA
(em mihes de ha) (1)
4,88 5,02 5,10 5,50 5,69 5,87 6,16
CANA DESTINADA A FABRICAO DE
ACAR E LCOOL (em milhes de ton) (2)
254,9 292,3 316,1 357,3 381,4 382,4 425,0
PRODUO DE ACAR POR
TONELADA DE CANA (em quilos)
132,8 131,5 137,8 139,4 137,5 137,7 138,0
PRODUO DE ACAR POR HECTARE
( em ton)
8,88 9,02 9,83 9,89 10,07 10,18 9,83
PRODUO DE LCOOL POR
TONELADA DE CANA (em litros)
78,3 77,5 81,2 82,2 80,8 81,2 81,6
PRODUO DE LCOOL POR HECTARE
( em mil litros)
5,23 5,32 5,80 5,83 5,92 5,75 6,00
Fonte:
* Prognstico MAPA 2006/07 e IBGE 2066/07
(1) Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica - IBGE
(2) Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento MAPA.
11
Tabela 2.Exportaes brasileiras de etanol
ANO Milhes de US$ LITROS (bilhes)
Preo mdio
US$/m
1997 54 0,146 370,09
1998 36 0,118 301,21
1999 66 0,407 161,70
2000 35 0,227 153,07
2001 92 0,346 266,57
2002 169 0,759 222,86
2003 158 0,757 208,56
2004 498 2,408 206,68
2005 766 2,592 295,31
2006 1605 3,428 468,20
Fonte:MAPA, 2007
No Brasil, o acar produzido a partir da cana, enquanto na Europa
fabricado a partir da beterraba. Hoje, em nosso pas, a cana tambm utilizada
para a produo do lcool.
importantssimo um trabalho em conjunto entre a lavoura e a indstria, de
forma bem programada nas etapas de corte, escolha de variedades adequadas,
com maior teor de sacarose, e o processamento quase imediato, para evitar a
deteriorao e perdas de acar (Coopersucar, 1987).
Basicamente, a sacarose o principal componente (slido) da cana-de-
acar, sendo indicada na tabela 03 a composio mdia da cana-de-acar e na
tabela 04 a distribuio dos vrios constituintes dessa matria-prima.
(Coopersucar, 1987)
Tabela 3. Composio mdia da cana-de-acar
Composio Teor (%)
gua 65-75
Acares 11-18
Fibras 8-14
Slidos Solveis 12-23
Fonte: Coopersucar, 1987

12
Tabela 4. Principais constituintes de cana-de-acar
Constituintes Slidos Solveis (%)
Acares 75 a 93
Sacarose 70 a 91
Glicose 2 a 4
Frutose 2 a 4
Sais 3.0 a 5.0
De cidos inorgnicos 1.5 a 4.5
De cidos orgnicos 1.0 a 3.0
Protenas 0.5 a 0.6
Amido 0.001 a 0.05
Canas 0.3 a 0.6
Ceras e Graxas 0.05 a 0.15
Corantes 3 a 5
Fonte: Coopersucar, 1987
O mosto de cana de acar obtido pelo esmagamento das canas nas
moendas misturado com gua, tornando um substrato rico em sacarose e em
acares redutores e desta forma est convenientemente diludo para sofrer a
fermentao alcolica. Segundo alguns autores a cana de acar libera caldo
quando submetidas a prensas sendo o resduo prensado dos talos denominado de
bagao. Este quando queimado, origina uma tima fonte de energia no processo
de destilao (Crueger & Cureger, 1993)
O caldo de cana de acar, servindo diretamente como matria-prima para a
fermentao, tem que ser diludo do seu teor de slidos solveis inicial de 16-
16,5Birx para14Brix (Rasovsky, 1973). Entretanto, para outros autores (Gava,
1998), a concentrao de acares no mosto deve estar entre 16 a 20 Brix. Alm
disso, durante a fermentao necessrio o controle de sua densidade, acidez,
13
componentes nutritivos necessrios ao crescimento das leveduras e da
temperatura de fermentao que deve ser mantida entre 28-30C (Rasovsky,
1973; Gava, 1998). Na utilizao de melaos, em alguns casos preciso fazer sua
diluio com gua. A diluio faz-se de modo contnuo, em misturadores
especiais, com freqente superviso para garantir as concentraes adequadas,
diluindo-se os melaos entre 15 e 25Brix, com mdi as de 18 a 20Brix. Mostos
muito diludos fermentam mais rapidamente e sujam menos as unidades de
destilao, mas exigem maior volume til de fermentadores, mais espao para
eles, mais consumo de vapor, mais gua para diluio, exigem um perodo maior
de safra e favorecem as contaminaes, alm de outros inconvenientes. Por outro
lado, os muitos concentrados ocasionam maiores perdas em acares no
fermentados, temperaturas mais altas durante a fermentao, sujam mais os
aparelhos de destilao, e outros inconvenientes, ao lado das vantagens de
diminurem o volume til de dornas e o perodo de safra (Lima, 2001).
O caldo de cana, que apresenta rendimento perto de 80 litros de etanol por
tonelada de cana-de-acar, at o presente momento a nica matria prima
utilizada em escala industrial para a produo do etanol no Brasil. A grandiosidade
do territrio brasileiro permite que o Brasil seja o maior produtor dessa cultura,
utilizando apenas 2.4% da rea agricultvel do solo brasileiro (Andrietta et al,
2006).

3.2. Caractersticas das leveduras
Leveduras so fungos predominantes unicelulares que possuem reproduo
vegetativa por brotamento ou fisso. A sua distribuio na natureza ampla,

14
podendo, na sua maioria, ser encontradas em folhas, flores, frutos, gros de
cereais e outros substratos contendo acares (Castro, 1995). Podem ser tambm
encontradas no solo, no ar, em guas de lagos, rios e mares, sobre a pele e no
intestino de animais e de alguns insetos. A distribuio na natureza ocorre por
vrios vetores, como ventos e corrente de gua e de ar (Potter & Hotchkiss, 1999).
As leveduras so empregadas, com alta freqncia, na obteno de produtos
de consumo dirios, entre eles o po e as bebidas alcolicas, destacam-se as
fermentadas e aquelas posteriormente destiladas. So microrganismos
eucariticos e suas estruturas correspondem basicamente quelas de outras
clulas eucariticas, com uma membrana citoplasmtica que apresenta
permeabilidade seletiva, regulando a entrada e sada de materiais da clula
(Copersucar, 1987). Caracterizam-se por apresentar alta resistncia em condies
ambientais, crescimento a pH baixo de a faixa, presena de sais e temperatura de
at, aproximadamente, 35C. Tm alta taxa de reproduo, podendo reproduzir-se
sexuadamente, formando esporos, ou por reproduo assexuada, envolvendo
brotamento, gemulao ou fisso binria (Lodder, 1971).
As leveduras so, sem dvida alguma, o grupo mais importante de
microrganismos explorado pelo homem. So tambm, reconhecidas como
economicamente importantes por causa de duas reaes de produo de energia:
a respirao oxidativa e a fermentao (Halsz & Lasztity, 1995). Ou seja, por
serem microrganismos anaerbicos facultativos, as leveduras podem respirar ou
fermentar o substrato, e a contribuio de cada um desses eventos depende das
condies do meio (Gancebo & Serrano, 1989). As leveduras necessitam dos
mesmos elementos qumicos que as outras formas de vida: carbono, hidrognio,
15
oxignio, nitrognio, fsforo, potssio, enxofre, magnsio, ferro, zinco, etc. e,
tambm, de fatores de crescimento tais como vitaminas, que so ativos em
concentraes muito baixas (Copersucar, 1987). As leveduras apresentam
membrana celular bem definida, pouco espessa, em clulas jovens; rgidas em
clulas adultas, de constituio varivel, com predominncia de hidratos de
carbono, e menor quantidade de protenas e graxas. Internamente delimitando o
citoplasma, existe a membrana citoplasmtica, mais evidente em clulas adultas,
por plasmlise. No geral, as leveduras se apresentam sem cpsula, se bem que
algumas espcies de Torulopsis se apresentem com cpsula, constituda de
hidratos de carbono (Lima, 1998).
O substrato mais utilizado pelas leveduras, em nvel industrial, a sacarose.
Em estgios iniciais de fermentao, a sacarose hidrolisada por ao da enzima
invertase em monossacardeos estruturais, glicose e frutose, sendo transportada
atravs da membrana celular (De la Fuente & Sols, 1962). A Saccharomyces
cerevisiae ascomictica, sendo a de maior importncia industrial. Ela tem a
capacidade de absorver e fermentar uma grande variedade de acares, como por
exemplo, sacarose, glicose, frutose, galactose e maltose (DAmore & Stewart,
1987). A espcie Saccharomyces cerevisiae e as espcies filogeneticamente
prximas so as mais empregadas pelo homem, que as utilizam em vrias
indstrias de fermentao de substratos aucarados ou amilceos previamente
hidrolisados. Isto fez com que atravs dos tempos, as melhores linhagens para as
diferentes indstrias pudessem ser selecionadas (Vitolo, 1989).
Em geral, leveduras so microrganismos manipulados com relativa facilidade
em processos industriais, sendo consideradas clulas grandes, fortes e robustas

16
por tolerarem certas condies desfavorveis, alm de no serem muito exigentes
nutricionalmente. Assume-se, portanto, que sejam clulas fceis de manter (Vitolo,
1989). As clulas vegetativas da maioria das leveduras industriais variam em
tamanho, de 4 a 8 de largura por 7 a 12 de comprimento, havendo,
evidentemente, espcies maiores e espcies menores que as citadas. Forma e
tamanho das clulas, mesmo em espcies monomorfas, podem variar de acordo
com o nutriente, as condies ambientais, o estado fisiolgico ou a idade (Lima,
1998).
Atualmente, as leveduras usadas na indstria alcooleira, de acordo com a
literatura tcnica mundial so classificadas em (Batista, 2003):
Selvagens: quando apresentam as caractersticas favorveis em nveis
pouco otimizados;
Prensadas: so leveduras selecionadas para a indstria de panificao.
Conseqentemente, so facilmente obtidos em grande quantidade no
comrcio, pois embora muito procuradas, no so especficas para a
produo de lcool;
O crescimento a temperaturas elevadas acima de 40
o
C em meios com altos
teores de acares ou cloreto de sdio, o requerimento de vitaminas, a
susceptibilidade a certas drogas como a ciclohexamida e a produo de
determinados metablitos so critrios tambm utilizados na descrio e
classificao de leveduras, e so importantes, uma vez que auxiliam no
agrupamento das linhagens de acordo com o habitat da levedura (Castro, 1995).
As caractersticas genticas que os fermentos ou levedos teriam que ter para
uma boa produo industrial de lcool so (Batista 2003):
17
Alta velocidade de fermentao: definida como a quantidade de acar
fermentada em determinada unidade de tempo por um determinado peso
de levedura. Essa caracterstica de relevante importncia, pois se a
fermentao for mais rpida, o volume das dornas ser menor e
conseqentemente, o investimento nesse setor poder ser reduzido, da
mesma forma que os riscos de contaminao por bactrias;
Alta tolerncia ao lcool: as leveduras mais tolerantes ao lcool produzem
vinho com teor alcolico maior, porque podem desdobrar maiores
quantidades de acares. Leveduras com essas caractersticas aumentam
a capacidade de fermentao e de destilao das instalaes industriais
tornando possvel trabalhar com o vinho mais concentrado;
Tolerncia a altas temperaturas: embora as temperaturas elevadas (35 a
40C) sejam indesejveis, na medida em que possam f avorecer a
evaporao de lcool e o desenvolvimento de bactrias contaminantes, as
leveduras tolerantes juntamente com as tcnicas de fechamento das dornas
e recuperao do lcool evaporado, podem superar esses problemas. Essa
caracterstica particularmente interessante para pases tropicais como o
Brasil;
Estabilidade: as caractersticas citadas anteriormente podem ser mantidas
em uma raa de levedura (fermento), em condies de fermentao
adequadas;
Tolerncia a meios de elevada acidez: as leveduras que superam
contaminaes de bactrias, geralmente no so muito resistente a meios
muito cidos.

18
Somente poucas espcies desses microrganismos so utilizadas na fabricao
de lcool, destacando-se o Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces
pombe, quando o substrato constitudo por hexoses, e Candida utilis, quando
uma parcela do substrato for constituda por pentoses (Batista, 2003).

3.3. Fermentao alcolica
A fermentao alcolica a ao de leveduras sobre acares fermentescveis
contidos em uma soluo/suspenso. um processo biolgico no qual a energia
formada por reaes de oxidao parcial pode ser utilizada para o crescimento de
leveduras e a oxidao parcial anaerbia da hexose na produo de lcool e CO
2

(Lima & Marcondes, 2002).
A transformao do acar em etanol e CO
2
envolvem 12 reaes em
seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica, conforme
apresentado na Figura 1. Tal aparato enzimtico est confinado no citoplasma
celular dos microrganismos fermentativos, sendo, portanto, nessa regio da clula
que a fermentao alcolica se processa (Lima et al, 2001).
A simplificao se d em trs etapas (Lima & Marcondes, 2002):
1- Via aerbia
C6H12O6 respirao CO
2
+H
2
O (crescimento celular rpido) Equao 1
2- Via anaerbia
C
6
H
12
O
6
fermentao C2H5OH+CO2 (crescimento celular lento) Equao 2
C
6
H
12
O
6
+2ADP +PO
4
-3
2C
2
H
5
O+ 2CO
2
+2ATP+H
2
O Equao 3
19

Figura 1. Seqncia de reaes enzimticas pela fermentao alcolica de
carboidratos endgenos (glicognio e trealose) ou exgenos (sacarose e maltose),
conduzida por Saccharomyces cerevisiae (Lima et al, 2001).

20
O lcool produzido durante a fermentao dependente da quantidade de
acares presentes no mosto. O processo se inicia por meio da atuao da
exoenzima invertase, a qual, por meio de hidrlise, transforma o acar (sacarose)
em glicose e frutose (monossacardeos estruturais). Esses monossacardeos
sero absorvidos pela clula da levedura (aerbio facultativo), que em condies
de aerobiose sero utilizadas no processo de respirao da mesma (Nobre 2005).
O objetivo primordial da levedura, ao metabolizar anaerobicamente o acar,
gerar uma forma de energia (ATP, adenosina trifosfato) que ser empregada na
realizao dos diversos trabalhos fisiolgicos (absoro, excreo e outros) e
biossnteses, necessrias manuteno da vida, crescimento e multiplicao,
para perpetuar a espcie. O etanol e CO
2
resultantes se constituem, to somente,
de produtos de excreo, sem utilidade metablica para a clula em anaerobiose.
Entretanto, o etanol, bem como outros produtos de excreo, (como o glicerol e
cidos orgnicos) podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e
biomassa, mas apenas em condies de aerobiose (Lima et al,2001).
O processo de produo de etanol difere drasticamente de outras
fermentaes industriais. Existem vrias peculiaridades no que se refere a esse
tipo de fermentao uma delas refere-se ao substrato; o mosto a ser fermentado
no sofre nenhum tratamento no sentido de eliminar a microbiota do caldo de
cana-de-acar (Andrietta, 2006).
A fermentao industrial envolve reciclo de clulas de leveduras, podendo
ocorrer tambm reciclo de clulas de microrganismos contaminantes. Os
principais contaminantes da fermentao so bactrias, estas acarretam ao
processo alguns problemas como: consumo de acar, queda na viabilidade
21
celular e morte das leveduras devido a toxinas lanadas no meio (Althertum et a
al, 1984).

3.4. Contaminantes do processo de produo de etanol
A presena de microrganismos no processamento de cana-de-acar
ocorre desde a lavoura at o setor de fermentao, sendo que a contaminao
bacteriana presente no caldo de cana e no mosto pode refletir a qualidade da
matria-prima utilizada, pois, tanto o caldo quanto o mosto so timos substratos
para o crescimento de microrganismos devidos aos teores de nutrientes orgnicos
e inorgnicos, alta atividade de gua, pH, alm da temperatura que ocorrem nos
processo industriais de fermentao (Gallo, 1990; Gallo & Canhos, 1991; Amorim
& Oliveira, 1982).
Gallo e Canhos (1991) relatam que a contaminao total de mesfilos da
cana da ordem de 10
5
a 10
7
UFC/mL quando a cana sadia, podendo atingir
valores de 10
8
UFC/mL quando a cana no sadia ou ficou armazenada por
longos perodos. Os autores ressaltam ainda que o caldo misto, mistura dos
caldos de diversas moendas, um meio favorvel ao desenvolvimento de muitas
espcies microbianas por apresentar um teor de slidos solveis de 10-18Brix,
pH 5,0-5,6, temperatura de 25-30C, aminocidos, sais orgnicos e outros
nutrientes. Nolasco Jr (2005) analisou mosto de cana-de-acar proveniente da
sada do decantador e encontrou contagem mdia para esporos mesoflicos
aerbios de 35esporos/mL, para esporos termoflicos aerbios produtores de Flat-
sour de 35 esporos/mL, e para bactrias mesfilas totais de ordem de
10
2
UFC/mL, no entanto, Nolasco e Finguerut (1998), ao analisarem os

22
fluxogramas de processo e preparo de mosto at a fermentao e os
equipamentos existentes nesse processo, verificaram invariavelmente que os
mostos chegada na fermentao apresentavam contagens de bactrias lcticas
da ordem de 10
6
UFC/mL alm de esporos mesfilicos e termoflicos da ordem de
10
1
esp/mL.
Um levantamento dos microrganismos em indstrias de lcool de So
Paulo indicou que cerca de 60% das espcies bacterianas isoladas eram do
gnero Lactobacillus seguido de Bacillus com 26,58%, destacando-se as
espcies: L. fermentun (15,04%) e L. helveticus (14,08%) e B.coagulans (15,09%)
e B. stearothermuphillus (6,91%) (Gallo, 1990).
A contaminao bacteriana na fermentao um dos problemas que afeta
o rendimento do processo de produo de lcool (Alcarde,2001; Oliva-Neto &
Yokoya, 1997) , em mdia de 1.5% a 5% de queda no rendimento do processo
fermentativo dependendo da forma como conduzido o processo fermentativo
(Formaggio e Finguerut, 1998). No entanto, Essia Ngang et al (1989) relataram
30% de perda no rendimento na produo de lcool de beterraba . Na
fermentao conduzida com cultura mista com lactobacilo, a levedura perde 96%
da viabilidade em aproximadamente 12 horas (Essia Ngang et al, 1992).
Os bacilos so microrganismos que habitam o solo, podendo ser
carregados, no corte da cana, com parte do solo que fica aderido na cana e
posteriormente contaminar o caldo e os equipamentos. E havendo condies
favorveis para a multiplicao dos bacilos, estes causam transtornos ao processo
fermentativo, as principais espcies de bacilos contaminantes do processo de
etanol so o Bacillus coagulans e Bacillus stearothermophilus (Gallo, 1990). Em
23
trabalho realizado por Nolasco Jr (2005), foram determinados os parmetros
cinticos para B. stearothermophilus, para tanto foram utilizadas temperaturas
entre 98-130C, os valores obtidos para a energia de ativao e o valor z foram
249.52 kJ/mol e 11.48C, respectivamente. Ainda baseado no tempo de residncia
mdio no decantador, o autor pode constatar que os esporos de B.
stearothermophilus sofriam apenas 0.14 redues decimais neste equipamento.
Leveduras e bactrias lcticas so freqentemente encontradas juntas em
ecossistemas naturais e podem competir pelos mesmos nutrientes. Gallo (1990) e
Oliva-Neto (1990) constataram a predominncia de bactrias lcticas no processo
de fermentao alcolica. As caractersticas que levam predominncia das
bactrias lcticas no processo fermentativo so: o metabolismo fermentativo, o
que capacita o crescimento rpido em meio rico em acar fermentescvel; alta
tolerncia a pH baixo e particularmente sua habilidade de crescimento rpido em
solues cidas; muitas espcies apresentam cpsula polissacardicas e secretam
gomas extracelulares as quais protegem as clulas dos efeitos letais do calor, de
agentes qumicos e da desidratao; algumas espcies so capazes de crescer
em temperaturas relativamente altas (Gallo e Canhos, 1991; Narendranath et al,
1994).
A maioria dos trabalhos identificou e tornou evidente a predominncia de
bactrias Gram positivas e em forma de bastonetes no processo industrial de
fermentao alcolica com destaque para os gneros Bacillus e Lactobacillus e
dentro do ltimo gnero as espcies L.fermentum e L. helveticus. Como os
lactobacilos competem com as leveduras pelos acares presentes no mosto, e
tm maior incidncia neste processo, foram escolhidos para este estudo.

24
3.5. Caractersticas morfolgicas e citolgicas de Lactobacillus fermentum
As bactrias lcticas so descritas como Gram positivas, no esporognica,
catalase negativa, citocromo ausente, no aerbia, mas aerotolerante, exigente
quanto aos fatores nutricionais, tolerante a cido e estritamente fermentativa como
a formao de cido lctico como principal produto da degradao do acar. So
geralmente associadas ao habitat rico em nutrientes como leite, carne e produtos
vegetais, mas alguns membros so associados pele e mucosa de mamferos
podendo at ser patognico ao hospedeiro (Costa, 2006). Geralmente, este grupo
de microrganismos caracterizado por serem fastidiosos, que exigem substratos
complexos com nucleotdeos, aminocidos, carboidratos e vitaminas,
principalmente a vitamina B1 com destaque para pantotenato de clcio, niacina e
tiamina. Desenvolvem-se em meio ligeiramente cido, com pH entre 4.4 e 6.4 e
em condies microaerfilas.
As bactrias pertencentes ao gnero Lactobacillus apresentam uma grande
importncia na indstria alimentcia, pois as mesmas so utilizadas tanto como
culturas iniciadoras em processos fermentativos, quantos nos leites fermentados
ou iogurtes na forma de probiticos (Kandler & Weiss, 1986).
O gnero Lactobacillus pode ser dividido em trs grupos distintos quanto ao
modo como realizam a degradao dos carboidratos (Kandler & Weiss, 1986). Os
trs grupos se assemelhem pelo fato de degradarem apenas hexoses, no entanto,
diferem pelo modo como o esqueleto carbono de tais compostos so
metabolizados:
25
Homofermentativos obrigatrios: atravs da via de Embden-Meyerhof
convertem 1 mol de hexoses em 2 moles de cido lctico e no fermentam
pentoses ou glucanato;
Heterofermentativos facultativos: realizam a fermentao de forma
semelhante ao grupo homofermentativo, contudo, algumas espcies
produzem outros cidos (actico) em condies limitantes de glicose.
Convertem pentoses em acido lctico e actico via fosfocetolase indutvel;
Heterofermentativos obrigatrios: convertem 1 mol de hexoses em 1 mol de
CO
2
, e 1 mol de cido lctico atravs da via 6-fosfoglucanato. Pentoses so
convertidas a cido lctico e actico.
Oliveira et al (1995) referem-se espcie L.fermentum como sendo bastonetes
de 0.5 a 0.9 m de largura e comprimento bastante varivel, apresentam-se
isolados e aos pares, Gram-positivos, no esporulados e raramente com
motilidade. Tambm apresenta as seguintes caractersticas fisiolgicas: so
anaerbios facultativos, heterofermentativos, apresentam catalase negativa, com
temperatura tima entre 30C e 40C e pH timo na faixa de 5.5 a 5.9.
A espcie L.fermentum compreende muitas linhagens e a maior parte delas
fermenta frutose, galactose, glicose, gluconato, lactose, maltose, manose,
melobiose, rafinose, ribose e sacarose, porm determinadas espcies tambm
fermentam a arabinose, celobiose, trealose e xilose (Kandler & Weiss, 1986).
Durante o processo de fermentao do acar, podem ser produzidos cidos
D-lctico e L-lctico, ou ainda a mistura racmica dos ismeros em propores
variveis. Tal aspecto decorrncia da existncia de enzimas desidrogenases

26
lcticas esteroespecficas, produzindo separadamente os ismeros D e L (Costa,
2006).
Guchte et al (2002) relatam que o efeito do cido lctico sobre a prpria
bactria no conhecido em detalhes, mas aceito que ocorre a difuso passiva
e que o acmulo intracelular reduz o pH intracelular e ento afeta a
permeabilidade da membrana. A proporo de cidos graxos presentes na
membrana plasmtica da bactria determina a sua resistncia aos estresses
causados pela presena de cidos.

3.6. Influncia dos contaminantes no processo de fermentao alcolcia
De acordo com a reao estequiomtrica de Gay-Lussac, o rendimento da
fermentao alcolica expresso em quantidade de produto formado (etanol) por
unidade de acar consumido. Em funo disto, todo acar que no convertido
em lcool, e sim em outros produtos, faz com que haja diminuio no rendimento
do processo de produo de etanol (Nobre, 2005).
O consumo da sacarose resultando na formao dos cidos lctico e actico,
como os principais cidos orgnicos formados, um dos principais prejuzos
causados pelas bactrias contaminantes no processo de produo de etanol
(Nobre, 2005). Outros compostos como a formao de goma, que aumenta a
viscosidade do caldo e podem causar entupimento nas tubulaes, centrfugas,
peneiras e trocadores de calor; a floculao do fermento, que diminui a velocidade
de fermentao, acarreta perda de clulas de leveduras pelo fundo da dorna e
dificulta a operao das centrfugas tambm so associados por diversos autores
perda no rendimento alcolico (Oliva-Neto e Yokoya, 1997).
27
As bactrias lcticas exercem um efeito inibidor sobre a levedura em funo da
presso osmtica exercida pela presena do cido lctico no meio de cultivo
(Essia-Ngang et al, 1989). Essia- Ngang (1992) estudaram a estimulao no
desenvolvimento de L. casei em cultura mista com S. cerevisiae em meio de
melao de beterraba e relataram que o estmulo, ao lactobacilo, tambm ocorre
devido hidrlise da sacarose em hexoses proporcionando maior facilidade de
assimilao dos carboidratos pela bactria.
A contaminao bacteriana considerada a maior causa da reduo na
produo de etanol durante a fermentao de meios amilceos, de usque
escocs e de mosto de cana, por S. cerevisiae. O estmulo no desenvolvimento do
Lactobacillus sp., quando em cultura mista devido excreo de nutrientes, da
levedura para o meio, como adenina, guanina, cido asprtico e nicotnico,
triptofano, glicina, alanina e lisina, biotina e vitamina B12 (Narendranath et al,
1997; Chin & Ingledew, 1994).
Oliva-Neto & Yokoya (1997) pesquisaram o desenvolvimento de trs linhagens
de L.fermentum, contaminantes isolados de destilarias brasileiras, em meios de
cultivo com diferentes composies em aminocidos e em cultura mista com S.
cerevisiae. A anlise dos resultados demonstrou que uma das linhagens
estudadas no se desenvolveu na ausncia de algum dos seguintes aminocidos:
fenilalanina, alanina, cido glutmico, cistina, prolina, histidina, arginina, teronina,
triptofano, serina e metionina. Tambm evidenciou que todas as linhagens
testadas no se desenvolveram em meios ausentes dos aminocidos leucina,
isoleucina e valina, porm todas as linhagens desenvolveram-se em cultura mista
com a levedura. Portanto, o estmulo ao desenvolvimento bacteriano tambm

28
causado pela liberao de aminocidos e presena de aminocidos no meio
fermentativo causada pela autlise das leveduras. O desenvolvimento bacteriano
favorecido nos estgios finais do processo fermentativo (Oliva-Neto, 1995).
Chin e Ingledew (1994) relataram que a contaminao com aproximadamente
10
8
UFC/mL de bactrias produtoras de cido lctico no afetou seriamente a
produtividade em etanol na fermentao de malte de trigo, mesmo com o aumento
gradual da concentrao de cido lctico ao longo de 5 fermentaes, mas
ocasionou uma reduo de 60% na viabilidade da levedura nas ltimas
fermentaes. No entanto, Essia Nang et al (1989) observaram uma reduo de
30% na produtividade de etanol da fermentao do mosto de beterraba quando a
concentrao de cido lctico, produzido pelas bactrias contaminantes atingiu,
5.0g/L.
Alterthum et al (1984) relatam que a elevada porcentagem de leveduras
mortas, bem como o aumento da acidez do mosto, mostra a provvel liberao de
substncias txicas, como cidos, pelas clulas bacterianas, no meio de cultura
promovendo a morte das leveduras ou mesmo dificultando seu desenvolvimento.
Da mesma forma, a grande quantidade de acares residuais presentes no mosto
fermentado confirma o fato de que as clulas de levedura existentes esto
enfraquecidas e incapacitadas de utilizar adequadamente o substrato disponvel.
Por outro lado, a perda no rendimento do etanol no justifica a elevada
concentrao de acares consumida, sugerindo que a mesma tenha sido
destinada para a formao de outros produtos ou que o etanol formado tenha sido
consumido pelos microrganismos infectantes.
29
Ferguglia (1997) relatou queda de 97% na viabilidade de S. cerevisiae aps 12
horas e 98% aps 30 horas em cultura mista com L.fermentum, quando cultivados
em meio de caldo de cana-de-acar suplementado com peptona e extrato de
levedura. Entretanto, o autor no destaca o nvel de contaminao ao qual a
levedura foi exposta.
Thomas et al (2001) avaliaram as interaes entre Saccharomyces cerevisiae
e algumas cepas de lactobacilos na fermentao de macerado de milho para a
produo de etanol. Com esta pesquisa, os autores verificaram que durante o
processo de fermentao houve decrscimo no rendimento do etanol, queda
rpida na viabilidade das leveduras aps a exausto dos acares
fermentescveis, aumento no desvio de carboidratos para a produo de glicerol e
cido lctico, reduo na proliferao de leveduras, quando a contaminao do
lactobacilo atingia elevados nveis (~10
9
UFC/mL). No entanto o crescimento do
lactobacilo inibido quando a levedura est presente em maior nmero, ou
quando a S. cerevisiae inoculada em igual concentrao que o lactobacilo.
Qualquer correlao entre o tamanho da contaminao bacteriana e perdas no
rendimento em etanol precisa ser mais bem compreendida, embora seja bvio que
cada molcula de acar direcionada para a produo de cido lctico pela
bactria resulta em perdas de duas molculas de etanol que poderiam ser
produzidas pelas clulas de leveduras (Nobre, 2005). Por outro lado, apesar da
importncia atual deste processo para o Brasil, no existem dados quantitativos na
literatura dos parmetros bsicos de crescimento como tempo de adaptao,
populao mxima da levedura e do lactobacilo quando em cultura mista, apenas
dados para a velocidade de crescimento so descritos na literatura.

30
3.7. Modelagem do crescimento da levedura em bioprocessos
A modelagem dos bioprocessos complicada, pois envolve crescimento
microbiano sob mudanas constantes nas condies de processo, impactando
diretamente na cintica da fermentao (Rivera et al, 2007).
Phisalaphong et al (2006) descreveram o efeito da temperatura no
crescimento de Saccharomyces cerevisiae em melao de cana e verificaram que
temperaturas altas, por volta de 45C causavam decrscimo no rendimento de
etanol e na massa celular, e ainda que a taxa de crescimento da levedura variou
de 0.1h
-1
a 0.78h
-1
. Damore et al (1987) observaram que em temperaturas mais
elevadas (40C) ocorre um aumento na permeabilidade da membrana plasmtica
em conseqncia da alterao da composio de cidos graxos. Ocorre que, em
temperaturas elevadas, h um acrscimo de cidos graxos insaturados que
proporcionam tima fluidizao na membrana para atividades celulares. Segundo
Yamamura et al (1991), devido a esse aumento da fluidizao da membrana,
clulas de leveduras crescendo a temperaturas elevadas so facilmente sujeitas
lise celular.
Rivera et al (2007), utilizaram uma cepa de S.cerevisiae isolada de uma
planta industrial de fermentao, para modelagem do processo fermentativo
utilizando melao de cana-de-acar. Estes autores verificaram que a 34C a
levedura tinha sua taxa de crescimento aproximadamente 0.4h
-1
. No entanto, a
esta temperatura apesar da levedura apresentar elevada taxa de crescimento, a
produo de etanol e o rendimento celular estes sofreram reduo de 140 Kg/m
3
a
30C para aproximadamente 76Kg/m
3
e 90 Kg/m
3
para aproximadamente 45
Kg/m
3
respectivamente.
31
Alm da influncia da temperatura nos parmetros de crescimento da
levedura, deve-se levar em considerao a contaminao bacteriana no mosto,
pois esta a maior causa de perda de rendimento no processo fermentativo. A
influncia do lactobacilo nos parmetros de crescimento da levedura foi relatado
por Narendranath et al (1997) em fermentao de macerado de trigo. Variando a
concentrao de clulas de lactobacilo de 10
5
a 10
8
UFC/mL, verificaram que, com
o aumento no nvel de inculo inicial de 10
5
para 10
9
UFC/mL, a taxa de
crescimento da levedura sofria decrscimo de 0.42 para 0.36h
-1
, demonstrando
assim que o lactobacilo tem influncia na taxa de crescimento da levedura.
As demais pesquisas realizadas (Oliva-Neto &Yokoya, 1997; Nobre, 2005)
para determinar a influncia do lactobacilo nos processos fermentativos relatam
como resultados a utilizao dos nutrientes excretados pela clula de levedura,
pelo lactobacilo para o crescimento durante o processo, e como conseqncia
deste fenmeno h a reduo na viabilidade celular e na produtividade de etanol.
A informao quantitativa dos parmetros de crescimento escassa.

32
PARTE II: MICROBIOLOGIA PREDITIVA
3.8. Microbiologia preditiva
A microbiologia preditiva surgiu descendendo de duas linhas de pesquisas
isoladas. Uma delas o controle da deteriorao de peixe fresco, e a segunda
rea a preveno de botulismo e outras intoxicaes microbianas (Ross &
McMeekin, 1994). O conceito de microbiologia preditiva est baseado no
conhecimento detalhado da resposta microbiana a mudanas ambientais, sendo
possvel predizer, atravs de observaes passadas, a resposta dos
microrganismos em um novo ambiente similar (Jagannath & Tsuchido, 2003;
McMeekin et al, 2002; Dens & Van Impe, 2001). Essas mudanas podem ser
aplicadas para adotar medidas de segurana alimentar, avaliando o efeito de
operaes como processamento, distribuio e estocagem dos alimentos e vida
de prateleira (McMeekin et al, 2002). Nos ltimos dez anos, muitas pesquisas tm
sido desenvolvidas nessa rea.

3.9. Planejamento experimental para modelagem preditiva
A anlise dos impactos dos fatores ambientais sob a resposta dos
microrganismos a fonte primria de dados para desenvolver modelos preditivos.
Para a investigao desta influncia com preciso, necessrio descrever esta
interao que uma importante considerao para desenhar os experimentos
(Rasch, 2004). Na etapa de planejamento, devem ser definidas algumas
caractersticas relacionadas (s) varivel(eis) independente(s), varivel
dependente, ao inculo e ao modelo experimental (Nakashima et al, 2000).
33
A faixa de condies, sobre as quais o modelo tem que operar tem que ser
definida, pois os modelos empricos no so aplicados alm da faixa definida na
qual o modelo foi gerado. Nessas condies, requerido que os fatores de
crescimento possam ser alterados facilmente (Blackburn, 2000).
Os tempos da amostragem so consideraes importantes para a aplicao
prtica do planejamento e devem ser concentrados em torno das regies de
mudanas mais rpidas da curva de crescimento, como o final da fase de
acelerao negativa para modelos de crescimento. A escolha das combinaes
dos fatores deve tambm ser considerada. Pode ser o caso de um planejamento
composto central mais apropriado para gerar modelos particulares, como aqueles
para a inativao trmica. Entretanto, para outros modelos, tais como aqueles que
descrevem uma regio de interesse, pode ser na rea onde a resposta que est
sendo medida mais varivel (interface de crescimento / no crescimento) ento
as medies podero necessariamente ser tomada nestas regies. O uso de
procedimentos de screening pode ser til para definir as variveis de interesse e
o uso de medidas de densidade tica para acompanhar o crescimento pode ser
particularmente usado para este propsito (Blackburn, 2000).

34
3.9.1. Desenho composto central
O desenho composto central consiste em um desenho fatorial completo 2
k
,
acrescido dos pontos centrais e axiais (Rasch, 2004). O nmero de experimentos
determinado atravs de 2
k
+2*k+n
o
, onde k o nmero de variveis do processo
e n
0
o nmero de pontos centrais(n
0
1), por exemplo um planejamento com k=2
e 3 e n
0
= 2, resulta em 9 e 16 ensaios respectivamente (Rasch, 2004).

3.10. Coleta de dados experimentais para a construo dos modelos
preditivos
A parte mais minuciosa, do trabalho experimental, a gerao de dados de
crescimento, sobrevivncia ou inativao trmica do microrganismo
(BlackBurn,2000). Para determinar a quantidade celular de microrganismos em
funo do tempo, pode-se utilizar vrios metdos de aquisio de dados. O
mtodo mais utilizado para a modelagem preditiva a contagem de clulas viveis
por ser realizada por contagem em placas com meio de cultura. No entanto, um
mtodo laborioso considerando o grande volume de dados a serem coletados
(Rasch, 2004). Alguns mtodos alternativos tm sido usados, como a medida de
densidade tica, onde aumenta a turbidez do meio de cultura com o crescimento
microbiano (Rasch, 2004). Para o cultivo de fungos, usualmente utiliza-se a
medida do crescimento radial, sendo o modelo de Baranyi & Roberts (1994), o
mas utilizado para o ajuste dos dados (Rasch, 2004).
O crescimento microbiano pode ser caracterizado pela figura 2.
35

Figura 2. Curva padro do crescimento bacteriano a temperatura constante

O significado biolgico de cada uma das fases da curva de crescimento
microbiano (Figura 2) pode ser assim definido (Nakashima et al, 2000):
Fase de adaptao ou fase lag: ajuste da fisiologia e bioqumica das
clulas para que possam ser capazes de explorar o ambiente onde se encontram.
Fase exponencial: fase de crescimento balanceado, ou seja, a sntese de
cada componente celular (enzimas, molculas estruturais, DNA, etc.) ajustada
para que no exista sntese alm do necessrio para a produo de novas clulas.
Todo o metabolismo est direcionado para a reproduo. Nesta fase, todos os
componentes celulares esto presentes em propores constantes e as clulas
so consideradas praticamente fisiologicamente idnticas. A velocidade de
crescimento, na fase exponencial, pode ser expressa como velocidade de
crescimento absoluta que indica o aumento da densidade da populao com o
tempo, ou como .velocidade de crescimento relativa ou especfica, que indica o
aumento da densidade da populao em um determinado intervalo de tempo,
dividido pela densidade de clulas no tempo final deste intervalo. O tempo

36
necessrio para a populao microbiana dobrar denominado de tempo de
gerao .
Fase estacionria: morte celular e lise devido ao acmulo de metablitos
txicos no meio de crescimento. Nesta fase, a velocidade de morte celular
equivalente velocidade de crescimento. Em condies que permitam o
crescimento celular.
Fase de declnio: Maior acmulo de substncias txicas, determinando uma
velocidade de morte celular maior do que a capacidade do meio em proporcionar a
reproduo ou diviso celular.
A fase lag e a exponencial so as de maior interesse para os
microbiologistas de alimentos pois, para a maioria dos alimentos, a deteriorao
ocorre antes dos microrganismos chegarem fase estacionria.
No caso de um estudo de vida de prateleira de produto, quanto maior a fase
lag, maior a vida de prateleira, assim como quanto maior a velocidade de
crescimento na fase exponencial, menor a vida de prateleira.

3.11. Influncia do inculo nos parmetros de crescimento dos
microrganismos
Os modelos preditivos foram tradicionalmente desenvolvidos utilizando como
inculo inicial concentraes celulares de microrganismos prximas aos nveis
encontrados em alimentos. Os pesquisadores desenvolveram os modelos de
forma a justificar a aproximao para a construo dos mesmos. O tamanho da
populao inicial elevada tambm representa uma m aproximao conservadora
37
do caso a ser modelado, porm as altas concentraes celulares asseguram a
repetibilidade e simplificam a variabilidade microbiana (McKellar & Lu, 2004).
A densidade do inculo inicial um importante parmetro (Malakar, et al,
2003). Nakashima et al (2000) relatam que uma mistura de 3 a 5 cepas de um
mesmo patgeno freqentemente utilizada para inocular um meio de
crescimento que ser modelado. Esta prtica experimentalmente vivel e resulta
em modelos para as cepas de crescimento mais rpido ou de maior resistncia
nas condies ambientais de estudo. O uso de uma mistura de cepas aumenta a
probabilidade de se criar um modelo representativo da situao real.
Nakashima et al (2000) e Blackburn (2000) relataram que a durao da fase
lag pode ser influenciada pelo tamanho do inculo, dependendo do limite de
deteco do mtodo de determinao da varivel de resposta a ser modelada.
Porm, McKellar & Lu (2004) afirmam que em alguns casos o tamanho do inculo
no afeta a resposta a ser modelada (i.e. taxa de crescimento). O estado
fisiolgico do microrganismo (estresse no ambiente versus preparao do inculo
no laboratrio) tem que ser considerado, pois afeta de forma mais intensa a fase
lag do que a taxa de crescimento (Miconnet et al, 2005).
Van Impe et al (2005) realizaram um estudo sob a influncia da
concentrao do inculo de Lactobacillus lactis nos parmetros de crescimento da
Listeria innocua e obtiveram como resultado que, com o aumento do inculo de L.
lactis de 10
3
UFC/mL para 10
7
UFC/mL, no havia influncia na taxa de
crescimento da listeria porm a populao mxima de L.innocua diminua de
10
6
UFC/mL para 10
2
UFC/mL com o aumento da concentrao do inculo em co-
cultura.

38
3.12. Modelagem matemtica
O termo modelo foi definido em diversas e excelentes revises de
modelagem matemtica de processos microbiolgicos. O termo modelo
matemtico mais rigoroso e se refere a um conjunto bsico de hipteses nos
processos estudados, alguns deles expressos por meios de funes e equaes
(diferenciais). Portanto, de um ponto de vista mecanstico, funo e modelo no
so termos equivalentes. Funo uma abstrao matemtica que torna mais
fcil a descrio de um modelo particular (Baranyi & Roberts, 1995).
A varivel primria pode ser a taxa de crescimento, tempo inativao
trmica, ou tempo para um evento acontecer, ou ainda, condies para atingir, e
tambm a probabilidade de um evento acontecer em um tempo pr-determinado
(Jagannath & Tsuchido, 2003).
Em um consenso geral, um modelo um sistema simplificado que usa
combinaes de descries, atravs de funes ou equaes matemticas, e com
condies iniciais especficas. Os modelos podem ser divididos em duas classes:
descritivos e explanatrios, sendo este ltimo composto por modelos analticos e
numricos. Modelos descritivos (i.e. de observaes, empricos, Black Box ou
indutivos) tm dados dirigidos,sendo que as aproximaes como as funes
polinomiais, redes neurais artificiais, e anlise do componente principal utilizada
para classificar os dados. difcil fazer predies verdadeiras com essa classe de
modelo, pois os modelos obtidos no podem ser extrapolados alm dos dados
utilizados para a construo do mesmo (McKellar & Lu, 2004).
Os modelos explanatrios (ou mecanstico, dedutivo, ou White Box), tm
como objetivo relacionar os dados com os princpios cientficos fundamentais, ou
39
com um processo fisiolgico mensurvel. Muitos modelos de microbiologia
preditiva que tm seus parmetros relatados a partir fenmenos observados so
considerados mecansticos. Estes modelos analticos so explicitados em forma
de equaes que se ajustam aos dados experimentais. Para ser verdadeiramente
mecanstico um modelo deve, no entanto, levantar perguntas e hipteses novas
que possam ser testadas (McKellar & Lu, 2004).
Os modelos so geralmente baseados em diversas hipteses biolgicas, na
interpretao das diferentes fases do crescimento microbiano, onde o principal
esforo est direcionado para estudar a fase lag cuja significncia biolgica ainda
vaga (Baty & Delignette-Muller, 2004).

3.12.1. Parmetros de crescimento
Microbiologistas usam classicamente trs parmetros para caracterizar a
curva de crescimento microbiano: tempo de adaptao (), a velocidade especfica
de crescimento () e a populao mxima (Rg), os parmetros estimam vrios
campos notveis na microbiologia de alimentos (Baty & Delignette-Muller, 2004).

3.12.1.1. Tempo de adaptao ()
um fenmeno inerente cintica microbiana, no qual tipicamente
observado como uma resposta tardia da populao microbiana mudana de
ambiente. A fase lag ocorre em ambos os processos crescimento e inativao
(Swinnen et al, 2004). Durante a fase de adaptao, os microrganismos passam

40
por mudanas intracelulares, para adaptarem ao novo ambiente (Yates & Smoter,
2007).
Yates e Smoter (2007) desenvolveram um modelo para descrever a fase de
adaptao dos microrganismos. O modelo comportamental descrevia trs
subpopulaes: (i) as clulas inicialmente no duplicadas que se adaptariam e
posteriormente seriam duplicadas; (ii) a clulas adaptadas que cresceriam em um
novo ambiente; (iii) e as clulas que morreriam e no adaptariam ao novo
ambiente. Um modelo de crescimento foi apresentado, incluindo a fase de
adaptao, fase exponencial e a fase estacionria, onde as curvas de crescimento
dependiam da taxa de crescimento e morte das trs subpopulaes e da poro
inicial de cada uma delas.

3.12.1.2. Taxa especfica de crescimento ()
A velocidade especfica de crescimento um importante parmetro para
modelar o crescimento microbiano, pois avalia a capacidade de crescimento do
microrganismo mostrando se h dificuldades ou no (Perni et al, 2005).
Em pesquisa realizada por Perni et al (2005), comparou-se os valores da
taxa mxima de crescimento predita pelos modelos de Gompertz, Logstico e
Baranyi com dados experimentais do crescimento de Listeria monocytogenes e
Listeria innocua, usando a absorbncia para quantificar a concentrao de clulas.
Todos os modelos tiveram bons ajustes, no entanto, comparando o valor de
obtido a partir do Gompertz e o modelo logstico os resultados foram bastante
similares, porm quando comparado que ao modelo de Baranyi os valores
preditos eram substancialmente diferentes.
41
3.12.1.3. Populao mxima (Rg)
A populao mxima um importante parmetro para trabalhos em cultura
mista, pois esta pode sofrer redues significativas com relao a cultura pura,
levando-se em considerao fatores ambientais como temperatura e nutriente
presente no meio de cultura. Em trabalho realizado por Vam Impe et al (2005), a
Listeria innocua quando cultivada em cultura pura atinge uma populao mxima
de 10
9
UFC/mL, e sofre uma reduo para 10
2
UFC/mL quando cultivada com
10
7
UFC/mL de Lactococcus lactis.

3.13. Modelagem primria
Os modelos primrios de crescimento descrevem a cintica microbiana
definindo precisamente as fases de crescimento dos microrganismos. A populao
microbiana plotada contra o tempo, resultando usualmente em uma curva de 4
fases: adaptao, exponencial, estacionria e morte
Nos modelos cinticos, a resposta da varivel expressa em unidades de
tempo para os parmetros taxa de crescimento e tempo de adaptao, j para a
populao mxima a unidade utilizada UFC/mL (Ross & McMeekin,1994). Os
modelos cinticos de primeira ordem mais importantes so o modelo de Baranyi &
Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et al., 1991). Esses modelos
medem a resposta a uma condio especfica em funo do tempo. A resposta
pode ser medida direta ou indiretamente atravs da populao microbiana ou de
produtos do metabolismo de microrganismos (Jagannath & Tsuchido, 2003).
O modelo de Baranyi e Roberts mais usado por vrias razes; (i) fcil
de usar; (ii) aplicvel s condies dinmicas de meio-ambiente; (iii) tem boa

42
capacidade de ajuste; (iv) a maioria dos parmetros so biologicamente
interpretveis (Van Impe, et al, 2005).
De acordo com os resultados obtidos por Baty & Delignette-Muller (2004),
dentre os trs modelos utilizados Baranyi e Roberts, Gompertz e Lag-exponencial,
pde-se notar que Baranyi, definitivamente o mais constante dos modelos,
porque ele ajusta da melhor forma a maioria dos dados e assim gera
razoavelmente e estima de forma mais precisa o tempo de lag ().

3.13.1. Modelo de Gompertz Modificado
O modelo de Gompetz uma funo que descreve uma curva sigmoidal
assimtrica. A modificao proposta por Zwietering et al. (1991) foi reparametrizar
o modelo em funo dos parmetros microbiolgicos de crescimento.

Equao 4

Onde: y= concentrao de clulas,
0
ln
N
N
y =
A= populao mxima atingida
mx = taxa mxima de crescimento
= tempo de lag

A equao no apresenta um perodo de aumento linear durante a fase de
crescimento exponencial, como observado com a maioria das curvas de
crescimento. Sendo assim, como a velocidade de crescimento determinada por
um ponto de inflexo na curva, o processo tende a fornecer valores que variam
mais do que as velocidades correspondentes determinadas por um perodo de

)
`
+
(
=
1 ) ( t
A
e
m
e
e A y
43
crescimento linear (Whiting e Buchanan, 1997), desta forma o tempo de gerao
pode ser superestimando em at 13% (McKellar & Lu, 2004). Alm disso, a funo
da inclinao da curva no pode ser ajustada em zero, e assntota inferior da
curva pode ser menor que o nvel de inculo, gerando negativo para alguns
casos (Mckellar & Lu, 2007).

3.13.2. Modelo de Baranyi
Baranyi e Roberts (1994) propuseram um modelo que inclui uma fase de
crescimento exponencial linear e uma fase lag determinada por uma funo de
ajuste. A equao proposta por Baranyi & Roberts (1994) est demonstrada na
equao 5:
)
1
1 ln( ) ( ) (
max
max
) (
max
o
y y
t A
o
e
e
t A y t y
+ + =
Equao 5
Onde:
y(t) = concentrao de clulas no tempo (t); onde:
0
ln
N
N
y =
y
o
= concentrao inicial de clulas no tempo 0 (t=0);
y
max
= concentrao mxima de clulas;
max
= mxima taxa de crescimento;

O valor do tempo de adaptao calculado pela equao 6
v
q
)
1
1 ln(
0
+
= Equao 6
O coeficiente,q
0
,

representado por q
0
=P
0
/K
p
, que expressa o estado
fisiolgico do inculo. Onde P
0
a concentrao de clulas no inicio do
processo de crescimento, e K
p
a constante de Michaelis-Menten.

44
O valor da taxa especfica do crescimento representado pela
equao 7
dt
t x d
t
)) ( (ln
) ( = Equao 7
Onde x(t) denota a concentrao celular bacteriana aumentando em funo
do tempo. O tempo de gerao expresso pelo G=ln2/
max
. Onde
max
mxima
taxa de crescimento atingida pelo microrganismo.
A funo A(t) expressa como:
max
) ln(
) (
0 0
h v h t
t
e e e
t A

+
=
, para h
0
= -ln
0
Equao 8
Onde o parmetro
0
chamado de estado fisiolgico das clulas no tempo
t= t
0
conseqentemente h
0
usa-se para caracterizar o estado fisiolgico inicial da
clula. Alm de apresentar vrias vantagens computacionais quando comparado a
outras funes sigmides, seu uso principal predizer a resposta de crescimento
bacteriano mesmo com alterao de temperatura durante a fase lag e
estacionria. Enfim, esta funo considera as caractersticas do meio e do
microrganismo em questo; critrio importante devidos s influncias dos
diferentes fatores ou variveis que provocam mudanas no meio e no
metabolismo do microrganismo de forma mais completa que a equao de
Gompertz( Pea, 2005).
O modelo de Baranyi & Roberts (1994) pode ser comparado a uma srie de
equaes diferenciais que ajustam um ambiente dinmico, resultando em perfis de
temperatura no-isotrmicos, desta forma o modelo por se utilizado para
descrever comportamento de microrganismos em temperatura subtimas
(McKlellar & Lu, 2004).
45
Atravs da utilizao do programa DMFit possvel se obter ambos os
modelos de crescimento citados acima. Considerando o modelo de Baranyi e
Roberts (1994) o programa ajusta uma funo sigmoidal que descreve os
parmetros: m. l, Rg, y
0
. E os parmetros de curvatura m e n, que podem variar de
0 at 20. O parmetro m representa a curvatura da transio da fase de
adaptao para a fase exponencial, enquanto que, o parmetro n representa a
curvatura da fase exponencial para a fase estacionria. Alm importante se
considerar que o parmetro yend(Rg) a assntota superior de uma curva sigmoidal
de crescimento, ou inferior se a curva for de morte. J quando se considera o
modelo de Gompertz gerado pelo programa (utilizado a equao de Zwietering et
al, 1991) gerada uma funo bifsica que consiste na juno de dois segmentos
lineares (Baranyi e Le Marc)

3.14. Modelagem preditiva em co-cultura
Muitas vezes na microbiologia preditiva, os microrganismos so modelados
em cultura pura, e as interaes microbianas no so levadas em considerao.
Isso feito apenas para simplificar a modelagem, mas este procedimento pode
causar discrepncia entre as predies feita pelos modelos e evoluo microbiana
real, particularmente para produtos que tm uma microbiota natural complexa,
como fermentados e minimamente processados (Janssen et al, 2006) onde os
sinergismos e antagonismos tm um papel importante.
A modelagem em co-cultura descreve as interaes microbianas, onde a
inibio pode ser causada por (i) competio pelo substrato e/ou (ii) produo de
metablitos txicos por um dos organismos (Van Impe et al, 2005).

46
A interao entre as bactrias lcticas (antagonistas) e microrganismos
patognicos (indicador) foi discutida e modelada por Van Impe et al(2005),
Janssen et al (2006), Antwi et al(2007) e Poschet (2005).
Durante o processo de fermentao, o cido lctico produzido pela
bactria lctica, e este cido dissocia-se no meio de cultivo abaixando o pH do
meio, causando um efeito txico para os microrganismos. O efeito inbidor tambm
pode ocorrer para a bactria lctica, que tem o seu crescimento cessado na fase
estcionaria, como um efeito auto-inibidor. Bactrias patognicas, como a Yersinia
enterocolitca, so muito sensveis ao efeito deste cido. A presena da bactria
lctica e, consequentemente, do cido lctico, causa redues na fase de
crescimento exponencial e na populao mxima deste patogno, conforme
verificado por Vereecken et al (2003). Estes autores cultivaram a Yersinia
enterocolitica em co-cultura com Lactobacillus sakei e observaram que, com o
aumento da concentrao das clulas do lactobacilo de 10
3
para 10
7
UFC/mL,
havia a reduo de 4 ciclos logartmicos na populao mxima de Y.enterocolitca,
e tambm uma reduo de 10 horas na durao da fase exponencial deste
microrganismo.
O modelo de inibio construdo pelos autores referenciados acima est
descrito na equao (9). Este modelo descreve a fase estacionria em funo de
N
i
(t) (nmero de clulas) e N
max
(nmero mximo de clulas), onde comea o
fenmeno da inibio do crescimento pela produo do cido lctico (Bernaerts et
al, 2004).
) ( ]). [ ], (.)([ (.).
max
t N H LaH
dt
dN
i lag
i +
=
Equao 9
47
Onde a taxa de crescimento, onde
i
(.) a taxa especifica de
crescimento global (
lag
Taxa de crescimento na fase de adaptao ;
max
Taxa
mxima de crescimento atingida na fase exponencial), [LaH] a concentrao de
cido lctico e [H
+
] a concentrao de ons hidrognio. A equao 9 descreve o
crescimento de ambos microrganismos, tanto da bactria lctica quanto do
microrganismo indicador particularmente para o antagonismo requer a adio
de uma equao diferencial apresentada na equao 10.
) ( (.).
) ( ] [
t N
dt
t LaH d
i
total
=
Equao 10
Onde (.) a taxa especfica de produo de cido lctico pela bactria
antagonista. O [LaH]
total
se refere concentrao de cido lctico, i. e. , a soma do
cido lctico dissociado e no-dissociado( Bernaerts et al, 2004).
Para descrever o processo qumico de dissociao de cido lctico em um
meio complexo foi utilizada uma equao qumica clssica, apresentada na
equao 11.
LaH
K H
P H
LaH
+
=
+
+
] [
]. [
] [
Equao 11
Onde P a concentrao de cido lctico, [H
+
] a concentrao de ons
hidrognio e K
LaH
= 10
-3.86
M.(constante de dissociao do cido lctico em Molar).
Para descrever a inibio foi uitilizada a equao 12

|
|
\
|
|
|
\
|
=
+
+
+
max
]
max
,
] [
[
1 .
] [
] [
1
H
H
LaH
LaH
H LaH
quando [LaH][LaH]
max
e [H
+
][H
+
]
max

Quando [LaH]>[LaH]
max
ou [H
+
] > [H
+
]
Max
Equao 12

48
Com [LaH]
max
a mxima concentrao de cido lctico quando cessa o
crescimento, [H
+
] a concentrao de protns no pH mimmo de crescimento e e
parmetros positivos. O termo de inibio ( +
H LaH,
)no tem efeitos na cintica
microbiana, contanto que os valores das concentraes de cido lctico
dissociado e a concentrao de prtons premaneam abaixo do valor inibitrio.
Para completar a estrutura do modelo, a taxa de produo de cido lctico
precisa ser matemticamente modelada. Esta taxa pode ser descrita pela equao
13
]) [ ], ([ (.) . (.)
, /
+
+ = H LaH Y Y
i m i N LaH
i

Equao 13

A estratgia de construo do modelo neste caso, comea com a
identificao do principal fenmeno que determina a dinmica microbiana. Este
exemplo ilustra que o microrganismo pode crescer sozinho, porm causa
mudanas nas condies ambientais do meio de cultivo, i. e., produo de
metablitos. O modelo descreveu a inibio do patgeno pela bactria lctica.

3.15. Modelo Quase-qumico
O modelo quase-qumico combina os conceitos de cintica qumica e
modelagem preditiva em alimentos. O modelo quase-qumico um modelo
baseado na simples premissa de modelos matemticos que compreendem uma
ou mais equaes diferenciais (Ross et al, 2005). Esse modelo tem a vantagem de
ser capaz de descrever crescimento/morte sendo possvel a avaliao da morte a
partir da fase estacionria do microrganismo. O modelo quase-qumico postula um
Fase de crescimento
Fase de manuteno
49
esquema de reaes, que combinam reaes de crescimento autocataltico e
feedback negativo, e presumidamente a formao de um metablito antagonista
hipottico, o qual induz a morte as clulas viveis em multiplicao (Ross et al,
2005). Sendo assim este modelo pode ser definido como um modelo cintico que
relata 4 fases do ciclo de vida do crescimento microbiano (fase de adaptao, fase
exponencial, fase estacionria e a morte) baseado num sistema de equaes
diferenciais ordinrias(ODEs) (Ross et al, 2005; Taub et al 2003).
O ciclo de vida microbiano que inclui os fenmenos de crescimento/morte
pode ser integrado dividindo-se o ciclo de vida das bactrias em 4 passos. A fase
de adaptao das clulas denominada por M, a fase de crescimento M
*
, o
antagonista por A e as morte das clulas por D. (Taub, 2003):
1 passo (ativao): representa a ativao das clulas da fase lag para a
fase de exponencial (M M
*
), e ocorre a uma taxa constante k
1
;
2 passo (multiplicao): representa a multiplicao das clulas (M
*
2
M
*
+A), com uma taxa constante k
2
.H a formao concomitante de metablitos
antagnicos (A) que interagem com as clulas em multiplicao.
3passo (sensibilizao): o microrganismo interage com os metablitos
antagonistas que sensibilizam as clulas para morte (D) (A+M
*
D) a uma taxa
constante k
3
.
4passo (morte): ocorre a morte natural (M*D), com taxa constante k
4
.
Taub et al (2003) apresentaram um modelo quase-qumico para estudar a
cintica de crescimento/morte de S.aureus em po para rao militar, onde o
modelo combina parmetros como pH, atividade de gua e temperatura.

50
A tabela abaixo apresenta as equaes das velocidades e as ODEs
utilizados para a construo de um modelo quase-qumico.
Tabela 5. Resumo do mecanismo e das equaes para o modelo quase-qumico
Passo
Equaes da
velocidade
ODEs
M M
*
M k v
1 1
= M k v dt dM
1 1
) ( = = (1)
M
*
2
M
*
+A
*
2 2
M k v = ) ( ) (
*
1 4 3 2 1
*
A G M M k v v v v dt dM + = + = (2)
A+M
*

D
A M k v
*
3 3
= ) ( ) (
2
*
3 2
A k M v v dt dA = = (3)
) ( ) (
4
*
4 3
A k M v v dt dD + = = (4)
M
*
D
*
4 4
M k v =
) ( ) ( ) (
*
t M t M t U + = (5)
Fonte: Ross (2005)
Onde: G = (k
1
-k
2
), taxa de crescimento natural;
U = M-M*, mudana na populao.
= (0<<1), erro estocstico
v
i
= velocidade em funo do tempo em cada passo
Para Taub et al (2003), quando o modelo quase-qumico foi comparado ao
modelo de Gompertz observou-se que o modelo quase-qumico foi capaz de se
ajustar aos dados de crescimento e morte de maneira contnua. Entretanto,
tambm se observou que a estimativa da taxa de crescimento para o modelo
ajustado com todos os dados, ou somente com os dados da fase de crescimento,
no foram significativamente diferentes.
O modelo quase-qumico um modelo verstil capaz de caracterizar a
cintica de crescimentos dos microrganismos nos alimentos, descrevendo os
cenrios de crescimento, crescimento-morte e a morte (inativao), atravs de
pequenas mudanas no ambiente experimental (Doona et al, 2005).
51
3.16. MODELAGEM SECUNDRIA
Os que modelos descrevem os efeitos das condies ambientais fsicas,
qumicas e caracteristicas biticas, nos parmetros primrios de crescimento so
chamados modelos secindrios (Ross & Dalgaard, 2004) .
De acordo com McMeekin e Ross (2002), na modelagem secundria tem
que ser considerado o efeito individual de cada fator mas, em diferentes situaes,
necessrio considerar como os diferentes fatores interagem restringindo o
crescimento microbiano.

3.16.1. Modelo de Belehrdek ou raiz quadrada
Em 1982, Ratkwosky apresentou um modelo simples para descrever a taxa
de crescimento como uma funo da temperatura. O modelo era baseado na
observao da raiz quadrada da taxa de degradao do nucleotdeo no msculo
de carpa, em funo da temperatura (Ross & McMeekin, 1994).
) (
min
T T b k =
Equao 14
onde:
k : taxa de crescimento;
T: temperatura;
T
min
: temperatura mnima de crescimento.

O modelo da raiz quadrada foi desenvolvido primeiramente com o objetivo
de predizer o efeito da temperatura no crescimento bacteriano (Delignette-Muller
et al, 1995). Em 1983 Ratkwosky, estendeu a aplicabilidade da equao incluindo
as temperaturas supertimas de crescimento.

52
De acordo com Delignette-Muller et al (1995), variantes do modelo da raiz
quadrada foram propostos a partir do modelo original levando em conta outros
fatores como pH e atividade de gua (a
w
).
Apesar de sua parcimnia, o modelo da Raiz Quadrada ajusta-se aos
dados to bem quanto os outros utilizados em microbiologia preditiva, como o
modelo polinomial, e muitas vezes, melhor. Justamente por esta qualidade,
muito mais geral que os modelos com muitos parmetros (Ross & McMeekin,
1994).

3.16.2. Modelo de Arrhenius modificado ou modelo de Davey
O modelo de Davey (1989) foi baseado no modelo de Arrhenius.
2
2
4 2 3
2
1
2 1 1 0 . ) ln( V C V C V C V C C K + + + = + Equao 15
onde:
C
1
...C
4
: so coeficientes a serem calculados;
V
1
e V
2
: so respectivamente fatores ambientais (aw, temperatura absoluta ou
pH);
K: Taxa de crescimento;

3.16.3. Modelos de superfcie de resposta
So polinmios mltiplos ajustados por regresso padro. Eles podem
conter termos lineares, quadrticos, cbicos, recprocos, e podem conter termos
de interaes ou cruzados. Freqentemente, o logaritmo da resposta melhor
ajustado, e a equao pode ser apresentada na forma completa, ou simplificada
at os termos estatisticamente representativos (Ross & McMeekin , 1994).
A equao genrica de um modelo polinomial (superfcie de resposta) est
apresentada abaixo:
53

+ + +
+ + + + + + + =
3 2 9 3 1 8
2 1 7
2
3 6
2
2 5
2
1 4 3 3 2 2 1 1 0
* *
*
x x b x x b
x x b x b x b x b x b x b x b b y

Equao 16
Onde:
= tempo de adaptao (dias)
x
1
x
3
= parmetros de controle
b
o
...b
9
= coeficientes do modelo
= erro

3.17. Validao de modelos
Aps coletar certo nmero de curvas e ajustar o modelo primrio e
estabelecer o modelo secundrio importante testar a preciso do modelo com
novos dados e novas combinaes dos fatores. A necessidade de desenvolver
ndices interpretveis, medidas baseadas na razo mdia entre o tempo predito e
o observado, originou os fatores de Bias e Exatido (Ross,1996).

3.17.1. Fator de bias
O fator de bias o antilogaritmo da razo mdia dos valores preditos e os
observados.
Por convenincia, este valor nomeado Fator de Bias, e definido
(Ross,1996):
\
|
n
observado
predito
log
10 Equao 17
onde:
predito: valor predito para a varivel;
observado: valores observados para a varivel;
n: nmero de observaes utilizadas no clculo.

54
O fator de Bias avalia quantitativamente onde o modelo prediz de maneira
segura determinando assim, em mdia, onde os dados preditos esto, por baixo
ou por cima da linha de equivalncia (Ross,1996).

3.17.2. Fator de exatido
O fator de exatido o valor absoluto do logaritmo da razo mdia do
predito e o observado.
Por convenincia, este valor nomeado Fator de Exatido, e definido
(Ross,1996):
n
observado
predito
log
10 Equao 18
onde:
predito: valor predito para a varivel;
observado: valores observados para a varivel;
n: nmero de observaes utilizadas no clculo.

O fator de exatido, por se tratar de um valor absoluto, sempre ter valores
maiores que um. Este fator indica a distncia entre cada ponto observado da linha
de equivalncia da predio, a variabilidade dos dados, ou seja uma simples
medida do nvel de confiana do modelo de predio (Ross,1996).

3.17.3. Erro do quadrado mdio (MSE)
O erro do quadrado mdio (MSE) um ndice estatstico, onde definido pela
soma quadrtica do resduo divido pelo nmero de graus de liberdade. O MSE
representa o desvio entre a medida experimental e o valor predito. Quanto menor
o valor do MSE melhor ser a adequao do modelo (George, 1999).
55
( )
n
n
SSE
MSE
predito obser
2

= = Equao 19

56
4. MATERIAL E MTODOS
4.1. Seleo das linhagens
Foi utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae CCT 0759, no floculante,
por ser descrita como possuidora de alto potencial fermentador e muito utilizada
nas indstrias de lcool brasileiras. Para o estudo do antagonismo lctico foi
selecionado o Lactobacillus fermentum CCT1668, a bactria lctica contaminante
com maior incidncia nas plantas de produo de etanol (Gallo, 1990). As culturas
foram obtidas de isolados de usinas de lcool da coleo de culturas da Fundao
Tropical de Pesquisas e Tecnologia Andr Tosello.
A manuteno da S. cerevisiae foi feita em Agar Extrato de Malte (MEA)
formulado com pH 6.7, para o L.fermentum. O meio de manuteno foi Mann,
Rogosa & Sharpe (MRS) caldo (DIFCO), e as cepas estocadas a 4C. Antes de
cada experimentos as culturas eram repicadas trs vezes.

4.2. Delineamento experimental
Para o delineamento experimental, foi selecionado um desenho composto
central rotacional (DCCR) com duas variveis, incluindo 3 pontos centrais e 4
pontos axiais, totalizando 11 ensaios (2
k
+2*k+n
o
). Os nveis deste planejamento
esto apresentados na tabela 6. Como variveis do processo foram selecionadas
a temperatura de processo fermentativo (T) e nvel de inculo de Lactobacillus
fermentum (L). Os parmetros do processo foram o nvel de inculo da levedura
mantido constante em 10
6
UFC/mL (Essia Ngang, 1990). No Brasil, a inoculao
feita levando em considerao o peso seco da levedura, iniciando com 10 g de
57
fermento (Lima et al, 2001). O pH do mosto (6,10,1) e a quantidade de slidos
solveis, presentes no mosto de cana-de-acar foram ajustados em 21.5Brix .
Como respostas do planejamento foram obtidas a taxa especfica de crescimento
( h
-1
), populao mxima (Rg UFC/mL), tempo de gerao (G- h), tempo de
adaptao ( - h) de ambos microrganismos, tanto em cultura pura quanto em
cultura mista. Durante cada ensaio, foram coletadas amostras em intervalos
regulares de tempo (vide item 4.5), para a determinao da concentrao de cido
lctico, etanol, frutose, glicose e glicerol (anlises descritas no item 4.9), e
avaliao do ndice de viabilidade da levedura quando cultivada em cultura pura e
mista (vide item 4.6).
Para cada ensaio realizado com a cultura mista, foram realizados outros dois
ensaios, conduzidos da mesma forma e com o mesmo substrato, para as culturas
puras de L.fermentum e S.cerevisiae, como controle. Para a descrio dos
experimentos, foi utilizado a seguinte codificao (valor de T(C) corresponde
temperatura de fermentao) (S seguido do nmero indicando nvel de inculo
da S. cerevisiae) (L seguido do nmero indicandonvel de inculo de
L.fermentum)). Exemplo experimento realizado a 28C, com 10
5
UFC/mL de
inculo de L.fermentum e com 10
6
UFC/mL de inculo de S. cerevisiae codificado
como (28S6L5).

58
Tabela 6. Desenho do planejamento experimental com valores codificados e
(reais).
Ensaios Temperatura(C)
Nvel de inculo de L.
fermentun(UFC/mL)
01 -1(25) -1(10
3
)
02 +1(31) -1(10
3
)
03 -1(25) +1(10
7
)
04 +1(31) +1(10
7
)
05 -1.4(24) 0(10
5
)
06 +1.4(32) 0(10
5
)
07 0(28) -1.4(10
1
)
08 0(28) +1.4(10
8
)
09 0(28) 0(10
5
)
10 0(28) 0(10
5
)
11 0(28) 0(10
5
)
4.2.1. Variveis de controle do processo fermentativo
Os nveis das variveis independentes foram selecionados conforme os itens
4.2.1.1 e 4.2.1.2.

4.2.1.1. Temperatura do processo fermentativo
As temperaturas selecionadas para o processo fermentativo foram descritas,
por Costa et al (2001) levando em considerao que temperatura acima de 40C
causam decrscimo na viabilidade celular da levedura (Maran et al 1999),
portanto, a faixa de temperatura selecionada foi de 24C a 32C (tabela 6). As
amostras foram inoculadas e incubadas em agitador, com agitao de 120rpm
(New Brunswick Scientific, Model G-27, U.S.A.) com temperatura controlada
(0,5C). As variaes de temperaturas foram registradas com o auxlio do
registrador de temperatura OMEGA CL526 mediante termopar tipo T flexvel
Omega TT-T- 30-SLE, fio duplex cobre constantan. Caso necessrio, nas
temperatura mais baixas (24 e 25
o
C) era acionado manualmente o controle de
refrigerao do agitador.
59
4.2.1.2. Nvel de inculo de Lactobacillus fermentum
O microrganismo, L.fermentum, foi inoculado em mosto, previamente
preparado, em cinco nveis de inculo variando de 10
1
a 10
8
UFC/mL, avaliando
nveis extremos de contaminao (tabela 6). O ponto central do desenho
experimental foi determinado conforme relatos de Gallo (1990) para a ocorrncia
de L.fermentum no mosto de caldo de cana resfriado, que foi da ordem de 10
5

UFC/mL.

4.3. Inoculao
O caldo de cana-de-acar, composto por 15% (v/v) de caldo de cana
proveniente dos filtros a vcuo das usinas a 13,2Brix, e o restante 63% (v/v) de
caldo de cana do segundo terno de extrao da moenda a 10Brix, clarificado
industrialmente, foi filtrado em algodo, para a retirada de sujidades (Nolasco Jr,
2005).
Para o ajuste do slidos solveis, 21.5Brix, foi utilizado mel a 78Brix, a
medio do teor de slidos solveis foi realizada com o auxilio de um refratmetro
manual (Atago,Type 500). O clculo das propores foi realizado pelo Quadrado
Pearson (vide representao a seguir), um mtodo simples, o qual permite o
calculo das propores de dois componentes de uma mistura.
Brix do caldo: 12brix 55.3

21.5 Brix + 64.8
Brix do mel 76.8Brix 9.5

Proporo do mosto a 12Brix: % 34 . 85
8 . 64
100 3 . 55
=
x

60
Proporo do mel a 76.8Brix: % 66 . 14
8 . 64
100 5 . 9
=
x

Aps misturas nas propores calculadas, a concentrao de slidos
solveis foi confirmada com o refratmetro.
O mosto a 21,5Brix, foi acondicionado em garrafes de vidro com
capacidade para 9L, e tratao termicamente a 121C por 40 minutos (Nolasco Jr,
2005).
Aps o tratamento trmico para eliminao dos contaminantes, o mosto foi
transferido para garrafas PET (Polietilenotereftalato) com capacidade para 500mL,
previamente sanitizadas com Vortex ES
0,03% conforme metodologia adaptada

de Petrus (2000), e estocadas a -20C at a realizao dos ensaios.

4.4. Preparo do inculo
O preparo do inculo dos microrganismos foi realizado por 3 transferncias
sucessivas em meio lquido Malt Extract broth (MEB) formulado com pH6,7 para a
levedura e MRS caldo (Man Rogosa Sharpe) (DIFCO) para o lactobacilo, num
perodo de 72 horas antecedentes a cada experimento.

4.4.1. Pr-inculo da levedura (Saccharomyces cerevisiae)
A cultura da levedura foi repicada em tubos com Agar Extrato de Malte
(MEA, formulado pH.6,7) e incubada 25C por 5 dias. Aps este perodo, foram
realizadas 3 transferncias sucessivas, como indicado a seguir, para a
multiplicao das clulas de levedura. O crescimento do tubo com MEA foi
transferido para 50 mL Caldo Extrato de Malte (MEB) e incubado com agitao de
61
120 rpm (New Brunswick Scientific, Model G-27, U.S.A.) por 24 horas
temperatura do respectivo experimento (Tabela 6). Aps este perodo, os 50mL de
meio com crescimento foram transferidos para 50mL de MEB, e incubados, com
agitao, por 24 horas respectiva temperatura. Decorrido 24 horas de
incubao, 100mL de meio, com crescimento, foram transferidos para
erlenmeyeres contendo 100mL de MEB, e reincubados por 24 horas, com
agitao.

4.4.2. Pr-inculo do lactobacilo (Lactobacillus fermentum)
A cultura da bactria foi repicada em MRS caldo e incubada a 32C por 72
horas. Aps este perodo, foram realizadas 3 transferncias sucessivas para a
multiplicao das clulas bacterianas: foi retirado 1mL da suspenso bacteriana e
transferido para 50mL de MRS caldo. Esta suspenso foi incubada com agitao
(New Brunswick Scientific, Model G-27, U.S.A.) temperatura do respectivo
experimento (Tabela 6) por 24 horas, com agitao de 120rpm. Decorrido o
perodo de incubao, 50mL da suspenso foram transferidos para frascos
erlenmeyeres, contendo 50mL de MRS caldo, e reincubados com agitao por 24
horas. Aps o perodo de 24 horas, os 100mL da suspenso foram transferidos
para erlenmeyeres contendo 100mL de MRS caldo, incubados com agitao por
24 horas.

62
4.4.3. Ajuste do inculo da levedura
A partir do pr-inculo, a concentrao inicial da levedura foi ajustada
mediante contagem em cmara de Neubauer (Nobre, 2006). A tcnica consiste
em misturar partes iguais da suspenso de levedura, adequadamente diluda e da
soluo corante (Azul de Metileno) (Lee et al, 1981). Com o auxilio da pipeta
Pasteur, foi transferida uma gota da amostra (suspenso de clulas + corante)
para a cmara e esta recoberta com uma lamnula, ento levada ao microscpio
ptico na objetiva de 40X.
Para determinao do nmero de clulas, foram contados 5 quadrados
mdios na diagonal da lmina (Figura 3) . O clculo do nmero de clulas foi
realizado de acordo com a equao 20 (Laluce et al,2007)
xD x Nx C
4
10 25 =
Equao 20
Onde: C: nmero de clulas/mL
N: mdia do nmero de clulas nos 5 quadrados mdios
25: nmeros de quadrados mdios da cmara
10
4
: correo do volume da Cmara de Neubauer (cm
3
ou mL)
D: fator de diluio da suspenso de leveduras

Figura 3. Quadrado Mdio da Cmara de Neubauer e sentido de contagem dos
quadrados mdios
63

O clculo da concentrao do volume de suspenso a ser inoculada foi
realizado de acordo com a equao 21.

Volume a ser inoculado = Concentrao de clulas desejada X Volume de meio no frasco
Concentrao da suspenso
Equao 21

4.4.4. Ajuste do inculo do lactobacilo
A partir do pr-inculo, a concentrao de clulas do lactobacilo foi ajustado
com o auxilio do aparelho Densimat
(BioMrieux, S.a, France). A concentrao

da bactria foi ajustada conforme os experimentos descritos na tabela 6. Os
padres McFarland (Tabela 7) foram utilizados como referncia para ajuste da
concentrao de clulas bacterianas, o equipamento avalia a turbidez da
suspenso num comprimento de onda de 550nm.
Tabela 7.Equivalncia dos padres McFarland
Padro
Concentrao
bacteriana X (10
6
)
Densidade ptica terica
a 550nm
0.5 150 0.125
1.0 300 0.25
2.0 600 0.50
3.0 900 0.75
4.0 1200 1.00
5.0 1500 1.25
Fonte: APHA, 2001.
O ajuste foi realizado considerando um volume de 200mL de mosto de
cana-de-acar.

64
Para as concentraes de inculo de 10
5
e 10
3
UFC/mL do lactobacilo, a
suspenso foi ajustada no padro 2.0 (6.0X10
8
UFC/mL). A partir do inculo
ajustado, foram feitas diluies decimais sucessivas para concentrao 10
7

UFC/mL e 10
5
UFC/mL, respectivamente. O clculo do volume de inculo foi
realizado de acordo com a equao 21. Para os experimentos com concentrao
de clulas em 10
7
UFC/mL, o inculo foi ajustado no padro 5 (1,5x10
9
UFC/mL). O
clculo do volume foi procedido da mesma forma descrita anteriormente. Na
concentrao de 10
1
UFC/mL, a suspenso foi ajustada no padro
1(3,0x10
8
UFC/mL) diluda at 3,0x10
3
UFC/mL, o procedimento para o clculo foi
realizado como os demais experimentos. Para o ajuste do inculo de 10
8
UFC/mL
foi utilizada o padro 5(1,5x10
9
UFC/mL). O clculo do volume foi realizado
conforme equao 19.

4.5. Coleta de amostras do processo fermentativo
As coletas foram realizadas de 3 em 3 horas num perodo de 24 horas
iniciais de fermentao, 6 em 6 horas de 30 horas at 60 horas de processo, a
partir de 68 horas de fermentao at o trmino do ensaio, 100 horas, as coletas
foram de 8 em 8 horas.
Em cada coleta, foi retirada uma alquota de 7mL de mosto fermentado,
2mL destinados contagem por diluio e plaqueamento em superfcie para e
levedura e profundidade para o lactobacilo, 1mL para a determinao do ndice de
viabilidade de levedura, e 4mL para a anlise das concentraes de etanol e cido
lctico e aferio do pH. As amostras para a determinao da concentrao de
65
etanol e cido lctico foram acondicionadas em frascos vedados e mantidas
congeladas a -20C at a determinao posterior dos respectivos compostos.

4.6. Avaliao da viabilidade das clulas de levedura
Para avaliao da viabilidade, foi realizada contagem em Cmara de
Neubauer, conforme procedimento descrito no item 4.4.3.
As clulas com alta atividade fisiolgica no se coloriram, enquanto as
clulas inativas (mortas) apresentaram-se coloridas de azul (Figura 4). O nmero
de clulas viveis foi calculado pela equao 18, da mesma forma foi determinado
o nmero de clulas inviveis (coloridas).

Figura 4. Determinao da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno.
As clulas coradas de azul so clulas mortas, enquanto as incolores so clulas
viveis

Para o clculo do ndice de viabilidade foi utilizada a equao 22 (Lee et al,
1981).

66
Nmero de clulas incolores
Nmero de clulas incolores + Nmero de clulas coloridas
Equao 22

4.7. Avaliao do crescimento
4.7.1. Contagem das clulas da S. cerevisiae
A avaliao do crescimento foi realizada mediante anlise microbiolgica de
contagem de S.cerevisiae e L.fermentum. Para a levedura, foi utilizada a
metodologia descrita Beuchat e Cousin (2001). A contagem da levedura foi
realizada mediante diluies decimais sucessivas que foram inoculadas em
superfcie utilizando como meio de cultura Malt Extract Agar (MEA) formulado com
pH 6.7 e suplementado de cloranfenicol (100mg/L) e tetraciclina (100mg/L). As
placas foram incubadas temperatura tima de crescimento (25C) por 5 dias.
Decorrido o crescimento, as placas foram contadas e as colnias presentes nas
placas foram avaliadas quanto a sua morfologia macroscpica (tipo de borda, cor
(topo e fundo), aspecto da colnia e tipo de crescimento) e microscpica.

4.7.2. Contagem das clulas do L. fermentum
Para o L.fermentum, foi utilizada a metodologia descrita por Hall et al.
(2001). Sendo assim foram realizadas diluies decimais sucessivas inoculadas
em profundidade utilizando como meio de cultura MRS Agar (Oxoid) acidificado
com a adio de cido actico 1N at pH 5,50,1 e suplementado com Natamax
(Danisco) (50mg/mL) (Botes et al, 2007; Jullian, 2005). As placas foram incubadas
temperatura tima de crescimento (35C) por 72 horas. Decorrido o crescimento,
as placas foram contadas e as colnias presentes nas placas foram avaliadas
ndice de viabilidade =
67
quanto a sua morfologia macroscpica (tipo de borda, cor (topo e fundo), aspecto
da colnia e tipo de crescimento) e microscpica.

4.8. Medio do pH do mosto
O pH foi aferido em potnciometro digital Digimed, modelo DMPH-2, a cada
coleta.

4.9. Avaliao da concentrao de cido lctico, cido actico, etanol,
frutose, glicose, glicerol
Os compostos foram detectados e quantificados por cromatografia lquida
de alta eficincia (CLAE/HPLC). A metodologia utilizada foi a proposta por Lpez
& Gmez (1996). Para a anlises foi utilizado um sistema cromatogrfico lquido
de alta eficincia (HPLC) Shimadzu (Integrador Shimadzu CR4A), composto
por uma bomba (ShimadzuCC-6A), um injetor manual, uma coluna para deteco
de cidos orgnicos, etanol e acares (SulpelcoSupelco Gel C.610H, Catalogue
Number 5-9320), forno (ShimadzuCTO6A) e desgaseificador automtico
(Shimadzu DGU2A) conectados em srie.
As aliquotas de mosto fermentado coletadas durante o processo
fermentativo foram centrifugadas a 15094xg/4C por 20 minutos, e posteriormente
filtradas em membrana PVDF (polivinilideno) material de 0,22m, previamente a
injeo no equipamento.
As amostras foram eludas em cido sulfrico 0,65mM, a uma taxa de fluxo
isocrtica de 0,7mL/mim. A temperatura de operao da coluna foi de 75C. Os

68
compostos eludos na fase mvel (cido sulfrico 0,65mM) foram analisados por
detector UV (ShimadzuSPD6A), ajustado a 214nm, e detector de ndice de
refrao (RI) (ShimadzuRI 10A), com a temperatura de cela do RI mantida a
50C durante os ensaios.

4.9.1. Preparo da fase mvel
Para o preparo da fase mvel, foi utilizada gua ultra-pura (Milliq
, Millipore;
Milford, MA) e cido sulfrico (Merck, Alemanha). Foi preparada uma fase mvel,
diariamente, com concentrao de 0,65mM de cido sulfrico, e filtrada, com
sistema de filtrao (Millipore; Milford, MA) acoplado a uma bomba de vcuo
(Millipore; Milford, MA Millipore vaccum pressure pump) (Figura 5) com
membrana de acetato de celulose com porosidade de 0,45m (Millipore; Milford,
MA).

Figura 5. Sistema de filtrao a vcuo para a fase mvel.

69
4.9.2. Condicionamento da coluna
Antes da injeo das amostras, a coluna foi condicionada com a respectiva
fase mvel e mantida na temperatura de 75C. O processo de condicionamento foi
conduzido por 12 horas.

4.9.3. Curva padro da glicose
Para a preparao da curva padro da glicose, foi utilizada Glicose Anidra
P.A. (Merck, Alemanha), com teor de pureza de 99,5%. Foram preparados 50mL
de soluo estoque com concentrao de 100g/L. A partir desta soluo, foram
feitas diluies para a preparao das demais concentraes 75, 50, 25, 10, 5, 1 e
0,1g/L. Para a deteco da glicose foi utilizado o ndice de refrao, com
temperatura de cela de 50C, a taxa de fluxo isocrtico de 0,7mL/min e
temperatura da coluna de 75C.

4.9.4. Curva padro frutose
A curva padro da Frutose P.A. (Synth, Brasil), com teor de pureza de
99,5%, foi construda nas concentraes de 100, 75, 50, 25, 10, 5, 1, 0,1g/L. Para
tanto foram preparados 50mL de uma soluo estoque com concentrao de
100g/L, e realizadas diluies para a preparao das demais concentraes. Para
a deteco da frutose, foi utilizada deteco por indice de refrao (RI) com
temperatura de cela de 50C, a taxa de fluxo isocrtico de 0,7mL/min e
temperatura da coluna de 75C.

70
4.9.5. Curva padro etanol
Para a preparao da curva padro do Etanol (VETEC, Brasil), grau HPLC
com 95% de pureza, foram utilizadas concentraes de 100, 75, 50, 25, 10, 5, 1,
0,1g/L. Foi preparada uma soluo estoque de 100g/L. A partir desta soluo,
preparadas as demais diluies. Para a deteco do etanol, foi utilizado o ndice
de refrao, com temperatura de cela de 50C, a taxa de fluxo isocrtico de
0,7mL/min e temperatura da coluna de 75C.

4.9.6. Curva padro glicerol
Para a preparao da curva padro do Glicerol (Sigma Aldrich, Alemanha),
teor de pureza de 99,5%, foram utilizadas concentraes de 100, 75, 50, 25, 10,
5, 1, 0,1g/L. Foi preparada uma soluo estoque de 100g/L. A partir desta
soluo, preparadas as demais diluies. Para a deteco do glicerol, foi utilizado
o ndice de refrao, com temperatura de cela de 50C, a taxa de fluxo isocrtico
de 0,7mL/min e temperatura da coluna de 75C.

4.9.7. Curva padro cido lctico
Para a preparao da curva padro do cido lctico (Sigma
Aldrich,Alemanha), teor de pureza de 99,8%, foram utilizadas concentraes de
10, 7, 5, 3, 1, 0.5, 0,1 mg/mL. Foi preparada uma soluo estoque de 10mg/mL. A
partir desta soluo preparadas as demais diluies. Para a deteco do cido
lctico, foi utilizado o ndice de refrao, com temperatura de cela de 50C, a taxa
de fluxo isocrtico de 0,7mL/min e temperatura da coluna de 75C. Para o cido
lctico, foram testados os padres dos ismeros D e L. No entanto, com a
71
metodologia utilizada no foi possvel a diferenciao destes ismeros, portanto,
foi ultizada uma mistura racmica do cido como padro de deteco.

4.9.8. Curva padro cido cetico
Para a preparao da curva padro do cido actico (Vetec, Brasil), teor de
pureza de 99,5%, foram utilizadas concentraes de 10, 7, 5, 3, 1, 0.5, 0,1 mg/mL.
Foi preparada uma soluo estoque de 10mg/mL. A partir desta soluo,
preparadas as demais diluies. Para a deteco do cido lctico, foi utilizado o
ndice de refrao, com temperatura de cela de 50C, a taxa de fluxo isocrtico de
0,7mL/min e temperatura da coluna de 75C.

4.9.9. Anlise das amostras
As amostras de mosto de cana-de-acar fermentadas foram filtradas
previamente injeo no cromatogrfo, em membrana de PDVF (Millipore) de
0,22um de poro e 13mm de dimetro. Foram injetados 20l de amostra na coluna
de deteco. Para o clculo das concentraes dos compostos detectados, foram
comparados os tempos de reteno das amostras com o tempo de reteno dos
padres e as concentraes foram calculadas de acordo com as curvas padres
(ver anexo D).

72
4.10. Modelagem preditiva
4.10.1. Modelagem primria
Os modelos de Baranyi & Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering et
al, 1991) foram utilizados para predizer os parmetros de crescimento, tempo de
lag (), taxa especfica de crescimento (), tempo de gerao (G) e populao
mxima (Rg) de cada microrganismo at a fase estacionria, Lactobacillus
fermentum e Saccharomyces cerevisiae. Para a determinao dos parmetros
descritos acima, foi utilizado o software DMFIT verso 2.1. Os dados utilizados
foram o logartimo da populao versus tempo de cada microrganismo.

4.10.2. Modelo quase-qumico
Foi utilizado o modelo quase-qumico proposto por Ross et al (2005) para a
descrio das etapas de crescimento e morte da levedura e do lactobacilo tanto
em cultura pura quanto em cultura mista, considerando que este modelo descrevia
crescimento/morte da populao de forma contnua, pressupondo que tanto a
levedura quanto o lactobacilo iniciariam um rpido declnio aps a fase
exponencial devido presena de metablito antagonista.
O modelo foi ajustado aos dados experimentais, mediante a utilizao do
software MATLAB 7.5 atravs da funo ODE15S, juntamente com anlise de
regresso no linear pela funo LSQNONLIN, para o modelo quase-qumico.
Os dados de entrada para a preparao do modelo foram a contagem celular
de ambos microrgansimos, chamada xd, e o intervalo de tempo de coleta de
dados, chamado td. Para o clculo das constantes k de crescimento/declniode
73
cada fase foram assumidos valores iniciais para k
1
, k
2
, k
3
e k
4
para ajuste deste
parmetro pela funo LSQNONLIN (vide anexo C).
Para a execuo do modelo, foram criadas 4 subrotinas (vide anexo C). O
script SD, que chama a funo no-linear calculando o erro pelo mtodo dos
mnimos-quadrados, tendo como dados de sada a funo f(x) e a norma do
passo; A funo ED que auxilia no ajuste dos dados e minimiza o erro da funo
pelo mtodo dos mminos quadrados; A funo utilizada para a soluo do
sistema de equaes diferenciais (ODE) definida como FD. O script PredOde
onde so calculadas as solues de M, M*,A, D e U, este script somente calcula
os valores das solues das equaes diferenciais, no envolvendo o ajuste dos
dados. Os dados de sada deste script so taxa de crescimento (), tempo de
adaptao () e populao mxima (Rg).

4.10.3. Modelagem secundrio
4.10.3.1. Modelagem de superficie de resposta
Foi aplicada a modelagem de superfcie de resposta para as variveis
dependentes , e concentrao mxima de etanol produzido durante a
fermentao pela cultura mista, em funo da temperatura de fermentao e nvel
de inculo de lactobacilo. Em cada experimento a determinao da concentrao
de etanol foi calculada a partir da equao da curva padro de etanol para cada
tempo; a partir, destes dados foi selecionado o valor mximo de etanol produzido
para cada situao. Com os dados das variveis indenpendentes e concentrao
mxima de etanol, foi usado o procedimento Industrial Statistics & Six Sigma e a

74
funo Experimental Design, Central composite, non factorial, surface design do
Software Statistica 7.0 e utilizando o procedimento ANOVA (p<0,10). O modelo
encontrado foi validado estatisticamente atravs de anlise de varincia. Os
fatores de bias e exatido foram calculados conforme descrito por Roos (1996).

4.10.3.2. Modelo de Davey (1989) e Raz quadrada
Os parmetros e foram modelados em funo da temperatura de
fermentao para tanto foi utilizado o procedimento de regresso no-linear
Advanced Linear/ Non linear models e a funo Non linear estimation do software
Statisitica 7.0. O modelo encontrado foi validado estatisticamente atravs de
anlise de varincia. Os fatores de bias e exatido foram calculados conforme
descrito por Ross (1995).

75
5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1. Curvas experimentais de crescimento e declino de Saccharomyces
cerevisiae e Lactobacillus fermentum

As curvas de crescimento e declnio experimentais, do lactobacilo e da
levedura, apresentadas na figura 6 no Anexo A demonstram que com o inculo de
levedura constante em 10
6
UFC/mL para todos os experimentos, e
independentemente do nvel de inculo do lactobacilo ou da temperatura do
processo fermentativo, o crescimento do Lactobacillus fermentum apresenta um
mximo entre 40 e 60 horas. Em contra-partida, neste mesmo perodo, o
crescimento da levedura que estava no estado estacionrio, comea a decrescer
exponencialmente.
Ao avaliar a durao da fase exponencial da levedura, esta tem durao de
aproximadamente 20 horas tanto em cultura pura, quanto em cultura mista, este
fenmeno idependente da presena do L.fermentum. O lactobacilo entra na fase
exponencial aps a fase estacionria da levedura, sendo que a durao da fase
exponencial do lactobacilo foi dependente da presena da levedura. Por outro
lado, observa-se na figura 18, que o ndice de viabilidade da levedura neste
mesmo perodo, para as mesmas condies experimentais, foi menor que 40%.
Em pesquisa de estimulao de lactobacilo na fermentao alcolica em melao
de beterraba, Essia-Ngang et al (1992), constataram que com o nvel de inculo
inicial de 10
7
UFC/mL, o lactobacilo em cultura mista com a levedura, tem o
mximo de crescimento exponencial ao redor de 25 horas de fermentao,
momento no qual observaram maior ndice de morte da levedura. Sendo assim,

76
pode-se verificar, que quando a levedura est na fase de declnio o lactobacilo
atingiu o auge do seu crescimento exponencial, isto poderia ser devido a h o
excreo de aminocidos e vitaminas no meio de cultivo (Oliva-Neto & Yokoya,
1997).
Pde-se (ver curvas Anexo A) verificar o aumento de 5 a 6 ciclos
logartmicos para o crescimento do lactobacilo a partir do inculo inicial, enquanto
para a levedura este aumento de apenas dois ciclos logartmicos em todos os
processos fermentativos.
1,00E+00
1,00E+04
1,00E+08
1,00E+12
0 20 40 60 80 100 120
L
a
c
t
o
b
a
c
i
l
l
u
s

(
U
F
C
/
m
L
)
Tempo (horas)
Lactobacillus cultura pura Lactobacillus cultura mista
Levedura cultura pura Levedura cultura mista

Figura 6. Curvas experimentais de crescimento para o experimento 04 (31S6L7),
para as culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum em mosto de
cana-de-acar.

77
5.2. Modelagem primria
As curvas de crescimento do lactobacilo e da levedura apresentadas a
seguir foram modeladas at o final da fase estacionria conforme Baranyi e
Roberts (1994) e Gompertz modificado (Zwietering, 1991), utilizando o software
DMFIT 2.1. Os valores estimados dos parmetros pelo modelo de Baranyi &
Roberts (1994), tempo de adaptao (lag), taxa de crescimento (.) e populao
mxima esto apresentados nas tabelas 9 e 10 para as culturas mistas e puras,
respectivamente. Para as curvas ajustadas pelo modelo de Gompertz modificado
(Zwietering et al, 1991) (vide tabelas 11 e 12), em dois experimentos no tiveram
bom coeficiente de correlao dos dados (R
2
<0,90), um para a cultura pura de
lactobacilo 04(31S0L7), e outro para a cultura mista de levedura 02 (31S6L3). O
modelo de Gompertz modificado no foi capaz de predizer o tempo de adaptao
para a cultura mista de lactobacilo no caso dos experimentos 02(31S6L3), 03
(25S6L7), 06(32S6L5), 7(28S6L1), 09 (28S6L5), 10(28S6L5) e 11(28S6L5).
Pelo coeficiente correlao dos dados (R
2
> 0,92) pode-se observar muito
bom ajuste do modelo de Baranyi e Roberts (1994), indicando que este descreve
melhor, quando comparado ao modelo de Gompertz modificado, o fenmeno de
crescimento de ambos microrganismos.
Portanto, para a modelagem primria optou-se pelos parmetros preditos
pelo modelo de Baranyi & Roberts (1994).
Observando a tabela 9 e figura 7 (25S6L3), pode-se observar que no h
diferena na taxa de crescimento da levedura quando em cultura pura (0,19h
-1
) ou
mista (0,18h
-1
), isto tambm pode ser observado para a populao mxima, no
entanto houve uma pequena diferena entre o tempo de adaptao da cultura

78
pura e mista, de 7,04h para 5,61h, respectivamente. Porm para o lactobacilo h
um decrscimo na taxa de crescimento de 0,30h
-1
para 0,21h
-1
quando este
cultivado juntamente com a levedura. Este fato pode ser relacionado com a
diferena na concentrao de clulas dos microrganismos, pois a levedura neste
experimento, foi inoculada em maior concentrao (10
6
UFC/mL) que o lactobacilo
(10
3
UFC/ml), desta forma a S. cerevisiae reduziu o crescimento de L.fermentum
no mosto de cana-de-acar. Este resultado est de acordo como os
apresentados por Thomas et al (2001). No entanto, o lactobacilo, quando em co-
cultura com a levedura atinge a populao mxima de 3,04x10
9
UFC/mL, enquanto
que o lactobacilo quando cultivado em cultura pura atingiu populao mxima de
5,83x10
8
UFC/mL.
A populao mxima da levedura, atingindo 10
8
UFC/mL em todos os
experimentos, no sofre redues considerveis quando em co-cultura com a
bactria lctica. Em cultura pura, a reduo na populao mxima do lactobacilo
pode ser devido ausncia de micronutrientes que so liberados com a autlise
das clulas da levedura, podendo-se destacar as vitaminas B12 e biotina,
permitindo desta forma que o lactobacilo, quando cultivado juntamente com a
levedura, atinja nveis elevados durante o processo de fermentao alcolica. Na
figura 7, pode-se avaliar tambm a extenso da fase exponencial da levedura que
de aproximadamente 10 horas, apresenta uma longa curvatura de acelerao
negativa antes da fase estacionria. A fase exponencial do lactobacilo quase 3
vezes maior, aproximadamente 30 horas.
79
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0
Baranyi - lactobacilo puro Baranyi - lactobacilo misto
Baranyi - levedura pura Baranyi - levedura mista
Dados experimentais - lactobacilo puro Dados experimentais - lactobacilo misto
Dados experimentais - levedura pura Dados experimentais - levedura mista

Figura 7. Curvas de crescimento experimento 01(25S6L3) de L.fermentum e S.
cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas.

Analisando-se a figura 8 (31S6L3), pode-se observar que o tempo de
adaptao do lactobacilo sofreu reduo quando cultivado em cultura mista com a
levedura, passando de 7,12 horas em cultura pura para 2,62 horas. A levedura foi
cultivada com o lactobacilo e teve seu tempo de adaptao de 1,26 horas e em
cultura pura sendo elevado 6 horas. No foi encontrado na literatura relatos para a
comparao destes resultados, no entanto parece existir sinergismo entre ambos
os microrganismos, com relao ao tempo de adaptao, facilitando, em alguns
casos, a adaptao um para o outro. Este fato importante pois, em cultura mista,
a levedura entra na fase exponencial num tempo 4 vezes menor do que quando
cultivada em cultura pura. Neste experimento, a taxa de crescimento do
lactobacilo, quando em co-cultura com a levedura foi 0,35h
-1
, sendo que a mesma
sofre uma reduo para 0,17h
-1
quando este microrganismo foi cultivado sem a
presena da levedura. Este acontecimento pode estar correlacionado ao fato do

80
lactobacilo requerer uma imensa variedade de fatores para seu crescimento,
sendo que dentre os mais importantes pode-se citar nucleotdeos, aminocidos e
vitaminas, como Biotina e vitamina B12. sabido que a biotina um fator
essencial de crescimento para a S. cerevisiae, de modo similar quando suas
clulas so lisadas aps algumas horas do processo fermentativo essa biotina vai
sendo liberado gradativamente no meio a partir do final da fase exponencial at o
inicio da fase estacionria, dando condies favorveis para o desenvolvimento
para o lactobacilo (Oliva-Neto & Yokoya,1997). No entanto, para o mesmo
experimento, a levedura teve a taxa de crescimento afetada pela presena do
lactobacilo, quando em cultura pura a taxa foi de 0,24h
-1
, sofrendo uma reduo
para 0,16 h
-1
, quando cultivada juntamente com a bactria lctica, afetando desta
forma o tempo de gerao da levedura de 2,88 horas para 4,30 horas (ver tabelas
8 e 9). Essia-Ngang et al (1989) quando avaliaram o efeito do cido lctico,
intencionalmente adicionado, nos parmetros de crescimento da levedura, em
concentrao de 3x10
6
UFC/mL em melao de beterraba, verificaram que, com o
aumento da concentrao de cido lctico no meio de cultivo de 5 g/L para 30 g/L,
houve a reduo da taxa de crescimento de 0,6h
-1
para aproximadamente 0,2h
-1
.
No entanto, quando o inculo de levedura foi incrementado para 5x10
7
UFC/mL, a
reduo na taxa de crescimento foi menos acentuada quando avaliada em mesmo
nvel de concentrao de cido lctico, o decrscimo na taxa foi de
aproximadamente 0,95h
-1
para a 0,8h
-1
.
81
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0

cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas.

A taxa de crescimento do lactobacilo no experimento 03 (25S6L7), em cultura
pura foi de 0,17h
-1
(vide tabelas 9 e 10), quando este microrganismo foi cultivado
com a levedura, S=10
6
UFC/mL, este parmetro foi elevado para 0.26h
-1
(tabelas 9
e 10). No entanto, no houve alterao na taxa de crescimento da levedura,
quando cultivada em cultura mista com o lactobacilo ou em cultura pura. O tempo
de adaptao da levedura sofreu um incremento de 8,61 horas quando cultivada
em cultura pura para 11,05 horas quando em co-cultura com a bactria lctica.
Para o lactobacilo, no houve modificaes considerveis no tempo de adaptao
quando cultivado em cultura mista ou individualmente. A populao mxima do
lactobacilo atingiu 4,37x10
13
UFC/mL quando cultivada em cultura mista com o
levedura. Este valor sofreu uma reduo para 2,18x10
12
UFC/mL quando o

82
microrganismo foi cultivado individualmente. Observa-se, na figura 9 que, quando
o lactobacilo est em cultura pura, no L=10
7
UFC/mL, a fase estacionria foi
atingida com 50 horas, j no caso da levedura em 15 horas entra na fase
estacionria nestas condies. Em contrapartida quando o lactobacilo estava em
co-cultura com a levedura em mesmo nvel de inculo, a fase estacionria foi
atingida por volta de 68 horas de processo. Estes resultados confirmam, mais uma
vez, uma sinergia de convivncia entre as duas culturas, onde quanto mais clulas
lisadas de levedura existirem maior o crescimento do lactobacilo, sendo que
muitos estudos tm atribudo este fato ao efeito da liberao de nutrientes no
meio, especialmente aminocidos como resultados da autlise da levedura (Essia-
Ngang, 1992).
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0


83
No experimento 04 (31S6L7), a levedura, quando cultivada em cultura mista
com o lactobacilo, tem a taxa de crescimento de 0,34h
-1
(ver tabelas 9 e 10),
atingindo a fase estacionria com por volta de 18 horas de fermentao (vide
figura 10). Neste mesmo perodo de tempo, o lactobacilo estava em pleno
crescimento exponencial. Este fato pode ser entendido quando se considera que a
levedura tem uma taxa de crescimento elevada em presena de inculo de
10
7
UFC/mL de L.fermentum, isto implica na chegada mais rpida na fase de morte
celular, liberando assim no meio, aminocidos essenciais ao crescimento do
lactobacilo (Oliva-Neto & Yokoya, 1997). A presena destes micronutrientes no
meio pode ser relacionada com a populao mxima atingida pelo lactobacilo, pois
quando em co-cultura o L.fermentum atingiu 1,04x10
12
UFC/ml, enquanto quando
cultivada individualmente esta populao foi reduzida a 7,38x10
11
UFC/mL. O
tempo de adaptao do lactobacilo passou de 30,42 horas, em cultura pura para
6,82 horas em cultura mista, demonstrando que a levedura permite melhor
adaptao ao meio do lactobacilo. possvel, que o tempo de adaptao do
lactobacilo seja afetado tambm pela temperatura de 31C na cultura pura. No
entanto, quando este microrganismo cultivado juntamente com a levedura o o
tempo de adaptao, foi reduzido. A taxa de crescimento do lactobacilo sofreu
decrscimo de 0,20 h
-1
, em cultura pura para 0,15h
-1
em co-cultura com a
levedura, onde o crescimento da bactria lctica pode ser inibido durante a
fermentao no somente pela produo de cidos orgnicos, mas tambm pela
limitao de nutrientes (Leroy & Vuyst, 2001), causando assim alteraes nos
parmetros de crescimento.

84
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0

Figura 10. Curvas de crescimento experimento 04 (31S6L7) L.fermentum e S.

A 24C com 10
5
UFC/mL de inculo de L.fermentum (24S6L5) (Figura 11, ver
tabelas 8 e 9), as taxas de crescimento dos microrganismos no sofreram
alteraes considerveis, quando cultivadas em cultura mista ou pura. No entanto,
o lactobacilo teve um incremento na taxa de crescimento de 0,17h
-1
em cultura
pura para 0,19h
-1
quando cultivado juntamente com a levedura. O trmino da fase
exponencial de crescimento do lactobacilo, tanto em cultura mista quanto em
cultura pura foi por volta de 40h. Demonstrando, desta forma o antagonismo entre
estes dois microrganismos, onde o lactobacilo compete com a levedura pelos
nutrientes do mosto, e os metablitos excretados no meio, pela bactria lctica,
inibem o metabolismo fermentativo da levedura (Chin e Ingledew, 1994).
85
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0


Quando a levedura cultivada em cultura mista com o lactobacilo, a 32C
com concentrao de clulas de lactobacilo em 10
5
UFC/mL (32S6L5) (Figura 12,
ver tabelas 9 e 10), a sua taxa de crescimento elevada de 0,16h
-1
, quando
cultivada individualmente, para 0,22h
-1
, quando cultivada em cultura mista com o
lactobacilo. No entanto, o lactobacilo tem a taxa de crescimento reduzida de
0,47h
-1
, quando em cultura pura, para 0,35h
-1
quando cultivado em co-cultura com
a levedura. Em contrapartida, quando o lactobacilo est cultivado juntamente com
a levedura, a populao mxima atingida de 1,53x10
12
UFC/mL, sofrendo uma
reduo para 2,07x10
11
UFC/mL, quando cultivado individualmente. Quando a
levedura atinge a fase estacionria, por volta de 20 horas, o lactobacilo estava em
pleno crescimento exponencial, evidenciando que a presena dos metablitos
excretados pela lise das clulas de levedura durante o perodo estacionrio, torna-

86
se importante fonte de nutrientes para o metabolismo da bactria lctica (Oliva
Neto & Yokoya, 1997; Essia-Ngang et al 1992).

0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0


No experimento 07 (28S6L1), o lactobacilo no teve influncia marcante
nos parmetros de crescimento da levedura, a taxa de crescimento manteve-se ao
redor de 0.20h
-1
, o tempo de adaptao foi aproximadamente 6 horas, para as
culturas mista e pura e, conseqentemente, o tempo de gerao no foi afetado (3
horas). Este fato importante pois neste nvel de contaminao (10
1
UFC/mL), o
lactobacilo no afeta os parmetros de crescimento da levedura, , e populao
mxima. Seria, portanto, interessante assim a contaminao do lactobacilo em
10
1
UFC/mL.
87
Essia-Ngang et al (1992) cultivaram em melao de beterraba, L.casei com
concentrao inicial fixa em 3x10
6
UFC/mL em co-cultura com S.cerevisiae com
concentrao inicial variando de 5x10
6
a 1.2x10
8
UFC/mL. E, verificaram que
quando a levedura estava em maior concentrao que o lactobacilo, a evoluo do
consumo de sacarose e as atividades metablicas das leveduras no foram
afetadas pelo crescimento da bactria lctica. Contudo, quando os parmetros do
lactobacilo foram avaliados, ao cultiv-lo em cultura mista com a levedura, a sua
taxa de crescimento foi incrementada de 0.16h
-1
para 0.28h
-1
, com conseqente
reduo no tempo de gerao de 4.47 horas, em cultura pura, para 2.52 horas, em
cultura mista. Demonstrando assim, o sinergismo de crescimento do lactobacilo
com a levedura.
0
1
2
3
4
5
6
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0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0

S. cerevisiae , em culturas puras e culturas mistas.

88
Quando o lactobacilo foi inoculado na concentrao de 10
8
UFC/mL, no
experimento 08 (28S6L8) (figura 14 ver tabelas 8 e 9), implicou em inibio leve
da taxa de crescimento da levedura, sendo que quando cultivada em cultura pura
a taxa foi de 0.23h
-1
sendo reduzida para 0.13h
-1
quando em co-cultura com o
lactobacilo. Vereecken et al (2003) em pesquisa na qual cultivaram Yersinia
enterocolitica em co-cultura com L.sakei, demonstraram que a produo de cido
lctico tem efeito txico para as clulas dos outros microrganismos em co-cultura,
pois, est associado com a reduo do pH do meio de cultivo e simultaneamente
com a formao de cido lctico na forma de lactato, o qual capaz de penetrar
na membrana celular ocasionando queda no pH intracelular. Os autores
verificaram que, com aumento da concentrao de clulas do lactobacilo, e
conseqente aumento da produo de cido lctico, o crescimento da Y.
enterocolitica era inibido. Desta forma, a bactria lctica tornava o meio adverso
para o crescimento da Y.enterocolitica. Este fenmeno conhecido como
antagonismo lctico para microrganismos patognicos.
O lactobacilo em concentrao de 10
8
UFC/mL (Figura 14), quando
cultivado juntamente com a levedura, teve sua taxa de crescimento elevada de
0,16h
-1
, em cultura pura para 0,51h
-1
. Esta taxa foi a maior registradas nos
experimentos em cultura mista e este aumento na taxa de crescimento pode ser
observado quando a levedura passa para a fase estacionria (figura 14). Este
fenmeno deve-se ao fato do lactobacilo ser um microrganismo fastidioso que
requer inmeros nutrientes para o seu crescimento. Estes nutrientes so liberados
no meio quando h autlise da clula da levedura, desta forma tornam-se
disponveis para o metabolismo da bactria lctica.
89
0
1
2
3
4
5
6
7
0 20 40 60 80 100
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0

S. cerevisiae, em culturas puras e culturas mistas.

No experimento 09 (28S6L5) (Figura 15 ver tabelas 8 e 9), o lactobacilo
sofreu reduo na taxa de crescimento de 0,53h
-1
em cultura pura para 0,18h
-1
em
cultura mista. O fato a levedura (10
6
UFC/mL) ter sido inoculada em maior
concentrao que o lactobacilo (10
5
UFC/mL) levando a inibio do metabolismo
do L.fermentum, como observado por Thomas et al (2001) e Essia-Ngang (1992).
No entanto, a taxa de crescimento da levedura tambm foi afetada pela presena
do lactobacilo no meio de cultivo, decaindo de 0,20h
-1
para 0,16h
-1
quando
cultivado com o lactobacilo, mostrando que mesmo o lactobacilo em menor
concentrao que a levedura, reduz o pH do meio de 6.07 para 4.86 em 36 horas
de fermentao. A concentrao de cido lctico era de 7,66g/L neste tempo de

90
processo que pode provocar a reduo do pH intracelular da levedura, causando
danos s clulas . A populao final do lactobacilo, no entanto, no foi afetada.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (horas)
L
o
g

N
/
N
0


Analisando, de forma geral, os dados das tabelas 9 e 10 pode-se inferir
que, na maioria dos casos, o lactobacilo tem seu tempo de adaptao reduzido
quando em co-cultura, e tambm pode-se verificar que h um efeito na taxa de
crescimento dado pela interao entre a temperatura e o nvel de inculo. A
populao mxima afetada pelo nvel inicial de inculo e pela presena da
levedura. No entanto, a populao mxima da levedura no afetada pela
presena do lactobacilo, porm a sua taxa de crescimento sofre decrscimo, em
alguns casos, quando cultivada em co-cultura. O tempo de adaptao da levedura,
91
na maioria dos experimentos, tem seu valor reduzido quando cultivado em cultura
mista.
Os parmetros gerados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994) foram
avaliados estatisticamente atravs do Teste de Tukey. No houve diferena
significativa para o tempo de adaptao, taxa de crescimento e populao mxima
em cultura pura e mista da levedura. Para o lactobacilo, as taxa de crescimento e
o tempo de adaptao no tiveram diferena significativa em cultura pura e mista,
no entanto, ao avaliar-se a populao mxima das culturas pura e mista, houve
diferena significativa ao nvel de 10% de significncia. Os testes esto
apresentados na tabela 8.

92
Tabela 8. Resultados do teste Tukey para os parmetros de crescimento do L.
fermentum e S. cerevisiae gerados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994).
Varivel Mdia
Desvio
Padro
N Diferena
Desvio
padro da
diferena
t GL p
Lactobacilo
misto
5.66 4.31
Lactobacilo
puro
8.78 7.68
11 -3.13 7.69 -1.35 10 0.0208
Levedura
mista
6.78 3.53
Tempo de
adaptao
(h)
Levedura
pura
6.86 0.99
11 -0.0836 2.71 -0.102 10 0.9205
Lactobacilo
misto
0.255 0.11
Lactobacilo
puro
0.302 0.16
11 -0.047 0.229 -0.686 10 0.508
Levedura
mista
0.191 0.062
Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Levedura
pura
0.208 0.023
11 -0.017 0.069 -0.820 10 0.431
Lactobacilo
misto
11.37 1.74
Lactobacilo
puro
11.01 1.74
11 0.367 0.0448 2.72 10 0.022
Levedura
mista
8.54 0.226
Populao
mxima
(UFC/mL)
Levedura
pura
8.46 0.242
0.241 0.077 0.217 1.166 10 0.271
Onde: mdia: mdias dos parmetros calculados pelo modelo;
N: nmero de parmetros avaliados;
Diferena: diferena entre as mdias das culturas puras e mistas;
t: valor do teste Tukey
GL: graus de liberdade
p: p valor

93
Tabela 9. Parmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura pura,
estimados pelo de Baranyi e Roberts (1994)
L.fermentum S. cerevisiae
Experimento
Temperatura
(C)
Nvel de
inculo de
L.fermentum
(UFC/mL)
Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

01 25 10
3
0,210 6,07 3,32 3,04E+09 0,99 0,180 5,61 3,84 7,46E+08 0,96
02 31 10
3
0,350 2,62 2,00 4,12E+09 0,98 0,160 1,26 4,30 2,66E+08 0,98
03 25 10
7
0,258 3,42 2,68 4,37E+13 0,99 0,233 11,05 2,98 8,03E+08 0,99
04 31 10
7
0,148 6,82 4,67 1,04E+12 0,97 0,347 14,96 1,99 1,82E+08 0,97
05 24 10
5
0,190 13,14 3,60 8,65E+11 0,99 0,140 5,96 4,82 4,52E+08 0,96
06 32 10
5
0,350 5,04 1,97 1,53E+12 0,98 0,220 4,66 3,12 2,67E+08 0,92
07 28 10
1
0,275 2,58 2,52 6,17E+07 0,98 0,216 6,12 3,21 2,02E+08 0,98
08 28 10
8
0,512 14,44 1,35 2,34E+13 0,96 0,127 5,40 5,48 2,41E+08 0,96
09 28 10
5
0,155 2,38 4,48 7,92E+11 0,98 0,167 6,45 4,15 2,79E+08 0,98
10 28 10
5
0,176 3,58 3,93 4,27E+11 0,96 0,154 6,68 4,50 5,94E+08 0,97
11 28 10
5
0,184 2,13 3,77 3,39E+11 0,96 0,155 6,38 4,48 2,88E+08 0,96

94
Tabela 10. Parmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura mista,
estimados pelo modelo de Baranyi e Roberts (1994)
Experimento
Temperatura
(C)
Nvel de
inculo de
L.fermentum
(UFC/mL)
Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

01 25 10
3
0,300 5,00 2,33 5,83E+08 0,97 0,190 7,04 3,61 9,05E+08 0,98
02 31 10
3
0,170 7,12 4,06 4,05E+09 0,96 0,240 6,01 2,88 3,25E+08 0,96
03 25 10
7
0,166 4,94 4,19 2,18E+12 0,97 0,213 8,61 3,26 2,58E+08 0,94
04 31 10
7
0,200 30,42 3,46 7,38E+11 0,93 0,219 8,70 3,16 2,39E+08 0,93
05 24 10
5
0,170 5,92 4,08 6,93E+11 0,97 0,190 5,76 3,63 2,28E+08 0,97
06 32 10
5
0,470 5,44 1,46 2,07E+11 0,98 0,160 5,77 4,24 4,57E+08 0,96
07 28 10
1
0,155 2,32 4,47 3,26E+07 0,98 0,195 6,67 3,55 1,85E+08 0,99
08 28 10
8
0,166 13,47 4,19 4,91E+13 0,99 0,225 6,81 3,08 1,57E+08 0,95
09 28 10
5
0,461 7,29 1,50 3,60E+11 0,98 0,225 6,72 3,08 2,55E+08 0,99
10 28 10
5
0,546 7,48 1,27 1,80E+11 0,96 0,229 6,96 3,02 5,63E+08 0,96
11 28 10
5
0,524 7,22 1,32 2,02E+11 0,98 0,200 6,40 3,48 1,50E+08 0,91

95
Tabela 11. Parmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura mista,
estimados pelo modelo de Gompertz modificado (Zwietering et al, 1991)
Experimento
Temperatura
(C)
Nvel de
inculo de
L.fermentum
(UFC/mL)
Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

01 25 10
3
0,239 7,80 2,99 3,91X10
9
0,98 0,126 4,10 5,50 7,54X10
8
0,96
02 31 10
3
0,176 - 3,94 4,25X10
9
0,97 0,188 1,49 3,69 2,79X10
8
0,89
03 25 10
7
0,130 - 5,33 3,12X10
13
0,98 0,230 10,07 3,01 2,55X10
8
0,93
04 31 10
7
0,163 7,85 4,25 2,57X10
12
0,95 0,209 7,99 3,31 3,34X10
8
0,94
05 24 10
5
0,181 10,99 3,83 1,52X10
13
0,97 0,182 7,54 3,81 4,60X10
8
0,94
06 32 10
5
0,166 - 4,18 1,58X10
12
0,97 0,239 4,75 2,90 2,70X10
8
0,92
07 28 10
1
0,144 - 4,81 6,32X10
7
0,97 0,269 6,85 2,58 2,02X10
8
0,97
08 28 10
8
0,243 13,50 2,85 1,66X10
13
0,95 0,163 6,64 4,25 2,49X10
8
0,94
09 28 10
5
0,141 - 4,92 1,99X10
11
0,97 0,204 8,48 3,40 2,96X10
8
0,96
10 28 10
5
0,150 - 4,62 5,54X10
11
0,96 0,198 8,99 3,50 5,61X10
8
0,97
11 28 10
5
0,160 - 4,33 5,63X10
11
0,97 0,206 8,99 3,36 2,77X10
8
0,96
(-) no houve ajuste do modelo

96
Tabela 12. Parmetros de crescimento do Saccharomyces cerevisiae e Lactobacillus fermentum em cultura pura,
estimados pelo modelo de Gompertz modificado (Zwietering et al 1991)
Experimento
Temperatura
(C)
Nvel de
inculo de
L.fermentum
(UFC/mL)
Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

Taxa de
crescimento
(h
-1
)
Tempo de
adaptao
(h)
Tempo
de
gerao
(h)
Populao
mxima
(UFC/mL)
R
2

01 25 10
3
0,198 7,66 3,50 9,94X10
8
0,98 0,133 3,36 5,21 5,52X10
8
0,96
02 31 10
3
0,154 4,20 4,50 3,30X10
9
0,93 0,280 6,48 2,48 3,38X10
8
0,93
03 25 10
7
0,152 4,19 4,56 2,23X10
6
0,97 0,176 7,82 3,93 2,55X10
8
0,93
04 31 10
7
0,080 10,86 8,66 2,97X10
14
0,82 0,168 6,28 3,31 2,11X10
8
0,94
05 24 10
5
0,211 8,77 3,28 1,36X10
12
0,96 0,140 5,32 4,95 2,76X10
8
0,96
06 32 10
5
0,212 0,85 3,27 1,869X10
11
0,97 0,185 6,39 3,75 4,57Z10
8
0,95
07 28 10
1
0,198 4,34 3,50 2,70X10
8
0,92 0,246 7,51 2,82 1,89X10
8
0,98
08 28 10
8
0,202 15,05 3,43 5,63X10
13
0,98 0,158 5,75 4,39 2,20X10
8
0,96
09 28 10
5
0,215 4,56 3,22 2,65X10
11
0,97 0,202 6,67 3,40 2,96X10
8
0,96
10 28 10
5
0,216 5,54 3,20 2,83X10
11
0,98 0,207 6,73 3,34 5,53X10
8
0,96
11 28 10
5
0,210 4,78 3,30 1,59X10
11
0,97 0,201 6,32 3,44 2,49X10
8
0,90

97
5.3. ndice de viabilidade da levedura (IV)
As percentagens do indce de viabilidade (IV) da levedura versus o tempo de
fermentao so apresentados para os experimentos 7 (28S6L1), 8 (28S6L8) e 9 (28S6L5)
(Figura 16), 1 (25S6L3) e 3 (25S6L7) (Figura 17), 2 (31S6L3) e 4 (31S6L7) e 1 (25S6L0), 2
(31S6L0), 5 (24S6L0), 6 (32S6L0) e 9 (28S6L0). Em todas as figuras foi apresentado o IV
para a levedura em cultura pura nas mesmas condies dos respectivos testes. Pode-se
observar, em todas as figuras, a correlao negativa da porcentagem de clulas viveis de
levedura e o aumento da concentrao de clulas de L.fermentum, portanto os resultados
demonstram que a presena de cido no meio de cultivo produzido pela bactria lctica,
provoca a diminuio da viabilidade celular. Os dados apresentados esto em concordncia
com os resultados apresentados por Nobre et al (2007), que cultivou S. cerevisiae em cultura
mista com L.fermentum em meio de caldo de cana-de-acar ajustado a 5Brix e
suplementado com 1,0% de extrato de levedura e 1,0% de peptona. Os autores observaram
uma correlao entre o aumento da acidez do meio e a diminuio da viabilidade celular da
levedura em cultivo associado com bactrias lcticas.
Na figura 16, ao tempo de 20 horas de processo com L=10
1
UFC/mL, o ndice de
viabilidade era de aproximadamente 90%,quando o pH era 4,95 e a concentrao de cido
lctico era 7,55g/L e quando o inculo foi elevado para 10
5
UFC/mL o ndice de viabilidade
sofreu reduo para 50% com valor de pH 4,83 e concentrao de cido lctico de 8,82g/L,
e quando o L foi incrementado para 10
8
UFC/mL o ndice de viabilidade foi menor que 20%,
ao mesmo tempo de processo, com pH do mosto fermentado de 4,23 e concentrao de
cido lctico 10,97g/L. Levando em considerao o processo de fermentao industrial, em
torno de 10 horas, para uma contaminao baixa com L=10
1
UFC/mL de lactobacilo, o IV da
levedura foi de 100%, no entanto ao elevar a contaminao para 10
5
ou 10
8
UFC/mL IV da
levedura foi reduzido para 80%.

98
Como o processo brasileiro de fermentao alcolica faz uso de reciclo de fermento,
as leveduras ficam expostas por tempos crescentes a ao das bactrias lcticas, podendo
acarretar no decrscimo da viabilidade celular.
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
0 20 40 60 80 100 120
C
l
u
l
a
s

v
i
v
e
i
s
Tempo (horas)
L=10^1 L=10^5 L=10^8 Levedura pura

Figura 16. ndice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum experimento
07(28S6L1), 08 (28S6L8) e 09 (28S6L5) e levedura em cultura pura (28S6L0).

A T=25C e com L=10
3
UFC/mL (figura 17), o IV foi de aproximadamente 98% a 10
horas de processo. Com o aumento de L=10
7
UFC/mL, o IV decai para aproximadamente
90%, e a partir deste perodo o ndice de viabilidade decresce oscilatoriamente e de forma
rpida. O mesmo fenmeno pode ser observado a 31C (Figura 18).

99
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
120.00%
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
l
u
l
a
s

v
i
v
e
i
s
Levedura pura L=10^3 L=10^7

Figura 17. ndice de viabilidade de S.cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum para o
experimento 01 (25S6L3) e 03 (25S6L7) e levedura em cultura pura (25S6L0).

0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
120.00%
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
l
u
l
a
s

v
i
v
e
i
s
Levedura pura L=10^3 L=10^7

Figura 18. ndice de viabilidade de S. cerevisiae, em co-cultura com L.fermentum para o
experimento 02(31S6L3) e 04(31S6L7) e levedura em cultura (31S6L0).

100
A anlise da figura 19 demonstra que a variao na temperatura afetou
consideravelmente o ndice de viabilidade celular, com incremento de 7C na temperatura, de
25 para 32C, h o decrscimo do ndice de viabilidade de aproximadamente 80% para 0%
em 100 horas de fermentao. Phisalaphong et al (2006) relatam que altas temperaturas
causam decrscimo no rendimento celular, e no caso de levedura para a produo de etanol,
a causa pode ser relacionada com a mudana na atividade de transporte celular ativo, ou no
nvel de saturao dos compostos solveis e dos solventes intracelulares. McMeekin et al
(2002) relatam que o efeito indireto de altas temperaturas pode estar associado
desnaturao dos ribossomos e enzimas, ou ainda problemas de permeabilidade da
membrana celular. Sendo assim, como o uso do reciclo de fermento uma prtica comum na
indstria brasileira, quando o processo ocorre a temperaturas acima de 30C, a levedura fica
exposta por um perodo longo de tempo a temperaturas altas que causam decrscimo no
ndice de viabilidade celular. No entanto, as indstrias fazem injeo de clulas novas de
levedura em um perodo de 8 a 12 horas de processo.
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
120.00%
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
l
u
l
a
s

v
i
v
e
i
s
24C 25C 28C 31C 32C

Figura 19. ndice de viabilidade de S. cerevisiae, em cultura pura em diferentes temperaturas
para os experimentos 01 (25S6L0), 02(31S6L0),05(24S6L0), 06(32S6L0), 09(28S6L0).

101
5.3.1 Efeitos da temperatrura de fermentao e nvel de inculo de L. fermentum no
ndice de viabilidade da levedura em cultura mista

Para o ndice de viabilidade (IV) foi gerado um modelo polinomial de segunda ordem,
tendo como variveis indepedentes temperatura e nvel de inculo, e varivel dependente o
ndice de viabilidade. Para o ajuste do modelo foi selecionado o valor de IV em 21 horas de
fermentao. Como pode-se verificar nas figuras 16, 17 e 18, neste perodo de tempo o valor
de IV apresenta um decrscimo relevante. O nvel de inculo de S. cerevisiae foi mantido
constante em 10
6
UFC/mL.
Avaliando-se a tabela 13 pode-se verificar que o nvel de inculo quadrtico tem maior
efeito significativo (p<0,10).
Tabela 13. Efeitos da temperatura de fermentao e nvel de inculo de L. fermentum no
Effect Estimates; Var .:IV; R-sqr=.85116; Adj:.70233 (dados de entrada do modelo.sta)
2 factor s, 1 Blocks, 11 Runs; MS Residual=309.4796
DV: IV
Factor
Effect Std.Err. t(5) p -95.%
Cnf.Limt
+95.%
Cnf.Limt
Coeff. Std.Err.
Coeff.
-95.%
Cnf.Limt
+95.%
Cnf.Limt
Mean/Interc.
(1)Temperatur a(L)
Temperatura(Q)
(2)Lactobacilo(L)
Lactobaci lo(Q)
1L by 2L
95,5994 10,15664 9,41249 0,000228 69,4909 121,7078 95,5994 10,15664 69,4909 121,7078
-14,6882 12,45799 -1,17902 0,291435 -46,7125 17,3361 -7,3441 6,22899 -23,3562 8,6681
-22,7870 14,86562 -1,53286 0,185885 -61,0003 15,4264 -11,3935 7,43281 -30,5001 7,7132
-41,2634 12,45799 -3,31220 0,021189 -73,2877 -9,2391 -20,6317 6,22899 -36,6438 -4,6196
-55,5268 14,86562 -3,73525 0,013498 -93,7401 -17,3134 -27,7634 7,43281 -46,8700 -8,6567
25,2800 17,59203 1,43701 0,210215 -19,9418 70,5018 12,6400 8,79602 -9,9709 35,2509

O modelo polinimial de segunda ordem est apresentado na equao 23. Este modelo
apresentou bom coeficiente de correlao dos dados com R
2
0,85.
2
* 76 , 27 * 63 , 20 60 , 95 L L IV =
Equao 23
Pela avaliao da figura 20 pode-se inferir que a levedura apresentou maior IV 25
o
C
com L=10
3
UFC/mL. Essas condies so favorveis a manuteno do IV da levedura
prximo a 100% ao crescimento (vide figura 19). O menor IV foi apresentado quando o
lactobacilo estava em concentrao 10
8
UFC/mL e T=28
o
C, isso indica que a temperatura

102
apesar de apresentar um pequeno efeito sobre IV o efeito mais significativo notato pela
mudanca no nvel de inculo de lactobacilo.

Figura 20. Efeitos da temperatura de fermentao e nvel de inculo de L. fermentum no

103
5.4. Modelagem quase qumica

Para a construo do modelo quase-qumico foi utilizada a metodologia proposta por
Ross et al (2004), descrito no item 4.10.2, utilizando o software Matlab 7.5. Este modelo foi
escolhido para descrever o crescimento/morte, pois pressupe-se que ambos
microrganismo, lactobacilo e levedura, teriam uma curta fase estacionria e entrariam no
processo de declnio instantneo, e tambm porque este modelo prediz crescimento e morte
de forma contniua, e os demais modelos ultilizados, Baranyi & Roberts e Gompertz
modificado, ajustam os dados somente da fase de adaptao at a fase estacionria.
Os resultados desta modelagem esto no Anexo C, e as figuras do crescimento/morte
esto graficadas apresentando o logartimo da contagem de colnias (Log Cols) experimental
(o) e calculado pelo modelo ( ) versus tempo (horas) O modelo prediz o crescimento/morte,
no contemplando a fase estacionria (vide figura 20). A morte, segundo Ross et al (2005),
seria devido produo de um metablito antagonista hipottico quorum sense, uma
quantidade de metablito produzido pelo prprio microrganismo que inibiria o crescimento
celular. Em alguns casos, como no experimento 09 para a levedura em cultura mista onde o
SSE (Soma do quadrado dos erros) igual a 1, este modelo se ajusta bem aos dados
experimentais, pois os microrganismos entram em processo de declnio imediatamente aps
a fase exponencial que pode ser devido ao esgotamento de acares. No entanto, a medida
da fase de adaptao () no fica bem definida neste modelo. Isto foi devido ao ajuste linear
realizado pelo modelo em cada fase do ciclo de crescimento do microorganismo (vide anexo
C experimento 01). Pode-se verificar uma relao direta entre o aumento do valor de k
1

(constante da fase de adaptao) e a reduo de tempo na fase de adaptao.
Ao comparar os experimento 01 (25S0L3), 02 (31S0L3), 03 (25S0L7) e 04 (31S0L7)
para a cultura pura de lactobacilo, pode-se verificar que o valor de k
1
sofre variao pela

104
interao do nvel inculo com a temperatura de cultivo do lactobacilo, onde o lactobacilo
quando cultivado a 25C com 10
3
UFC/mL, tem taxa constante k
1
= 44,53 de ativao das
clulas (M M*) e, conseqentemente, tem o menor tempo de adaptao com o valor de
0.0225 h, j nos demais experimentos (02, 03 e 04) o valor da constante k
1
tem valores entre
12 e 14, e os valores de 0,07 e 0,08 (vide tabela 13).
O modelo quase-qumico subestima a populao mxima para o experimento 04
(31S0L7), pois o modelo prediz Rg=1,77X10
11
UFC/mL (vide anexo C) enquanto a populao
mxima experimental 1,10X10
12
UFC/mL, e o modelo de Baranyi & Roberts (1994) prediz
uma populao mxima prxima de 7,38X10
11
UFC/mL mais prximo da populao verificada
experimentalmente. No entanto, as duas predies so subestimadas. Ao avaliar o
parmetro estatstico SSE, no caso deste experimento 04, que tem um valor de 3,00,
demonstrando desta forma que o modelo no tem bom ajuste aos dados experimentais.
No caso do experimento 05 (24S0L5) para o L. fementum em cultura pura, o modelo se
ajusta bem aos dados experimentais, com o valor de SSE=1,92 (vide figura 21), pois o
lactobacilo tem uma curta fase estacionria entrando imediatamente em fase de declnio, o
que pode ser devido reduo da glicose disponvel que em 60 horas de fermentao atinge
uma das menores concentraes medidas com valor de 25,14g/L.
Em todos os experimentos o valor de k
3
, a constante para as clulas sensibilizadas pelo
metablito antagonista, tem valores prximos de zero, portanto esta etapa, torna-se
praticamente desprezvel (Ross et al, 2005). A morte para o lactobacilo cultura pura ocorre
de forma natural, segundo definio de Roos (2005) pois, a partir de de 48 horas, houve o
esgotamento de glicose (vide anexo C Figura 41 a 51).
105

Figura 21. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura pura para o experimento 05
(24S6L5)

Para o experimento 07 (28S0L1), no h bom ajuste do modelo apresentando um
valor de SSE igual a 3,08. O lactobacilo no entra na fase de declnio, aps 54 horas de
fermentao este microrganismo se mantm na fase estacionria plana, e o modelo no
contempla uma fase estacionria (vide tabela 12 e figura 22).

Figura 22. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura pura para o experimento 07
(28S0L1)

106
O experimento 08 (vide figura 23), para o lactobacilo em cultura pura (28S0L8) o
modelo teve bom ajuste para fase de adaptao, =10,44h; este resultado quando
comparado ao valor obtido pelo ajuste do modelo proposto por Baranyi & Roberts (1994)
=13,47h, mostra-se prximo. O mesmo pode ser verificado para a taxa de crescimento, o
modelo quase-qumico prediz 0,132h
-1
e o modelo de Baranyi & Roberts (1994) prediz
0,166h
-1
. No entanto, a predio para a populao mxima pelo modelo quase-qumico de
4,94x10
14
UFC/mL, o valor obtido com este modelo est prximo do verificado
experimentalmente que foi de 1,65X10
14
UFC/mL.Sendo a predio obtida pelo modelo de
Baranyi & Roberts (1994) de 4,93X10
12
UFC/mL um ciclo logartmico menor que o valor
experimental.

Figura 23. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura pura para experimento 08
(28S0L8)

Os experimento 09, 10 e 11 (28S0L5) apresentam boa repetibilidade. Para estes
experimentos, o modelo quase-qumico no caracteriza fase de adaptao nestas condies
experimentais utlizadas (vide figura 24 para o experimento 09 e tabela 12 para os demais
experimentos)
107

Figura 24. Modelo quase-qumico para o experimento 09, L.fermentum em cultura pura
(28S0L5)

Para os experimentos realizados com a levedura em cultura pura, a medida do tempo
de adaptao () pelo modelo quase-qumico no fica bem definida para nenhum dos onze
experimentos. Para os experimentos 09,10 e 11 no houve boa reprodutibilidade do modelo,
para o parmetro k
1
como relatado anteriormente este modelo no realiza bom ajusta para a
fase lag, portanto os valores de gerados pelo modelo so discrepantes para as trs
repeties. Ao avaliar a taxa de crescimento, a diferena entre os valores gerados no
relevante. No entanto, a populao mxima do experimento 10(20S6L0) um ciclo
logartimico maior que as demais (09 e 11) (vide tabela 12), devido ao ajuste do modelo,
porque este no descreve um plateau da fase estacionria e tende a ajustar pelo ponto de
maior valor (vide figura 25).

108

Figura 25. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura pura(28S6L0)

Os valores de k
1
para os experimentos com a levedura em cultura pura variam de 15 a
30 (vide tabela 12), isto demonstra a rpida transio das clulas (MM*) da fase lag para a
fase exponencial do crescimento (vide figura 26). Ao avaliar os SSE do modelo para a
levedura em cultura pura estes tm menor valor que os SSE dos modelos ajsutados para o
lactobacilo em cultura pura, onde o maior valor de SSE para a levedura foi de 2,34, sendo
que para o lactobacilo em cultura pura o maior erro foi de 3,10, demonstrando assim que o
modelo se ajustou melhor aos dados experimentais da levedura em cultura pura.
109

Figura 26. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura (31S6L0)

Para os experimentos em cultura mista, todos os experimentos, tanto para o lactobacilo
quanto para a levedura, apresentam elevados valores de k
1
(vide tabela 13), demonstrando a
ativao rpida das clulas inoculadas (Figura 27).
Os valores de k
3
, constante da fase de sensibilizao das clulas pelo metablito
antagonista, so maiores que zero para a levedura cultivada em co-cultura, onde na
passagem da fase exponecial para a fase estacionria h uma sensibilizao das clulas da
levedura, provocando a morte deste microrganismo. Quando esta mesma constante (k
3
)
avaliada para o lactobacilo em cultura mista, o valor desprezvel para todos os
experimentos, com exceo do experimento 07 (28S6L1) (Figura 28), onde a levedura se
sobrepe ao lactobacilo devido diferena de nvel de inculo de 5 ciclos logartimicos. No
experimento 04 (31S6L7) em 36 horas de processo, onde a levedura passa para a fase de
morte, a concentrao de cido lctico medida foi de 9,05g/L, sendo que no final do processo
de fermentao (100 horas), onde a levedura atingiu sua menor concentrao celular, a

110
quantidade de cido lctico era 13,71g/L, demonstrando assim, que este cido tem efeito
malfico para as clulas de leveduras.

Figura 27. Modelo quase-qumico para o S. cerevisiae em cultura mista (31S6L7)

Figura 28. Modelo quase-qumico para o L.fermentum em cultura mista (28S6L1)

111
Ao avaliar as constantes geradas pelo modelo, pode-se verificar que, quando a
levedura cultivada com o lactobacilo, a constante k
3
(vide tabelas 14 e 15) sofre um
aumento, demonstrando que houve um efeito antagnico para a levedura em presena de
lactobacilo, mesmo o modelo no contemplando o cultivo de dois microrganismos juntos.

112
Tabela 14. Parmetros gerados pelo modelo quase-qumico para as culturas puras de S. cerevisiae e L.fermentum.
Exp.
Temperatura
(C)
Nvel de
inculo de
L.fermentum
(UFC/mL)
(h
-1
) (h) Rg(UFC/mL) K1 K2 K3 K4 SSE (h
-1
) (h) Rg(UFC/mL) K1 K2 K3 K4 SSE
01 25 10
3
0,1124 0,02 2,35X10
9
44,53 1,50 0,005 1,25 2,30 0,0674 0,03 1,39X10
9
29,00 1,41 0,006 1,25 1,69
02 31 10
3
0,1117 0,07 1,02X10
10
14,58 1,50 0,002 1,25 3,00 0,0842 0,03 6,00X10
8
29,86 1,38 0,024 1,18 2,33
03 25 10
7
0,0892 0,08 1,62X10
13
12,48 1,60 0,000 1,39 3,04 0,0590 0,03 9,88X10
8
34,05 1,41 0,007 1,27 2,13
04 31 10
7
0,0822 0,08 1,77X10
11
12,39 1,55 0,000 1,36 2,41 0,0872 0,06 5,32X10
8
17,65 1,44 0,028 1,25 1,60
05 24 10
5
0,1389 0,08 1,23X10
12
13,17 1,57 0,000 1,25 1,92 0,0619 0,05 1,05X10
9
18,77 1,41 0,007 1,27 1,70
06 32 10
5
0,1241 0,05 2,53X10
12
19,23 1,53 0,000 1,25 2,76 0,0733 0,05 9,88X10
8
20,80 1,42 0,011 1,25 1,97
07 28 10
1
0,1298 0,05 4,37X10
9
21,39 1,55 0,007 1,25 3,10 0,0772 0,04 6,89X10
8
26,92 1,42 0,017 1,25 1,94
08 28 10
8
0,1321 10,44 4,95X10
14
0,013 1,33 0,000 1,02 2,45 0,0755 0,03 5,93X10
8
39,94 1,42 0,020 1,25 1,83
09 28 10
5
0,1295 0,08 1,42X10
12
12,89 1,55 0,000 1,25 2,34 0,0748 0,03 5,03X10
8
33,79 1,42 0,022 1,25 1,63
10 28 10
5
0,1383 0,08 2,20X10
12
12,50 1,57 0,000 1,25 2,57 0,0795 0,05 1,30X10
9
18,37 1,42 0,009 1,25 2,34
11 28 10
5
0,1351 0,08 1,16X10
12
12,21 1,55 0,000 1,24 3,10 0,0711 0,06 6,78X10
8
15,44 1,41 0,015 1,25 2,24

113
Tabela 15. Parmetros gerados pelo modelo quase-qumico para as culturas mistas de S. cerevisiae e L.fermentum
Exp.
Temperatura
(C)
Nvel de
inculo de
L.fermentum
(UFC/mL)
(h
-1
) (h) Rg(UFC/mL) K1 K2 K3 K4 SSE (h
-1
) (h) Rg(UFC/mL) K1 K2 K3 K4 SSE
01 25 10
3
0,1267 0,03 4,44X10
10
37,65 1,53 0,0007 1,24 3,03 0,0689 0,03 1,57X10
9
38,01 1,41 0,006 1,25 1,79
02 31 10
3
0,1204 0,07 2,57X10
10
14,66 1,53 0,001 1,25 2,80 0,0767 0,01 7,78X10
8
86,96 1,40 0,015 1,23 2,54
03 25 10
7
0,1049 0,07 9,65X10
12
13,69 1,57 0,000 1,33 2,01 0,0675 0,01 1,15X10
9
89,66 1,40 0,008 1,25 2,64
04 31 10
7
0,1112 0,07 7,27X10
11
13,46 1,56 0,000 1,30 2,99 0,1167 0,08 6,91X10
8
12,06 1,52 0,037 1,25 1,69
05 24 10
5
0,1256 0,02 9,76X10
11
47,05 1,53 0,000 1,24 2,17 0,0649 0,01 1,24X10
9
85,26 1,40 0,007 1,25 2,51
06 32 10
5
0,1215 0,08 2,57X10
12
13,07 1,52 0,000 1,25 2,63 0,0842 0,08 1,22X10
9
12,59 1,44 0,011 1,25 2,46
07 28 10
1
0,1052 0,01 1,87X10
8
165,54 1,44 0,115 1,20 2,25 0,0667 0,03 7,14X10
8
38,99 1,40 0,012 1,25 2,32
08 28 10
8
0,0950 0,08 4,95X10
13
12,52 1,71 0,000 1,49 3,08 0,0797 0,08 8,72X10
8
12,60 1,53 0,013 1,35 1,91
09 28 10
5
0,1136 0,03 9,72X10
11
29,44 1,51 0,000 1,25 2,16 0,0830 0,08 8,32X10
8
12,53 1,44 0,016 1,25 1,35
10 28 10
5
0,1180 0,07 1,37X10
12
13,29 1,52 0,000 1,25 2,10 0,0787 0,08 8,67X10
8
12,41 1,43 0,014 1,25 1,00
11 28 10
5
0,1255 0,01 1,45X10
12
96,60 1,53 0,000 1,24 2,31 0,0752 0,08 5,99X10
8
12,39 1,42 0,018 1,25 1,42

114
5.5. Modelagem secundria
5.5.1 Efeitos da temperatura e nvel de inculo de L. fermentum sobre a concentrao
mxima de etanol
Para a concentrao mxima de etanol, foi gerado um modelo polinomial de segunda
ordem, em funo de temperatura e nvel de inculo de lactobacilo, utilizando os valores
codificados para as variveis, como fatores significativos (Tabela 16), a p<0.10,o modelo foi
construdo a partir das variveis significativas, temperatura e nvel de inculo (linear e
quadrtico) e a interao entre a temperatura e o nvel de inculo. Este modelo apresentou
um alto coeficiente de correlao dos dados, demonstrando que 94.7% dos dados esto de
acordo com o modelo proposto, e os parmetros de performance do modelo (bias e exatido)
demonstram excelente concordncia Os parmetros de performance do modelo foram
calculados, onde o valor de bias 1.00 e o valor do fator de exatido de 1.02.
Avaliando a tabela 16, a temperatura quadrtica tem maior efeito, ou seja, menor p
valor = 0.001746, na concentrao mxima de etanol. Este efeito pode ser verificado na
superfcie de resposta apresentada na figura 29.
Considerando a cultura mista dos microrganismos S.cerevisiae e L.fermentum, a
produo mxima de etanol ocorre a 28C com L=10
5
UFC/mL (vide figura 28), e
S=10
6
UFC/mL, a quantidade de etanol produzida de 84.83g/L.

115
Tabela 16. Efeitos da temperatura e nvel de inculo para a concentrao mxima de etanol
em cultura mista

O modelo polinomial de 2 ordem est apresentado na equao 24
L T L L T T ol e * 3625 , 2 * 87 , 4 * 253359 , 4 * 36750 , 5 * 43815 , 0 53 , 84 max] tan [
2 2
=
Equao 24
A maior concentrao foi gerada pelo ponto central, seguindo este raciocnio o ponto
de inflexo para maior produo de etanol corresponde a 84.5g/L, o que bem similar ao real
observado que de 84.83g/L. Este modelo pode ser aplicado na indstria para predizer a
quantidade mxima de etanol produzida, quando se conhece o nvel da contaminao por
lactobacilo e a temperatura de fermentao, dentro da faixa estudada. A superfcie de
resposta (figura 28) demonstra o efeito quadrtico da temperatura e do nvel de inculo de
lactobacilo na faixa estudada, sobre a concentrao mxima de etanol.

116

Figura 29. Efeito da temperatura e concentrao de L. fermentum sobre a concentrao
mxima de etanol em funo da temperatura e nvel e inculo

5.5.2 Efeito da temperatura e nvel de inculo de L. fermentum , e Rg

Considerando as culturas mistas da levedura e do lactobacilo o modelo de raiz
quadrada (Ratwosky) no foi capaz de ajustar com preciso os dados experimentais para o
tempo de adaptao (). Onde o coeficiente de correlao dos dados, para o modelo do
lactobacilo R
2
foi 0,22 (vide tabela 17), e apesar do fator de exatido apresentar 31% dos
dados discordantes do modelo e o fator de exatido aproximadamente 96% dos dados esto
preditos na regio segura do modelo, este modelo no prediz de forma coerente a relao
entre a temperatura e o tempo de adaptao. O mesmo fato ocorre com o modelo da raiz
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

m
x
i
m
a

d
e

e
t
a
n
o
l

(
g
/
L
)

C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

L
a
c
t
o
b
a
c
i
l
l
u
s

f
e
r
m
e
n
t
u
m

(
F
C
/
m
L
)

117
quadrada (Ratwosky) para a levedura, que apresenta um R
2
de 0,43, demonstrando baixa
concordncia do modelo com os dados experimentais. Estes dados demonstram que do
lactobacilo e da levedura tem baixa dependncia do fator temperatura. O mesmo ocorre com
o modelo de Davey (1989) testado para o tempo de adaptao apresenta baixo coeficiente
de correlao, com menos de 50% dos dados em concordncia com o modelo, o fator de
bias com um valor de 0,934 e o fator de exatido com um valor de 1,34, demonstrando da
mesma forma do modelo da raiz quadrada, a baixa dependncia da temperatura na faixa
estudada.
Tabela 17. Comparao dos ndices de validao dos modelos secundrios para a
S.cerevisiae e L. fermentum para os parmetros , e Rg
Modelo
Arrhenius modificado Raiz Quadrada Polinomial de 2 ordem
Levedura mista R Bias Exatido R Bias Exatido R Bias Exatido
0,450 0,988 1,129 0,430 0,992 1,10 0,636 1,009 1,131
0,301 0,890 1,330 0,352 0,960 1,220 - - -
R
e
s
p
o
s
t
a
s

Rg - - - - - - - - -

Arrhenius modificado Raiz Quadrada Polinomial de 2 ordem
Lactobacilo misto R Bias Exatido R Bias Exatido R Bias Exatido
0,243 0,964 1,230 0,244 0,980 1,15 0,585 1,022 1,195
0,480 0,934 1,340 0,220 0,956 1,310 - - -
R
e
s
p
o
s
t
a
s

Rg - - - - - - 0,975 1,000 1,020
Onde (-) no houve significncia das variveis
Como estes modelos avaliam somente a influncia da temperatura, e os dados
avaliados so provenientes de uma cultura mista de microrganismos com vrias
concentraes de lactobacilo (10
1
a 10
8
UFC/mL) e uma concentrao de levedura fixa
(10
6
UFC/mL), onde h uma interao complexa entre estes dois microrganismos (lactobacilo
e levedura) que no descrita pelos modelos da raiz quadrada e Davey, portanto estes
modelos no se ajustaram aos dados experimentais.

118
Como os modelos da raiz quadrada e de Davey no ajustam dados para a populao
mxima, foi gerado um modelo polinomial de segunda ordem, utilizando valores codificados
para as variveis (temperatura e nvel de inculo), tendo como fatores significativos (Tabela
18), a p<0,10, nvel de inculo (linear e quadrtico) e a interao entre a temperatura e o
nvel de inculo. Este modelo apresentou um alto coeficiente de correlao dos dados,
demonstrando que 97,5% dos dados esto de acordo com o modelo proposto, e os
parmetros de performance do modelo (bias e exatido) demonstram excelente
concordncia. Pelo clculo do fator de bias 100% dos dados esto na regio segura da
predio do modelo, e somente 2% dos dados, de acordo com o fator exatido, esto em
discordncia com o modelo predito.
Tabela 18. Efeitos da temperatura e nvel de inculo para a populao mxima do lactobacilo
em cultura mista

Ao avaliar o efeito das variveis, a que apresenta maior significncia L inculo linear
do lactobacilo com um p valor de 0.000045 (vide tabela 18 e figura 30), demonstrando assim
que a populao mxima influenciada pelo inculo inicial de lactobacilo. A equao do
modelo est apresentada abaixo (equao 25). Esta equao permite calcular a populao
mxima atingida em um processo de fermentao alcolica, a partir da populao inicial de
lactobacilo, dentro da faixa estudada.
L T L L Rg Log * * 43887 , 0 * 58622 , 0 * 80619 , 1 68645 , 11 ) (
2
+ =

Equao 25
A superfcie de resposta (figura 30) demonstra o efeito quadrtico do nvel de inculo de
lactobacilo e o efeito quase linear da temperatura na faixa analisada.
119
Figura 30. Efeito da temperatura de fermentao e nvel de inculo de L. fermentum sobre o
logartmo da populao mxima do lactobacilo em cultura mista

Para os modelos secundrios testados para a levedura em cultura mista (vide tabela
17), os modelos de Davey e Ratwosky no apresentaram bom coeficiente de correlao dos
dados (R
2
< 0,90), demonstrando desta forma a baixa dependncia da taxa de crescimento e
do tempo de adaptao do fator temperatura. Para a taxa de crescimento da levedura foi
testado um modelo polinomial quadrtico em funo de temperatura e nvel de inculo de
lactobacilo, porm o R
2
foi de 0,636, demonstrando da mesma forma a baixa dependncia da
temperatura e do nvel de inculo de lactobacilo, apesar dos indce de performance do
modelo bias e exatido apresentarem valores bons, 1,009 e 1,131, respectivamente.

L
o
g

d
a

p
o
p
u
l
a
o

m
x
i
m
a

120
5.5.3 Anlises da produo de metablitos (etanol, glicerol, cido lctico e
cido actico) e acares (glicose)

Os dados de crescimento, juntamente com a produo de metablitos e
consumo de acares esto apresentados na figura 31, para o experimento 07
(28S6L1).
0,00
40,00
80,00
120,00
160,00
200,00
-2,000
0,000
2,000
4,000
6,000
8,000
0 20 40 60 80 100 120
G
l
i
c
o
s
e
/

E
t
a
n
o
l
/

G
l
i
c
e
r
o
l

(
g
/
L
)
L
e
v
e
d
u
r
a

e

L
a
c
t
o
b
a
c
i
l
o

(
L
o
g

N
/
N
0
)
c
i
d
o

l
c
t
i
c
o

e

a
c
t
i
c
o

(
g
/
L
)
Tempo (horas)
Levedura (log n/N0) Lactobacilo (Log N/N0) cido actico
Etanol cido Lctico Glicose
Glicerol

Figura 31. Curva de evoluo da produo de etanol, cido lctico, cido actico e
glicerol; consumo de glicose; curva de crescimento do lactobacilo e levedura em
cultura mista para o experimento 07 (28S6L1).

Pela anlise da figura 31, pode-se verificar que o valor mnimo de glicose
(8,77 g/L) coincide com o inicio da fase estacionria da levedura em 30 horas de
processo de fermentao, e a produo de etanol atinge o seu mximo em 48
horas, o glicerol acompanha a produo de etanol atingindo seu mximo tambm
em 48 horas com 21g/L. Os cidos lctico e actico tm o auge de sua produo
121
no final da fermentao em 84 horas, onde a levedura atingiu sua menor
populao, demonstrando assim que os cidos orgnicos produzido pelo
lactobacilo inibem o crescimento da levedura.

122
6. CONCLUSES
O ndice de viabilidade da levedura em cultura pura foi afetado
por mudanas na temperatura. Porm para a cultura mista, num
tempo fixo de fermentao (21h) o nvel de inculo de lactobacilo
foi altamente significante. O melhor ndice de viabilidade foi
observado para L=10
3
Ufc/mL e T=25
o
C;
Altas temperaturas reduzem o rendimento celular do lactobacilo
em cultura pura, a 31C;
No houve diferena significativa, ao nvel de 10% de
significncia, para o tempo de lag, taxa de crescimento e
populao mxima da levedura em cultura pura e mista;
Para o lactobacilo, no houve diferena significativa, ao nvel de
10% de significncia, para a taxa de crescimento e tempo de lag.
No entanto, para a populao mxima houve diferena
significativa quando o microrganismo foi cultivado em cultura pura
e mista;
A populao mxima do lactobacilo em cultura mista afetada
pela quantidade inicial de inculo do mesmo;
A quantidade de cido lctico produzido no meio de cultivo
influencia a atividade celular da levedura;
A glicose um fator limitante para o crescimento do lactobacilo;
Quando a levedura atinge a fase estacionria, o lactobacilo teve
sua taxa de crescimento incrementada;
O modelo quase-qumico no caracteriza bem a fase de
adaptao dos microrganismos (L. fermentum e S. cerevisiae)
devido ao ajuste linear realizado pelo modelo. Este modelo no
se ajustou muito bem aos dados experimentais, pois os
microrganismos (lactobacilo e levedura) no entram em processo
de morte instataneamente aps a fase exponencial, nos casos
em que ocorrem esta situao (morte instantnea) o ajuste do
modelo muito bom;
123
O modelo desenvolvido para a populao mxima do lactobacilo
pode ser aplicado, dentro da faixa estudada, na indstria de
processamento de cana-de-acar pois, conhecendo a
concentrao inicial do lactobacilo, pode-se predizer a populao
mxima atingida num processo fermentativo;
Considerando os processos de fermentao industrial a melhor
condio para a produo mxima de etanol com a levedura em
cultura mista e foi com concentrao inicial de lactobacilo em
10
5
UFC/mL e a temperatura de fermentao 28C.
O modelo encontrado para descrever a produo mxima de
etanol demonstra a interao significativa entre a temperatura de
fermentao e o nvel de inculo de lactobacilo no processo
fermentativo. No entanto, o efeito mais importante o da
temperatura quadrtica. Sendo assim, este modelo pode ser
aplicado na prtica, dentro da faixa estudada, pois conhecendo a
temperatura de fermentao e o nvel de inculo do lactobacilo
pode-se estimar a quantidade mxima de etanol a ser produzida
durante o processo fermentativo realizado dentro das condies
estudadas.

124
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141
ANEXO A
Nas figuras abaixo esto apresentadas as curvas de crescimento. Os dados
experimentais esto apresentados no Anexo C nas matrizes do modelo quase-
qumico.
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)
Lactobacilo cultura pura Lactobacilo cultura mista

Figura 32. Curva de crescimento para o experimento 01 (25S6L3), para as
culturas mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum.

142
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
1,00E+11
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)

Figura 33.Curva de crescimento para o experimento 02 (31S6L3) para as culturas
mistas e puras de S. cerevisiae e L.fermentum
1,000E+02
1,000E+03
1,000E+04
1,000E+05
1,000E+06
1,000E+07
1,000E+08
1,000E+09
1,000E+10
1,000E+11
1,000E+12
1,000E+13
1,000E+14
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)
Lactobacilo cultura pura Lactobacillo cultura mista
Levedura cultura mista Levedura cultura pura


143
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
1,00E+11
1,00E+12
1,00E+13
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)

e puras de S. cerevisiae e L.fermentum
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
1,00E+10
1,00E+11
1,00E+12
1,00E+13
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)


144
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
1,00E+09
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)

1,000E+04
1,000E+05
1,000E+06
1,000E+07
1,000E+08
1,000E+09
1,000E+10
1,000E+11
1,000E+12
1,000E+13
1,000E+14
1,000E+15
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)

145
1,000E+03
1,000E+04
1,000E+05
1,000E+06
1,000E+07
1,000E+08
1,000E+09
1,000E+10
1,000E+11
1,000E+12
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)
Lactobacilo cultura pura lactobacilo cultura mista


1,000E+03
1,000E+04
1,000E+05
1,000E+06
1,000E+07
1,000E+08
1,000E+09
1,000E+10
1,000E+11
1,000E+12
1,000E+13
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
L
a
c
t
o
b
a
c
i
l
o

(
U
F
C
/
m
L
)


146
1,000E+04
1,000E+05
1,000E+06
1,000E+07
1,000E+08
1,000E+09
1,000E+10
1,000E+11
1,000E+12
1,000E+13
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (horas)
C
o
n
t
a
g
e
m

(
U
F
C
/
m
L
)

Figura 41.Curva de crescimento experimento 11 (28S6L5), para as culturas

147
ANEXO B
Preparo das solues de antibitico
1. Tetraciclina
Dissolver 500mg de cloridrato de tetraciclina em 200mL de etanol (Manual Merck,
1996). Estocar a soluo em frasco escuro estril, sob refrigerao. Adicionar ao
meio de cultura 40mL/L aps a esterilizao do meio de cultura.
A soluo no deve ser mantida em estoque por mais de uma semana.

2. Cloranfenicol
Dissolver 0.1g de cloranfenicol em 100 ml de gua destilda, adicionar 40mL/L
desta soluo antes de autoclavar o meio de cultura (Tournas et al, 1998). A
soluo deve ser estocada em frasco escuro e sob refrigerao, por no mximo 1
semana.

3. Natamicina
Dissolver 1g em 200mL de cido actico 1N (Thomas & Delves- Broughton, 2001),
esterilizar a soluo por filtrao com membrana de 0.22m (Millipore, Miliford,
USA). Acondicionar em frasco escuro estril, estocar sob refrigerao, por no
mximo 1 semana.

4. Preparo do corante Azul de Metileno para colorao de clulas viveis (Lee et
al, 1981)

Azul de Metileno 0.025g
NaCl 0.9g
KCl 0.042g
CaCl
2
.6H
2
O 0.048g
NaHCO
3
0.02g
Glicose 1g
gua 100 mL
Estocar o corante em frasco escuro.

148
5. Formulao do Agar Extrato de Malte (Pitt & Hocking, 1985)
Extrato de Malte 20g
Glicose 20g
Peptona 1g
Agar 20g
gua destilada 1L
Autoclavar 121C por 15 minutos.pH final 6.7

149
ANEXO C
Programa para a resoluo do modelo quase-qumico
(%) comentrios feitos no programa
(xd) contagem do nmero de clulas
(x0) - contagem celular no tempo 0
(td) intervalo de tempo de dados
(Lx) logaritimo da concentrao celular experimental
(Ld) logartimo da concentrao celular do microrganismo predito pelo modelo
(h) erro estocstico do modelo
(mesh) tempo em que o modelo calcular o valor de Ld
(L0) concentrao celular inicial predita pelo modelo
(MuL) taxa de crescimento do microrganismo ()
(LB) limite inferior
(UB) limite superior

150

151

152
Curvas de crescimento/declnio geradas pelo modelo quase-qumico

Figura 42. Modelo quase-qumico para o L.fermentum cultura pura experimento 01
(25S0L3)
Tempo (horas) Lx Ld (Lx-Ld)
0 3.2175 3.2175 0
3.0000 3.2214 3.5522 -0.3308
6.0000 3.2822 3.8894 -0.6073
9.0000 3.8062 4.2267 -0.4205
12.0000 4.1959 4.5639 -0.3680
15.0000 4.4502 4.9011 -0.4509
18.0000 5.5011 5.2384 -0.2627
21.0000 5.5911 5.5756 -0.0155
24.0000 6.9217 5.9128 1.0089
30.0000 7.2380 6.5871 0.6509
36.0000 7.5502 7.2609 0.2893
42.0000 8.5378 7.9317 0.6061
48.0000 8.7160 8.5891 0.1268
54.0000 8.8513 9.1879 -0.3368
60.0000 9.2304 9.5824 -0.3523
68.0000 8.6385 9.4749 -0.8371
76.0000 8.2368 8.8551 -0.6191
84.0000 8.3365 8.0961 -0.2395
92.0000 7.5798 7.3116 0.2673
100.0000 7.4571 6.5230 0.9333
SSE = 2.3007
k = 44.5282 1.5043 0.0055 1.2455
= 0.1124
Lambda = 0.0225
Rg = 6.4154

153

experimento 02 (31S0L3)
0 3.1399 3.1399 0
3.0000 3.1206 3.4675 -0.3469
6.0000 4.3522 3.8027 0.5494
9.0000 4.5315 4.1380 0.3935
12.0000 5.1761 4.4732 0.7029
15.0000 6.1351 4.8084 1.3267
18.0000 6.4779 5.1436 1.3342
21.0000 6.3129 5.4789 0.8340
24.0000 6.4201 5.8141 0.6059
30.0000 6.4802 6.4845 -0.0044
36.0000 7.2175 7.1548 0.0626
42.0000 8.3936 7.8241 0.5694
48.0000 8.5539 8.4890 0.0647
54.0000 8.5769 9.1339 -0.5573
60.0000 8.3222 9.6954 -1.3739
68.0000 9.5263 10.0046 -0.4803
76.0000 9.4807 9.6144 -0.1367
84.0000 9.4579 8.9105 0.5441
92.0000 8.5539 8.1389 0.4116
100.0000 7.0414 7.3554 -0.3174
SSE = 3.0033
k = 14.5763 1.5067 0.0023 1.2494
= 0.1117
Lambda = 0.0683
Rg = 6.8699

154

0 7.6075 7.6075 0
3.0000 6.4232 7.8680 1.4448
6.0000 6.8976 8.1356 1.2380
9.0000 8.5605 8.4033 0.1572
12.0000 9.5982 8.6710 0.9273
15.0000 9.3892 8.9386 0.4505
18.0000 9.5250 9.2063 0.3188
21.0000 9.6335 9.4739 0.1596
24.0000 9.5119 9.7415 0.2297
30.0000 11.5533 10.2767 1.2766
36.0000 11.6180 10.8114 0.8067
42.0000 11.7520 11.3445 0.4076
48.0000 11.3608 11.8723 0.5115
54.0000 12.3522 12.3822 0.0300
60.0000 12.6675 12.8363 0.1689
68.0000 12.3979 13.1930 0.7950
76.0000 12.4579 13.0660 0.6081
84.0000 12.4031 12.5847 0.1816
92.0000 12.2799 11.9772 0.3027
100.0000 12.0512 11.3373 0.7139

SSE = 3.0432
k = 12.4826 1.5961 0.0000 1.3906
= 0.0892
Lambda = 0.0798
Rg = 5.6009

155

0 7.3522 7.3522 0
3.0000 7.3324 7.5922 -0.2598
6.0000 8.0737 7.8388 0.2349
9.0000 8.5011 8.0854 0.4157
12.0000 8.1367 8.3319 -0.1952
15.0000 8.2430 8.5783 -0.3353
18.0000 8.2900 8.8246 -0.5346
21.0000 8.6990 9.0706 -0.3716
24.0000 8.9031 9.3161 -0.4130
30.0000 8.8129 9.8037 -0.9908
36.0000 9.0414 10.2798 -1.2384
42.0000 11.0210 10.7218 0.2992
48.0000 12.0368 11.0745 0.9623
54.0000 12.0418 11.2441 0.7977
60.0000 11.7789 11.1678 0.6111
68.0000 10.5315 10.7743 -0.2428
76.0000 10.0607 10.2322 -0.1715
84.0000 9.4900 9.6459 -0.1559
92.0000 8.8228 9.0478 -0.2250
100.0000 8.2041 8.4469 -0.2428

SSE = 2.4090
k = 12.3929 1.5520 0.0001 1.3627
= 0.0822
Lambda = 0.0801
Rg = 3.8962

156


0 5.3729 5.3729 0
3.0000 5.7597 5.7791 -0.0194
6.0000 6.1973 6.1957 0.0016
9.0000 6.0969 6.6124 -0.5155
12.0000 6.8293 7.0290 -0.1997
15.0000 7.2978 7.4456 -0.1479
18.0000 6.7520 7.8622 -1.1102
21.0000 8.3617 8.2789 0.0829
24.0000 9.4526 8.6955 0.7571
30.0000 9.8261 9.5282 0.2979
36.0000 10.3811 10.3577 0.0234
42.0000 11.5058 11.1659 0.3397
48.0000 12.1903 11.8479 0.3411
54.0000 11.9320 12.0777 -0.1497
60.0000 11.4338 11.7162 -0.2882
68.0000 10.4928 10.8586 -0.3727
76.0000 9.4314 9.9200 -0.4961
84.0000 9.0273 8.9723 0.0474
92.0000 8.2565 8.0236 0.2250
100.0000 7.9004 7.0748 0.8177

SSE = 1.9166
k = 13.1701 1.5718 0.0000 1.2521
= 0.1389
Lambda = 0.0752
Rg = 6.7161
157


0 5.3570 5.3570 0
3.0000 5.1523 5.7229 -0.5706
6.0000 5.2304 6.0952 -0.8648
9.0000 6.2516 6.4675 -0.2159
12.0000 7.2718 6.8398 0.4320
15.0000 8.3874 7.2122 1.1752
18.0000 8.7033 7.5845 1.1188
21.0000 8.8513 7.9568 0.8945
24.0000 8.5502 8.3291 0.2211
30.0000 9.6527 9.0737 0.5790
36.0000 10.2636 9.8179 0.4457
42.0000 10.5453 10.5598 -0.0145
48.0000 11.2480 11.2893 -0.0414
54.0000 11.4241 11.9552 -0.5315
60.0000 11.4749 12.3705 -0.8971
68.0000 11.5384 12.1622 -0.6269
76.0000 11.0374 11.4333 -0.3994
84.0000 11.0065 10.5916 0.4112
92.0000 10.3892 9.7330 0.6521
100.0000 9.1367 8.8723 0.2601
SSE = 2.7615
k = 19.2275 1.5325 0.0000 1.2467
= 0.1241
Lambda = 0.0518
Rg = 7.0469

158

0 1.0792 1.0792 0
3.0000 0.7782 1.4625 -0.6844
6.0000 1.4624 1.8519 -0.3895
9.0000 2.0414 2.2413 -0.2000
12.0000 2.8261 2.6307 0.1953
15.0000 3.1931 3.0202 0.1730
18.0000 3.9614 3.4096 0.5518
21.0000 4.6675 3.7990 0.8685
24.0000 4.9345 4.1884 0.7461
30.0000 6.0414 4.9673 1.0741
36.0000 6.5051 5.7461 0.7590
42.0000 6.5911 6.5248 0.0663
48.0000 7.6580 7.3028 0.3552
54.0000 8.2695 8.0763 0.1933
60.0000 8.3032 8.8237 -0.5205
68.0000 8.2742 9.5660 -1.2918
76.0000 8.2683 9.4536 -1.1853
84.0000 8.3589 8.7171 -0.3582
92.0000 8.3170 7.8441 0.4729
100.0000 8.2480 6.9520 1.2960
SSE = 3.1012
k = 21.3874 1.5462 0.0071 1.2473
= 0.1298
Lambda = 0.0466
Rg = 8.5617

159


0 8.1508 8.1508 0
3.0000 7.3118 8.1614 -0.8496
6.0000 7.5740 8.2089 -0.6349
9.0000 7.8261 8.3249 -0.4988
12.0000 7.6484 8.5342 -0.8858
15.0000 8.0334 8.8295 -0.7961
18.0000 8.7202 9.1797 -0.4596
21.0000 9.6484 9.5570 0.0913
24.0000 10.4472 9.9460 0.5012
30.0000 11.0550 10.7350 0.3200
36.0000 11.5441 11.5275 0.0166
42.0000 12.7634 12.3197 0.4437
48.0000 13.6284 13.1077 0.5206
54.0000 14.2175 13.8693 0.3479
60.0000 13.9912 14.4930 -0.5026
68.0000 13.7672 14.6166 -0.8524
76.0000 13.4571 13.9755 -0.5220
84.0000 13.4487 13.1290 0.3156
92.0000 12.3811 12.2518 0.1251
100.0000 12.1658 11.3706 0.7907
SSE = 2.4386
k = 0.0132 1.3257 0.0000 1.0214
= 0.1321
Lambda = 10.4422
Rg = 6.5435

160


0 5.3729 5.3729 0
3.0000 5.1303 5.7515 -0.6211
6.0000 5.5682 6.1400 -0.5718
9.0000 5.9868 6.5286 -0.5418
12.0000 6.6232 6.9171 -0.2939
15.0000 7.1931 7.3056 -0.1125
18.0000 8.3617 7.6941 0.6676
21.0000 9.1106 8.0827 1.0279
24.0000 9.5441 8.4712 1.0729
30.0000 9.7520 9.2480 0.5040
36.0000 10.0374 10.0237 0.0138
42.0000 10.2672 10.7921 -0.5250
48.0000 11.3054 11.5196 -0.2142
54.0000 11.6335 12.0548 -0.4213
60.0000 11.4807 12.0980 -0.6173
68.0000 11.7435 11.4795 0.2640
76.0000 11.1973 10.6269 0.5704
84.0000 9.9031 9.7388 0.1643
92.0000 8.4409 8.8463 -0.4054
100.0000 7.9614 7.9531 0.0083
SSE = 2.3408
k = 12.8992 1.5453 0.0000 1.2471
= 0.1295
Lambda = 0.0768
Rg = 6.7786

161

experimento 10 (28S0L5).
0 5.3222 5.3222 0
3.0000 5.2672 5.7263 -0.4592
6.0000 5.4698 6.1414 -0.6715
9.0000 5.8603 6.5564 -0.6961
12.0000 6.7889 6.9714 -0.1826
15.0000 7.6021 7.3865 0.2156
18.0000 8.2822 7.8016 0.4806
21.0000 9.3243 8.2166 1.1076
24.0000 9.6679 8.6317 1.0362
30.0000 9.9777 9.4616 0.5161
36.0000 10.4949 10.2900 0.2049
42.0000 10.7709 11.1083 -0.3374
48.0000 11.0881 11.8627 -0.7746
54.0000 11.6248 12.3205 -0.6957
60.0000 11.9845 12.1721 -0.1876
68.0000 11.4241 11.3969 0.0271
76.0000 11.3936 10.4729 0.9207
84.0000 9.8893 9.5300 0.3593
92.0000 8.3434 8.5852 -0.2418
100.0000 7.1139 7.6403 -0.5263

SSE = 2.5714
k = 12.5047 1.5656 0.0000 1.2470
= 0.1383
Lambda = 0.0792
Rg = 7.0199

162


0 5.1508 5.1508 0
3.0000 5.1139 5.5453 -0.4313
6.0000 5.3233 5.9507 -0.6274
9.0000 5.7324 6.3561 -0.6237
12.0000 6.3979 6.7615 -0.3636
15.0000 7.6946 7.1670 0.5276
18.0000 8.4232 7.5724 0.8508
21.0000 9.4472 7.9779 1.4693
24.0000 9.0864 8.3833 0.7030
30.0000 9.6180 9.1940 0.4240
36.0000 10.2553 10.0032 0.2520
42.0000 10.6902 10.8031 -0.1129
48.0000 11.0550 11.5462 -0.4912
54.0000 11.1492 12.0262 -0.8770
60.0000 11.0253 11.9337 -0.9084
68.0000 11.0212 11.2047 -0.1835
76.0000 11.9165 10.3051 1.6113
84.0000 9.4771 9.3827 0.0945
92.0000 8.1156 8.4577 -0.3421
100.0000 7.4548 7.5324 -0.0775

SSE= 3.1000
k = 12.2141 1.5473 0.0000 1.2361
= 0.1351
Lambda = 0.0811
Rg = 6.9129
163


0 6.3617 6.3617 0
3.0000 6.4843 6.5617 -0.0774
6.0000 6.6484 6.7639 -0.1156
9.0000 7.0253 6.9659 0.0594
12.0000 7.7118 7.1676 0.5442
15.0000 8.0107 7.3687 0.6420
18.0000 8.1538 7.5690 0.5848
21.0000 8.1717 7.7679 0.4038
24.0000 8.2945 7.9648 0.3297
30.0000 8.5855 8.3467 0.2388
36.0000 8.8633 8.6958 0.1675
42.0000 8.9542 8.9746 -0.0204
48.0000 8.4232 9.1278 -0.7045
54.0000 8.7745 9.1136 -0.3391
60.0000 8.8482 8.9446 -0.0964
68.0000 8.1123 8.5672 -0.4549
76.0000 8.0899 8.1105 -0.0206
84.0000 7.9566 7.6256 0.3310
92.0000 7.8293 7.1314 0.6979
100.0000 6.6180 6.6340 -0.0160

SSE = 1.6898
k = 29.0034 1.4078 0.0064 1.2524
= 0.0674
Lambda = 0.0344
Rg = 2.7811

164

0 6.2292 6.2292 0
3.0000 6.1959 6.4789 -0.2830
6.0000 6.5911 6.7310 -0.1399
9.0000 7.1461 6.9824 0.1637
12.0000 7.6721 7.2325 0.4396
15.0000 8.4843 7.4804 1.0039
18.0000 8.6532 7.7243 0.9289
21.0000 8.7243 7.9612 0.7631
24.0000 8.3274 8.1862 0.1412
30.0000 8.7202 8.5658 0.1543
36.0000 8.6990 8.7670 -0.0680
42.0000 8.1599 8.7148 -0.5549
48.0000 8.2625 8.4504 -0.1879
54.0000 7.9217 8.0711 -0.1494
60.0000 7.0000 7.6434 -0.6434
68.0000 7.2109 7.0472 0.1636
76.0000 5.9956 6.4420 -0.4464
84.0000 5.6817 5.8349 -0.1532
92.0000 5.7754 5.2272 0.5481
100.0000 5.7559 4.6194 1.1364
SSE = 2.3328
k = 29.8631 1.3762 0.0240 1.1823
= 0.0842
Lambda = 0.0333
Rg = 2.5492

165

Figura 55. Modelo quase-qumico para a S. cerevisiae em cultura puraexperimento
03 (25S6L0)
0 6.4065 6.4065 0
3.0000 6.3118 6.5818 -0.2700
6.0000 6.6990 6.7587 -0.0597
9.0000 6.4843 6.9353 -0.4510
12.0000 7.5966 7.1116 0.4850
15.0000 7.5740 7.2874 0.2866
18.0000 7.9217 7.4624 0.4592
21.0000 8.1987 7.6364 0.5623
24.0000 8.6721 7.8086 0.8635
30.0000 9.0550 8.1446 0.9104
36.0000 8.4843 8.4587 0.0256
42.0000 8.9731 8.7287 0.2444
48.0000 8.2967 8.9199 -0.6232
54.0000 8.2856 8.9945 -0.7090
60.0000 8.4074 8.9368 -0.5294
68.0000 8.4472 8.6913 -0.2442
76.0000 8.2343 8.3323 -0.0980
84.0000 8.4393 7.9227 0.5166
92.0000 7.5949 7.4933 0.1017
100.0000 7.5694 7.0563 0.5130

SSE = 2.1307
k = 34.0544 1.4081 0.0069 1.2722
= 0.0590
Lambda = 0.0293
Rg = 2.5881

166

0 6.3139 6.3139 0
3.0000 5.8949 6.5704 -0.6755
6.0000 6.9542 6.8312 0.1231
9.0000 6.8751 7.0909 -0.2158
12.0000 7.4158 7.3487 0.0671
15.0000 8.0969 7.6028 0.4941
18.0000 8.1987 7.8506 0.3480
21.0000 8.3181 8.0872 0.2309
24.0000 8.4771 8.3046 0.1725
30.0000 8.4472 8.6320 -0.1848
36.0000 8.2529 8.7210 -0.4681
42.0000 8.6902 8.5441 0.1461
48.0000 8.0569 8.1940 -0.1371
54.0000 7.9614 7.7660 0.1954
60.0000 7.6767 7.3086 0.3681
68.0000 6.8543 6.6838 0.1705
76.0000 5.2254 6.0544 -0.8289
84.0000 5.0869 5.4239 -0.3371
92.0000 5.0471 4.7933 0.2538
100.0000 4.6325 4.1625 0.4700
SSE = 1.5979
k = 17.6457 1.4460 0.0276 1.2452
= 0.0872
Lambda = 0.0563
Rg = 2.4119

167

0 6.1206 6.1206 0
3.0000 6.1177 6.3030 -0.1853
6.0000 6.2249 6.4886 -0.2638
9.0000 6.7924 6.6742 0.1182
12.0000 7.1271 6.8595 0.2676
15.0000 7.5441 7.0446 0.4995
18.0000 7.6721 7.2292 0.4429
21.0000 8.0952 7.4131 0.6821
24.0000 8.0899 7.5960 0.4939
30.0000 8.5315 7.9563 0.5751
36.0000 8.2095 8.3019 -0.0923
42.0000 8.2753 8.6151 -0.3398
48.0000 8.9614 8.8643 0.0971
54.0000 8.5911 9.0054 -0.4144
60.0000 8.6628 9.0050 -0.3423
68.0000 8.4065 8.7993 -0.3928
76.0000 8.1523 8.4453 -0.2930
84.0000 8.1446 8.0244 0.1202
92.0000 8.2978 7.5779 0.7199
100.0000 7.2765 7.1220 0.1545

SSE = 1.7012
k = 18.7728 1.4092 0.0071 1.2666
= 0.0619
Lambda = 0.0530
Rg = 2.9030

168


0 6.2799 6.2799 0
3.0000 6.2028 6.4963 -0.2935
6.0000 6.3892 6.7160 -0.3269
9.0000 6.8357 6.9354 -0.0998
12.0000 7.5185 7.1543 0.3642
15.0000 7.8808 7.3724 0.5084
18.0000 7.8893 7.5890 0.3003
21.0000 8.5966 7.8033 0.7933
24.0000 8.5315 8.0138 0.5177
30.0000 8.9217 8.4127 0.5090
36.0000 8.6580 8.7490 -0.0910
42.0000 8.8261 8.9584 -0.1324
48.0000 8.5315 8.9787 -0.4472
54.0000 7.9542 8.8120 -0.8577
60.0000 8.3711 8.5202 -0.1491
68.0000 7.7818 8.0382 -0.2565
76.0000 7.6075 7.5168 0.0907
84.0000 7.9638 6.9832 0.9806
92.0000 6.6075 6.4461 0.1615
100.0000 6.0253 5.9080 0.1173
SSE = 1.9748
k = 20.7972 1.4194 0.0106 1.2506
= 0.0733
Lambda = 0.0479
Rg = 2.7151
169


0 6.0774 6.0774 0
3.0000 6.0086 6.3060 -0.2974
6.0000 6.0934 6.5373 -0.4438
9.0000 6.6675 6.7682 -0.1008
12.0000 7.1658 6.9986 0.1672
15.0000 7.7745 7.2280 0.5465
18.0000 8.2240 7.4558 0.7682
21.0000 8.2788 7.6809 0.5979
24.0000 8.3222 7.9014 0.4209
30.0000 8.2672 8.3149 -0.0478
36.0000 8.4314 8.6496 -0.2182
42.0000 8.1761 8.8269 -0.6508
48.0000 8.2430 8.7881 -0.5451
54.0000 8.3892 8.5614 -0.1723
60.0000 8.1875 8.2238 -0.0363
68.0000 8.0846 7.6996 0.3850
76.0000 7.5378 7.1464 0.3914
84.0000 7.3118 6.5853 0.7265
92.0000 6.0065 6.0219 -0.0154
100.0000 4.8357 5.4579 -0.6222
SSE = 1.9404
k = 26.9208 1.4254 0.0168 1.2477
= 0.0772
Lambda = 0.0370
Rg = 2.7611

170


0 6.0434 6.0434 0
3.0000 5.9420 6.2679 -0.3259
6.0000 6.1746 6.4941 -0.3195
9.0000 6.8096 6.7200 0.0896
12.0000 7.0626 6.9453 0.1173
15.0000 7.4150 7.1697 0.2453
18.0000 7.7443 7.3925 0.3518
21.0000 8.3324 7.6127 0.7197
24.0000 8.1206 7.8285 0.2921
30.0000 8.3979 8.2345 0.1634
36.0000 8.1367 8.5675 -0.4308
42.0000 8.1367 8.7548 -0.6181
48.0000 8.5563 8.7365 -0.1802
54.0000 8.0149 8.5311 -0.5162
60.0000 8.4065 8.2106 0.1960
68.0000 8.0022 7.7031 0.2990
76.0000 7.9469 7.1633 0.7836
84.0000 7.0107 6.6139 0.3969
92.0000 6.0128 6.0619 -0.0491
100.0000 4.7672 5.5092 -0.7421
SSE = 1.8338
k = 39.9377 1.4197 0.0188 1.2459
= 0.0755
Lambda = 0.0250
Rg = 2.7296

171


0 6.0334 6.0334 0
3.0000 6.0607 6.2556 -0.1949
6.0000 6.1038 6.4798 -0.3760
9.0000 6.6021 6.7036 -0.1016
12.0000 7.0212 6.9268 0.0944
15.0000 7.6628 7.1490 0.5138
18.0000 7.9294 7.3694 0.5601
21.0000 8.0000 7.5869 0.4131
24.0000 8.4257 7.7997 0.6260
30.0000 8.1875 8.1977 -0.0102
36.0000 8.2041 8.5186 -0.3144
42.0000 8.2480 8.6898 -0.4418
48.0000 8.2368 8.6571 -0.4203
54.0000 8.0969 8.4443 -0.3474
60.0000 8.1599 8.1221 0.0377
68.0000 8.1206 7.6167 0.5039
76.0000 7.2095 7.0806 0.1289
84.0000 7.0253 6.5356 0.4897
92.0000 6.0881 5.9880 0.1001
100.0000 4.9934 5.4397 -0.4463
SSE = 1.6283
k = 33.7917 1.4200 0.0217 1.2477
= 0.0748
Lambda = 0.0295
Rg = 2.6686

172


0 6.2430 6.2430 0
3.0000 6.1319 6.4773 -0.3453
6.0000 6.2999 6.7157 -0.4157
9.0000 6.6064 6.9538 -0.3474
12.0000 7.5563 7.1914 0.3649
15.0000 7.9614 7.4282 0.5332
18.0000 7.9731 7.6636 0.3096
21.0000 8.6902 7.8964 0.7938
24.0000 8.4914 8.1250 0.3664
30.0000 8.6180 8.5560 0.0621
36.0000 8.8603 8.9086 -0.0483
42.0000 8.9269 9.0995 -0.1726
48.0000 8.6335 9.0624 -0.4289
54.0000 8.0212 8.8266 -0.8055
60.0000 8.0986 8.4762 -0.3776
68.0000 8.1818 7.9348 0.2470
76.0000 7.8692 7.3652 0.5041
84.0000 7.7672 6.7878 0.9793
92.0000 6.8921 6.2086 0.6835
100.0000 4.6180 5.6289 -1.0108
SSE = 2.3377
k = 18.3705 1.4321 0.0095 1.2489
= 0.0795
Lambda = 0.0541
Rg = 2.8700

173


0 6.1861 6.1861 0
3.0000 6.1319 6.3948 -0.2628
6.0000 6.0663 6.6078 -0.5415
9.0000 6.6180 6.8205 -0.2025
12.0000 7.4232 7.0327 0.3905
15.0000 7.5911 7.2440 0.3471
18.0000 7.7160 7.4538 0.2622
21.0000 8.1673 7.6613 0.5060
24.0000 8.5798 7.8651 0.7147
30.0000 8.1303 8.2512 -0.1209
36.0000 8.8603 8.5784 0.2820
42.0000 8.0864 8.7879 -0.7015
48.0000 8.4771 8.8208 -0.3437
54.0000 8.2553 8.6740 -0.4187
60.0000 8.1303 8.4016 -0.2712
68.0000 8.0414 7.9410 0.1004
76.0000 7.9614 7.4373 0.5242
84.0000 7.8228 6.9197 0.9031
92.0000 6.9294 6.3979 0.5316
100.0000 4.7959 5.8748 -1.0789
SSE = 2.2388
k = 15.4443 1.4138 0.0146 1.2501
= 0.0711
Lambda = 0.0643
Rg = 2.6451

174


0 3.2227 3.2227 0
3.0000 3.2253 3.5996 -0.3742
6.0000 3.3655 3.9798 -0.6143
9.0000 4.0334 4.3600 -0.3266
12.0000 4.7745 4.7402 0.0343
15.0000 5.0899 5.1204 -0.0305
18.0000 5.1430 5.5007 -0.3576
21.0000 6.4871 5.8809 0.6062
24.0000 7.1239 6.2611 0.8627
30.0000 8.3892 7.0216 1.3676
36.0000 8.5315 7.7818 0.7497
42.0000 9.2330 8.5407 0.6923
48.0000 9.2430 9.2926 -0.0495
54.0000 9.8692 10.0051 -0.1359
60.0000 9.1903 10.5382 -1.3479
68.0000 9.4346 10.5125 -1.0779
76.0000 9.3365 9.8266 -0.4902
84.0000 9.1931 8.9786 0.2145
92.0000 8.9370 8.1062 0.8309
100.0000 7.9085 7.2307 0.6778
SSE = 3.0353
k = 37.6478 1.5337 0.0007 1.2419
= 0.1267
Lambda = 0.0266
Rg = 7.4247

175


0 6.4472 6.4472 0
3.0000 6.9031 6.6522 0.2509
6.0000 6.7672 6.8588 -0.0917
9.0000 7.1903 7.0653 0.1251
12.0000 7.7559 7.2713 0.4846
15.0000 8.0374 7.4767 0.5607
18.0000 8.1461 7.6811 0.4650
21.0000 8.1875 7.8839 0.3036
24.0000 8.7853 8.0842 0.7011
30.0000 8.8096 8.4702 0.3392
36.0000 8.9661 8.8159 0.1499
42.0000 8.9590 9.0763 -0.1180
48.0000 8.6767 9.1919 -0.5165
54.0000 8.3424 9.1304 -0.7899
60.0000 8.8195 8.9208 -0.1036
68.0000 8.1931 8.5088 -0.3183
76.0000 8.1106 8.0320 0.0759
84.0000 7.8893 7.5333 0.3532
92.0000 7.7202 7.0274 0.6899
100.0000 6.5623 6.5194 0.0402
SSEE = 1.7885
k = 38.0075 1.4079 0.0060 1.2491
= 0.0689
Lambda = 0.0262
Rg = 2.7480

176


0 3.2695 3.2695 0
3.0000 3.0934 3.6224 -0.5290
6.0000 3.7076 3.9835 -0.2760
9.0000 5.1492 4.3446 0.8046
12.0000 5.3385 4.7057 0.6327
15.0000 5.6284 5.0668 0.5616
18.0000 6.2529 5.4279 0.8250
21.0000 6.5832 5.7890 0.7942
24.0000 7.2014 6.1501 1.0513
30.0000 7.5224 6.8722 0.6502
36.0000 7.4249 7.5941 -0.1692
42.0000 8.1139 8.3148 -0.2009
48.0000 9.3692 9.0291 0.3401
54.0000 9.3945 9.7106 -0.3163
60.0000 9.3345 10.2497 -0.9156
68.0000 9.3945 10.3364 -0.9430
76.0000 9.3181 9.7419 -0.4253
84.0000 9.2718 8.9442 0.3261
92.0000 9.1106 8.1119 0.9972
100.0000 7.2900 7.2744 0.0141
SSE = 2.8023
k = 14.6626 1.5258 0.0010 1.2487
= 0.1204
Lambda = 0.0678
Rg = 7.1411
177


0 6.2253 6.2253 0
3.0000 6.5623 6.4546 0.1077
6.0000 7.3711 6.6845 0.6865
9.0000 7.3424 6.9141 0.4284
12.0000 7.8573 7.1429 0.7144
15.0000 8.7076 7.3706 1.3370
18.0000 8.2553 7.5963 0.6589
21.0000 8.0212 7.8188 0.2024
24.0000 8.9469 8.0359 0.9111
30.0000 8.2695 8.4379 -0.1684
36.0000 8.6484 8.7501 -0.1018
42.0000 8.4065 8.8933 -0.4868
48.0000 8.3139 8.8207 -0.5069
54.0000 7.7745 8.2269 -0.1855
68.0000 8.1430 7.7010 0.4420
76.0000 6.9845 7.1499 -0.1654
84.0000 6.8162 6.5915 0.2247
92.0000 6.8513 6.0314 0.8199
100.0000 5.6435 5.4707 0.1727
SSE = 2.5396
k = 86.9615 1.4085 0.0147 1.2318
= 0.0767
Lambda = 0.0115
Rg = 2.6707

178


0 7.4843 7.4843 0
3.0000 7.3424 7.7915 -0.4490
6.0000 7.9614 8.1062 -0.1448
9.0000 8.2201 8.4211 -0.2009
12.0000 9.1523 8.7358 0.4164
15.0000 9.4298 9.0506 0.3791
18.0000 9.7076 9.3654 0.3422
21.0000 9.9217 9.6801 0.2416
24.0000 10.1173 9.9948 0.1225
30.0000 11.4425 10.6236 0.8189
36.0000 11.3962 11.2499 0.1463
42.0000 11.7160 11.8658 -0.1498
48.0000 12.0569 12.4394 -0.3825
54.0000 12.6767 12.8687 -0.1920
60.0000 12.8451 12.9728 -0.1277
68.0000 13.0170 12.5740 0.4430
76.0000 10.8865 11.9029 -1.0164
84.0000 10.7324 11.1691 -0.4367
92.0000 10.6812 10.4235 0.2578
100.0000 10.6180 9.6758 0.9423
SSE = 2.0147
k = 13.6880 1.5673 0.0000 1.3257
= 0.1049
Lambda = 0.0727
Rg = 5.5001

179


0 6.3979 6.3979 0
3.0000 6.3118 6.5995 -0.2878
6.0000 6.3892 6.8017 -0.4126
9.0000 6.6532 7.0036 -0.3504
12.0000 8.2368 7.2051 1.0317
15.0000 7.7782 7.4059 0.3723
18.0000 7.7853 7.6055 0.1798
21.0000 8.9320 7.8034 1.1285
24.0000 8.9191 7.9985 0.9205
30.0000 8.4150 8.3735 0.0413
36.0000 8.6721 8.7066 -0.0347
42.0000 8.9708 8.9537 0.0166
48.0000 8.3551 9.0586 -0.7045
54.0000 8.9518 8.9936 -0.0430
60.0000 8.9518 8.7872 0.1631
68.0000 7.4314 8.3845 -0.9548
76.0000 7.3617 7.9183 -0.5583
84.0000 7.4314 7.4301 -0.0005
92.0000 7.5237 6.9345 0.5874
100.0000 7.4962 6.4367 1.0578
SSE = 2.6357
k = 89.6554 1.4006 0.0078 1.2452
= 0.0675
Lambda = 0.0111
Rg = 2.6625

180


0 7.1903 7.1903 0
3.0000 7.8122 7.5159 0.2964
6.0000 8.0453 7.8496 0.1957
9.0000 8.1761 8.1834 -0.0073
12.0000 8.6085 8.5171 0.0914
15.0000 8.9191 8.8507 0.0683
18.0000 9.8312 9.1842 0.6469
21.0000 9.8156 9.5172 0.2981
24.0000 10.1430 9.8494 0.2929
30.0000 10.8228 10.5064 0.3134
36.0000 12.2695 11.1267 1.1294
42.0000 12.2695 11.6070 0.6128
48.0000 11.6902 11.7403 -0.1712
54.0000 10.3010 11.4683 -1.3466
60.0000 9.9614 10.9786 -1.2199
68.0000 9.8451 10.2231 -0.5881
76.0000 9.5623 9.4416 -0.0907
84.0000 9.7243 8.6561 0.8567
92.0000 9.3160 7.8698 1.2347
100.0000 8.0212 7.0835 0.7263
SSE = 2.9920
k = 13.4607 1.5557 0.0000 1.2995
= 0.1112
Lambda = 0.0736
Rg = 4.6712

181


0 6.2355 6.2355 0
3.0000 5.8865 6.5761 -0.6896
6.0000 6.1239 6.9253 -0.8015
9.0000 6.9294 7.2727 -0.3433
12.0000 7.7782 7.6158 0.1624
15.0000 7.9661 7.9494 0.0168
18.0000 8.3096 8.2630 0.0467
21.0000 8.5250 8.5366 -0.0115
24.0000 8.3979 8.7388 -0.3409
30.0000 8.1461 8.8085 -0.6624
36.0000 8.4314 8.4641 -0.0327
42.0000 8.2788 7.9279 0.3508
48.0000 8.0170 7.3344 0.6826
54.0000 6.9777 6.7258 0.2519
60.0000 6.3404 6.1137 0.2267
68.0000 5.4150 5.2964 0.1186
76.0000 4.2430 4.4788 -0.2358
84.0000 3.2788 3.6612 -0.3825
92.0000 2.5378 2.8435 -0.3057
100.0000 1.9031 2.0259 -0.1228
SSE = 1.6879
k = 12.0653 1.5174 0.0368 1.2485
= 0.1167
Lambda = 0.0818
Rg = 2.6042

182


0 5.2833 5.2833 0
3.0000 5.6857 5.6574 0.0284
6.0000 6.0792 6.0342 0.0450
9.0000 6.0755 6.4110 -0.3354
12.0000 6.4518 6.7877 -0.3359
15.0000 6.9590 7.1645 -0.2054
18.0000 7.2122 7.5413 -0.3291
21.0000 7.4698 7.9180 -0.4482
24.0000 8.2122 8.2948 -0.0826
30.0000 8.9217 9.0481 -0.1264
36.0000 10.1461 9.8004 0.3457
42.0000 11.2672 10.5470 0.7202
48.0000 12.2810 11.2620 1.0191
54.0000 11.5966 11.8288 -0.2322
60.0000 11.2553 11.9732 -0.7179
68.0000 11.0969 11.4546 -0.3577
76.0000 9.9269 10.6427 -0.7158
84.0000 9.7745 9.7812 -0.0067
92.0000 9.4232 8.9131 0.5101
100.0000 9.0212 8.0441 0.9771
SSE = 2.1688
k = 47.0463 1.5324 0.0000 1.2432
= 0.1256
Lambda = 0.0214
Rg = 6.7060

183


0 6.0531 6.0531 0
3.0000 6.1492 6.2469 -0.0977
6.0000 6.7033 6.4415 0.2618
9.0000 6.4472 6.6359 -0.1888
12.0000 7.2695 6.8302 0.4393
15.0000 7.4698 7.0243 0.4455
18.0000 7.9138 7.2179 0.6959
21.0000 8.1931 7.4109 0.7822
24.0000 8.8388 7.6030 1.2358
30.0000 8.8751 7.9819 0.8932
36.0000 8.2227 8.3459 -0.1232
42.0000 8.7118 8.6764 0.0355
48.0000 8.2279 8.9375 -0.7097
54.0000 8.3856 9.0794 -0.6938
60.0000 8.6484 9.0656 -0.4172
68.0000 8.5119 8.8299 -0.3180
76.0000 8.0969 8.4458 -0.3489
84.0000 8.0899 7.9993 0.0906
92.0000 8.4800 7.5301 0.9499
100.0000 7.3222 7.0530 0.2693
SSE = 2.5115
k = 85.2642 1.4030 0.0067 1.2537
= 0.0649
Lambda = 0.0117
Rg = 3.0400

184


0 5.2989 5.2989 0
3.0000 5.1818 5.6541 -0.4723
6.0000 5.3560 6.0186 -0.6627
9.0000 6.2553 6.3831 -0.1280
12.0000 6.5185 6.7476 -0.2293
15.0000 7.3404 7.1121 0.2281
18.0000 8.3945 7.4766 0.9175
21.0000 8.5315 7.8412 0.6900
24.0000 9.3522 8.2057 1.1461
30.0000 9.4914 8.9347 0.5562
36.0000 9.8261 9.6634 0.1621
42.0000 10.2122 10.3904 -0.1791
48.0000 10.8949 11.1089 -0.2159
54.0000 11.0531 11.7838 -0.7371
60.0000 11.4150 12.2761 -0.8838
68.0000 12.5328 12.2376 0.2376
76.0000 12.0453 11.5827 0.3916
84.0000 11.7443 10.7679 0.9037
92.0000 9.5623 9.9270 -0.4376
100.0000 8.4150 9.0827 -0.7404
SSE = 2.6305
k = 13.0790 1.5253 0.0000 1.2455
= 0.1215
Lambda = 0.0759
Rg = 7.1115

185


0 6.0212 6.0212 0
3.0000 6.3139 6.2671 0.0468
6.0000 6.2095 6.5194 -0.3099
9.0000 7.6857 6.7717 0.9141
12.0000 7.5250 7.0235 0.5016
15.0000 8.0607 7.2746 0.7861
18.0000 8.2810 7.5245 0.7565
21.0000 8.5740 7.7722 0.8018
24.0000 8.3979 8.0161 0.3819
30.0000 8.6946 8.4790 0.2156
36.0000 8.1523 8.8626 -0.7103
42.0000 8.5250 9.0718 -0.5468
48.0000 8.4983 9.0282 -0.5299
54.0000 8.1523 8.7682 -0.6159
60.0000 8.5185 8.3896 0.1289
68.0000 7.9217 7.8132 0.1085
76.0000 7.7243 7.2114 0.5129
84.0000 7.5911 6.6030 0.9881
92.0000 5.6721 5.9932 -0.3211
100.0000 5.2175 5.3831 -0.1656
SSE = 2.4643
k = 12.5871 1.4434 0.0112 1.2496
= 0.0842
Lambda = 0.0788
Rg = 3.0649

186


0 1.0607 1.0607 0
3.0000 0.7404 1.3756 -0.6352
6.0000 1.4624 1.6912 -0.2288
9.0000 2.1303 2.0067 0.1236
12.0000 3.0414 2.3223 0.7191
15.0000 3.5855 2.6378 0.9476
18.0000 3.7709 2.9534 0.8174
21.0000 3.6990 3.2690 0.4300
24.0000 3.9004 3.5846 0.3158
30.0000 4.8692 4.2157 0.6535
36.0000 5.3711 4.8468 0.5242
42.0000 5.6335 5.4777 0.1557
48.0000 5.8420 6.1077 -0.2657
54.0000 6.4518 6.7337 -0.2819
60.0000 7.2175 7.3430 -0.1255
68.0000 7.5966 8.0343 -0.4377
76.0000 7.5185 8.2609 -0.7424
84.0000 7.5315 7.8706 -0.3392
92.0000 7.3784 7.2072 0.1712
100.0000 7.1614 6.4801 0.6813

SSE = 2.2544
k = 165.5408 1.4463 0.1152 1.2041
= 0.1052
Lambda = 0.0063
Rg = 7.2105
187


0 6.2175 6.2175 0
3.0000 6.0969 6.4159 -0.3190
6.0000 6.3802 6.6160 -0.2358
9.0000 6.9269 6.8157 0.1112
12.0000 7.5911 7.0150 0.5761
15.0000 8.0719 7.2135 0.8584
18.0000 8.8122 7.4109 1.4013
21.0000 8.4624 7.6066 0.8558
24.0000 8.3617 7.7995 0.5622
30.0000 8.1761 8.1701 0.0060
36.0000 8.2695 8.4996 -0.2300
42.0000 8.0531 8.7450 -0.6920
48.0000 8.3222 8.8520 -0.5298
54.0000 8.4698 8.7923 -0.3225
60.0000 8.4232 8.5924 0.0279
76.0000 7.7443 7.7377 0.0066
84.0000 7.6021 7.2552 0.3469
92.0000 6.9494 6.7649 0.1845
100.0000 6.5185 6.2723 0.2463
SSE = 2.3262
k = 38.9966 1.3999 0.0123 1.2462
= 0.0667
Lambda = 0.0256
Rg = 2.6360

188


0 8.3212 8.3212 0
3.0000 7.6128 8.5988 -0.9860
6.0000 7.7924 8.8839 -1.0915
9.0000 8.3334 9.1690 -0.8356
12.0000 8.5740 9.4542 -0.8802
15.0000 8.7284 9.7393 -1.0110
18.0000 9.3424 10.0244 -0.6820
21.0000 10.2636 10.3095 -0.0459
24.0000 11.2967 10.5946 0.7021
30.0000 12.0294 11.1644 0.8650
36.0000 12.1931 11.7328 0.4603
42.0000 13.2625 12.2964 0.9661
48.0000 12.0473 12.8421 -0.7949
54.0000 13.9934 13.3275 0.6659
60.0000 13.3551 13.6452 -0.2901
68.0000 13.0550 13.5943 -0.5393
76.0000 12.8573 13.1056 -0.2483
84.0000 12.2355 12.4601 -0.2246
92.0000 12.1206 11.7772 0.3434
100.0000 11.6284 11.0865 0.5419
SSE = 3.0799
k = 12.5152 1.7130 0.0000 1.4942
= 0.0950
Lambda = 0.0792
Rg = 5.3738
189


0 6.2455 6.2455 0
3.0000 6.0026 6.4782 -0.4756
6.0000 6.1361 6.7169 -0.5808
9.0000 6.8603 6.9553 -0.0949
12.0000 7.1614 7.1929 -0.0315
15.0000 7.6675 7.4292 0.2383
18.0000 7.6812 7.6633 0.0179
21.0000 8.3802 7.8938 0.4864
24.0000 8.3010 8.1180 0.1831
30.0000 8.6767 8.5285 0.1482
36.0000 8.5623 8.8322 -0.2699
42.0000 8.2945 8.9404 -0.6459
48.0000 8.2175 8.8172 -0.5997
54.0000 9.1861 8.5245 0.6616
60.0000 8.1614 8.1447 0.0166
68.0000 7.9345 7.5859 0.3486
76.0000 7.8573 7.0076 0.8497
84.0000 6.0314 6.4243 -0.3929
92.0000 5.9165 5.8397 0.0767
100.0000 4.6075 5.2549 -0.6474
SSE = 1.9062
k = 12.5994 1.5349 0.0131 1.3514
= 0.0797
Lambda = 0.0787
Rg = 2.6949

190


0 5.4393 5.4393 0
3.0000 5.4314 5.7763 -0.3449
6.0000 5.2304 6.1171 -0.8866
9.0000 6.6128 6.4579 0.1549
12.0000 7.3589 6.7987 0.5602
15.0000 7.9287 7.1395 0.7892
18.0000 7.8293 7.4803 0.3490
21.0000 8.1889 7.8211 0.3679
24.0000 8.0607 8.1619 -0.1012
30.0000 9.2577 8.8434 0.4143
36.0000 9.3692 9.5244 -0.1552
42.0000 10.2911 10.2030 0.0881
48.0000 11.0191 10.8703 0.1489
54.0000 11.3775 11.4865 -0.1090
60.0000 11.5211 11.9156 -0.3945
68.0000 11.5145 11.8563 -0.3417
76.0000 11.5484 11.2471 0.3013
84.0000 9.4639 10.4836 -1.0197
92.0000 9.8951 9.6920 0.2032
100.0000 9.8212 8.8960 0.9251
SSE = 2.1612
k = 29.4372 1.5086 0.0000 1.2470
= 0.1136
Lambda = 0.0339
Rg = 6.5482

191


0 6.0212 6.0212 0
3.0000 6.0453 6.2637 -0.2184
6.0000 6.2443 6.5126 -0.2684
9.0000 6.4472 6.7613 -0.3142
12.0000 6.9294 7.0094 -0.0800
15.0000 7.3118 7.2566 0.0551
18.0000 7.9058 7.5021 0.4037
21.0000 8.1492 7.7447 0.4046
24.0000 8.5378 7.9821 0.5557
30.0000 8.7634 8.4246 0.3388
36.0000 8.4878 8.7694 -0.2816
42.0000 8.5441 8.9189 -0.3748
48.0000 8.3766 8.8189 -0.4424
54.0000 8.3617 8.5286 -0.1669
60.0000 8.1538 8.1403 0.0135
68.0000 7.9370 7.5646 0.3725
76.0000 7.3838 6.9682 0.4156
84.0000 6.2135 6.3667 -0.1532
92.0000 5.9542 5.7639 0.1903
100.0000 5.0000 5.1609 -0.1609
SSE = 1.3486
k = 12.5337 1.4413 0.0160 1.2501
= 0.0830
Lambda = 0.0791
Rg = 2.8987

192


0 5.4639 5.4639 0
3.0000 5.3395 5.8091 -0.4697
6.0000 5.5211 6.1632 -0.6420
9.0000 6.9186 6.5173 0.4013
12.0000 7.0792 6.8713 0.2079
15.0000 7.0212 7.2253 -0.2042
18.0000 7.5099 7.5794 -0.0695
21.0000 8.2162 7.9334 0.2827
24.0000 8.5664 8.2875 0.2789
30.0000 9.3334 8.9955 0.3380
36.0000 9.6375 9.7029 -0.0654
42.0000 10.7889 10.4075 0.3813
48.0000 11.7202 11.0980 0.6222
54.0000 11.5843 11.7218 -0.1377
60.0000 11.5809 12.1056 -0.5255
68.0000 11.0294 11.9167 -0.8891
76.0000 11.2405 11.2324 0.0061
84.0000 9.9165 10.4311 -0.5170
92.0000 9.9469 9.6104 0.3342
100.0000 9.9031 8.7871 1.1138
SSE = 2.0970
k = 13.2939 1.5191 0.0000 1.2474
= 0.1180
Lambda = 0.0747
Rg = 6.6724

193


0 6.1790 6.1790 0
3.0000 6.3464 6.4086 -0.0623
6.0000 6.3560 6.6443 -0.2883
9.0000 6.8482 6.8797 -0.0316
12.0000 6.9542 7.1145 -0.1603
15.0000 7.2833 7.3483 -0.0650
18.0000 7.3263 7.5803 -0.2539
21.0000 8.0645 7.8092 0.2552
24.0000 8.3075 8.0331 0.2744
30.0000 8.3560 8.4500 -0.0940
36.0000 8.7520 8.7779 -0.0259
42.0000 8.8325 8.9328 -0.1002
48.0000 8.7243 8.8617 -0.1374
54.0000 8.6128 8.6070 0.0058
60.0000 8.6902 8.2504 0.4398
68.0000 7.9638 7.7100 0.2538
76.0000 7.0492 7.1448 -0.0955
84.0000 6.0086 6.5727 -0.5641
92.0000 5.8949 5.9991 -0.1042
100.0000 5.6675 5.4249 0.2426
SSE = 1.0081
k = 12.4107 1.4323 0.0139 1.2512
= 0.0787
Lambda = 0.0799
Rg = 2.7575

194


0 5.1106 5.1106 0
3.0000 5.0212 5.4858 -0.4647
6.0000 5.2672 5.8624 -0.5952
9.0000 6.9269 6.2390 0.6879
12.0000 7.2253 6.6155 0.6098
15.0000 7.6902 6.9921 0.6981
18.0000 7.6180 7.3687 0.2494
21.0000 8.1461 7.7452 0.4009
24.0000 8.7202 8.1218 0.5983
30.0000 9.4771 8.8749 0.6022
36.0000 9.6902 9.6275 0.0627
42.0000 10.2553 10.3775 -0.1222
48.0000 11.0792 11.1129 -0.0337
54.0000 11.6232 11.7729 -0.1497
60.0000 11.4281 12.1468 -0.7187
68.0000 11.2577 11.8635 -0.6058
76.0000 11.2553 11.1053 0.1500
84.0000 9.9845 10.2523 -0.2678
92.0000 9.1818 9.3856 -0.2037
100.0000 9.7076 8.5171 1.1905
SSE = 2.3076
k = 96.6022 1.5317 0.0000 1.2427
= 0.1255
Lambda = 0.0105
Rg = 7.0499

195


0 6.1931 6.1931 0
3.0000 5.7818 6.4127 -0.6310
6.0000 6.2175 6.6381 -0.4206
9.0000 6.8129 6.8630 -0.0501
12.0000 6.8513 7.0871 -0.2359
15.0000 7.5563 7.3100 0.2463
18.0000 7.8451 7.5307 0.3144
21.0000 8.1072 7.7479 0.3593
24.0000 8.1790 7.9593 0.2197
30.0000 8.3711 8.3485 0.0226
36.0000 8.7853 8.6460 0.1393
42.0000 8.4472 8.7763 -0.3292
48.0000 8.3522 8.6983 -0.3461
54.0000 8.4065 8.4529 -0.0463
60.0000 8.2553 8.1127 0.1425
68.0000 7.9638 7.5964 0.3674
76.0000 7.2833 7.0550 0.2283
84.0000 5.8949 6.5062 -0.6113
92.0000 5.7889 5.9555 -0.1666
100.0000 5.8482 5.4043 0.4439
SSE = 1.4234
k = 12.3860 1.4227 0.0184 1.2494
= 0.0752
Lambda = 0.0801
Rg = 2.5846

196
ANEXO D
Curvas padro de acares e cidos e etanol
y = 15166x + 74018
R = 0,999
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
18000000
0 20 40 60 80 100 120
r
e
a
Concentrao (g/L)

Figura 86. Curva padro para a frutose

y = 16236x + 41790
R = 0,999
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
18000000
0 20 40 60 80 100 120
r
e
a
Concentrao (g/L)

Figura 87. Curva padro para a glicose

197
y = 66610x + 28896
R = 0,992
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
0 20 40 60 80 100 120
r
e
a
Concentrao (g/L)

Figura 88. Curva padro para o etanol

y = 12726x + 76770
R = 0,994
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 20 40 60 80 100 120
r
e
a
Concentrao (g/L)

Figura 89. Curva padro para o glicerol

198
y = 14941x + 52056
R = 0,984
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
0 2 4 6 8 10 12
r
e
a
Concentrao (mg/mL)

Figura 90. Curva padro para o cido lctico

y = 79824x + 13185
R = 0,950
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
0 2 4 6 8 10 12
r
e
a
Concentrao (mg/mL)

Figura 91. Curva padro para o cido cetico

199
ANEXO E
Dados do ndice de viabilidade da levedura
o
C
Tempo L=10
1
UFC/mL L=10
5
UFC/mL L=10
8
UFC/mL Levedura pura
0 99,67% 90,00% 98,25% 100,00%
3 99,80% 85,71% 75,86% 100,00%
6 99,85% 86,96% 96,92% 100,00%
9 99,65% 56,67% 88,89% 100,00%
12 96,30% 86,94% 64,44% 88,06%
15 99,63% 89,61% 59,00% 87,67%
18 96,53% 53,93% 55,56% 92,82%
21 57,89% 51,96% 16,03% 96,06%
24 93,14% 37,26% 26,64% 87,70%
30 89,90% 52,73% 24,79% 88,73%
36 97,55% 36,26% 18,83% 44,00%
42 97,49% 78,97% 37,06% 77,12%
48 95,90% 72,08% 28,24% 77,40%
54 50,51% 38,24% 20,74% 65,99%
60 41,51% 59,50% 25,91% 43,37%
68 42,86% 59,09% 24,28% 53,06%
76 48,28% 33,33% 13,27% 37,04%
84 41,50% 12,20% 3,39% 22,58%
92 47,16% 5,71% 2,08% 21,99%
100 31,47% 2,83% 0,14% 0,72%

200
o
C
Tempo L=10
7
UFC/mL L=10
3
0 98,25% 96,88% 100,00%
3 75,86% 95,92% 100,00%
6 96,92% 95,83% 100,00%
9 88,89% 73,86% 100,00%
12 64,44% 95,83% 99,92%
15 59,00% 62,96% 99,50%
18 55,56% 93,42% 99,26%
21 19,29% 94,08% 99,07%
24 26,64% 39,49% 99,08%
30 24,79% 82,11% 98,46%
36 18,83% 65,52% 98,37%
42 37,06% 14,74% 98,44%
48 28,24% 20,00% 97,75%
54 20,74% 57,10% 98,18%
60 25,91% 42,97% 97,84%
68 24,28% 46,67% 89,86%
76 13,27% 44,86% 82,56%
84 3,39% 43,33% 81,06%
92 2,08% 42,64% 69,87%
100 0,14% 54,85% 74,16%

201
o
C
Tempo L=10
7
UFC/mL L=10
3
0 100,00% 97,62% 100.00%
3 81,82% 98,15% 100.00%
6 82,54% 98,20% 100.00%
9 79,12% 96,15% 100.00%
12 81,79% 97,83% 98.23%
15 67,55% 98,86% 97.27%
18 35,71% 43,40% 89.02%
21 50,93% 78,42% 90.35%
24 69,33% 81,74% 97.79%
30 49,28% 81,98% 82.11%
36 40,14% 74,14% 95.02%
42 56,66% 54,84% 98.01%
48 55,61% 44,06% 99.39%
54 36,14% 41,70% 93.65%
60 38,40% 52,38% 92.13%
68 8,06% 9,97% 50.00%
76 0,00% 12,37% 16.42%
84 0,00% 21,52% 19.40%
92 0,00% 12,78% 11.27%
100 0,00% 0,96% 0.00%

202
Tabela 22. ndice de viabilidade para a levedura em cultura pura em diferentes
temperaturas
Tempo (horas) 24C 25C 28C 31C 32C
0 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%
3 100,00% 100,00% 100,00% 81,82% 100,00%
6 100,00% 100,00% 100,00% 82,54% 100,00%
9 100,00% 100,00% 100,00% 79,12% 84,62%
12 89,69% 99,92% 88,06% 81,79% 95,35%
15 97,30% 99,50% 87,67% 67,55% 91,11%
18 97,56% 99,26% 92,82% 35,71% 97,67%
21 98,53% 99,07% 96,06% 50,93% 89,61%
24 98,97% 99,08% 87,70% 69,33% 98,18%
30 98,18% 98,46% 88,73% 49,28% 96,97%
36 97,78% 98,37% 44,00% 40,14% 97,96%
42 98,29% 98,44% 77,12% 56,66% 95,48%
48 97,59% 97,75% 77,40% 55,61% 96,88%
54 96,77% 98,18% 65,99% 36,14% 73,02%
60 98,24% 97,84% 43,37% 38,40% 69,17%
68 95,24% 89,86% 53,06% 8,06% 57,71%
76 94,44% 82,56% 37,04% 0,00% 66,14%
84 81,33% 81,06% 22,58% 0,00% 30,74%
92 61,04% 69,87% 31,50% 0,00% 21,94%
100 80,37% 74,16% 18,50% 0,00% 0,88%

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0,03% conforme metodologia adaptada

(BioMrieux, S.a, France). A concentrao

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