FERMENTAO ALCOLICA PRTICA: 01 OBJETIVOS: Determinar o Brix de uma amostra aucarada pelo mtodo aeromtrico INTRODUO: Brix a concentrao

ao de slidos solveis presentes numa amostra aucarada expressa em percentagem em peso; por definio, grau brix corresponde a uma relao entre a massa do soluto pela massa da soluo. O brix de uma amostra pode ser determinado pelo mtodo refratomtrico ou pelo mtodo aeromtrico. Nossa prtica se deter ao aprendizado desse ltimo. O aremetro (densmetro) o aparelho mais simples usado para se medir o grau brix, sua escalas so bem variadas correspondendo a valores de 0 a 90o Brix. Salienta-se, no entanto, que as escalas mais utilizadas so as de 0 a 10oBrix, de 10 a 20oC e de 20 a 30oBrix. Esses aparelhos aferidos com uma soluo padro de sacarose a 20oC so muitas vezes conhecidos como sacarmetros ou brixmetro. MATERIAL: - Melao; Caldo-de-cana ou Mostos aucarados - Diversos: Bquer de 50ml e 500ml; Basto de vidro Proveta de 250 ml; Aremetro de 10 a 20o Brix e de 20 a 30o Brix Termmetro de 0 a 50oC Balana EQUIPES: Equipe A: Equipe B: Equipe C: Equipe D: Fazer diluio de 1 :2 para determinar o brix do melao Fazer diluio de 1: 4 para determinar o brix do melao Usar mostos aucarados Usar caldo de cana

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: a) Determinao do Brix Pesar 100 g de melao num Bquer e realizar a diluio recomendada; Dissolver completamente; Transferir a amostra (que poder se tambm caldo de cana ou mostos aucarados) para uma proveta; Deixar a soluo em repouso por alguns minutos (5 minutos) para eliminar as impurezas grosseiras; Obs:. Filtrar caso haja uma grande concentrao de slidos em suspenso Remover as espumas deixando o lquido transbordar um pouco; Imergir o aremetro no lquido em anlise; Efetuar a leitura do brix na haste do aremetro; no ponto de encontro entre a haste contendo a escala e o lquido examinado; Anotar o brix lido; Imergir o termmetro e efetuar a leitura; Fazer a correo do brix observado para o brix a 20o C ( fT ) atravs de uma tabela correspondente. Obs.: Caso a temperatura da leitura seja inferior a 20oC, subtrair o nmero encontrado na tabela do valor lido na haste. O procedimento inverso feito quando a temperatura de leitura for superior a 20oC. Calcular o brix real da amostra utilizando a frmula Caso tiver sido realizada uma diluio, multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluio correspondente ( fd ). Brix real = ( Brix lido fT) fd b) Determinao do pH pelo potencimetro ou pHmetro Antes da determinao do pH pelo potencimetro, o mesmo deve ser aferido com solues tampo de pH 7,0 e 4,0; Usar a soluo 1+1 preparada para a determinao areomtrica; Obs.: O pH em amostras de caldo de cana ou mostos pode ser determinado diretamente sem necessitar diluio. Transferir 50ml da soluo para um Bquer; Imergir o eletrodo na amostra, cobrindo a membrana;

Obs.: Para a leitura correta, necessrio que o observador posicione sua vista exatamente

Fazer leitura do pH; Voltar o boto para a posio neutra; Retirar o eletrodo e lavar com gua destilada.

DISCUSSO 1. Especificar as condies de trabalho e os resultados obtidos 2. Na determinao do grau brix do melao: (i) Qual o efeito da diluio ? (ii) Por que necessrio fazer a correo da temperatura? (iii) Como a temperatura pode influenciar essa determinao analtica?

PRTICA: 02 OBJETIVOS: Determinar o fator do licor de Fehling pelo mtodo de Eynon-Lane INTRODUO: A partir de uma soluo padro de sacarose de concentrao conhecida possvel por titulao avaliar o fator de uma soluo mista de Fehling-Soxlet (5ml de soluo A e 5ml de soluo B) conhecida como Licor de Fehling. O volume de soluo padro de sacarose gasto na titulao de 10 ml do Licor de Fehling pode ser relacionado com o valor da concentrao de acares redutores por intermdio de um clculo estequiomtrico. Quando as solues forem devidamente preparadas deve-se gastar cerca de 10ml de soluo padro de sacarose para titular 10ml de licor de Fehling. O resultado experimental obtido equivale ao fator do Licor de Fehling e ser mais correto quanto mais se aproxime de 0,056. MATERIAL E REAGENTES Sacarose p.a.; Solues de Fehling A e B*; solues de HCl (1:1); solues de NaOH (1N); azul de metileno a 1%; soluo de fenolftalena a 1%; Bequer; balo volumtrico de 1000ml; basto de vidro; funil; frascos de Erlenmeyer de 250ml (3); proveta de 50ml; prolas de vidro; garra; pipetas volumtricas de 5ml (2) e 10ml (1); bureta de Mohr (50ml); bico de Bunsen; Tela de amianto; trip de ferro; balana de preciso; banho-maria com controle de temperatura, termmetro.

* Soluo A: Dissolver 34,639g sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) em gua diluir para 500ml Soluo B: Dissolver 173g de sal de Rochelle (tartarato de sdio e potssio) e 50g de NaOH em gua, diluir para 500ml e deixar em repouso dois dias. Azul de metileno: Dissolver 1g de azul de metileno em gua destilada e completar para 1000ml. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Pesar 4,75g de sacarose em Bquer numa balana analtica; Diluir a amostra com 75 ml de gua destilada; Adicionar 10 ml de cido clordrico (1:1); Deixar a soluo em repouso durante 24 horas para completar a inverso da sacarose; Adicionar 2 a 3 gotas do indicador fenolftalena a 1%; Neutralizar cuidadosamente com hidrxido de sdio (1N) agitando constantemente; Completar a soluo para 1000ml.

Obs.: conveniente que a soluo ao ser armazenada seja mantida cida, pois quando neutralizada esta se deteriora rapidamente, por conta de sua composio (sacarose) que bastante favorvel ao crescimento de microrganismos. Para que a soluo seja

armazenada durante muito tempo, deve-se adicionar cido benzico soluo de acar invertido. MTODO DE EYNON-LANE Adicionar 20 ml da soluo A e 20ml da soluo B (Licor de Fehling) em um frasco de Erlenmeyer e agitar bastante; Obs.: Deve-se acrescentar a soluo A sobre a soluo B. Transferir 10 ml do licor de Fehling para um frasco de Erlenmeyer de 250ml e adicionar 50ml de gua; Juntar algumas prolas de vidro; Aquecer at ebulio durante 2 minutos; Colocar 2 a 3 gotas da soluo de azul de metileno a 1% e esperar 20 segundos; Titular com a soluo aucarada da bureta, at obter uma colorao ligeiramente avermelhada; Anotar o volume da soluo consumida na titulao (V1); Repetir (mais duas vezes), acrescentando a frio um volume da soluo a ser analisada, menor do que o volume gasto na primeira titulao e anotar os volumes gastos (V2 e V3); Determinar a mdia V dos volumes gastos nas duas titulaes. Obs.: A diferena entre as titulaes no deve ser maior que 0,20ml, caso contrrio deve-se refazer a titulao.

CLCULO ESTEQUIOMTRICO H2O C12H22O11 2C6H12O6 342g 2 x 180g 4,75g X X = 5 g de redutores Observa-se experimentalmente que utilizando 5ml da soluo A e 5ml da soluo B, temos 10ml do Licor de Fehling devero ser gastos 10 ml da soluo padro na titulao, logo: 1000ml (volume total da soluo) 5 g de redutores 10ml (volume gasto na titulao) F F = 0,05g de redutores F = Fator do Licor de Fehling

PRTICA: 03 OBJETIVOS: Determinar acares Redutores pelo mtodo de Eynon-Lane INTRODUO: Os acares redutores de uma amostra aucarada podem ser determinados pelo mtodo volumtrico da dupla reduo de Eynon-Lane. Essa determinao baseia-se na reduo do on cprico em cuproso pelo grupo redutor do acar e tambm na reduo do indicador utilizado (azul de metileno), que na ausncia de Cu++ livre, reduz-se ficando descorada. A mistura de solues de Fehling-Soxlet conhecida como licor de Fehling - titulada pela soluo aucarada. A reduo constatada pela formao de xido cuproso (colorao vermelho-tijolo) quando se faz reagir o licor de Fehling com os acares redutores da amostra. Esse mtodo adequado para avaliar os acares existentes em caldo-de-cana ou em melao. Neste ltimo as impurezas podem interferir no ponto de virada do indicador, logo pode-se clarificar a amostra para facilitar a titulao. Definies Tcnicas Acares Redutores Simples (ARS) correspondem concentrao de glicose e frutose existentes na matria-prima na forma redutora. Acares Redutores Totais (ART) correspondem ao teor de glicose e frutose existente na amostra, mais aqueles que so originados da hidrlise da sacarose . ART = ARS + S Obs.: Para hidrolizar a sacarose pode-se usar cido clordrico ou a enzima invertase. H2O SACAROSE GLICOSE + FRUTOSE H+ Acares Redutores Infermentescveis (ARI) so substncias de carter redutor, mas contudo no so convertidas em lcool ou seja, no fermentam. So constitudos por complexos de glicose e frutose com aminocidos e/ou derivados. Acares Redutores Fermentescveis (ARF) presentes numa amostra correspondem aos redutores totais menos os redutores infermentescveis. ARF = ART - ARI

MATERIAL E REAGENTES Melao; Solues de Fehling A e B*; solues de HCl (1:1); solues de NaOH (1N); azul de metileno a 1%; soluo de fenolftalena a 1%; Bequer; balo volumtrico de 500ml; balo de fundo chato 250ml; basto de vidro; funil; frascos de Erlenmeyer de 250ml (6); proveta de 50ml; prolas de vidro; garra; pipetas volumtricas de 5ml (2) e 10ml (1); bureta de Mohr (50ml); bico de Bunsen; Tela de amianto; trip de ferro; balana de preciso; banho-maria com controle de temperatura, termmetro.

* Soluo A: Dissolver 34,639g sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) em gua diluir para 500ml Soluo B: Dissolver 173g de sal de Rochelle (tartarato de sdio e potssio) e 50g de NaOH em gua, diluir para 500ml e deixar em repouso dois dias. Azul de metileno: Dissolver 1g de azul de metileno em gua destilada e completar para 1000ml. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1. Tratamento das amostras aucaradas a) ARS Pesar quantitativamente 4g de melao em Bquer numa balana analtica; Transferir quantitativamente para um balo volumtrico de 500ml usando gua destilada. Completar o volume. Colocar esta soluo na bureta e titular o Licor de Fehling.

b) ART Pesar quantitativamente 2g de melao em Bquer numa balana analtica Transferir a amostra para uma balo de fundo chato diluindo com 50 ml de gua destilada; Adicionar 10 ml de cido clordrico (1:1) ou 5ml de HCl concentrado; Levar a um banho-maria temperatura de 68-70oC (temperatura interna) por 15 minutos; Deixar esfriar e transferir a amostra para um balo volumtrico de 500ml; Obs.: O termmetro dever tambm ser lavado para dentro do balo volumtrico. Adicionar 2 a 3 gotas do indicador fenolftalena a 1%; Neutralizar cuidadosamente com hidrxido de sdio (1N) agitando constantemente; Completar a soluo para 500ml. Colocar esta soluo na bureta e titular o Licor de Fehling. c) ARI

Pesar 50,0g de melao; Dissolver a amostra em 200ml de gua; Adicionar soluo 0,3g de KH2PO4 e 0,3g de (NH4)2SO4; Adicionar 5g de levedura prensada (fermento) dissolvida em 50ml de gua; Homogeneizar suavemente; Deixar fermentar a 30oC durante no mnimo 36 horas; Filtrar vcuo ou centrifugar; Lavar 2 vezes o sedimento com gua; Transferir os sobrenadante para balo volumtrico de 500ml; Fazer aferio do balo; Usar essa soluo para titular 4ml de Licor de Fehling (2ml de A + 2ml deB); Anotar os volumes gastos (V2 e V3).

2. Mtodo de Eynon-Lane Adicionar 20 ml da soluo A e 20ml da soluo B (Licor de Fehling) em um frasco de Erlenmeyer e agitar bastante; Obs.: Deve-se acrescentar a soluo A sobre a soluo B. Transferir 10 ml do licor de Fehling para um frasco de Erlenmeyer de 250ml e adicionar 50ml de gua; Juntar algumas prolas de vidro; Aquecer at ebulio durante 2 minutos; Colocar 2 a 3 gotas da soluo de azul de metileno a 1% e esperar 20 segundos; Titular com a soluo aucarada da bureta, at obter uma colorao ligeiramente avermelhada; Anotar o volume da soluo consumida na titulao (V1); Repetir (mais duas vezes), acrescentando a frio um volume da soluo a ser analisada, menor do que o volume gasto na primeira titulao e anotar os volumes gastos (V2 e V3); Determinar a mdia V dos volumes gastos nas duas titulaes. Obs.: A diferena entre as titulaes no deve ser maior que 0,20ml, caso contrrio deve-se refazer a titulao.

3. Clculos: a) ARS 4 g de melao 500ml M V (mdia dos volumes gastos) M (massa de melao) 0,05 (fator do licor de Fehling) 100 ARS 625 ARS (%) = V

b) ART 2 g de melao 500ml M V (mdia dos volumes gastos) Vx 2 V M = = 500 250 M (massa de melao) 0,05 (fator do licor de Fehling) 100 ART 1250 ART (%) = V c) ARI 50 g de melao 500ml M V (mdia dos volumes gastos) M (massa de melao) 0,02 (fator do licor de Fehling) 100 ARI 200 ARI (%) = V DISCUSSO Especificar as condies de trabalho e os resultados obtidos; Calcular o percentual de Aucares redutores fermentescveis (ARF) e o percentual provenientes da inverso da sacarose (S); Comparar os resultados obtidos com o padro utilizado para o melao; Concluso.

PRTICA: 04 OBJETIVO: Realizar um processo fermentativo em batelada para produzir etanol

INTRODUO: A produo de etanol a partir do processo fermentativo tem sido explorado a partir do melao, subproduto da indstria do acar ou diretamente do caldo-de-cana por ao de leveduras. A elaborao desse produto de em quantidade e condies economicamente viveis a finalidade dessa prtica. Assim, nosso objetivo criar condies favorveis ao microrganismo agente da fermentao e desfavorveis aos contaminantes. Todo o processo acompanhado por anlises qumicas e microbiolgicas. Os controles qumicos mais importantes so: a) variao da concentrao do substrato; b) variao da temperatura; c) variao da acidez total, pois o pH nem sempre permite acompanhar o processo; d) desprendimento gasoso; e) aumento da concentrao do produto da reao. Os controles microbiolgico incluem exame do inculo nas diversas fases e do mosto em fermentao. Mosto a denominao que se d a matria-prima (melao, caldo-de-cana ou outros) devidamente preparada para ser fermentada. A matria prima se transforma em mosto aps a correo do Brix, pH, acidez e adio de nutrientes (se necessrio). O mosto produzido por melao ou caldo-de-cana pode ser empregado na propagao do Inculo ou na fermentao para obteno de lcool etlico. Quando o mosto destinado ao Inculo dever ser preparado com uma concentrao de slidos solveis baixa (Brix 11) para favorecer o crescimento do microrganismo. Neste caso a esterilizao se faz necessria. J o mosto destinado fabricao de etanol dever conter um grau brix maior (18 22oBrix), para fornecer um elevado teor de lcool. Por outro lado, denomina-se Inculo, p de cuba ou p de fermentao um volume de clulas de concentrao suficiente de microrganismo capaz de garantir um processo biotecnolgico em rendimento satisfatrio. Quando esse processo uma fermentao de melao ou caldo-de-cana para produo de etanol os agentes responsveis que fornecem melhores rendimentos so as leveduras. O inculo na prtica pode ser preparado a partir de uma cultura estoque mantida num tubo de ensaio por propagao sucessivas em volumes crescentes de mosto. Neste caso o microrganismo dever se adaptar a mostos com concentrao gradativamente crescente e as condies de temperatura, oxignio e pH devem se adequados ao desenvolvimento do mesmo. Em muitas destilarias o preparo do inculo realizado a partir de fermento prensado para panificao (50g/L) e assim a fase de propagao pode ser eliminada.

Amostras

Cultura de Saccharomyces cerevisiae em forma de fermento prensado ou liofilizada Material e reagentes: Balanas; potencimetro; densmetros com escalas de 0 a 10o Brix e de 10 a 20o Brix; termmetro; Bqueres de 250ml (3) e 500ml (3), basto de vidro (3); esptulas; bales de fundo chato de 1 ou 2litros (3) e de 6 litros (3). Melao; (NH4)2HPO4; MgSO4; H2SO4 concentrado.

Procedimento experimental Equipe A: preparar 200ml de mosto com 5oBrix Equipe B: preparar 1500 ml de mosto com 8oBrix Equipe C: preparar 7500ml de mosto com 11oBrix Fazer os clculos da diluio do melao at o brix desejado de acordo com o esquema recomendado por Cobenze B M A B-M M-A

Onde: B = Brix do melao A = Brix do diluente M = Brix do Mosto (desejado) M - A = massa do melao B - M = massa do diluente Fazer converso do resultado obtido de massa para volume usando para isso a densidade do melao e da gua.; Obs.: Consultar a tabela para obter a densidade do melao em funo do brix; Calcular a proporo entre a gua e o melao; Com o auxlio da frmula Vmosto = Vmelao + Vgua + Vnutrientes Calcular o volume de melao desejado; Pesar e dissolver o melao na gua; Pesar os nutrientes: (NH4)H2PO4 .................. 1g/L de mosto MgSO4 ........................... 0,5g/L de mosto Dissolver os nutrientes para suplementar o mosto; Ajustar o pH para 4 - 5 com H2SO4; Confirmar o brix pelo uso de um aremetro; Distribuir em frascos de Erlenmeyer ou bales esterilizados; Inocular o fermento e incubar

PRTICA: 05 OBJETIVO: Realizar um processo fermentativo em batelada para produzir etanol Comparar resultados

INTRODUO: A produo de etanol a partir do processo fermentativo tem sido explorado a partir do melao, subproduto da indstria do acar ou diretamente do caldo-de-cana por ao de leveduras. A elaborao desse produto de em quantidade e condies economicamente viveis a finalidade dessa prtica. Assim, nosso objetivo criar condies favorveis ao microrganismo agente da fermentao e desfavorveis aos contaminantes. Todo o processo acompanhado por anlises qumicas e microbiolgicas. Os controles qumicos mais importantes so: a) variao da concentrao do substrato; b) variao da temperatura; c) variao da acidez total, pois o pH nem sempre permite acompanhar o processo; d) desprendimento gasoso; e) aumento da concentrao do produto da reao. Os controles microbiolgico incluem exame do inculo nas diversas fases e do mosto em fermentao. AMOSTRAS Equipe A: Cultura pura de Saccharomyces cerevisiae; preparar 30L de mosto com 18o Brix (usar dorna A). Equipe B: Cultura pura de Schizocaccharomyces; preparar 20 L de mosto com 18oBrix (usar dorna B). Equipe C: CCultura em forma de fermento prensado ou liofilizada; preparar 20L de mosto com 18o Brix (usar dorna C). MATERIAL E REAGENTES Balanas; potencimetro; densmetro de 10 a 20o Brix; termmetro; Bquer 500ml; basto de vidro; esptulas; provetas 250ml; fermentador (dorna); lminas; microscpio; cmara de Neubauer. Melao; (NH4)H2PO4; MgSO4; H2SO4 concentrado; tetraciclina. ou penicilina.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Preparar 20-30 litros de mosto de acordo com a metodologia da prtica anterior (usar o esquema recomendado por Cobenze). Adicionar o antibitico (tetracilina ou penicilina) se necessrio; Inocular o fermento separando uma alquota para avaliar a viabilidade celular (prtica subsequente); Acompanhar a fermentao de acordo com o quadro a ser fornecido na prtica;

Guardar na geladeira alquotas de 50ml retiradas durante o processo fermentativo para determinao do teor alcolico.

PRTICA: 07 OBJETIVO: Determinao do teor alcolico

INTRODUO: A alcoometria tem por objetivo determinar o teor de lcool puro, anidro nas misturas de lcool e gua. A riqueza alcolica pode ser avaliada por densimetria ou por ebuliometria.. Na densimetria o alcolico geralmente avaliada por um dos dois processos; em peso ou em volume. No primeiro caso, o resultado obtido exprime o peso de lcool contido em 100 partes de peso da mistura e no segundo, o volume de lcool contido em 100 volumes do lquido alcolico. A alcoometria ponderal usada na Alemanha,Austria, Russia e pazes nordicos, enquanto que no Brasil, Frana, Itlia e outro pases latinos o teor alcolico avaliado por volumetria. Vrios alcometros so destinados a avaliao do teor alcolico dentre eles podemos citar o de Gay Lussac, Sikese Proof spirit, Cartier. Nossa prtica se deter a utilizao do alcometro de Gay Lussac. Na ebuliometria a amostra destilada diretamente num ebulimetro e o teor alcolico determinado pelo uso de uma escala (rgua) que compara a variao da temperatura de ebulio com o teor alcolico da mistura. AMOSTRAS Mosto em fermentao; Mosto fermentado; Leite de leveduras.

8.1. EBULIOMETRIA MATERIAL Tubos de ensaio; ebulimetro (lamparina, caldeira, condensador, rgua, termmetro, tubo especfico). PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Colocar gua at o nvel marcado na cuba (15ml); Adaptar o termmetro; Aquecer o aparelho; Fazer leitura quando a temperatura ficar estvel; Graduar a rgua que acompanha o ebulimetro, fixando o zero com a tempertarua de ebulio da gua; Esvaziar a caldeira e resfri-la;

Remover o termmetro da caldeira; Colocar a amostra na cubeta at o 2o trao (50ml); Conectar o termmetro e encher o condensador com gua; Acender a lamparina; Aps estabilizar fazer a leitura da temperatura; Localizar na rgua o teor alcolico da amostra.

Obs.: Aps cada anlise lavar a caldeira com gua para evitar incrustao; mas caso ocorra, deve-se ferver durante 5 minutos com uma soluo a 20% de hidrxido de sdio.

MODELO DE RELATRIO DE FERMENTAO ALCOLICA

Equipe: Nome dos alunos participantes: Fermentador: 1. INTRODUO 2. MATERIAIS E MTODOS 2.1. Determinaes analticas no melao (i) Brix, pH (ii) Acar redutor simples (iii) Acares redutores totais (iv) Acares redutores infermentescveis 2.2. Condies da Fe rmentao (i) Microrganismo (ii) Inculo (iii) Mosto (iv) Fermentador (Dorna) 2.3 Determinao analtica do produto (i) Teor alcolico 3. RESULTADOS DE DISCUSSO 4. CONCLUSO