Races transformadas

Algunos metabolitos secundarios sintetizados en races

Metabolito Atropina Berberina Esteres bornilo Gnero vegetal Hyoscyamus Hydratis canadensis de Valeriana Aplicacin Anticolinrgico Antihemorrgico uterino Sedante Tnico, estimulante Insecticida Antileucmico Antimalrico, antirreumtico Antihipertensivo

Ginsensidos Panax ginseng Rotenona Vincristina, vinblastina Quinina, quinidina Reserpina Derris elliptica Catharantus roseus Cinchona Rauwolfia

Metabolitos acumulados en cultivos de races NO transformadas

El estudio de la bioqumica y la qumica de las races ha estado siempre acotado debido a las dificultades tcnicas derivadas de los hbitos subterrneos de este rgano.

La posibilidad de contar con un sistema de cultivo "in-vitro" se a tornado en una herramienta sumamente til a los fines de investigacin.

Agrobacterium rhizogenes .

Bacteria del suelo gram negativa causa la enfermedad de las races en cabellera

Agrobacterium tumefaciens

La infeccin de muchas especies in-vitro con el microorganismo patgeno Agrobacterium rhizogenes permite obtener clones de races estables y en condiciones axnicas

Mayoritariamente, los clones preservan la capacidad biosinttica de las races de las plantas que les dieron origen

Las races neoplsicas producidas por A. rhizogenes se caracterizan por : su alto ndice de crecimiento y su estabilidad gentica

Estos cultivos producen niveles de metabolitos secundarios comparables a las plantas intactas

Otra aplicacin de los cultivos de races transformadas es la produccin de protenas bioactivas Ej: exoenzimas: peroxidasas en Brassica napus quitinasas de accin antifngica glucanasas protenas activantes de ribosomas (RIPs) Tambin es posible almacenamiento acumular protenas de

Ej: sporamina en batata que tambin ha demostrado jugar algn rol en procesos de defensa.

Adems los cultivos de races transformadas constituyen ideales para realizar estudios metablicos y regulatorios.

modelos

Por ejemplo con estos sistemas se ha demostrado que las races pueden expresar capacidad fotosinttica, llegando en algunos casos a desarrollarse en ausencia de fuentes hidrocarbonadas, en total fotoautotrofa.

Ya que la asimilacin de carbono esta estrechamente afectada por la produccin de metabolitos secundarios estos sistemas son aptos para analizar interacciones entre metabolismo primario y secundario.

Biologa de la interacin Agrobacterium-planta

El nico ejemplo conocido de transferencia natural de ADN inter-reino

Can survive independent of plant host in the soil.

Infects plants through breaks or wounds. Common disease of herbaceous plants, dicots.

The genus Agrobacterium has a wide host range:

n

Agrobacterium can transfer T-DNA to a broad group of plants Individual Agrobacterium strains have a limited host range The molecular basis for the strain-specific host range is unknown Many but not all the monocot plants can be transformed Under lab conditions, T-DNA can be transferred to yeast, other fungi, and even animal and human cells

Steps of Agrobacterium-plant cell interaction

n n

n n n n

Cell-cell recognition Signal transduction and transcriptional activation of vir genes Plasmidic DNA metabolism Intercellular transport Nuclear import T-DNA integration

T-DNA
n

T-DNA carries genes involved in the synthesis of plant growth hormones (auxin: auxin synthesis; cyt: cytokinin synthesis) and the production of low molecular weight amino acid and sugar phosphate derivatives called opines (ocs: octopine; mas: mannopine; and ags: agropine). Agrobacteria are usually classified based on the type of opines specified by the bacterial T-DNA.

El T-ADN es el sector del plsmido que se transfiere a las clulas husped Esta flanqueado por las secuencias bordes de aproximadamente 25 pb esenciales para la transferencia En el T-ADN existen dos regiones, la derecha (TR) y la izquierda (TL) Ambas codifican para funciones rizognicas una vez integradas a la clula husped La regin TR especifica la sntesis de agropinas y auxinas Regin TL porta cuatro loci que contienen los genes rol (A,B,C y D) implicados en el desarrollo morfolgico de las races mediante la sensibilizacin de las clulas al efecto auxnico El gen rol D induce la formacin de tejido de callos mientras que los genes rol A, B y C regulan el tamao, grado de ramificacin, alteraciones de tropismo y dems caractersticas de las races en cabellera

Opinas Auxinas Genes Rol A, B, C y D

TR

TL

Regin Vir catabolismo de opinas

Origen de Replicacin

Los genes codificados en el T-DNA presentan secuencias Tregulatorias eucariticas que permiten su expresin en las plantas infectadas En la regin Ti hay tambin genes vir cuya transcripcin induce la sntesis de compuestos fenlicos como los que liberan las plantas mecnicamente injuriadas como las acetosiringonas. acetosiringonas.

En ausencia de TR-DNA los genes del TL-DNA dirigen la TRTLdiferenciacin hacia races en cabellera si hay suministro de auxinas exgenas.

Agrobacterium-host cell recognition is a two-step process

1.Loosely bound step: acetylated polysaccharides are synthesized. 2.Strong binding step: bound bacteria synthesize cellulose filaments to stabilize the initial binding, resulting in a tight association between Agrobacterium and the host cell.

Plant Receptors are involved in initial binding

Plant vitronectin-like protein (PVN, 55kDa) was found on the surface of plant cell. This protein is probably involved in initial bacteria/plant cell binding. PVN is only immunologically related to animal vitronectin. Animal vitronectin is an important component of the extracellular matrix and is also an receptor for several bacterial strains.

Plant signals

Wounded plants secrete sap with acidic pH (5.0 to 5.8) and a high content of various phenolic compounds (lignin, flavonoid precursors) serving as chemical attractants to agrobacteria and stimulants for vir gene expression Among these phenolic compounds, acetosyringone (AS) is the most COCH effective.
3

H3CO OH

OCH3

The plant phenolic compounds stimulate the autophosphorylation of a transmembrane receptor kinase VirA at its His-474

It in turn transfers its phosphate group to the Asp-52 of the cytoplasmic VirG protein

3
n

VirG then binds to the vir box enhancer elements in the promoters of the virA, virB, virC, virD, virE and virG operons, upregulating transcription.

Plant signals

Sugars like glucose and galactose also stimulate vir gene expression when AS is limited or absent

Low opine levels further enhance vir gene expression in the presence of AS

Structure of the T-DNA

n

Although right border and left border are required to delimit the transferred segments, the T-DNA content itself has no effect on the efficiency of transfer. Therefore, researchers replace most of the TDNA with DNA of interest, making Agrobacterium a vector for genetic transformation of plants.

Production of T-strand
n

Every induced Agrobacterium cell produces one T-strand. VirD1 and VirD2 are involved in the initial T-strand processing, acting as site-and strand-specific endonucleases. After cleavage, VirD2 covalently attaches to the 5 end of the T-strand

Formation of the T-complex

n

The T-complex is composed of at least three components: one T-strand DNA molecule, one VirD2 protein, and around 600 VirE2 proteins

n n n

Whether VirE2 associates with T-strand before or after the intercellular transport is not clear.

Formation of the T-complex

n

Judging from the size of the mature T-complex (13nm in diameter) and the inner dimension of Tpilus (10nm width), the Tstrand is probably associated with VirE2 after intercellular transport.

Plant Nuclear Import

n

Because the large size of Tcomplex (50,000 kD, ~13nm in diameter), the nuclear import of T-complex requires active nuclear import. The T-complex nuclear import is presumably mediated by the T-complex proteins, VirD2 and VirE2. Both of them have nuclear-localizing activities.

Nuclear Import
n

VirD2 is imported into the cell nucleus by a mechanism conserved between animal, yeast and plant cells (bipartite consensus motif). VirE2 has a plant-specific nuclear localization mechanism. It does not localize to the nucleus of yeast or animal cells. In host plant cells VirD2 likely cooperate with cellular factors to mediate T-complex nuclear import and integration into the host genome.

T-DNA integration is not highly sequence-specific

n

There are no obvious site preference for integration throughout the genome. About 40% of the integrations are in genes and more of them are in introns.

Rutas bioosintticas de fitorreguladores vegetales en el gnero Agrobacterium

serie octopina Derivan de Arg serie nopalina

serie manopinas Derivan de Glu serie agropinas

Opinas sintetizadas por plantas infectadas con Agrobacterium rhizogenes

Rol de las opinas Las opinas son utilizadas como fuente de C y N por el Agrobacterium pero no por la planta su sntesis determina una desviacin energtica del vegetal en provecho de la bacteria En muchos casos las opinas son el metabolito ms importante de las clulas afectadas, constituyendo hasta un 7 % del peso seco total En un proceso de infeccin normal las opinas son secretadas al suelo y son catabolizadas por los Agrobacterium de vida libre

Establecimiento de cultivos de races transformadas Se deben preparar suspensiones de A. rhizogenes de 48 h. de edad cultivado entre 25-26C, puesto que a temperaturas mayores de 28C pueden provocar la cura de la bacteria de su plsmido. Acondicionar los explantos a infectar que pueden ser rganos de plantas silvestres o preferentemente plntulas estriles. Provocar cortes con una jeringa hipodrmica conteniendo la suspensin de A. rhizogenes sobre la superficie de los explantos y cultivar. A los 7-14 das, cuando las races emergentes tengan de 5-10 mm de longitud, seccionarlas, separarlas del explanto y colocarlas en medio de cultivo apropiado (B5, LS o MS de media fuerza (La mitad de la concentracin salina) con 30g/l de sacarosa y 0.5 mg/ml de sulfato de ampicilina). Subcultivar cada dos semanas en el mismo medio utilizando inculos de 3 a 4 cm de longitud con ramificaciones laterales. Luego de 8 subcultivos suprimir el agregado de antibitico al medio.

The growth medium has a significant effect on hairy root induction. High salt media such as LS or MS favors hairy root formation in some plants but not in others. Low salt media such as B5 favor excessive bacterial multiplication in the medium and therefore the explant needs to be transferred several times to fresh antibiotic containing medium before incubation.

The bacterial concentration

Suboptimal concentrations may result in lower availability of bacteria for transforming the plant cells

High concentrations may decrease it by competitive inhibition

Hairy roots induced from the leaf explants on growth regulator-free Murashige and Skoog medium (MS) 20 days after infection by Agrobacterium rhizogenes ATCC15834 (scale bar 1.5 cm)

Detection of agropine(A) and mannopine (M) and neutral sugars (NS) by paper electrophoresis in extract of two hairy root cultures. Lane 1 agropine and mannopine standards Lanes 2 and 3 hairy root cultures Lane 4 non-transformed control roots of sterile plants ,

PCR analysis of hairy roots

PCR was performed with primers for the rooting locus genes rolC (lanes 15) and rolB (lanes 611). Lanes 14 and lanes 69 fragments from hairy roots Lanes 5 and 10 fragments from control roots Lane 11 control without template DNA Lane 12 marker (1 kb DNA ladder) These results indicated that the rolB and rolC genes from the Ri plasmid of A. rhizogenes ATCC15834 were integrated into the genome of P. phaseoloides hairy roots.

A Sterile hairy roots of Pueraria phaseoloides cultured on solid, growth regulator-free MS medium for 18 days (scale bar 2.5 cm). B Sterile hairy roots in liquid MS medium, cultured for 10 days (scale bar 2.2 cm)

Hairy roots are fast growing and plagiotropic They require no external supply of growth hormones The plagiotropic characteristic is advantageous as it increases the aeration in liquid mediumand roots grown in air have an elevated accumulation of biomass.

Una vez establecidos los cultivos de races transformadas se pueden desarrollar a partir de pequeos inculos y obtener buenos ndices de crecimiento. El principal problema es el cambio de escala a niveles industriales ya que la agitacin mecnica causa injurias que conducen a la formacin de callos.

En los medios lquidos se forman esferas de races con las raicillas jvenes en crecimiento sobre la periferia y un corazn de tejido viejo en el interior La restriccin nutricional que soporta esta parte interna, principalmente en lo referido al oxgeno da origen a un bolsillo de tejido senescente

Debido a las ramificaciones las races forman una matriz que ofrece resistencia al flujo, siendo el principal problema nuevamente el suministro de oxgeno.

Produccin de metabolitos en cultivos de races TRANSFORMADAS

Las principales ventajas de utilizar cultivos de races transformadas, en cabellera o hairy roots para producir metabolitos secundarios en lugar de cultivos dediferenciados son: Con estos sistemas no son necesarios medios suplementados con fitorreguladores para desarrollar biomasa Las races transformadas crecen rpidamente, son robustas y vigorosas Sintetizan metabolitos secundarios caractersticos de las races de las plantas de las cuales provienen La sntesis de estos metabolitos se realiza a niveles reproducibles puesto que, a diferencia de los cultivos de clulas indiferenciadas, son genticamente estables por perodos prolongados de cultivo El cultivo masivo de races transformadas es sencillo y tiene potencialidad para desarrollarse en biorreactores, ampliando la posibilidad de aplicacin industrial de estos procedimientos