PRCTICA 1

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE AZCARES TOTALES EN UN ALIMENTO POR ESPECTROCOLORIMETRA

Itzel Prez Ayala Ral Villa Arvalo Alejandro Contreras

Anlisis Instrumental Prof. Dr. Eliel Rafael Romero Garca 9 de marzo de 2012. Morelia, Michoacn

Introduccin
En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes de alimentos. Son carbohidratos los diferentes azcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas. Los azcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempean un papel relevante, por ejemplo, el sabor est dado bsicamente por un balance entre azcares y cidos orgnicos. El sabor caracterstico de y diferente de las frutas se debe a la gran variacin en composicin y concentracin de los azcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucsidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza est determinada por los polisacridos estructurales. Dada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios mtodos para su determinacin: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, HagerdornHensen, espectrometra etc., Una de las tcnicas analticas ms potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiacin absorbida por la misma. Esta tcnica se llama Espectrofotometra. Se puede utilizar el espectrofotmetro para determinar la longitud de onda de la radiacin necesaria para las determinaciones de la cantidad de azcar en las muestras bajo estudio, comparndola despus con la radiacin absorbida por un blanco. 1

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DETERMINACIN CUANTITATIVA DE AZCARES TOTALES EN UN

ALIMENTO POR ESPECTROCOLORIMETRA
Preparacin de la muestra:
Adicionar 5 mL de
etanol al 50%, adicionar otros 5 mL al mortero para lavar

Pesar y pulverizar 5 gr de la muestra (fruta)

Transf erir el pulverizado a un vaso de precipi tados de 50 mL

Mezclar a homogeneid ad con una vari l la de vidrio por 3 minutos

filtrar en un embudo simple y f ibra de vidrio

El fi l t rado se transfiere a un tubo cnico y cent rifugar lo a 5000 rpm por 15 min

Decantar el sobrenadante (SN) a un tubo de ensaye seco

Preparacin de la curva estndar

Colocar en tubos de ensayo soluciones de glucosa a partir de un stock de 1g/100 ml

Soluciones: 0.005%, 0.125%,0.025%, 0.05%, 0.125%, 0.25%, 0.5%

Anal ice 0.5 mL de cada solucin de azcar , extra cto et l ico (por duplicado) o un testigo.

Hacerla reaccionar con 0.5 mL de fenol al 5%, mezclar

Anotar observaciones y clculos.

Determinar la absorbancia y el %T a 490 nm para cada una de las muestras en el espectrofotmetro.

Adicionar 5 mL de agua destilada a cada tubo

Someta la reaccin a un calentamiento suave a 30C en bao de agua por 20 min.

Adicionar con cuidado y por las paredes del tubo 2.5 mL de cido Sulfrico concentrado, mezclar.

OBJETIVOS -En esta prctica aislaremos los azucares para poderlos cuantificar y saber cuntos azucares posee la fruta que utilizamos. -tambin aprende a utilizar el colormetro tambin tendremos que poner en prctica qumica analtica para hacer las curvas de calibracin MARCO TEORICO Los espectrocolormetros son instrumentos de medicin que se emplean para efectuar mediciones de luz transmitida o absorbida por materiales slidos o lquidos, los cuales son ampliamente utilizados en diversas determinaciones analticas en la salud, universidades, institutos de investigaciones, centros del Polo Cientfico, centros de la industria alimenticia, entre otros. Principio de la Espectrofotometra Todas las sustancias pueden absorber energa radiante . La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica para cada sustancia qumica. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energa es absorbida; la energa radiante no puede producir ningn efecto sin ser absorbida. El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas. La espectrofotometra ultravioleta-visible usa haces de radiacin del espectro electromagntico, en el rango UV de 80 a 400 nm, principalmente de 200 a 400 nm y en el de la luz visible de 400 a 800 nm , por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la regin ultravioleta y visible del espectro.

Al campo de luz uv de 200 a 400 nm se le conoce tambin como rango de uv cercano , la espectrofotometra visible solamente usa el rango del campo electromagntico de la luz visible , de 400 a 800 nm. Adems, no est de ms mencionar el hecho de que la absorcin y trasmitancia de luz depende tanto de la cantidad de la concentracin como de la distancia recorrida.

Un espectrofotmetro es un instrumento usado en la anlisis qumico que sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra. Tambin es utilizado en los laboratorios de qumica para la cuantificacin de sustancias y microorganismos. Hay varios tipos de espectrofotmetros, puede ser de absorcin atmica o espectrofotmetro de masa y visuales. Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:

1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra 2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos interesa est presente en la muestra.

Ley de Beer-Lambert-Bouger: La cantidad de luz absorbida o transmitida por una solucin colorida es una funcin exponencial de la concentracin de la sustancia absorbente presente y de la longitud de la trayectoria (espesor) en donde se encuentra la muestra.

donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda, I es la intensidad de transmisin, L la longitud de ruta a travs de la muestra, y c la concentracin de las especies absorbentes. Para cada especie y longitud de onda, es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extincin. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presin particular, y tiene como unidades 1/M * cm o, a menudo, U/M * cm.

RESULTADOS Y OBSERVACIONES. Primero se prepararon soluciones diluidas a partir de una solucin de concentracin conocida al 1% (10 mg/ml). Posteriormente se tomo 0.5ml de la solucin para agregarle 0.5ml de fenol 5%; despus delicadamente por las paredes (dado que es una reaccin exotrmica) se adiciono 2.5ml de H2SO4 concentrado obteniendo as nuestra solucin colorida. A las cuales se diluyeron posteriormente para su anlisis. Dados los valores de absorbancia medidos por el espectrofotmetro, se registraron en la siguiente tabla y se les dio tratamiento estadstico de regresin lineal simple; con el objetivo de obtener una curva de calibracin estndar para poder realizar estimaciones de muestras problema de concentracin desconocida:

Conc mg/ml 5 2.5 1.25 0.5 0.25 0.05 Testigo M. Problema

Abs 1.6 1.6 1.29 0.74 0.42 0.03 0.27 0.35

La seal del testigo es importante debido a que se le resto alas absorbancias obtenidas experimentalmente. Tambin se utilizo la siguiente formula para calcular los factores de dilucin empleados.

Abs
1.6 1.4 1.2

y = 0.9893x + 0.113 R = 0.9505

Absorbancia

1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 Con. mg/ml 1 1.5 Abs Linear (Abs)

Para realizar la grafica anterior fueron ajustados los datos de mayor concentracin dado que saturaban la curva y disminuan el coeficiente de determinacin (R2), por lo cual se omitieron. La ecuacin de la recta se utilizara para realizar estimaciones de la muestra problema, para nuestro caso fue la fruta papaya, ala cual se le un tratamiento igual que a las soluciones de dextrosa.

Donde y es la absorbancia y x es la concentracin, por lo tanto despejando x:

Por lo tanto la estimacin de dextrosa en papaya es 0.24 mg/ml. El coeficiente de determinacin no es el ms adecuado, pero fue el ms acertado al cual nos fue posible aproximarnos. Adems le atribuimos algunos errores de medicin en la cristalera empleada, as como el manejo de la misma. REPORTE. 1.- Los datos ya se reportaron previamente en las observaciones.

2.- Fundamento terico 3.- Otros mtodos tiles para la determinacin de azucares en productos biolgicos. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES Prepare una serie de diluciones a partir de la solucin stock de glucosa. Las concentraciones debern ser de 300, 150, 75 y 30 g/ml. Utilice matraces volumtricos aforados con tapn y mrquelos con la concentracin correspondiente. Pipetee 1 ml. de cada solucin estndar de glucosa y agua destilada como blanco en tubos de ensayo con capacidad de 25 ml. aforados. Aada 1 ml. de reactivo alcalino de Nelson. Mezcle. Coloque los tubos en un bao de agua hirviendo durante 20 minutos y enfrelos al chorro de agua fra. Aada 1 ml. de arsenomolibdato. Mezcle bien por un perodo de 5 min. (Para disolver el Cu2O para reducir el arsenomolibdato). Afore a 25 ml. con agua destilada y mezcle. Lea la absorbancia a 520 nm. Determinacin de Glcidos Reductores por. Titulacin yodomtrica de obre, no reducido a Cu2O, segn Schoorl (53):

25 g. de muestra pulverizada o rallada se calientan hasta su licuacin y se agregan, bajo agitacin, 40 ml de agua a 80C. Se traslada con 100 ml de agua caliente a un matraz aforado de 250 ml, se enfra al chorro d agua hasta 20C y: se clarifica con 3,75 ml de acetato bsico de; plomo (230 g acetato neutro se `disuelven en 700 ml de agua hirviente y s agregan, bajo ebullicin; lentamente 120 g de Ph0. Una vez disuelta la mayor parte, se filtra en caliente y se completa l litro). A 50 ml del filtrado clarificado se agregan en un matraz aforado de 200 ml, 2 ml de oxalato de sodio al 101 y, despus de 1', 2 ml de Na2HPO4 + 12 H2O al 10%. Se agita, se completan los 200 ml con agua y se filtra, despus de agregar un poco de tierra de infusorios. Este filtrado puede usarse,para la determinacin polarimetra o la yodomtrica, como sigue:

En un matraz cnico de 300 ml se' colocan 25 ml del siguiente reactivo: 50 de cido ctrico se disuelven en 200 MI de agua caliente y se vacan en una solucin de 388 g Na2CO3 -f-

12 H20 en otros 200 ml de agua caliente; luego se agregan 25 .g de CuSO4 crist. Disueltos en 100 ml de agua -y se completa el litro con agua. Se agrega un volumen del filtrado anterior que contenga 10 a 60 mg de glcido y se completan 50 ml con agua. Se agregan unos granos de pmez y se lleva a ebullicin a .llama directa; en 2'. Luego se sigue hirviendo a llama directa, con refrigerante de bolas durante 10' exactos. Se enfra al chorro de agua, se agregan 0,5 g KI, luego lo ms rpidamente posible ( ero con cuidado) 20 ml de HCI al 25% y 10 m1 de KSCN al 20%. Se agita asta desaparicin de la efervescencia y se titula con Na2S2O3 N/10 hasta que el color azul, producido por 1 m1 de almidn al 2% (agregado al final), pase al color crema con tinte violceo. La diferencia entre un ensayo en blanco y, esta titulacin se consulta en la tabla adjunta, con la interpolacin correspondiente. 4.- Diferentes tipos de errores en anlisis qumico. Errores determinados. Son errores que pueden ser atribuidos a causas determinadas. Pueden clasificarse en: Errores personales : atribuibles al experimentador, como equivocacin al anotar el dato de una pesada, error en la lectura de un volumen, errores de manipulacin al transvasar materiales, al aadir una cantidad dada de reactivo y al permitir contaminacin de muestras, entre otros. Errores instrumentales: Se atribuyen a imperfecciones de las herramientas de trabajo del experimentador como por ejemplo, los materiales volumtricos (buretas, pipetas, matraces aforados) pueden contener o proporcionar volmenes que difieren del indicado en su graduacin. Errores metdicos: Se atribuyen a las limitaciones propias a que estn sujetos los procedimientos analticos. Son errores ms difciles de corregir o minimizar, puesto que son inherentes al mismo mtodo. Errores indeterminados. Consisten en el mayor o menor grado de incertidumbre a que estn sujetas todas las mediciones fsicas. Un planteamiento adecuado del experimento puede ayudar a disminuir esta incertidumbre hasta un lmite tolerable, pero no hay manera de eliminarla totalmente, hay que aceptar que el valor final de toda determinacin fsica est sujeta a cierto grado de incertidumbre, o sea a un error indeterminado. 5.- No se calcularon la desviacin promedio, media y dems datos estadsticos debido a que solo calculamos dos curvas estndar en nuestra sesin y la otra curva resulto demasiado irregular. 6.- Prueba Q Con frecuencia al efectuar una serie de replicas de anlisis alguno de los resultados ser distinto de los otros. Pero existe la posibilidad de dar un tratamiento estadstico a los

datos; una de las pruebas es la prueba Qumica de Dixon para su calculo se ordenan de manera creciente o decreciente los datos y se elige un valor sospechoso o anmalo. | | | |

La relacin de la Q experimental obtenida se compara con un valor de tablas de un nivel de confianza definido. Si la Q calculada resulta mayor o igual que la de tablas se puede rechazar ese valor sospechoso. n 3 4 5 6 7 8 9 10 15 20 25 30 7.- Tipo de espectrofotmetro Spectronic 20 de un solo haz. Qcrit 0.970 0.829 0.710 0.625 0.568 0.526 0.493 0.466 0.384 0.342 0.317 0.298 95% de confianza

8.- Diferencias entre fotmetros y espectrofotmetros.

Que el espectrmetro analiza el espectro caracterstico de un movimiento ondulatorio y este puede ser casi cualquiera y el fotmetro es casi cualquier instrumento que se emplea para medir la luz, por ejemplo pruebas colorimtricas. 9.- Funcin de filtros prismas y rejillas de difraccin. La funcin de los prismas es para dispersar la luz y el cual es usado comnmente para estudiar las longitudes de onda emitidas por una fuente de luz La funcin de la rejilla de difraccin es para obtener la longitud de onda de cada lnea espectral con la cual producimos mximos de difraccin

Conclusiones generales En esta practica pudimos manejar el espectrofotmetro de una manera directa lo que nos ayudara en futuras practicas donde sea necesaria la utilizacin e este instrumento ya que con este podremos hacer determinaciones mas exactas de las muestras que deseamos probar.

BIBLIOGRAFA: http://www.uam.es/personal_pas/patricio/trabajo/segainvex/electronica/proyectos/curso_in strumentacion/instrumentacion2.pdf http://es.scribd.com/doc/18030546/quimica-analitica http://www.chem.utoronto.ca/coursenotes/analsci/StatsTutorial/qcrittable.html http://www.docencia.izt.uam.mx/lyanez/analisis/practicas/azucares.rtf